MEMÓRIAS DO INSTITUTO BUTANTAN

Conteúdo

Pag-

Editorial. XI

Artigos Originais/Original Articles

Maturação eritrocitária em roedores . 1

Erythrocytary maturation in rodents

Adolpho BRUNNER JR.

Achados anátomo-patológicos em necroscopia de paciente falecido

por envenenamento elapídico . 41

Autopsy findings in a human case of elapidic poisoning.

Jesus Carlos MACHADO e Gastão ROSENFELD

Epidemiologia da Moléstia de Hodgkin em crianças. Um estudo de

36 casos . 55

Epidemiology of Hodgkin’s disease in children. A study of 36 cases.

Jesus Carlos MACHADO, J. FRANCO da SILVEIRA F.° and

Antonio Dionísio RUSSO.

Alterações do epilélio e esfregaços vaginais da preá ( Cavia aperea

aperea ) durante o ciclo estral e estudo comparativo com as da cobaia

Alterations in the epithelium and vaginal smears of the Preá ( Cavia

aperea aperea) during the estrous cycle and comparison with those

of the Guinea-Pig.

José FRANCO da SILVEIRA F.° e Jesus Carlos MACHADO

III

SciELO

10 11 12 13 14 15

Produção de lesões semelhantes às do Pênfigo Foliáceo pela injeção

intradérmica, em coelhos e macacos, de sôros de doentes com título

elevado de autoanticorpo . 79

Production of Pemphigus-like lesions by intradermal injection of

monkeys and rabbits with Brazilian Pemphigus Foliaceus sera with

high content of intracellular antibody.

Ernst BEUTNER, Gary W. WOOD, Tadeusz P. CHORZELSKI,

Cid ABREU LEME e Otto G. BIER

Estudo comparativo da alergia tuberculínica e da proteção conferida

pela vacina BCG. Via oral e intradérmica, em cobaios. 95

Comparative study on tuberculin allergy and protetion conferred to

guinea-pigs by oral and intradermal BCG vaccine.

Bruno SOERENSEN Cardozo, Jandyra Planet do AMARAL, Marta

Maria MUTTI PEREIRA e Maria Antonieta da SILVA

Ocorrência de Micrurus hemprichii hemprichii no Brasil (Serpentes

Elapidae).. . 107

Micrurus hemprichii hemprichii recorded for Brazil

Alphonse Richard HOGE e Sylvia Alma ROMANO

8 Notas sôbre Leptomicrurus Schmidt (Serpentes Elapidae)

Notes on Leptomicrurus Schmidt

Sylvia Alma R. W. L. ROMANO

111

Revisão de alguns tipos de aranhas caranguejeiras(ORTHOGNATHA)

estabelecidos por Cândido de Mello Leitão e depositados no Museu

Nacional do Rio . 117

Revision of some types of Mygalomorph spiders of the collection in

the Museu Nacional — Rio de Janeiro

Wolfgang BÜCHERL, Anna Timotheo da COSTA e Sylvia LUCAS

10 Três casos de parasitismo no Brasil entre a aranha caranguejeira

Lasiodora klugi (C. L. Koch) e uma môsca do gênero Exetasis

(DIPTERA, ACROCERIDAE) . 139

Three cases of parasitism in the Mygalomorph spider Lasiodora

klugi (C. L. Koch) by a fly of the genus Exetasis (DIPTERA,

ACROCERIDAE) in Brazil.

Vera Regina D. von EICKSTEDT

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

SciELO ^

MEMÓRIAS DO INSTITUTO BUTANTAN

INSTRUÇÕES AOS AUTORES

1 — FINALIDADE

As MEMÓRIAS DO INSTITUTO BUTANTAN são publicadas sob a

orientação da Comissão Editorial, sendo que os conceitos emitidos são de intei¬

ra responsabilidade dos autores. Tem por finalidade a apresentação de trabalhos

originais que contribuam para o progresso nos campos da Biologia e da Medici¬

na, elaborados por especialistas nacionais ou estrangeiros que se enquadrem no

REGULAMENTO DOS TRABALHOS.

2 — REGULAMENTO DOS TRABALHOS

2.1 NORMAS GERAIS

2.1.1. Os trabalhos devem ser inéditos e destinar-se exclusivamente à

revista “MEMÓRAS DO INSTITUTO BUTANTAN”. Os artigos serão publi¬

cados a convite da Comissão Editorial.

2.1.2. ESTRUTURA DO TRABALHO

2.1.2.1 Elementos preliminares

a) cabeçalho — título do trabalho e nome do autor (es);

b) filiação científica e enderêço para correspondência.

2.1.2.2 Texto

Sempre que possível deve obedecer à forma convencional do

artigo científico:

a) Introdução — Estabelecer com clareza o objetivo do tra¬

balho, relacionando-o com outros do mesmo campo e apre¬

sentando de forma sucinta a situação que se encontra o

problema investigado. Extensas revisões de literatura de¬

vem ser substituídas por referências aos trabalhos mais re¬

centes, onde tais revisões tenham sido apresentadas.

b) Material e métodos — A descrição dos métodos usados

deve limitar-se ao suficiente para possibilitar ao leitor a per¬

feita compreensão e repetição dos métodos; as técnicas já

descritas em outros trabalhos devem ser referidas somente

por citação, a menos que tenham sido consideràvelmente

modificadas.

c) Resultados — Devem ser apresentados com clareza e, sem¬

pre que necessário, acompanhados de tabelas e material

ilustrativos adequados.

VII

í, | SciELO

ERRATA

- "Normas Gerais" - 2.1.X - onde se le: MEMORAS leia-se MEMÕRIAS

- "EDITORIAL" - 5a.linha - onde se lê: deve-se le j a-s e deve se

4 4 - for Golgi Complex read Golgi coroplex

§ 1 - line 7 - for erõthroblast read erythroblast

for end read and

for Dibutyl phtalate 1% v/v

Benzoil peroxide 0.05 ml

read

Dibutyl phtalate 0.05 ml

Benzoil peroxide 1% v/v

Pg. 7

§ 4 - line

- for identifyed read identified

Pg. 8

§ 1 - line

- for Threre read There

Pg. 9

§ 2 - line

- for cach read each

Pg. 12

§ 2 - line

- for polychrornatiphi1ic read polychr omatoph i1ic

Pg. 15

§ 1 - line

- for Skutelsby read Skuteisky

F$.16

§ 5 - line

- for rhytydia read crytydia

Pg - 1 7

line 2 - for

fiblroblasts read fibroblasts

§ 2 - line

- for aggress read aggrees

Pg. 19

5 2 - line

- for aforemenitioned read aforementioned

Pg • 20

6 - line

- for Laitha read Lajtha

Pg.27

Fig.16 - for

— 4

Dye at 1x10 read Dye at 1x10

Pg • 36

line 7 - for

HumanErõthropoiesis read Human Erythropoiesis

Pg.37 -

Pg.38 -

line 19 - for Etudy read Study

line 22 - for Nuclear-Mitochondria read Nuclear-Mitochondrial

line 23 - for inPelomyxa carolinensis read in Pelomyxa carolinensis

line 35 - for Estrutura read Estruturas

line 9 - for Eearle ' s read Earle’s

line 21 - for Zelforch read Zellforch

line 46 - for "in Vitr" read "in vitro"

line 48 - for Exptl.Cel Res.,:56-59,1963 read Exptl.Cell Res.,^5:

56-59,1963

line 5 - for SchWeiz read Schweiz

line 10 - for Fred. read Fed.

line 20 - for LEBLOND.C.P. and Droz , read LEBLOND ,C.P.and DROZ ,

line 21 - for show read shown; for Procursors read Precursors

line 30 - for Size.Phenylhydrazine

read Size..... Phenylhydrazine - Induced.Reti*culocytos is

Proc.Soc.Exper.Biol.Med. , 57 :344-347,1944

line

36 -

for

9:228,1960 read

9:248,1960

line

43 -

for

SC11ULTZ ,H.UND DE

PAOLA read

SCHULTZ ,11. und

DE PAOLA

line

4-5 -

for

SEN0.S.,HABA,K.,

T... read

SENO.S. - The

Structure

and the Function of Reti-

culocyte . Acta Haem.Jap .21:

171-181,1958.

SciELO

0 11 12 13 14 15 16

cont

Pg.38 -

Pg.39 -

Pg•50 -

Pg.61 -

Pg • 63 -

Pg•71 -

Pg•113 -

Pg. 119 -

Pg.120 -

Pg•130 -

Pg.H8 -

Pg•152 -

Pg•153 -

line 47 - for SENO , S. ,HABA,K. ,T. and NAKAMOTO,T.

read SENO ,S. ,HABA,K. ,MAKI,T. and NAKAMOTO,T.

line 5 - for oes read Does

line 29 - for and Hall.C.E. read and HALL,C.E.

Leg.Figs.3 e 4 - onde se le hemogrobina leia-se hemoglobina

" BIBLIOGRAPHY" - for FRAUMENT,Jr. read FRAUMENI ,Jr.

"INTRODUÇÃO" - 9a. linha - onde se lê "Antes dele, von Ubisch e

Mello,1940, fizeram esses estudos era

animais provenientes diretamente do

campo"...

leia-se " Antes dele,von Ubisch e Mello

1940, publicaram algumas observações sobre

o ciclo sexual da preá e seu período de

gestação. De 11ias , 1969 , e von Ubisch e

Mello, 1940, fizeram esses estudos em a-

nimais provenientes diretamente do campo"...

§ 2 - 29a.linha - onde se le ....Rosa e Alvarado, 1959)

leia-se ...Rosa e Ve 1 ardo , 1959)

for narducii or narducci read narduccii

"DIPLURIDAE,DIPLURINAE" - 3a.linha - onde se lê: D.borgmieri

leia-se : D.b orgmeie ri

"BARICHELIDAE,DIPLOTHELINAE" - 2a.linha - onde se lê

N.leonardosi leia-se N.leonardoi

leg.fig.8 - onde se lê Diplura bitaeniatas

leia-se Diplura bitaeniata

§4 -line 2 - for show read shown

§2 -line 1 - for Benzimodazo 1e read Benzimidazole

§1 -line 1 - for (12) read (2); for dymethy1aminopropiophenone

read dimethylaminopropiophenone

cont

Pg.38 -

Pg.39 -

Pg.50 -

Pg.6 1 -

Pg.63 -

Pg•71 -

Pg•113 -

Pg.119 -

Pg.120 -

Pg•130 -

Pg.148 -

Pg•152 -

Pg.153 -

line 47 - for SENO , S. ,HABA,K. ,T. and NAKAMOTO,T.

read SENO , S. , HABA,K.,MAKI,T. and NAKAMOTO,T.

line 5 _ for oes read Does

line 29 - for and Hall.C.E. read and HALL.C.E.

Leg.Figs.3 e 4 - onde se lê heraogrobina leia-se hemoglobina

" BIBLIOGRAPHY" - for FRAUMENT,Jr. read FRAUMENI ,Jr.

"INTRODUÇÃO" - 9a. linha - onde se lê "Antes dêle, von Ubisch e

Mello,1940 , fizeram esses estudos em

animais provenientes diretamente do

campo"...

leia-se " Antes dele,von Ubisch e Mello

1940, publicaram algumas observações sobre

o ciclo sexual da preá e seu período de

gestaçao. De 11ias , 1969 , e von Ubisch e

Mello, 1940, fizeram esses estudos em a-

nimais provenientes diretamente do campo"...

§ 2 - 29a.linha - onde se lê ....Rosa e Alvarado, 1959)

leia-se ...Rosa e Velardo , 1959)

for narducii or narducci read narduccii

"DIPLURIDAE .DIPLURINAE" - 3a.linha - onde se lê: D.borgmieri

leia-se : D.borgmeieri

"BARICHELIDAE,DIPLOTHELINAE" - 2a.linha - onde se lê

N. leonardosi leia-se N■leonardoi

leg.fig.8 - onde se lê Diplura bitaeniatas

leia-se Diplura bitaeniata

§4 -line 2 - for show read shown

§2 -line 1 - for Benzimodazole read Benzimidazole

§1 -line 1 - for (12) read (2); for dymethy1aminopropiophenone

read dimethy1aminopropiophenone

d) Discussão — Deve restringir-se à apresentação dos dados

obtidos e dos resultados alcançados, relacionando-se novas

contribuições aos conhecimentos anteriores. Evitar hipó¬

teses ou generalizações não baseadas nos resultados do tra¬

balho.

e) Conclusões — devem ser fundamentadas no texto.

Dependendo do assunto do artigo, as divisões acima poderão ser modifica¬

das de acordo com o esquema de trabalho, porém, o artigo deve conter obriga¬

toriamente:

a) Introdução;

b) Desenvolvimento do tema (com as divisões a critério do

autor);

c) Conclusão.

Agradecimentos — devem ser mencionados antes das Referências Biblio¬

gráficas.

2.1.2.3 Material de Referência

Todo trabalho deve vir obrigatoriamente acompanhado de:

a) RESUMO — um no mesmo idioma do texto, outro em

inglês, redigidos pelo(s) próprio (s) autor(s), devem

expressar o conteúdo do artigo, salientando os elementos

novos e indicando sua importância. O resumo na língua

em que está redigido o trabalho deve ser colocado antes

do texto; e o em inglês no final. Só excepcionalmente ex¬

cederá a 200 palavras. Os títulos dos trabalhos devem ser

traduzidos para o inglês.

b) UNITERMOS — Correspondendo a palavras ou expres¬

sões que identifiquem o conteúdo, devem ser em número

necessário para a completa descrição do assunto e assina¬

lados com asteristicos os 3 unitermos principais. Para a

escolha dos unitermos usar o vocabulário protótipo do

campo especializado. *

c) REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS — Devem ser in¬

cluídas apenas as referências mencionadas no texto e arran¬

jadas em ordem alfabética do sobrenome do autor, nume¬

radas consecutivamente.

Periódico:

AMORIM, M. de F., MELLO, R. F. e SALIBA, F. —

Envenenamento botrópico e crotálico. Contribuição

para o estudo experimental comparado das lesões.

Mem. Inst. Butantan, 23: 63, 1950-51.

Para as ciências da saúde usar o "Medicai Subject Headings", com tradução em português rea¬

lizada pelo Grupo de Bibliotecários Biomédicos da A.P.B.

VIII

SciELO

10 11 12 13 14 15

Livro:

BIER, O. — Bacteriologia e imunologia. 1, 13. ed. São

Paulo, Melhoramentos, 1966.

1 .

2 .

As citações no texto devem ser em números índices, correspondendo às res-

vas referências bibliográficas.

Exemplos:

As investigações sôbre a fauna flebotomínica no Estado de São Paulo, fo-

feitas em várias ocasiões *■ s > 4 .

. .. método derivado de simplificação de armadilha de Disney 2 (1968).

Referências Bibliográficas (correspondentes aos números índices)

BARRETO, M. P. — Observações sôbre a biologia em condições naturais

dos flebótomos do Estado de São Paulo (Diptera Psychodidae); São

Paulo, 1943. (Tese — Faculdade de Medicina da Universidade de São

Paulo).

DISNEY, R. H. L. — Observations on a zoobosis: leishmaniosis in British

Honduras. J. appl. Ecol., 5:1-9, 1968.

FORATTINI, O. P. — Algumas observações sôbre Biologia dos flebótomos

(Diptera, Psychodidae) em região da bacia do Rio Paraná (Brasil).

Arq. Fac. Hig. S. Paulo, 5:15-136, 1954.

FORATTINI, O. P. — Novas observações sôbre Biologia de flebótomos

em condições naturais (Diptera, Psychodidae). Arq. Fac. Hig. S. Paulo,

25: 209-15, 1960.

3 _ NORMAS PARA APRESENTAÇÃO DOS ORIGINAIS

3.1 — Datilografia — Os originais devem ser datilografados, em 3

(três) vias, com espaço duplo, em uma só face, mantendo as

margens laterais com 3 cm aproximadamente. Tôdas as pá¬

ginas devem ser numeradas consecutivamente, com algaris¬

mos arábicos, no canto superior direito.

3.2 — Tabelas — Devem ser numeradas consecutivamente com al¬

garismos arábicos e encabeçadas pelo seu título. Os dados

apresentados em tabela não devem ser, em geral, repetidos no

texto. As notas de rodapé das tabelas devem ser restritas ao

mínimo possível e referidas por asteristicos.

3 3 — Ilustrações — (fotografias, desenhos, gráficos, etc) — As

ilustrações devem ser numeradas consecutivamente com al¬

garismos arábicos e citadas como Figuras. Tôdas as figuras

serão identificadas fora da área de reprodução com: número,

nome do autor, título abreviado do trabalho, indicação da

página de texto onde deverão constar. As legendas devem ser

apresentadas em folhas à parte. As ilustrações devem permitir

perfeita reprodução em clichês até a redução mínima de 6,3

cm (largura da coluna do texto). Os desenhos devem ser fei¬

tos em papel vegetal e tinta nanquim preta e as letras com

normógrafo, nunca datilografadas.

1 .

2 .

2 3

5 6

11 12 13 14 15

A Revista admite clichês (branco e preto) até 6 do texto, para cada traba¬

lho, devendo os demais serem pagos pelo autor. Para clichês coloridos deverá ha¬

ver prévia combinação entre a Comissão Editorial e o autor.

De cada trabalho serão tiradas 100 (cem) separatas, devendo o autor pagar

as separatas que excedam a êsse número, quando solicitar uma quantidade maior.

As separatas em excesso devem ser solicitadas quando o manuscrito fôr encami¬

nhado à Comissão Editorial.

Os trabalhos poderão ser redigidos, além da língua portuguesa, em: inglês,

francês e espanhol. Outras línguas ficarão a critério da Comissão Editorial.

A reprodução total ou parcial dos trabalhos em outros periódicos — com

menção obrigatória da fonte — dependerá de autorização prévia da Comissão

Editorial.

Para fins comerciais, será proibida a tradução e reprodução dos trabalhos

publicados pela revista.

2 3

5 6

10 11 12 13 14 15

EDITORIAL

Este número das “Memórias do Instituto Butantan” assinala uma nova fase

na vida funcional deste Instituto, representada pela implantação de uma nova

estrutura técnico-científica e administrativa mais complexa, que proporcionou uma

hierarquia funcional e melhoria na inter-relação dos diferentes trabalhos. E certo

que a atual organização deve-se modificar com o tempo e a experiência, para que

ela melhor se adapte às necessidades crescentes do Estado de São Paulo e do

Brasil.

Originado em 1898 como dependência do Instituto Bacteriológico, com a

finalidade de preparar sôro antipestoso para atender a surto epidêmico de peste

bubônica desencadeado na cidade de Santos, foi em 23 de fevereiro de 1901 des¬

ligado dessa instituição sanitária tornando-se uma unidade autônoma com o nome

de Instituto Butantan.

Já nesta época se aliavam os estudos dos sôros antivenenosos, muito espe¬

cialmente os antiofídicos, aos trabalhos iniciais de sôros e vacinas contra as mo¬

léstias infecciosas em geral. Seu primeiro Diretor e orientador dos trabalhos foi

o ilustre cientista e médico brasileiro Vital Brazil Mineiro da Campanha.

Decorridos 70 anos de existência com grandes realizações técnico-científicas,

muito especialmente no campo da saúde pública, tendo passado por seus labo¬

ratórios uma plêiade de cientistas nacionais e estrangeiros, arrola no presente

importantes equipes de trabalhos que se identificam no campo da Imunologia,

Biologia, Zoologia muito especialmente relacionada aos animais peçonhentos,

Genética, Microbiologia, Patologia, Fisiologia, Farmacologia, Química e Citolo-

gia, podendo ser considerado no presente uma das mais complexas e importantes

organizações técnico-científicas do Brasil.

Orgão da Secretaria da Saúde do Estado de São Paulo, anexo à Coordenado-

ria de Serviços Técnicos Especializados, tem suas finalidades gerais discrimina¬

das como segue:

— desenvolver estudos e pesquisas, puras e aplicadas, em qualquer ramo

da medicina e biologia, direta ou indiretamente relacionados com a Saú¬

de;

— colaborar com os órgãos da Secretaria da Saúde no combate a surtos

epidêmicos;

— prestar assistência aos órgãos oficiais do Estado no controle e na pa¬

dronização de produtos biológicos;

— divulgar suas pesquisas e trabalhos que interessem ao progresso da me¬

dicina e biologia;

SciELO

10 11 12 13 14 15

— realizar missões científicas, tanto no País como no exterior;

— promover e colaborar na formação e aperfeiçoamento de pessoal técnico

científico de nível médio e superior, do Instituto ou de outras entidades;

— fabricar medicamentos e substâncias químicas para uso diagnóstico, pro¬

filático ou curativo, estudados ou aperfeiçoados no Instituto Butantan ou

ainda, de interêsse especial para os serviços de saúde pública;

— facultar à indústria farmacêutica, considerado o interêsse nacional, con¬

dições para o seu aperfeiçoamento tecnológico e a realização de pesqui¬

sas médicas e farmacológicas.

Jandyra Planet do Amaral

DIRETORA GERAL

XII

2 3

5 6

10 11 12 13 14 15

Mero. Inst. Butantan

35: 1-39, 1971.

ERYTHROCYTARY MATURATION IN RODENTS. *

A. BRUNNER JR.

Laboratório de Microscopia Eletrônica

Instituto Butantan

SUMMARY: Erythrocytary series of

peripheral rabbit and hamster blood

have been studied by methods of he-

molysis and thin sections at the ul-

trastructural levei.

The presence of filamentous or rod-

like mitochondria, that disintegrate to

circular membranous forms, has been

demonstrated when hemolysis was do-

ne in suspension in distilled water.

After nuclear extrusion, occurring

generally in the orthochromatic ery-

throblast, concomitantly with active

contraction and expansions, an increa-

se of mitochondria occurs. This is

coincident with the higher intensity

of hemoglobin synthesis, as verified

by other authors.

Besides the organelles, as mitochon¬

dria and polyribosomes, which parti-

cipate in hemoglobin synthesis, there

is the Golgi Complex, probably

acting in the reticulocyte water and

salts balance during maturation, as

well as vesicles and a smooth endo-

plasmic reticulum.

The final maturation of the erythro-

cyte is characterized by the increase

of hemoglobin concentration followed

by a Progressive disappearance of all

the cytoplasmic structures and the

rise of the characteristic discoidal bi-

concave form, constituted by only an

ordinate paracrystalline structure at

the molecular levei.

UNITERMS: Erythrocytary Matura¬

tion.

INTRODUCTION

An accurate study of mammalian erythrocytes shows that the cell during the

maturation process, undergoes successive structural and biochemical transforma-

tions which confer a functional specificity to it. Theses modifications arise in a

cell at the beginning of differentiation, and therefore, without any definitive mor-

phologic and physiologic characteristics. In this respect, erythropoiesis is a very

illustrative phenomenon, well known nowadays. Every maturation phase was follo-

wed up by the classical staining and cytochemical techniques for optical rnicros-

copy. Proerythroblast, the first phase of differentiation, is followed by the baso-

philic, polychromatophilic and acidophilic erythroblast; the latter gives rise to

the non nucleated cell, namely reticulocyte, that develops to the mature erythro-

cyte.

* Thesis of the doctorate sustained at the Departamento de Fisiologia Geral e Animal of the Faculdade

de Filosofia, Ciências e Letras at the Universidade de São Paulo.

Add t*açç •

C.P. 65, São Paulo, Brazil

SciELO

10 11 12 13 14 15

BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mcrn. Inst. Butantan, 35: 1-39. 1971.

In animais considered as normal, the transitional phases follow the synchrcc-

nism law of nucleocytoplasmic evolution, occuring a parallelism between cyto-

plasmic and nuclear transformations during the maturation of the blood cells;

this synchronism did not occur under pathological conditions (Bessis, 1961). In

this sequence of evolution, mitosis takes place, followed or not by cytoplasmic

division (Berman, 1947; Wolff and Hofe, 1951), and loss of the nucleolus in

the basophilic eròthroblast; further, a gradual decrease of basophilia occurs,

and hemoglobin synthesis takes place in the polychromatophilic phase; the aci-

dophilic erythroblast shows a marked decrease of nucleoplasmic relationship at

the picnotic stage of the nucleus, and a reduction in number of mitochondria that

arrange themselves generally near the nucleus. At this phase the nucleus vanishes

through cariolysis, carioexis or extrusion, the latter being the more frequent phe-

nomenon (Astaldi et ah, 1950; Leonardi, 1951).

Right after this phase, the reticulocyte develops, showing a more intense he¬

moglobin symhesis in accordance with comparative microspectrophotometric de-

tcrminations for mature erythrocytes, reticulocytes, erythroblasts and purified

hemoglobin, corresponding to the extinction at 4060 A wave length (Seno, 1953).

The immature erythrocyte, or reticulocyte is characterized by granules and fila-

ments at vital or supravital staining with brilliant cresyl blue, Janus green B or

other dyes. The nature of the reticulum thus formed has been studied exhaustively

by Cesaris-Demel (1907). The granules were denominated A substance, and the

filaments, B substance; these structures are known as “Substantia granulo-filamen-

tosa”. It has been discussed also whether or not this structure could be an artifact,

resulting from the precipitation of the dyes employed. The majority of authors con-

sider “Substantia granulo-filameníosa” as a real artifact on the basis of their ex¬

perimental results.

Dustin (1947) and Theorell (1950) carne to the conclusion that the mamma-

lian reticulocytes contain a diffuse basophilic substance, resulting in a granular

agglomeration in the presence of basic dyes. They demonstrated that basophilia is

due to the presence of ribonucleoproteins, since this structure is not evidenced

after treatment of the reticulocytes with ribonuclease; Burt et al. (1951), and

Thoma (1959) confirm these observations. Kosenow (1952), when observing

young erythrocytes staincd in increasing acridin-orange H-concentrations by fluo-

rescence microscopy, demonstrated an increase of granules and filaments. He con-

cludes, as others do, that this fact is due to the presence of diffuse nucleic acid.

Bessis (1954) holds the hipothesis of an artifact due to dye and ribonucleopro-

tein precipitation, and does not admit the preexistence of the so-called “Substan¬

tia granulo-filamentosa”.

However, the preexistence of a structure in non stained reticulocytes has

been observed through dark field microscopy by Simmel (1926) and Seyfarth

(1927), as well as by phase contrast microscopy after hemolysis (Lüdin, 1949),

or in intact reticulocytes (Sano, 1965). The nature of this structure and its

relationship to the “Substantia granulo-filamentosa” was enlightened by electron

microscopy with various techniques (Brunner et al., 1956; Braunsteiner et al.,

1956; Vallejo-Freire and Brunner, 1958; Brunner, 1962).

Structures that constitute the Golgi complex, or vesicles and dictyosomes,

were observed in normal and lead poisoned guinea-pigs as well as in rabbit embryo

erythrocytes. Concentric lamellar structures of unknown function, described for

2 3

5 6

10 11 12 13 14 15

BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39, 1971.

several kinds of cells, were also observed in reticulocytes (Brunner and Vallejo-

Freire, 1964).

Basophilia and all the structures of the reticulocytary phase disappear gra-

dually, giving rise to a mature erythrocyte with the characteristic discoidal and

biconcave form that contains only a structure at the molecular levei.

In the present work, morphologic aspects of some evolutive phases at the

ultrastructural levei are analysed, occurring during the maturation of the erythro-

blast up to the definitive red blood cell. With reference to the above considera-

tions, various questions arise, mainly related to physiology. The following facts

are quoted: a — “Substantia granulo-filamentosa” is of essential mitochondrial

nature; b — the different aspects of mitochondria, when reticulocytes are hemoly-

sed by different techniques; c) — the quantitative increase of mitochondrial

structures after nuclear extrusion; d — in consequence of the former phenomenon,

the mechanism that leads to the quantitative increase of mitochondria, as well as

the degenerating process of these organelles; e — the components of the Golgi

complex in the young erythrocytes; f — the possible existence of a molecular

arrangement in the normal mature erythrocyte.

MATERIAL AND METHODS

Guinea-pigs ( Cavia porcellus ) weighing 350-400 g, newbom rabbits (Orycío-

lagus cuniculus), rabbit and hamster embryos ( Mesocriceíus auratus), 16-22 and

10 days old, respectively, were used.

Bleeding anemia in guinea-pigs.

To increase the number of reticulocytes in blood, 5 to 6 ml of blood were

withdrawn daily by cardiac punction during 5 days; 2-3 days after the last

bleeding, blood was collected for examination. The Giemsa stained smears show

reticulocytes recognized by their diffuse basophilia, with a percentage varying

between 10 and 15%.

Lead poisoning anemia in guinea-pigs.

One ml of an 1 % aqueous lead acetate solution was injected subcutaneously

during 3 to 9 days. Blood was withdrawn by cardiac punction after 3-7 days.

Reticulocytosis varied from 6 to 50%, and the proportion of erythroblasts was

about 6%.

Blood samples with reticulocytosis and erythroblastosis.

Blood samples of newborn rabbits were obtained by cardiac puncture; from

hamster and rabbit embryos, by sectioning the umbilical cord. Embryonic blood

consists merely of megaloblasts, megalocytes, erythroblasts and reticulocytes; the

percentage of reticulocytes is about 20% in newborn rabbits; erythroblasts are

rarely found in the peripheral blood.

Hemolysis.

Technique A — Thin blood smears were prepared on collodion-coated his-

tological slides and allowed to dry at room temperature for 5-10 hs, and hemolysis

SciELO

10 11 12 13 14 15

BRUNNER JR. f A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39. 1971.

was pcrformed in 0.8% NaCl solution containing 2.5% formalin. The stromas

were then stained for 5-10 min 1% aqueous phosphotungstic acid solution, pH

about 3.5, washed in distilled water and dried at room temperature. The films,

carrying the stromas, were transferred to metal grids for examination (Brunner

and Vallejo-Freire, 1956).

Technique B — One ml of blood was washed once in 0.85% NaCl solution

and hemolysed in 20 ml distilled water.

Technique C — Washed blood was hemolysed in 20 ml of 0.2% NaCl

solution containing 2.5% formalin.

In the latter two instances, 2 ml of a 2% O O^ aqueous solution were

added to the samples after hemolysis. After 5 min the ghosts, or stromas, were

centrifuged at 60 g for hemoglobin elimination, and washed three times in distilled

water; the sediment was suspended in 4 or 5 ml of distilled water and then

dropped over collodion-coated metal grids. After 50 or 60 min the excess of

water was absorbed with filter paper, and the preparations air dried at room

temperature (Brunner and Vallejo-Freire, 1956).

Replica

To investigate the existence of structures on the erythroblast nucleus, blood

smears were fixed with O O vapor for 1 h, and then covered with a 1%

s 4

collodion amyl acetate solution, and tilted at an angle of about 50° to the hori¬

zontal, for 30 min. After drying, the replicas were detached from the smears and

transferred to metal grids.

Treatment with ribonuclease

Smears hemolysed according to technique A, without staining, were kept in

a M/7 veronal-acetate buffer, pH 6.8, containing 0.1% ribonuclease (General

Biochemical Inc ) at 37°C for 1 h; Controls were treated under the same con-

ditions. All smears were washed in distilled water and stained for 5 to 10 min

in an 1% aqueous phosphotungstic acid solution. After washing and drying the

films with the adhering stromas or ghosts were transferred to metal grids.

Most of all these preparations were submitted to the shadow-casting process,

with chromium or palladium.

Retraction of the inner erythrocyte material by osmic acid.

Peripheral blood erythrocytes of normal guinea-pigs were fixed for 18 to 20

h in NaCl Solutions of concentrations varying between 0.60 and 0.40%, con¬

taining 10% formalin. Part of each suspension was centrifuged at 60 g and the

sediments suspended or not in 1% aqueous phosphotungstic acid solution for 15

min; the remaining part of each suspension was centrifuged and the sediments

suspended in 1% aqueous osmic acid solution for 15 min.

The erythrocytes treated with phosphotungstic or osmic acid were, after

dehydration, embedded in methyl and butyl-methacrylates, and ultrathin sections

prepared for examination.

2 3

5 6

10 11 12 13 14 15

BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39. 1971.

Supravital staining wilh Janus green B.

Reticulocytes of guinea-pings with bleeding anemia, were stained with Janus

green B, adding 2 or 3 blood drops to 3 or 4 ml of 0.85% NaCl in a series

of dye dilutions from lxlO 4 to 5x1o- 6 . After 5 min, and when the staining at the

IxlO 4 dilution is microscopically visualized, the erythrocyte suspensions were

centrifuged at 60 g, and the sediments suspended in an 1% osmic acid solution

in veronal-acetate buffer of 7.4 pH. For fixation of the dye, and to increase the

contrast at the electron microscope, an equal volume of an aqueous solution,

containing 3.0% HgCl 2 and 5.6% Kl was added to the suspension after 5 min,

according to the technique of Seno et al. (1958). After washing in distilled

water, the erythrocytes were dehydrated in alcoholic series; the passages should

be as short as possible because the Janus green B-dye fixative complex is soluble

in alcohol.

Fixation end embedding techniques for ultrathin sectioning.

A few blood drops of rabbit and hamster embryos were added to an 1%

KMnO ( solution in veronal-acetate buffer, pH 7.4. After 5 min the suspension

was centrifuged at 60 g for 10 min, the supernatant discarded, and the sediment

suspended in an 1 % O O solution in “Subtosan” or veronal-acetate buffer for

10 min. Blood of normal and lead acetate treated guinea-pigs was fixed only in

an 1% O O solution in veronal-acetate buffer, pH 7.4, for 15-20 min. Erythro-

s 4

cytes embedded in a 3:7 methyl and butyl methacrylate mixture, containing 1%

benzoil peroxide, were dehydrated in alcoholic series; embeddings prepared in

Epon 812+, and in Crystic-araldite++ were firstly dehydrated in acetone se¬

ries, or when dehydrated in alcoholic series, they were finished in 100% acetone.

The time allowed for erythrocytes in each dehydrant médium was about 15 min,

and passages from one médium to another were made by successive centrifuga-

tions up to the final embeddings.

Sections were cut in a Porter-Blum microtome with glass knives, and har-

vested on collodion or carbon-coated metal grids. To increase the contrast of the

sections of Epon or Crystic-araldite inclusions, lead citrate staining was employed,

according to the procedure of Reynolds (1963).

+ Epon mixture (Luft, J., 1961), modified

Epon 812

DDSA

NMA

DMP-30

5.3 ml

2.0 ml

3.8 ml

2% V

+ + Crystic-araldite mixture (Weigl, D.R. and Kisielius, J.J., 1967)

Crystic 196

Araldite

Dibutyl phtalate

Benzoil peroxide

7.5 ml

2.5 ml

1% v/

0.05 ml

2 3

5 6

11 12 13 14 15

BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39, 1971.

Comparative stucly of the number and area of mitochondria in immature

erythrocytes.

The criterion adopted in the computation of sectioned cells or from hemoly-

sed smears, to determine the total mitochondrial area per early reticulocytes, and

erythroblasts, is based on the following facts: 1 — The reticulocyte loses gra-

dually the mitochondria as it develops into the mature erythrocyte; 2 — in an

immature erythrocyte population exist, therefore, besides erythroblasts, reticulo¬

cytes of any maturation phase, from that containing the highest number of mito¬

chondria to the end phase of evolution. In each preparation, only cells showing

the highest number of mitochondria have been considered, to verify whether the

early reticulocytes actually contain a higher number of those organelles than the

erythroblasts. The values obtained for mitochondrial areas in thin sections of

nucleated and non nucleated erythrocytes in relation to the respective frequencies

of the erythrocytes, considered in this work, were graphically represented.

Determination of the mitochondrial areas in sections or after hemolysis of

the smears.

The areas are estimated from the weight of the mitochondria, cut out from

the photographic paper used for the copies or enlargements of the negatives, with

relation to the médium paper weight per area unit. The total mitocondrial area

per erythrocyte was converted to yf-.

The preparations were examined and photographed with the Siemens ÜM

100 b and Elmiskop I electron microscopes of the Instituto Butantan. The magni-

fications were from x 1200 to x 20000; an acceleration potencial of 60 KV was

applied.

RESULTS

There are no morphological differences between erythroblasts, reticulocytes,

and erythrocytes of guinea-pigs, rabbits and hamsters, except for those guinea-pigs

with lead acetate intoxication, whose immature erythrocytes present mitochondria

much larger than the ones of normal animais.

Blood of hamster and rabbit embryos obtained from the umbilical cord, and

examined in Giemsa-stained smears, contains besides erythroblasts, 10 to 15%

of megaloblasts; no mitosis occurs in the blood of 18 to 19-days old rabbit embryos;

in the embryos of 16 days, only two mitoses could be observed.

In peripheric blood of lead poisoned guinea-pigs with an aproximately 50%

reticulocytosis, and a 5-6% erythroblastosis, only a few basophilic erythroblasts

were found.

Megaloblasts are easily distinguished from erythroblasts by their much larger

diameter, and by the small nucleus, generally Iocated at the center of the cells;

reticulocytes are readily distinguished by the electron dense reticulum at dif-

ferent stages, and by the absence of a nucleus (Figs. 1 and 2).

Erythroblasts

Hemolysed smears prepared in accordance with technique A, show erythro¬

blasts with a fine membrane, containing large electron dense filaments and gra-

2 3

5 6

10 11 12 13 14 15

BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39,

1971.

nules. The nucleus, larger than that of megaloblasts, are of irregular periphery

(Fig. 3), sometimes located at an excentrical position, probably during the

extrusion phase.

Erythroblasts, when hemolysed in suspension in distilled water without

partial drying, according to technique B, present granules and circular forms

within the folded membrane. Under those conditions of hemolysis, no filaments

nor rods have been observed. Their irregular nucleus may be found at the center

or at the peripherv of the stroma (Fig. 4). The same structures are also found

in the subsequent evolutive reticulocytary phase, where a more detailed analysia

has been done.

Ultrathin cell sections undergo less drastic treatment, and are integrally

analysed without any hemolytic procedure. Megaloblasts contain a more electron

dense cytoplasm as compared to erythroblasts, with several mitochondria, vesicles

and endoplasmic reticulum. The nucleus is small and heterogeneous (Fig. 5).

Only one mitotic figure was observed in hundreds of preparations of ultrathin

rabbit and hamster embryo sections. Fig. 6 shows a possibly basophilic erythroblast

in mitosis, corresponding to an intermediary phase between prophase and me-

taphase; the double nuclear membrane shows large gaps at several regions with

a mitochondrion at one of the extremities; the other organelles dispose themselves

close to the membranes. Chromosomes are less electron dense than cytoplasm, and

apparently individualized. The cell shows an irregular configuration, probably due

to protoplasmic movements, ocurring during mitosis.

The erythroblast in Fig. 7 is constituted by an electron dense cytoplasm,

compared to other types of cells, because at this stage it contains already synthe-

sized hemoglobin. Some sections show mitochondria of about 0.3 jx in diameter,

disposed near the agranular endoplasmic reticulum. This structure is sometimes

associated with the Golgi complex. In other cytoplasmic regions there is a fine,

dense granulation, identifyed as ferritin, enclosed in a membrane; these granu-

lations may agglomerate to form masses of about 0.03 to 0.1 situated between

double membranes of mitochondrial nature. The ferritin granules may also be

aligned, forming parallels as if corresponding to the mitochondrial lamellar

structure (Fig. 8). The nucleus (Fig. 7), generally less electron dense, presents

however, regions similar in density to the cytoplasm; it is limited by a double

membrane that shows small pores.

At the acidophilic maturation phase that precedes that of nuclear extrusion,

the cell shows an irregular configuration, and a homogeneously dense excentric

nucleus limited by a double membrane, generally without pores. Cytoplasmic con-

tractions and expansions are observed at a more advanced evolutive phase, giving

rise to several lobes, one of which contains the nucleus. At this stage of deve-

lopment the proximity of mitochondria is commonly noted near the nuclear mem¬

brane (Fig. 9).

Reticulocyte

Well-marked cytoplasmic contraction and expansion movements persist still

in the earlier reticulocyte after the extrusion of the erythroblast nucleus (Fig. 10).

This reticulocyte from lead poisoned guinea-pigs, shows mitochondria with dia-

SciELO

10 11 12 13 14 15

BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39, 1971.

meters of about 0.90 jx, corresponding on the average to three times the diame-

ter of mitochondria in normal animal reticulocytes; the internai membrane, as well

as the lamellas, are disrupted.

This anucleated, basophilic, and therefore immature erythrocyte presents the

same structures already described for erythroblasts, when hemolysed according to

the three techniques. Threre are differences, however, as to quantity, of large

filaments or circular forms, according to technique A or B, respectively. The

recently constituted reticulocytes present large filaments and rods in a higher

number and length (technique A) than the erythroblasts; also the number of

circular forms is higher in less evolved reticulocytes, in conformity to technique B

for hemolysis in suspension in distilled water, as will be seen later.

The large filaments may attain 10 ^ in length, or more, and show diameters

ranging from 0.20 to 0.30|j.; generally, they are continuous to an irregular region

of the same density. Their extremely variable dispositions present a radial, con-

voluted or undefined configuration (Fig. 11). There are diffusively distributed

granules, ranging from 0.10 to 0.15 p. in diameter, which may appear in a large

number, exceeding sometimes one hundred; these granules disintegrate through

treatment with ribonuclease under the above exposed conditions. In erythrocytes

slightly shadowcasted, thin filaments are clearly visible whose extremities maintain

contact with the border of the stroma, and apparently with the large filaments

too (Fig. 12).

Reticulocytes of lead poisoned animais show the same structures; the large

filaments, however, have diameters of about 0.75 p, (Fig. 13), corresponding, on

the average, to three times that observed in normal animais.

When reticulocytes are supravitally stained with Janus green B at dilutions

from lxl0 4 to 5x10 4 in physiologic saline, and hemolysed in partially dried

smears, according to technique A, they show large and irregular filamentous struc¬

tures of accentuated electron density; thin filaments and granules are not visible

at low dilutions (Fig. 14). At higher dilution of Janus green B, these immature

erythrocytes show clearly all the structures (Fig. 15). Through ultrathin sections,

reticulocytes stained with dye at dilutions of lxl0 4 , show well contrasted mito¬

chondria due to mercuric chloride and potassium iodide, that form a dense complex

with the dye within these organelles, close to the internai membranous structures,

thus reducing the intertrabecular space; this complex is also near the agglomeration

of granules from 100 to 150 A, and the enlarged endoplasmic reticulum (Fig.

16); the Controls show reticulocytes with the same structural aspects as unstained

cells, when submitted to the same treatment.

Reticulocytes from blood hemolysed in suspension in distilled water (technique

B) contain circular forms from 0.3 to 1.0 ^ as well as granules from 0.15 to

0.20 p, (Fig. 17). In these preparations, no large nor thin filaments were found.

When reticulocytes have been hemolysed in hypotonic NaCl and formalin

(technique C), they show forms similar to the circular ones, but not individua-

lized; granules are also present in these red cells (Fig. 18). Ultrathin sections

of these erythrocytes show that mitochondria became volumous, presenting sections

of about 0.08 | } ., as in Fig. 19; this initially filamentous mitochondrion shows

several constrictions, due to osmotic changes.

SciELO

10 11 12 13 14 15

BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inat. Butantcm, 35: 1-39, 1971.

The ultrathin sections of intact blood present reticulocytes of less electron

density than the mature erythrocyte. This fact is due to the lower hemoglobin

concentration in immature cells. A varying number of mitochondria is found in

transverse, obliqúe or longitudinal sections of rods and filamentous forms; sections

of greater diameters measure up to 0.35 p, in normal material. Transverse and

longitudinal sections from the agranular endoplasmic reticulum were observed. The

diameter of these canaliculated Systems are of about 0.07 p. (Fig. 20); this

reticulum is continuous to the plasmic membrane as in other kinds of cells,

existing however, temporarily in reticulocytes (Fig. 21); frequently a relation

of proximity to the mitochondria is observed (Figs. 7 and 20). Some cells show

membranous structures, constituting the dictyosomes and vesicles of the Golgi

complex as in Fig. 22; the distance between the membranes is of approximately

0.02 p..

Quantitative considerations on erythroblast and reíiculocyte structures.

Through hemolysis by technique A, structures of erythroblasts and reti¬

culocytes may be observed integrally, thus providing a more suitable way for

comparative studies on the quantity of these structural elements within these

cells. In cach preparation, only cells with a higher number of large filaments

were taken into account, considering that they diminish gradually during the

reticulocyte maturation phase. By using technique A for hemolysis of partially

dried smears, we observed that the quantity of large filaments with respect to

number and extension, is higher in reticulocytes than in erythroblasts. These struc¬

tures of erythroblasts with excentric nucleus may present areas of about 8.5 p, 2

(Fig. 23); in erythroblasts with the nucleus already in the extrusion phase, the

area of filaments and rods decreases considerably (Fig. 24), and a value of

3.6 p, 2 was found. The newly constituted reticulocytes show an increase of large

filaments, attaining twice the above values, taking into account only the areas

of erythroblasts still containing an excentric nucleus; the anucleated erythrocytes of

Figs. 25, 26, 27, and 28 show areas of 8.6, 12.7, 16.7, and 17.2 p. 2 , respectively.

These cells are still of an irregular shape due to protoplasmic movements that occur

during the extrusion of the nucleus at the late evolutive erythroblastic phase.

The immature erythrocytes, hemolysed in suspension in distilled water,

according to technique B, show also a higher number of circular forms in the

reticulocytes when compared with erythroblasts (Figs. 29 and 30).

By the ultrathin sectioning method a confrontation was performed based on

statistical values, whereas the presence of a higher or a smaller number of mito¬

chondria depends on the levei of the sections as well as on the evolutive erythro¬

cytary stage, since mature red blood cells are destitute of any structure. Hence,

in each preparation only erythroblasts and reticulocytes with a higher number

of mitochondria were considered.

Determinations were done in 138 erythroblasts and 191 reticulocytes, and

the percentual frequency of cells were listed in the Table; the mitochondrial area

per cell has been converted into p, 2 with interval of 0.1 p, 2 and represented in the

histogram of Fig 31.

í, | SciELO

BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodcnts. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39, 1971.

Erithroblasts -

- 138

Reticulocytes — 191

E B

Mitoch. área/cell (y_ 2 )

R C

10,1

0.0

0.1

0.5

24.6

0.1 -

0.2

2.1

23.9

0.2 -

0.3

1.6

14.5

0.3

0.4

6.7

13.0

0.4 -

0.5

9.4

5.1

0.5 -

0.6

10.1

3.6

0.6 -

0.7

7.9

2.9

0.7 -

0.8

8.9

2.9

0.8 -

0.9

11.0

0.9 -

1.0

12.1

1.0 -

1.1

5.2

1.1 -

1.2

4.7

1.2 -

1.3

4.2

1.3

1.4

2.6

1.4 -

1.5

3.2

1.5

1.6

3.6

1.6 -

1.7

1.6

1.7

1.8

0.5

1.8 -

1.9

0.5

1.9 -

2.0

0.5

2.0 -

2.1

1.0

2.1 -

2.2

1.0

2.2 -

2.3

—

2.3

2.4

—

2.4 -

2.5

■ —

2.5 -

2.6

—

2.6 -

2.7

0.5

2.7 -

2.8

—

2.8 -

2.9

0.5

TABLE

SciELO

10 11 12 13 14 15

BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem . Inst. Butantan, 35: 1-39, 1971.

Genesis and disappearance of mitochondria.

These aspects were only observed in a few reticulocytes. Several sections

show mitochondrial structures apparently in formation (Figs. 32 and 33). A

possible canalicular system, sectioned longitudinally, shows two parallel and con-

voluted membranes (Fig. 34), and it seems that the inner membrane of the

whole gives rise to a double lamella by invagination; the externai one may cons-

titute the limiting membrane of a newly formed mitochondrion. A relationship

between canalicules and partially formed mitochondria is well suggestive in Figs.

35 and 36. More complex inner structures of mitochondria, resulting from bifur-

cations or bilateral expansions of the double lamellas, were also observed.

Several aspects of mitochondrial structures, suggesting a gradual breakdown,

were also found in some reticulocytes (Figs. 37 and 38). Mitochondria lose the

externai limiting membrane, then the internai one; finally, only double lamellas,

or traces of them, are seen.

Erythrocyte.

This final stage of the evolutive erythrocytary process in characterized by

its structural simplicity at the cytological levei. Through the techniques A, B, or

C, for osmotic hemolysis, only the remnants of the folded plasmic membrane,

namely stroma, can be observed.

When red cells are fixed integrally by formalin in hypotonic saline, and

embedded as above described for ultrathin sectioning, their transversal sections

show biconcave forms of enlarged diameters due to osmotic changes, provoked

under these conditions; these sections show electron dense granules attached one

to another by thin, more or less long filaments. As a whole these elements give

an aspect of an irregular meshwork with the larger and more agglomerated granules

concentrated at the periphery (Figs. 39 and 40).

If erythrocytes fixed by formalin in hypotonic saline are suspended in an

aqueous ormic acid solution before dehydration, they present biconcave forms,

but now compact, and therefore with a high electron density and normal dimen-

sions, as if fixed by formalin or osmic acid in an isotonic médium. This is due to

a retraction of the inner components of the erythrocytes; the membrane, or

stroma, remains expanded and partially detached from the erythrocytary content.

Three dimensionally this membrane constitutes large sacs, enclosing the retracted

material (Figs. 41 and 42).

In some erythrocytes, partially hemolysed by disruption of the membrane

during manipulation previous to treatment with osmic acid, no such phenomenon

has been observed.

DISCUSSION

In this study, cytologically less heterogeneous material has been used, closely

related to other investigations on the isolation of a possible intrinsic maturation

factor in cells of the erythrocytary series. Peripheral blood of anemic animais or

í, | SciELO

BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39. 1971.

embroyonic blood is a more adequate material than bone marrow or erythropoietic

liver. Early embryonic blood is also favorable since leuco — and thrombocytopoie-

sis does not occur at this uterine growth stage. Lead poisoned animais present a

much longer maturation period in the erythrocytary series, according to Seno et

al. (1953), thus allowing the detection of all structures from active phases to

disappearance.

Structures observed ajter hemolysis.

The blood of embryos hemolysed in partially dried smears (tecnique A),

allows an observation of at least three elements, relatively preserved as a whole,

eommon to megaloblasts, erythroblasts and reticulocytes: granules that correspond

to the polyribosomes, large filaments or rods, and thin filaments well defined in

Figs. 2, 12, 13, and 15, constituting the agranular endoplasmic reticulum, better

examined in ultrathin sections. The large filaments are identified as mitochondria

in accordance with the following facts: 1 — they are stainable with ferric hema-

toxylin and acid fucsin for mitochondrial evidence by the methods of Regaud and

AJtmann, respectively; 2 — they decrease quantitatively as the reticulocyte de-

velops to a mature erythrocyte, the same ocuring with mitochondria; 3 — in

erythroblasts as well as in reticulocytes of lead poisoned animais, they increase in

diameter, on the average, about three times that of normal animais, comparing

Fig. 13 with others; the same enlargement is observed in mitochondria as seen

in Fig 10 in comparison with Fig. 20 of normal animal reticulocyte (Vallejo-Freire

and Brunner. 1958); 4 — they are morphologically comparable with the mito¬

chondria in fibroblasts from tissue culture médium examined as a whole (Porter,

1953); 5 — they increase in size when in contact with a hypotonic médium

(Brunner and Vallejo-Freire, 1956); the same occurs with mitochondria as

observed by Lewis and Lewis (1915), Zollinger (1948), and Vallejo-Freire and

Brunner (1958).

Partial drying of the smears preserves relatively the large filaments or mito¬

chondria without coagulation of the hemoglobin, now existent in the polychroma-

tiphilic erythroblasts, thus allowing hemolysis (technique A); when hemolysis is

performed in suspension in distilled water (tecnique B), the mitochondria in¬

crease in size up to disintegration, resulting circular forms (Figs. 4, 17, 29, and

30) as observed by Bernhard et al. (1949). Intermediary forms may be obtained

.vhen hemolysis is performed according to technique C, in a less hypotonic mé¬

dium containing formalin (Fig. 18). These structures can be observed in sections,

as in the reticulocyte shown in Fig. 19, whose inicially filamentous mitochondrion

increased in size, consequently giving rise to sectors limited through cons-

trictions. The disruption of these membranous septa gives origin to circular forms

constitutcd by the limiting mitochondrial membrane, traces of the inner mem-

brane and double lamellas.

Reticulocyte granules, ranging from 0.10 to 0.15 p., clearly visible in Figs.

11, 12, 17, and 18, did not change morphologically when hemolysed by any one

of the three techniques, A, B, or C. Each granule is morphologically similar to

the polyribosomes described by Warner et al. (1962) as tetra, penta, and hexa-

merous forms, from lysed reticulocytes, constituting the site of globin synthesis.

rhese granules disintegrate partially when treated with ribonuclease; remnants

2 3

5 6

10 11 12 13 14 15

BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mera. Inst. Butantan, 35: 1-39. 1971.

possibly represent the proteic part of the ribosomes. In reticulocytes stained with

Janus green B, these granulations precipitate with the dye, as will be shown

later.

Mitochondria and “Substantia granulo-filamentosa”

Our observations on reticulocytes treated with Janus green B agree with

those of Kosenow (1952) which refer to the concentrations of the dye used.

In reticulocytes treated with a lxlO 4 dilution, the struetures are detected with

some difficulty at optical microscopy. Figure 14 shows a reticulocyte supravitally

stained with this dilution, and hemolysed according to technique A, where only

13 single, long and pronounced electron dense strueture can be observed. In these

preparations the large filaments or mitochondria, the polyribosomic granules and

íhe thin filaments or endoplasmic reticulum, agglomerate with the dye. Reticulo¬

cytes treated with higher dilutions, e.g., 5x1o- 6 , show clearly all those struetures,

independent one of each other (Fig. 15). Ultrathin sections of the stained reti¬

culocytes show mitochondria of increased contrast after HgCl 2 and Kl fixation.

The membranes, mainly the double lamellas are thicker than in Controls, reducing

therefore the intertrabecular space (Fig. 16). Surrounding these mitochondria,

sections of the enlarged endoplasmic reticulum and agglomerated particles werc

íound, identified as ribosomes by their density and dimension.

Lazarow and Cooperstein (1953) suggest that the cytochomoxidase system

takes part in the staining of mitochondria with Janus green B; this enzymatic

system is probably responsible for the specificity of this staining. Rubinstein et

al. (1956) determined cytochromoxidase in the mitochondrial fraction of rabbit

reticulocytes.

Mitochondria are the predominant structural elements in immature erythro-

cytes; they may therefore be regarded as the essential component of the “Substan¬

tia granulo-filamentosa” in those cells stained with Janus green B, considering that

the dye fixes itself within the mitochondria, and that the resultant ribonucleoprotein

precipitate surrounds these organelles. Thus, a pre-existent strueture is indirectly

evidenced at the optical microscope. The concept of “Substantia granulo-fila¬

mentosa” is restricted merely to the mitochondria of unstained reticulocytes, only

hemolysed after partial drying of the smears.

Observations on some evolutive phases.

The embryonic, megaloblastic, or primordial erythroblastic series are distin-

guishable from the definitive or secondary erythroblastic series through their cells

of larger dimension, contain hemoglobin in higher concentration, even at the

nucleated phases (Fig. 5). In comparison with the definitive erythroblasts there is

an evolutive cytoplasmic anticipation in relation to the nucleus.

According to Jolly (1923) the definitive erythroblasts arise in 14-day rabbit

embryos. In spite of a low mitosis frequency, and the reduced examination field

at the electron microscope, a possible basophilic erythroblast has been detected,

showing a mitotic figure at an intermediary phase between prophase and metaphase.

In this latter stage, the nuclear membrane disappears, and the individualized

chromosomes arrange themselves at the equatorial region of the cell. Fig. 6 shows

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BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst . Butantan, 35: 1-39. 1971.

a nuclear membrane with long interruptions, and at one point, one mitochondrion

arrange itself dose to one of the extremities of this membrane. The well defined

chromosomes, as a morphological entity, are less electron dense than cytoplasm,

and apparently will dispose themselves at the equatorial region of the erythroblast.

These dislocations are accompanied by cytoplasmic movements which confer to

the cell an irregular configuration.

The erythroblast in Fig. 7, more frequently observed in the preparations,

may be considered as polychromatophilic due to its relative dense cytoplasm,

containing now synthesized hemoglobin. Some of the mitochondria arrange

themselves close to the endoplasmic reticulum whose function probably consists

in conducting material between those organelles and blood plasma. Fig. 21 shows

a reticulocyte whose plasmic membrane is continuous with the endoplasmic reti-

culum, constituting a pore of about 180 A. These pores exist only temporarily

and disappear during maturation.

In some hypochromic anemias, morphological aspects of hemoglobin biosyn-

thesis is easier to be detected because of the slowness or interruption of the pro-

cess in which iron, originating from the reticular cells, participates in the for-

mation of the heme prostetic group. Using this material, Bessis and Breton-Gorius

(1957) detected part of the iron cycle through electron microscopy, from its in-

corporation into the erythroblast, as ferritin, its allocation in mitochondria at the

intertrabecular space, to finally, its dispersion in the cytoplasm in form of fine

grains, by disruption of the mitochondrial membranes. Rimington (1957) attained

from a suspension of liver cell mitochondria, some stages of hemoglobin biosyn-

thesis. In normal, immature red cells, these enzymatic reactions are rapid; it is,

therefore, difficult to detect some of these aspects at the electron microscope. Fig.

8 shows a fine ferritin granulation disposed between membranes of mitochondrial

nature. The mitochondria decrease quantitatively up to the acidophilic stage of

erythroblasts, as observed by Sorensen (1960) and confirmed by our observations.

However, these organelles increase in number in the less evolutive phase of

reticulocytes, as shown by comparative examinations.

The nucleus of erythroblasts (Fig. 7) is heterogenously electron dense,

presenting regions of the same density as the cytoplasm. This material is often

continuous to the cytoplasm through pores of the double nuclear membrane, a

fact also verified by Grasso et al. (1962), and Skutelsky and Danon (1967) in

mouse erythroblasts. Simpson and Kling (1967) reported the same fact for dog

erythroblasts, and suggested the presence of hemoglobin in the nucleus. The same

observation was also described in amphibian erythroblasts, where the nuclear

hemoglobin arranges itself in a paracrystalline form, an arrangement not suggested

for cytoplasmic hemoglobin (Fawcet and Witebsky, 1964). Through cytochemical

reactions and absorption determinations at a wave length of 4047 A in human

and rat erythrocytes, Carvalho (1953) suggested the presence of the heme group

in the nucleus. Davies carne to the same conclusion through measurements with

the same wave length and by electron microscopy of bird and amphibian erythro¬

blasts.

A few hamster erythroblasts showed a less electron dense material extruded

from the nucleus into the cytoplasm. According to Simpson and Kling (1967) this

Feulgen positive material could be the result of a karyolytic process, giving rise

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BRUNNER JR. f A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan , 35: 1-39, 1971.

to Jolly bodies. Summarizing, there exist in the nucleocytoplasmic relationship of

erythroblasts, intranuclear regions of the same electron density as in cytoplasm,

which absorb wave lengths of 4047 A, corresponding, therefore, to the heme

group, and sometimes less electron dense cytoplasmic regions, deriving from the

nucleus and containing desoxiribonucleic acid.

At the beginning of the extrusion process the erythroblast shows active

contraction and expansion movements, and the nucleus disposes itself excentrically

up to its location within a cytoplasmic lobe (Fig. 9). These movements have been

studied through microcinematography by Comandon and Jolly (1923), and by

Bessis and Bricka (1952). Observations of this phenomenon are relatively

frequent in blood smears, stained by usual methods, of embryos, or of animais

with erythroblastosis (Albrecht, 1951; Brunner, 1968). The here observed

agglomeration of some mitochondria in close proximity to the nuclear membrane,

is not to be seen in the preceding phases. These aspects were also observed by

Sorenson (1960), Grasso et al. (1962), Skutelsby and Danon (1967), Orlic et

al. (1965). Simpson and Kling (1967) suggest that these mitochondria provide

the energy necessary for extrusion; they also may be related to the constituíion

of a new membrane which is required at the site of the nuclear extrusion,

according to Skutelsky and Danon (1967). The nuclear membrane pores

disappear, and the nucleus becomes homogeneously electron dense. However,

some authors, as Skutelsky and Danon 1967) described a heterogeneous nucleus,

apparently liberated.

The nuclear extrusion process lasts for at least ten minutes, from inicial

contractions to definite elimination, under examination conditions (Bessis and

Bricka, 1952).

With exception of our findings and the ones of Zamboni (1965), the

supposedly liberated nucleus seems to be surrounded by a thin cytoplasmic

layer, containing one or more mitochondria (Grasso et al., 1962; Orlic et al.,

1965; Simpson and Kling, 1967; Skutelsky and Danon, 1967, and Weiss,

1965). Details correlaíed with this phenomenon might be elucidated by serial

sectioning of those erythroblasts or by an examination of a suspension of nuclei

now liberated, and without cells. Depending on the levei of sectioning, the nucleus

may appear as already liberated; it must be considered that the erythroblasts

present at this stage a well pronounced irregular configuration. It is quite possible

that the few nuclei devoid of any cytoplasmic layer, observed by us and by

Zamboni (1965) are the result of an artefact. Further investigations of numerous

and totally isolated nuclei, may supply more detailed information.

The active movements still persist in the reticulocytes, as shown in Fig. 10.

After this new evolutive stage the cell resumes its normal configuration which may

be spherical or ovid, as shown in Fig. 20. At these evolutive stages the mitochon¬

dria increase in number and length, and assume considerably long, filamentous

forms. At no time, erythroblasts show long structures similar to those observed

during the reticulocytary phase.

By hemolysis method, technique A, and through comparative analysis, it can

be verified that the number of mitochondria is higher in reticulocytes than in

erythroblasts (Figs. 23-28). In this way however, mitochondria, disposed under

or over the nucleus, are not detected, an error partially eliminated through the

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BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39, 1971.

replica method that shows that rarely erythroblast mitochondria are found over

the nucleus. On the other hand, the majority of erythroblasts, used for such com-

parisons, presented a nucleus practically eliminated, a condition under which all

organelles may be observed.

Tecnique B for hemolysis in suspension in distilled water, has also been

used to compare the number of circular forms, resulting from the disintegration of

mitochondria of those nucleated and anucleated cells. The results are the same

(Figs. 29, 30).

The less developed reticulocytes (Figs. 28 and 30) present accentuated high

amount of filamentous or circular forms, compared to the more evoluted and

more frequent cells. This aggrees with the statistical values obtained with the

ultrathin sectioning method. Reticulocytes, presenting mitochondria during the

formation and growth process, are less frequent too, as will be shown below.

Both observations suggest that the increase as well as the decrease of mitochondria

is a relatively rapid process within the anucleated cells, thus reducing the proba-

bility of a frequent detection of these aspects.

Through ultrathin sections of erythroblasts and reticulocytes, values on

mitochondrial areas per cell, were obtained and distributed, according to the

histogram in Fig 31. This histogram shows a different distribution of classes

among the two kinds of evolutive cells, which is in aggreement with the observa¬

tions aforementioned, about those cells examined by the hemolysis method. The

comparative histogram, conceming mitochondrial area, is more significam,

although comparisons with respect to the number of these organelles per cell

show also differences. A mitochondrion may be sectioned at variables planes,

depending on its disposition within the cell, resulting either a diminute or a very

large area.

Figure 31 shows high erythroblast frequencies, corresponding to small

mitochondrial areas of about 0.30 p> 2 ; the frequencies decrease at about

0.90 y. 2 , the highest value obtained. The inverse occurs in reticulocytes, up to

0.95 fj. 2 , although the larger areas of about 2.85 p- 2 correspond to low fre¬

quencies.

The increase of mitochondrial struetures in reticulocytes evidently results

from the formation of new organelles, or the growth of the pre-existent ones; it

is quite possible that both phenomena are involved (Figs. 32-36). There are

no data on the origin of mitochondria from canalicules as suggested for reticulo¬

cytes. Floffman and Grigg (1958) reported the formation of mitochondria in

onion root tip cells, rat thymus, and mouse lymph nodules, frequently ocurring

during mitosis, what accounts for their similarity. The relationship between nuclei

and mitochondria in those cells is the same; it has been verified that the externai

nuclear membrane is continuous to the mitochondrial membrane, suggesting that

mitochondria are originating from it. The same relationship has been observed by

Brandt and Pappas (1959) in the ameba Pelomyxa carolinensis, frequently

in nuclear evagination. In other cases, the increase of mitochondrial number is

due to the division of pre-existent organelles, as in rabbit oocytes (Blanchette.

1961). An important fact is Steinert’s observation (1961) on the rhytydia phase

of Tripanosoma mega from “in vitro” cultures, where the mitochondrion is derived

from the Feulgen positive kinetoplast. After the completion of its development.

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BRUNNER JR. A. _ Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan , 35: 1-39, 1971.

the mitochondrion is liberated, individualizing itself. This could be related to the

findings of Chèvremont (1963) in fiblroblasts, whose mitochondria contain DNA,

detected by Feulgen reaction. Further studies have shown that an incorporation

of 3 H-thymidine occurs in those cells. These not yet generalized facts could

explain the cytogenetical phenomena related to mitochondria.

The mechanism of hemoglobin biosynthesis in reticulocytes is not yet clear,

due to the lability of the messenger RNA, only synthesized in the presence of

DNA, according to the hypothesis on nucleocytoplasmic genetic relations of

Jacob and Monod (1961). No DNA has been yet detected in reticulocytes. Some

authors, however, as Nathans et al. (1962) suppose, that in such case. the

messenger RNA would be well stable and synthesized at the nucleated phase.

They noted that the incorporation of aminoacids is higher than the degradation

of RNA, as determined by liberated 32 P measurements. Burny (1962) concluded

that there exists RNA synthesis in reticulocytes, because 32 P was incorporated

and distributed to the messenger and transfer RNA. On the other hand, Seno et

al. (1963) verified that an incorporation of labeled uridine did not occur in

these erythrocytes, concluding therefore, that any kind of RNA may be synthesi¬

zed. Pinheiro et al. (1963) reported identical results, demonstrating that also

labeled citydine and adenin are not incorporated at this erythrocytary phase.

The increase of mitochondrial structurcs at the reticulocytary phase coincides

with higher capacity for hemoglobin synthesis at this evolutive phase, according

to the microspectrophotometric determinations of Seno (1958). This aggress also

with the cqual or higher degree of 59 Fc incorporation by those erythrocytes in

relation to erythroblasts, as observed by autoradiographic determinations in hu-

man bone marrow cultures (Lajtha and Suit, 1955; Suit et al., 1957). In rabbit

bone marrow, the degree of 59 Fe incorporation is the same in both evolutive

phases, but it increases highly in reticulocytes of the peripheral blood (Suit et al.,

1957). Evidently these three facts are correlated with hemoglobin biosynthesis,

considering that mitochondria take an important part in the biochemistry of these

immature erythrocytes.

Reticulocytes of normal animais, intoxicated guinea-pigs, and embryos, show

a membrane system, consisting of vesicles and dictyosomes (Fig. 22). This

structural set composes the Golgi complex, as in other kinds of cells. The obser-

vation that the region which involves the contractile vacuoles of some protozoans,

reduces the osmic acid, as occurs in the vertebrate Golgi complex, leads Nassonov

(1924) to suggest the existence of a homology between these two structures.

This hypothesis has been confirmed by Gatenby et al. (1955) through electron

microscopic examination of protozoans and spongeans. This apparent homology

involves the Golgi complex, as a control system for the osmotic equilibrium in

cells, although other functions were atributed to this structure. It is possible that

in reticulocytes this structure is involved in the loss of sodium, potassium, calcium,

and phosphorus, whose concentrations are higher than the ones in mature red

blood cells, according to Kay (1930), Rappaport et al. (1944), and Kruszynski

(1955). Consequently, the elimination of water which is 5% higher in reticulo¬

cytes (Gaffney, 1957; Lowenstein, 1959) occurs too.

Reticulated, concentric or convoluted lamellar structures were described in

basophilic myelocytes (Pease, 1956), epithelial cells from convoluted proximal

mouse kidney tube (Clark, 1957), 1-60 cells (Dales and Siminovitch, 1961),

cm 1

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BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39, 1971.

and in epithelial cells frora salamander branch (Schulz and de Paola, 1961). The

function of these structures is unknown, just as the one rarcly observed in reticulo-

cytes from lead poisoned animais (Brunner and Vallejo-Freire, 1964). Similar

structures were also found in smooth human megacolon fibers, and less frequen-

tly in the normal colon (Kiss, 1968). Jones (1966) reported an intramitochon-

drial formed lammellar structure, in early erythroblasts from fetal rats, arising

from degenerated mitochondria, and followed by its extrusion from the cell,

suggesting that this might be a normal secretory lipoprotein process.

All these structures, above described, disappear gradually as occurs with

mitochondria. The externai membrane is the first to disappear, followed by the

internai one, and finally the double lamellas, clearly to be seen in Figs. 37 and

38. These less frequent reticulocytes from lead poisoned guinea-pigs does not

present any mitochondria of increased volume nor disrupted lamellas, morpholo-

gically characterizing those immature erythrocytes (Fig. 10). The reticulocytes

in Figs. 37 and 38 present a cytoplasm of low electron density due to its low

hemoglobin content, and its mitochondria present themselves in degeneration, their

function having ceased by now. According to Rouiller (1960) the degenerated

mitochondrial forms vary in aspect, showing a disrupted or a single integral mem¬

brane. In the malignant melanoma of the ciliary body, similar aspects were found

(Toledo, in press). Jones (1966) showed degenerated mitochondria of early

erythroblasts, with the same forms as shown in reticulocytes.

The final stage of the evolutive erythrocytary process is characterized by

distinctly shaped red blood cells. The obtained results confirm indirectly the exis-

tence of a structure at the molecular levei. Its hemoglobin content (Bessis, 1961)

attains about 33 per cent, e.g., in human blood cells.

Several authors suspect that there might exist a certain order in the interior

of red blood cells. Dervichian et al. (1947), through X-ray diffraction of horse

erythrocytes, came to the conclusion that there is a paracrystalline arrangement

of hemoglobin molecules. Perutz (1948) suggests that the inner components of

erythrocytes do not arrange themselves at random, in view of the molecular weight

of hemoglobin and the red cell volume. Hitherto, it has also been shown that

hemoglobin can crystallize in the red cells of some animais under certain conditions

(Ponder, 1945). Pauling et al. (1949), in aggreement with the conclusions of

othcr investigators, ascribe falciform anemias to a molecular intraerythrocytary di-

sease. However, it seems that physicochemical surface phenomena, due to several

factors in the blood plasma, are responsible for the shape of erythrocytes, as

shown by Furchgott and Ponder (1940), Ponder (1948) and Bessis and Bricka

(1950). Spherical or sea urchin forms were restored to their discoidal form by

treatment of washed red cells, with normal plasma, albumin, glucose, and other

substances; this was even observed in ghosts or stromas, void of hemoglobin.

Besides these facts it is also known that the pcripheral region of erythrocytes is

more dense than the more internai one (Bessis and Bricka, 1950), where hemo¬

globin exists as a solution of high concentration. The periphery is constituted of

iipoproteins and glucosides with only a small amount of hemoglobin (Ponder,

1948). Thus, the ultra-structure cannot be regarded merely as a sac, containing

hemoglobin, or as a spongework in which hemoglobin is contained. The experi¬

mental results support the hypothesis that the structure seems to be something

between these two alternatives (Bessis, 1961).

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BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan t 35: 1-39, 1971.

Guinea-pig erythrocytes, fixed by formalin in hypotonic saline, present

an increased volume, maintaining however its discoidal-biconcave form (Figs. 39

and 40). These red cells show a peripheral electron dense region, limited by a

very thin film, and a less dense internai region. The sections show an irregular

meshwork, constituted by granules, larger and more agglomerated at the periphery

than the ones from the central region; very thin filaments, long or short, link the

granules to each other. When those erythrocytes are suspended in an aqueous

osmic acid solution, after “fixation” with formalin, they resume their normal

dimensions through retraction of their content, which becomes compact and highly

electron dense, their membrane remaining stretched (Figs. 41 and 42). This

aggrees with the observations of Dervichian et al. (1947), that the membrane

might be independent of the inner erythrocytary structure. If erythrocytes were

partially hemolysed through disrupture of the membrane, this retraction, pro-

voked by osmic acid, did not occur, what might be explained by the partial loss

of their content.

These observations aggree also with the aforemenitioned experimental results,

suggesting that, at least in part, besides externai factors, also an internai mole¬

cular arrangement would be responsible for the shape of red blood cells.

CONCLUSIONS

1 ■ Megaloblasts, erythroblasts, and reticulocytes hemolized in partially dried

blood smears, and integrally examined, present large filaments and rods identi-

fied as mitochondria, and thin filaments, corresponding to the endoplasmic reti-

culum and polyribosomic granules, diffusively distributed.

2. When hemolysis is performed in suspension in distilled water, without par¬

dal drying, the filamentous mitochondria disintegrate, giving rise to circular

forms. Intermediary structures between the filamentous and circular forms are

observed when hemolysis is interrupted.

3. Erythroblasts and reticulocytes, supravitally stained with Janus green B

show an agglomeration of endoplasmic reticulum, and a dye-polyribosomic preci-

pitate, surrounding the mitochondria. As a whole, this constitutes the so-called

■‘Substantia granulo-filamentosa”. This concept is restricted to the filamentous or

rodlike mitochondria of those unstained cells, only hemolysed in partially dried

smears.

4. The nucleus of erythroblasts shows equal electron dense regions as cyto-

plasm, continuous with the latter through the pores of the nuclear membrane.

This fact and the specific absorption determinations at wave length of 4047 A

(Carvalho, 1953; Davies, 1961), or 4060 À (Seno, 1958), suggest the presence

of hemoglobin or of the heme-group within the nucleus.

5. The nucleus of erythroblasts is eliminated by extrusion, a process not yet

completely elucidated. Aspects which may suggest a karyolysis or karyorrexis

process, were rarely observed.

6. The number of mitochondria in the less evoluted reticulocytary stage is

higher than in the nucleated phase. This coincides with the higher isotopic iron

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BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39, 1971.

uptake (Laitha and Suit, 1955; Suit et al., 1957), and with the higher activity

of hemoglobin biosynthesis in reticulocytes in relation to erythroblasts (Seno,

1958).

7. The increase in mitochondrial number in early reticulocytes is due to the

formation of new organelles, arising from canalicules. This increase might also

lesult through growth of the already existent mitochondria.

8. Erythroblasts and reticulocytes show an endoplasmic reticulum close to

the mitochondria, and continuous to the plasmic membrane, constituting pores at

the cell surface. The function of this canalicular system is supposed to conduct

material between the inner structures, mainly the mitochondria, and blood plasma.

9. The Golgi complex observed in reticulocytes is identical with that of other

kinds of cells. It is quite possible that its function is related to the salt-water equi-

librium between cells and blood plasma.

10. All these structures disappear gradually as the concentration of hemo¬

globin increases. Mitochondria disappear through sucessive loss of the externai

membrane, followed by the internai one, and finally by the double lamellas.

11. The mature erythrocyte has probably an internai structure at the mole¬

cular levei, independent of the stroma or the limiting membrane. This molecular

arrangement would be, in part, responsible for the discoidal and biconcave form of

the erythrocyte.

RESUMO: A série eritrocitária do

sangue periférico de embriões de coe¬

lho e hamster foi submetida a estudos

ao nível ultraestrutural pelos métodos

de hemólise, segundo três técnicas, e

através de cortes ultrafinos. Pelo mé¬

todo de hemólise em esfregaço foi

constatada a presença de mitocôndrios

filamentosos ou em bastonete, que se

desintegram em formas membranosas

circulares quando a hemólise se pro¬

cessa em suspensão em água destilada.

Após a extrusão nuclear, geralmente

ocorrente no eritroblasto ortocromá-

tico, acompanhada de movimentos ci-

toplasmáticos ativos de contrações e

expansões, foi constatado um aumento

da quantidade de mitocôndrios, fato

coincidente com a maior intensidade

de síntese de hemoglobina, segundo

verificações de outros autores.

Além dos organelos participantes na

síntese hemoglobínica, como mitocôn¬

drios e poliribosomos, foi observada

ainda a presença do complexo de

Golgi, provàvelmente com função no

equilíbrio da água e sais no reticuló-

cito, no decorrer da maturação. Foi

constatada a presença de vesículas e

de retículo endoplasmático liso.

A maturação final do eritrócito ca-

racteriza-se pelo aumento crescente na

concentração em hemoglobina com o

desaparecimento gradual de tôdas as

estruturas citoplasmáticas e a aquisi¬

ção da forma discoidal bicôncava ca¬

racterística, constituída apenas por

uma estrutura ordenada, paracristali-

na, ao nível molecular.

UNITERMOS: Maturação eritroci¬

tária.

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BRUNNER JR. f A. — Erylhrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan , 35: 1-39, 1971.

A CKNO WLEDGEMENTS.

The author is indebted to Prof. Dr. Paulo Sawaya, Director of the Departa¬

mento de Fisiologia Geral e Animal at the Universidade de São Paulo, for his

helpful orientation during the course of this work.

To the sucessive Directors of the Instituto Butantan, Dr. Aristides Vallejo-

Freire, Prof. Dr. Lucio Penna de Carvalho Lima, and Dr. Jandyra Planet do Ama¬

ral for material support, and for facilities and conditions provided during the

realization of this work.

To Prof. Ary J. Dias Mendes and Prof. Clóvis de Araújo Peres, from the

Departamento de Estatística of the Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras at

the Universidade de São Paulo, for their help in statistical analysis.

To Mrs. Sibylle Heller for translation and editorial aid.

To Mr. José Antônio de Toledo Bilotta for his extensive tecnical work; Miss

Alice Henrique Pedreira, Mr. Eduardo Navas Neto, and Mr. Roberto Navas for

typewriting.

To Mr. Taufic Aued, and Mr. Antônio Seixas Neto for the execution of the

electromicrographs.

Dedication : To my parents, Olga Brunner and Adolpho Brunner. To my wife,

Margarida and my daugthers Olga and Luiza.

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BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39, 1971.

Hcmolysed embryo blood.

Figs. 1 and 2. —* Mb — megaloblasts ; Eb — erythroblasts; Rc — reticulocytes. Tcchnique A.

Fig. 3 — Erythroblast. N — nucleus; / — large filaments. Technique A.

Fig. 4 — Erythroblast. N — nucleus; arrows — circular forms M Technique B.

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BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39. 1971.

Embryo blood. Thin sections stained with lead acetate. Epon 812.

Fig. 5 — ■ Megaloblast. N — nucleus; m — mitochondria; re — endoplasmic reticulum:

Fig. 6 —■ Mitotic erythroblasts, c — chromosomes; mn —■ nuclear membrane; m — mitochondria; re -

endoplasmic reticulum; mp — plasmic membrane.

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BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39, 1971.

mp>

Embryo blood. Thm sections stained with lead acetate

Fig. 7 — Polychromatophilic erythroblast. N — nucleus; p — pores; mn — nuclear membrane; m —

mitochondria; re — endoplasmic reticulum; mp — plasmic membrane. Epon 812.

Fig. 8

Erythroblast. fe — ferritin grains; me — mitochondnal membrane; fe — elcctron dense

agglomerated grains. Crystic-araldite.

SciELO

BRUNNER JR.. A.

Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39, 1971.

Blood of lead poisoned guinea-pigs. Methyl-butyl methacrylate.

Fig. 9 — Acidophilic erythroblast. N — nucleus; m — mitochondria; mp — plasmic membrane.

Fig. 10 — Early reticulocyte. m — mitochondria; re — endoplasmic reticulum; mp — plasmic

membrane.

BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan t 35: 1-39. 1971.

Hemolyscd reticulocytes of guinea-pig blood (Technique A).

Fig. 11 — Bleeding anemia. / — large filaments; g — polynbosomes; e — stroma.

Fig. 12 — Bleeding anemia. / — large filaments; g — polyribosomes; arrows —* thin filaments.

Fig. 13 — Lead poisoning anemia. / — large filaments; g — polyribosomes; arrows — thin filaments.

SciELO

BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39, 1971.

Bleeding anemia. Reticulocytes supravitally stained with Janus green B.

Fig. 14 — Dye at 1x10 4 . Sgf — "Substantia granulo-filamentosa”. Technique A.

Fig. 15 — Dye at 5x10* 6 . f — large filaments; arrows — thin filaments. Technique A.

Fig. 16 — Thin section. Dye at 1x10 „ m — mitochondria; tr — double lamellas; re — endo-

plasmic reticulum; p — polyribosomes; e — stroma. Methyl-butyl methacrylates.

BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mcm. Inst. Butantan, 35: 1-39. 1971.

Fig. 17 — Hemolysis (technique B). Awows — circular forms; g — polynbosomes.

Fig 18 — Hemolysis (technique C). .Arrows — not individualized circular forms; g — polyribosomes.

Fig. 19 — Thin section. e — constrictions; mm — mitochondrial membranes; mp — plasmic mem-

brane. Methyl-butyl mcthacrylates.

SciELO

Bleeding anemia. Reticulocytes.

BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39. 1971.

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i U.y)M 0-4

Thin sections of reticulocytes. mp — plasmic membrane; re — endoplasmic reticulum;

m — mitochondria.

Fig. 20 — Embryo blood. Epon 812; lead acetate.

Fig. 21 — ,Lead poisoned guinea-pig blood. Methyl-butyl methacrylates.

Fig. 22 — Embryo blood. d — dictyosome; v — vesicles. Epon 812; lead acetate.

SciELO

BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst . Butantan, 35: 1-39, 1971.

Fig

Hemolysed embryo blood smears (technique A). N — nucleus; / — large filaments (mito-

chondria); arrows — thin filaments (endoplasmic reticulum); g — polyribosomic granules.

— Erythroblast. Mitochondrial area (f) — 8.5 ^2.

— Erythroblast. / — 3.6 ^2 #

— Reticulocyte. / — 8.6 2 .

— Reticulocyte. / — 12.7 2.

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BRUNNER JR. ( A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39, 1971.

Hemolysed embryo blood smears (technique A). Arrows — thin filaments (endoplasmic

reticulum); g — polyribosomic granules; / — large filaments (mitochondria).

Fig. 27 — Reticulocyte. / — 16.7 ^2.

Fig. 28 — Reticulocyte. / — 17.2 2.

Hemolysed embryo blood (technique B). Arrows — circular forms (disintegrated mito¬

chondria).

Fig. 29 — Erythroblasts. N — nucleus.

Fig. 30 — Reticulocyte.

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SciELO

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BRUNNER JR., A.

Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39, 1971.

Erythroblasts

Reticulocytes

O n n n PI !!

SciELO

— Frequency distribution histogram presenting mitochondrial areas ^ ^2 ^ f cell — abscissa —

of sectioned erythroblasts and reticulocytes with intervals of 0.1 2. Ordinate: % of cells.

— Mitochondriogenesis in a reticulocyte. m^ — mitochondria formation; m — mitochondrion ;

re — endoplasmic reticulum; V — vesicles; arrows — canalicules. Epon 812; lead acetate.

Fig. 32

Fig 31

BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39, 1971.

Mitochondriogenesis in reticulocytes. Epon 812; lead acetate.

Fig. 33 — 1 — double lamellas; V — vesicles.

mitochondria formation; m — mitochondrion ; re — endoplasmic reticulum

mitochondrion .

mitochondrion with a mem-

branous expansion (e).

Fig. 34 — w 1 and m,

Fig. 35 — m 1 — mitochondrion formation; ai^rows — canalicules; m

Fig. 36 — — mitochondrion formation; arrows — canalicules; m

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BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39, 1971.

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Figs. 37 and 38 — Reticulocytes of lead poisoned guinea-pigs, presenting degenerative mitochondrial

forms (m , m,,, m 3 ); m 4 — mitochondrion with digitiform membrane system; fe —

ferritin granules; re — endoplasmic reticulum. Methyl-butyl methacrylates.

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6 SciELO 10 11 12 13 14 15

BRUNNER JR., A. — Erythrocytary Maturation in Rodents. Mem. Inst. Butantan, 35: 1-39, 1971.

Mature erythrocytes of normal gumea-pigs, fixed with formalin in hypotonic NaCl

solution. Embedding in methyl-butyl methacrylales.

Figs. 39 and 40 — Erythrocytes stained by phosphotungstic acid.

Fig. 41 and 42 — Erythrocytes treated by aqueous osmic acid solution after "fixation" with formalin

in a hypotonic médium; e — envelope or membrane.

SciELO

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Recebido para publicação em 1018/71

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Mem. Inst. Butantan

35: 41-53, 1971.

ACHADOS ANÁTOMO-PATOLÓGICOS EM NECROSCOPIA DE

PACIENTE FALECIDO POR ENVENENAMENTO ELAPÍDICO

JESUS CARLOS MACHADO * * e GASTAO ROSENFELD **

(Laboratórios de Anatomia Patológica e Fisiopatologia do Instituto Butantan).

RESUMO: Os Autores apresentam

um caso de envenenamento elapídico,

assinalando que a raridade de tal ma¬

terial justifica sua publicação. Anali¬

sam os dados clínicos e os achados

de necrópsia com estudo histopato-

lógico. Discutem o problema do acha¬

do de cilindros de hemoglobina nos

rins, apesar do veneno elapídico não

ser considerado hemolítico, nefrotó-

xico ou proteolítico. Acreditam que

a morte do paciente deveu-se à insu¬

ficiência cardíaca que se instalou após

o acidente. O paciente era portador

de hipertensão essencial com insufi¬

ciência cardíaca crônica, fator êsse

que no entender dos AA. justifica a

“Causa Mortis” apesar dela ter ocor¬

rido horas após o acidente, possibili¬

tando a hipótese de ter sido provo¬

cada associadamente com a ação do

veneno.

UNITERMOS: Envenenamento elapi-

dico; Nefrose hemoglobinúrica.

INTRODUÇÃO

Os acidentes provocados por animais peçonhentos não são raros na medicina

clínica. Já os relatos de necroscopias humanas por diversas razões que aqui escapam

à análise mais objetiva, não são numerosas na literatura especializada (ver ta¬

bela 1).

Algumas espécies de serpentes, como p.e. as Crotálicas e as Botrópicas por

apresentarem distribuição mais vantajosa na natureza, aliado a outros fatores,

provocam maior número de acidentes. As (corais) elapídicas, por seu pequeno

porte, sua menor agressividade, por possuir pele mais vistosa, facilitando sua

identificação e por apresentar aparelho bucal de menores proporções, determinam

somente cêrca de 2,5% do total de acidentes ofídicos segundo Mc Collough e

Genaro (7) e 0,29% no Instituto Butantan, segundo G. Rosenfeld (8). Dêstes

acidentados pelas corais, o êxito letal ocorre em cêrca de 15 a 20%. Esses fatos

Realizado com o auxílio do Fundo de Pesquisas do Instituto Butantan.

* Diretor de Divisão de Patologia.

** Ex-Chefe do Serviço de Fisiopatologia do Instituto Butantan. Chefe de Pesquisas do C.N.Pq.

Endereço para correspondência

C.P. 65, São Paulo, Brasil.

SciELO

10 11 12 13 14 15

MACHADO, J. C. e ROSENFELD, G. — Achados anátomo-patológicos em necroscopia dc paciente

falecido por envenenamento elapídico. Mem. Inst. Butantan, 35: 41-53, 1971.

por si só demonstram a extrema dificuldade em se obter material para estudo das

lesões que o veneno dessas serpentes provoca no homem. O veneno elapídico é

obtido em quantidades mínimas, dificultando também estudos experimentais, pela

avidez com que se o procura para produzir o anti-sôro correspondente.

Na literatura, segundo Amorim e Mello (1952), encontramos relatos de

necroscopias humanas e estudos experimentais produzidos por envenenamento

botrópico com Bates (1925); Mallory (1926); Roltes (1937); Mac Clure

(1935); Pena de Azevedo e Teixeira (1938); Amorim e Franco de Mello

(1952); e envenenamento crotálico com Mitchell (1860); Reichert (1886);

Pearce (1909); Taube e Essex (1937); Fidler, Geangow e Carmichael (1940).

Já, dados referentes a necroscopias humanas condicionadas por envenenamento

elapídico com estudo histopatológico não encontramos referência Há um caso pu¬

blicado por Vital Brazil e Vital Brazil F.° (10) com estudo necroscópico mas sem

laudo histopatológico. Daí acharmos justificativa para a publicação de necroscopia

com estudo histopatológico que realizamos em paciente acidentado por serpente

coral e falecido em decorrência do mesmo.

MATERIAL E MÉTODOS

Caso 11.573 (1-10-1962)

O paciente (P.M.) de 50 anos, sexo masculino, côr branca, acidentou-se

no litoral paulista sendo picado por uma serpente coral, provavelmente Micrurus

coralinus. Imediatamente, dado o agravamento do quadro clínico, seus familiares

rumaram para o Instituto Butantan, trazendo-o para tratamento. Mas, no cami¬

nho, o paciente faleceu, seis horas e trinta minutos após o acidente. Realizamos

a necroscopia, algumas horas após, tendo sido observado o que se segue:

RELATÓRIO MACROSCÓPICO DA NECROSCOPIA (S-B-911): Rea-

lidade da morte : esta verificou-se pelos sinais tanatológicos clássicos: rigidez ca¬

davérica, resfriamento do corpo, opacificação da córnea, depressibilidade dos

globos oculares e ausência de fenômenos vitais de respiração e circulação. Exame

externo: cadáver dc indivíduo do sexo masculino, aparentando a idade referida de

50 anos com distribuição pilosa de acordo com o sexo. Epiderme discretamente

pálida, apresenta à altura do pé. E., na face lateral externa, lesão ulcerada re¬

coberta por crosta hemorrágica em forma de X, medindo 2,8 x 2,7 cm. de com¬

primento em cada ramo, tendo a ulceração da pele uma espessura máxima de

0,7 cm. e mínima de 0,3 cm. (foto 1). Mucosa levemente descorada. Segmento

cefálico: calota craniana — couro cabeludo sem alterações dignas de nota. Me-

ninges transparentes, hiperêmicas com acentuação evidente do relêvo vascular.

Encéfalo pesando 1.290 gr., com as circunvoluções aumentadas em espessura e

comprimindo os sulcos. Ao corte, discreta saída de líquido claro que borra a

emergência dos pequenos vasos encefálicos seccionados. Nada digno de nota nos

núcleos da base. Pedúnculos, protuberância, bulbo, cerebelo e hipófise: nada dig¬

no de nota. Olhos: pupilas isocrômicas e isocóricas. Cavidade bucal e órgãos do

pescoço: Bochechas — mucosas descoradas, rósea, e brilhante. Língua de super¬

fície rugosa, coloração brancacenta e saburnosa. Amígdalas de superfície rugosa,

irregular, de coloração rósea escura. Faringe apresentando mucosa rósea, lisa e

brilhante. Cordas vocais sem nada digno de nota. Traquéia apresentando mucosa

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MACHADO, J. C. e ROSENFELD, G. — Achados anátomo-patológicos em necroscopia de paciente

falecido por envenenamento elapídico. Mem. Inst. Butantan , 35: 41-53, 1971.

rósea, discretamente hiperemiada. Tireóide pesando 190 gr., apresenta superfí¬

cie lisa, brilhante, de côr castanha clara e consistência elástica. A superfície de

corte é de côr castanha clara, vesiculada. Paratireóide e partes moles sem nada

digno de nota. Tórax: panículo adiposo escasso. Musculatura normotrófica. Glân¬

dulas mamáreas de acordo com o sexo, sem nada digno de nota. Pulmões: D. pe¬

sando 550 gr. de superfície lisa, coloração rósea clara com pontos pretos, não

contrátil à abertura do gradeado costal. Crepitação diminuída, principalmente

nas bases. Aderências filiformes no ápice do pulmão. Pulmão E. pesando 650 gr.

do mesmo aspecto que o D. Ao corte os pulmões D. e E. apresentam intensa saí¬

da de líquido claro espumoso e regular quantidade de sangue, cuja coloração é

vermelho escura. Gânglios linfáticos peri-bronquiais apresentam intensa coloração

escura, preta e discretamente aumentados de volume. Pleuras: superfície lisa, bri¬

lhante, transparente, apresentando à altura do ápice do pulmão D. aderências

filiformes. Mediastino sem nada digno de nota. Pericárdio transparente, liso e

brilhante. Conteúdo líquido claro, transparente, levemente amarelado. Coração —

Miocárdio: apresenta-se de coloração vinhosa, elástico sem nada digno de nota.

Endocárdio mostra-se liso, brilhante e transparente. Válvulas sigmoides aórticas

apresentam discretas placas ora de um branco nacarado ora amareladas irregula¬

res. As demais válvulas nada digno de nota apresentam. Pêso de 290 gr. Esôfago

com mucosa brancacenta lisa e sem alterações dignas de nota. Cavidade abdomi¬

nal: panículo adiposo normotrófico. Musculatura normotrófica. Peritôneo parietal e

visceral apresentam hiperemia dos vasos que se destacam no relêvo seroso. Estô¬

mago apresenta mucosa com pregueamento íntegro, conteúdo líquido, espesso,

de côr escura. Duodeno e intestino delgado e grosso, nada digno de nota. Fígado

pesa 1.450 gr. e mostra superfície lisa e brilhante de côr castanha amarelada e

consistência elástica. Ao corte observamos congestão vascular. Vesícula biliar

cheia de bile espessa e de côr escura. À abertura, ausência de cálculos. Pâncreas

pesando 190 gr., sendo de superfície lisa, brilhante e de côr castanha clara, sendo

de consistência firme elástica. Ao corte nada digno de nota. Baço com superfície

lisa, brilhante, de coloração cinza clara, e consistência elástica. Ao corte intensa

congestão da polpa vermelha e atrofia da branca. À raspagem, saída de polpa

vermelha. Rins D. e E. pesando cada um 145 gr. Apresentam superfície lisa, bri¬

lhante e de côr vermelha escura. Cápsula, não muito facilmente destacável, obser¬

vando-se que a superfície parenquimatosa acha-se grosseiramente sulcada por de¬

pressões moderadamente profundas. Ao corte atrofia da cortical com nítida sepa¬

ração desta para com a medular. Nesta, observamos na parte superior, justa cor¬

tical, coloração vermelha escura que se estende até a parte medial, trajeto descen¬

dente dos túbulos das pirâmides de Malpighi. Em alguns cálices a coloração aver¬

melhada compromete as paredes mais inferiores dos túbulos. Adrenais D. e E.

superfície lisa e brilhante de côr castanha clara. Ao corte nítida delimitação da

cortical e da medular notando-se nesta hiperemia vascular. A cortical apresenta

côr clara deslipidizada. Ureter: mucosa brancacenta lisa c brilhante. Pélvis, bexi¬

ga, mucosa brancacenta, pregueada, lisa e brilhante. Próstata discrctamente au¬

mentada de volume, sendo de consistência elástica e coloração brancacenta. Ao

corte salpicado preto, irregularmente distribuído. Trombose dos plexos venosos,

peri-prostáticos. Pênis: nada digno de nota. Membros inferiores: Pele: já descrita

a lesão do pé E. Músculos e esqueleto sem nada digno de nota. Vasos venosos:

ausência de trombos. Artérias com endotélio liso, brilhante e de côr amarelada em

alguns trechos. RELATÓRIO MICROSCÓPICO : O relatório microscópico apre-

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MaCHADO, J. C. e ROSENFELD, G. — Achados anátomo-patológicos cm necroscopia de paciente

falecido por envenenamento elapídico. Mem. Inst. Butantan, 35: 41-53, 1971.

sentou como o de maior interêsse o que se segue: Pele: necrose localizada com

focos de hemorragia, disseminados. Exsudato leucocitário — polimorfonucleares I

neutrófilos e basófilos e histiomonócitos, com discreto edema. Rins: após pesquisa

paciente encontramos alguns cilindros de hemoglobina, não muito numerosos.

Inchação turva e congestão passiva crônica. Chamou a atenção a intensidade de

arterio-arterioloesclerose apesar de macroscopicamente, não se observar rim re¬

traído. Os cilindros de hemoglobina foram mais verificados na zona intermediá- [

ria, como acentuam Amorim e Mello. Pulmões: Congestão passiva crônica. En¬

farte hemorrágico com embolia trombòtica de pequenos ramos da artéria pulmo¬

nar. Coração: franca hipertrofia do miocárdio. Fígado e Baço: hiperemia passiva.

Adrenais hiperemia passiva. Inchação turva. Discreta adrenalite crônica inespecífi-1

ca. Pâncreas: hiperemia passiva. Cérebro: intenso edema cerebral.

Dos achados macro e microscópicos poderíamos ao proceder a epicrise de¬

duzir o que se segue: tratava-se de um paciente de 50 anos, portador de uma

Hipertensão essencial benigna, já fixada, pelas alterações arteriolares encontra-1

das, com sinais de insuficiência cardíaca — verificável pelo grau de congestão

passiva dos pulmões, fígado e rins.

DISCUSSÃO

A ação dos venenos animais e das serpentes em particular, possue uma ação

local e outra geral, manifestando-se à distância do ponto de inoculação (gráfi¬

co 2).

No caso que descrevemos, podemos afirmar pelos achados macro e micros¬

cópicos que se tratava de paciente de 50 anos, portador de Hipertensão essencial

benigna, já fixada com lesões renais microscópicas evidentes e sinais de insuficiên¬

cia cardíaca aliada a trombose venosa dos plexos peri-prostáticos. Como conse¬

quência local o veneno produziu pequena necrose com moderado exsudato celular

e seroso. A ação à distância caracterizou-se por vaso dilatação generalizada com

queda de pressão, agravamento da insuficiência cardíaca e embolia trombòtica de

pequenos ramos da artéria pulmonar com enfarte hemorrágico. Veio a falecer

com Edema agudo pulmonar bilateral. Os achados macroscópicos de vaso dila¬

tação, com moderada exsudação correspondente aos achados de Vital Brazil e

Vital Brazil F.° (10) em caso que publicaram.

Chamou-nos a atenção a presença de alguns cilindros de hemoglobina, obser¬

vados após árdua pesquisa, nos túbulos renais. Para o lado do sistema nervoso

central, a única lesão evidente foi o edema cerebral.

Teríamos portanto, de analizar êstes dois aspectos, primeiro o não encontro

de lesões do sistema nervoso, e segundo, a presença de cilindros de hemoglobina

desde que não se tem o veneno elapídico na conta de hemolizante potente e de

nefrotóxico.

Sabemos que a ação do veneno brotrópico é fortemente tóxica no local da

inoculação, determinando forte necrose. Já, o veneno crotálico que localmente não

produz extensas lesões, tem ação lesiva renal evidente — fator nefrotóxico — e

forte fator hemolítico.

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MACHADO, J. C. e ROSENFELD, G. — Achados anátomo-p^tológicos em necroscopia de paciente

falecido por envenenamento elapídico. A/em. Inst. Butantan, 35: 41-53, 1971.

Amorim, Mello e Saliba (1965) descrevem mesmo a reprodução experimen¬

tal do que chamam “Nefrose do Nefron intermediário” em cães inoculados com

veneno crotálico. Antes Amorim e Mello (1954) haviam descrito estas lesões em

três casos de acidente crotálico humano.

O veneno elapídico, segundo G. Rosenfeld (8), não produz lesões locais pois

é pràticamente destituído de atividade coagulante e proteolítica. Afirma ser o ve¬

neno especificamente neurotóxico proporcionando sintomatologia ligada a essa

ação. Assinalamos ainda que segundo êste autor, “qualquer veneno pode provo¬

car choque e colápso periférico” e tôda a sintomatologia daí decorrente, quando

penetra na circulação em grande quantidade. Boquet e colaboradores (6) obtive¬

ram do veneno elapídico — Najá nigricollis — após extração por GEL DEX-

TRANE (Sephadex G 100 fino), seis (6) frações. A neurotóxica, na sua clas¬

sificação é de número seis (6). A número 1, coagula o sangue e a três inibe a

coagulação. Não há referência sôbre fatores nefrotóxicos ou cardiotóxicos. No

que diz respeito à presença dos cilindros de hemoglobina, podemos analizá-los sob

dois aspectos. Inicialmente sôbre se seriam realmente cilindros de hemoglobina.

A descrição feita por Amorim e Mello, à página 284 (1952), a respeito da mor¬

fologia dos cilindros corrobora as observações de Baker e Doolds (1925): “os

cilindros formam, assinalam os A.A. ora um bloco homogêneo ora são for¬

mados pelo amontoamento de numerosos fragmentos de estrutura homogênea;

as partes ascendentes das alças de Henle chamam atenção por apresentar a luz

cheia pelos cilindros de material hialino fortemente corados pela eosina”. Em

nosso caso, os cilindros sempre foram de aspecto homogêneo e não tão abundan¬

tes, como nos casos de acidentes crotálicos. Para a formação dos cilindros de he¬

moglobina são necessários pelo menos dois fatores (gráfico 3), uma liberação

de hemoglobina a partir de uma hemólise ou de uma mionecrose. As necroses mus¬

culares maciças ocorridas quando do esmagamento de membros ou “crush syn-

drome” em processos musculares graves, são fatores de liberação de hemoglobina;

o segundo fator será o nefrotóxico. O rim assim lesado não dissolverá os cilin¬

dros e os precipitará conforme acentuam Amorim e colab. (1965). Também ou¬

tra forma de precipitação de hemoglobina seria a alteração do pH da urina.

Assim é como se os reproduz experimentalmente em coelhos mantidos em dieta

verde durante três dias, segundo Yorke e seus colaboradores (11).

Qual seria a origem da hemoglobina em nosso caso? Segundo vimos, Rosen¬

feld (8) afirma que o veneno elapídico não possui ação necrotizante porque é

destituído de atividade coagulante ou proteolítica; e não há segundo Boquet (6)

nos venenos elapídicos por êle estudados fração hemolítica. Estávamos nesse pro¬

blema quando resolvemos em colaboração com F. Saliba estudar a ação do ve¬

neno elapídico em coelhos. Podemos antecipar, após inoculação de 12 exemplares

que a ação local não é assim tão destituída de toxidade, havendo uma necrose

muscular evidente, apesar do veneno ter sido inoculado subcutâneamente. Por¬

tanto, poderíamos ter aí uma possível fonte de hemoglobina.

Estamos com Amorim, Mello e Saliba (1965), quando afirmam que há ne¬

cessidade de um fator nefrotóxico para se ter a cilindraria, mas acrescentaríamos

a possibilidade de que, se o Rim estiver prèviamente lesado por processos pato¬

lógicos anteriores, têrmos a formação de cilindros.

Procuraremos em estudos experimentais, já em andamento na Secção de

Anatomia Patológica do Instituto Butantan, esclarecer êste problema.

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MACHADO, J. C. e ROSENFELD, G. — Achados anátomo-patológicos em necroscopia de paciente

falecido por envenenamento elapídico. Mem. Inst. Butantan, 35: 41-53, 1971.

• SUMMARY — The authors present a

case of micrurus venon noting that

the rarity of such material justifies

its publication. We analysed the cli¬

nicai data, the autopsy findings and

the histopathology. We discuss the

problem of finding cilindres of hemo-

globin in the kidneys, even though

the micrurus venon is not considered

hemolytic, nephrotoxic or proteolytic.

We believe that the death of the

patient was due to cardiac insuffiency

that occurred after the accident. The

patient suffered essential hyperten-

sion, with chronic cardiac insuffici-

ency, a fact that, to the authors, jus¬

tifies the “causa mortis”, even though

cardiac insufficiency occurred hours

after the accident, possible hypothesis

being that it was provoked by the

action of the poison.

UNITERMS: Elapidic poisoning; He-

moglobinuric nephrosis.

TABELA 1

ESTUDOS EXPERIMENTAIS E RELATOS DE NECROSCOPIAS HUMANAS EM

PACIENTES FALECIDOS POR ENVENENAMENTO OF1DICO

I BOTRÚPICO.

a) NECROSCOPIAS HUMANAS

1. Mallory (1926) 1 caso.

2. Mac Clure (1935) 1 caso.

3. Bates (1925-27) 2 casos.

4. Rotter (1937) 3 casos.

5. Azevedo Teixeira (1938) 1 caso.

b) EXPERIMENTAL

1. Amorim, Mello e Saliba (1952) B. Jararaca-coelho cão.

2. Saliba (1964) B. jararaca — coelho.

3. Amorim, Mello e Saliba (1952) B.jararacussú — coelho

II. CROTALICO.

a) NECROSCOPIAS HUMANAS

1. Amorim e Franco de Mello (1952) 3 casos.

b) EXPERIMENTAL

1. Mitchell (1860).

2. Mitchell e Rcichert (1886)

3. Pearce (1909)

4. Taube e Essex (1937)

5. Fidler, Glasgow e Carmichael (1940).

6. Amorim, Franco de Mello e Saliba (1951) cão.

III ELAPÍDICO (CORAL).

a) NECROSCOPIAS HUMANAS

1. Vital Brazil e Vital Brazil F.° (1933).

2. Machado e Rosenfeld (1968).

b) EXPERIMENTAL.

1. Gennaro e Mc Collough (1963) (Micrurus fulvius).

2. Vital Brazil e Vital Brazil F.° (1933).

3. Machado e Saliba (1968-69).

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AÇÃO DOS VENENOS DE SERPENTES EM ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO E NO HOMEM (2).

MACHADO, J. C. e ROSENFELD, G. — Achados anátomo-patológicos em necroscopia de paciente

falecido por envenenamento elapídico. Mem. Inst. Butantan, 35: 41-53, 1971.

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MACHADO, J. C. e ROSENFELD, G. — Achados anátomo-patológicos em necroscopia de paciente

falecido por envenenamento elapídico. Mem. Inst. Butantan, 35: 41-53, 1971.

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MACHADO, J. C. e ROSENFELD, G. — Achados anátomo-patológicos em necroscopia de paciente

íalecido por envenenamento elapídico. Mem. Inst. Butantan, 35: 41-53, 1971.

Fig. i — Pé D. mostrando o local do acidente elapídico

— Atrofia parenquimatosa com hiperplasia “ex-vacuo do tecido adiposo da pélvis.

Fig. 2 — Rim D.:

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MACHADO, J. C, e ROSENFELD, G. — Achados anátomo-patológicos em necroscopia de paciente

falecido por envenenamento elapídico. Mem. Inst. Butantan, 35: 41-53, 1971.

Fig. 5 — Rim; col. H.E. (8x45); Cilindros de hemoglobina em túbulos renais.

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MACHADO, J. C. e ROSENFELD, G. — Achados anátomo-patológicos em necroscopia de paciente

falecido por envenenamento elapídico. Mem. Jnst. Butantan, 35: 41-53, 1971.

BIBLIOGRAFIA

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crotálico. Contribuição para o estudo experimental das lesões. Mem.

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envenenamento crotálico humano. Estudo Anátomo patológico. Mem.

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3. AMORIM, M.F. e MELLO, R.F. — Intermediate Nephron Nephrosis from

Snak Poisoning in Man. Amer. J. Path. 30: 479/499, 1954.

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Toxines des Venins de Serpents. Recherches Biochimiques et Immuno-

logiques sur le Venin de Naja nigricollis. Mem. Inst. Butantan, vol.

XXXIII, fase. II,: 371/378, 1966.

7. MC COLLOUGH, N.C. and GENNARO Jr., J.F. — Coral Snakes bites in

the United States. J. Fia. med. Ass., 39: 968/972, 1963.

8. ROSENFELD, G. — Acidentes por animais peçonhentos. Serpentes, aranhas

e escorpiões in Veronesi, R. — “Doenças infecciosas e parasitárias”.

Livraria Luso-Brasileira-Espanhola. S. Paulo, 2.° vol., 1960.

9. SALIBA, F. — Estudo Anátomo Patológico da evolução da necrose produzida

experimentalmente por veneno de Bothrops Jararaca. Influência de

substância organoheparinoide. Mem. Inst. Butantan, 31: 191/200, 1964.

10. VITAL BRAZIL, O. e VITAL BRAZIL F.°, O. — "Do envenenamento elapídico

em confronto com o choque anaphylático”. Boi. Inst. Vital Brasil n.° 15,

jan. 1933.

11. YORKE, W. and R.W. Naun — The mechanism of the prodution of supression

of urine of biach-vater fever. Ann. trop. Med. Parasit. 5 :287/312, 1911.

Recebido para publicação em 27 de novembro de 1969.

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Mem. Inst. Butantan

35: 55-61, 1971.

EPIDEMIOLOGY OF HODGKIN’S DISEASE IN CHILDREN

A STUDY OF 36 CASES. *

JESUS CARLOS MACHADO **. J. FRANCO DA SILVEIRA FILHO e ANTONIO D. RUSSO ***

SUMMARY: The authors presents

their findings with respect to the epi-

demiology of Hodgkin’s disease in

36 cases of children coming from

the South of Brazil, on the bounda-

ries between the tropical and tem-

perate zones.

They produce evidence that the

peak incidence occurs, in their mate¬

rial, at age 5/6 years, and that there

is another peak at age 9. They find

the male/female ratio to be 4:1. They

State that the highest incidence of

its clinicai onset is in Autumn. Signi-

ficant peaks and falis were observed

in other seasons.

These findings, compared with

those reported by MacMahon, Innes

and Newall, and Cridland, show that

both in the Northern Hemisphere and

in the Southern Hemisphere, the

highest incidence of Hodgkin’s disea¬

se in children occurs at the end of

Autumn.

In the opinion of the authors their

findings corroborate the hypothesis

that Hodgkin’s disease is an infec-

tious disease.

UNITERMS: Hodgkin’s disease; Epi-

demiology on neoplastic disease;

Seasonal influence on neoplastic di¬

sease.

I. — INTRODUCTION

Epidemiological studies on Hodgkin’s disease being made in the Northern

Hemisphere by MacMahon (8), Fraumeni and Li (5), Cridland (3), Innes and

Newal (6) and others, give support to old ideas about the nature and etio-

logy of this disease. Further studies must be made in other parts of the world

£o obtain more statistical data and new observations. In this paper we intend to

enlarge the comparative sector conceming the epidemiology of Hodgkin’s disease

and to provide statistics for the Southern Hemisphere, that is, cases of Hodgkin’s

disease observed in children in the south of Brazil on the boundaries between the

tropical and temperate zones.

Study made in cooperation with the Department of Pathological Anatomy of the APCC Central

Institute (Dr. A. Luisi, Director) and the Pathological Anatomy Section of the Butantan Institute,

Pathology Division (Director Dr. Jesus Carlos Machado).

Director of the Pathology Division of the Butantan Institute; Member of the WHO Internacional

Reference Committee for the Classification of Lymphomas and Leukemias.

Fellows of the Butantan Institute Research Fund

Study made with assistence of the Butantan Institute Research Fund.

Adress

C. P. 65 — São Paulo, Brazil.

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MACHADO, J. C.; FRANCO DA SILVEIRA F.°, J. and RUSSO, A. D. — Epidcmiology of Hodgkin’s

disease in children. A study of 36 cases. Mem. Inst. Butantan, 35: 55-61, 1971.

II. — MATERIAL

The data used in this study relate to 36 out of 46 cases of Hodgkin’s disease

recorded in the files of the Department of Pathological Anatomy of the APCC

Central Institute (See Table 1). We disregarded ten cases because of lack of

clinicai data.

In all 36 cases the diagnosis was established by histopathological examination

and reviewed by the author. The data given here were obtained from the clinicai

records of these patients on file at the AC Camargo Hospital.

III. — RESULTS

Table 1 shows the incidence of the cases by age, sex, and race. These data

are being published separately, together with other observations on other types

of malignant lymphomas. We see that in our material Hodgkin’s disease affects

children that are more than 4 years of age, there being only one child aged two

years. The highest peak is betwen five and six years, and there is also another less

pronounced, at age nine, after which the incidence of the disease diminishes. The

írequency in males is much greater than in females reaching a ratio of 4:1. As

expected, the highest incidence is among Caucasians and there is not a single case

among Orientais and Negrões.

In Table 2, in addition to age, and sex, for the purpose of comparison we have

listed associated diseases, whether or not related to Hodgkin’s disease. Sometimes

they are concurrent to the treatment. Thus we note that toxoplasmosis is asso¬

ciated with Hodgkin’s disease in three cases, herpers zooster in two cases, and

Kaposi Sarcoma in one, in addition to other which, in our opinion, are of less

importance.

Figures 3 and 4 give the percentage data of the frequency according to the

calendar month of the clinicai onset of the disease. With respect to diagnosis we

see that the months of highest incidence are January, February, March, July and

September. Deaths occur more frequently in the months of January/February and

June/July.

What is striking are the data relating to the clinicai onset of the disease,

that is, when the first signs or symptoms of it were observed. Figures 3 and 4

show that the highest percentage was characteristic of the months of May/June,

that is, of Autumn in the Southern Hemisphere. It is also to be noted that, in

all seasons, there is a rise and sudden fali of incidence.

IV.

DISCUSSION

When we compare the number of cases and the age with those presented by

Fraumeni and Li (5), we see that in our material the peak incidence occurs at age

5/6, whereas for those authors its was age 9. We wish to point out that, surpri-

singly, after age 5-6 we also have a peak at age 9 with a subsequent decline until

age 14, as occurs in the data of Fraumeni and Li (5). We believe that, in our

country children are, perhaps, more exposed to infectious and parasitic agents,

which would more actively excite the reticuloendothelial system and the lymphoid

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MACHADO, J. C.; FRANCO DA SILVEIRA F.°, J. and RUSSO, A. D. — Epidemiology of Hodgkin's

disease in children. A study of 36 cases. Mem. Jnst. Butantan , 35: 55-61, 1971.

tissue, thereby favoring the appearance of this incidence before age 9. In our

cases the incidence in males exceeds the statistics of the above-mentioned authors.

Whereas they found the ratio to be 3:1, we foiind it to be 4:1. For the purpose of

comparison, we point out that our findings are similar to those of Junqueira Al¬

varenga (1) in children in the State of Minas Gerais, near São Paulo. The peak

incidence occurs at age 6/7 and there is another similar peak at age 9, which

subsequently declines. That author found the ratio betwen male and female inciden¬

ce to be 3:1, lower than what we found. Now the data provided by Adónis de Car¬

valho (2) of Pernambuco, in Northeastern Brasil, are significantly different as far

as incidence by sex is concerned. In his data we find a ratio of 1.5:1 (male/female).

In his age table we find that the peak appears at age 6/7. We would need further

data from different places before we could be certain that this variation is actually

due to geographical differences, since Brazil is continental in size.

The most interesting verification relates to the variation according to sea¬

sons of the year. By plotting the clinicai onset of the disease by frequency on a

monthly graph, we find (Figures 1 and 2) that, in our material, the greatest fre¬

quency occurs in Autumn, and that in each season there is a peak and fali in

incidence. If we construct a similar graph with the data obtained by J. F. Fraumeni

and F. P. Li (5), we see that our observations coincide with those of the two

above-mentioned authors. Thus we see that the highest peak is also in Autumn

and there is a peak and fali in other seasons. The map shows the geographical

arigin of the patients, all of whom are from the south of Brazil, on the boundaries

between the tropical and temperate zones.

V. _ CONCLUSIONS

In addition to the conclusion which the authors (7) reached in collaboration

with others namely that, among the malignant lymphomas and related diseases,

excluding leukemias, Hodgkin’s disease in children is the most frequent illness in

Brazil, we can now add that the incidence by age in this more selected material,

occurs at age 5/6, with a new peak at age 9. We believe, like Dalldorf (4), that

perhaps in our country other agents can act in the direction of sensitizing the

reticulo-endothelial system and inducing it more in the direction of Hodgkin’s

disease, in contrast to África, where the direction is towards Burkitt Lymphoma.

With respect to sex, our male/female ratio is 4:1. The most interesting fact, in

our opinion, is the influence of the seasons of the year. We observe that in our

material the highest frequency of clinicai onset occurs in the month of June, that is,

at the end of Autumn. We note that the statistics from the Northern Hemisphere,

that is, those of MacMahon (8), Innes and Newall (6), Cridland (3) also show

that the highest incidence of clinicai onset occurs in Autumn. Therefore, we can

State that, according to our findings, Autumn is the season of the year in which

the greatest number of cases of Hodgkin’s disease occurs also in the Southern

Hemisphere. These observations will facilitate further comparisons of speculations

concerning the etiology of this disease.

SciELO

10 11 12 13 14 15

MACHADO, J. C.; FRANCO DA SILVEIRA F.°, J. and RUSSO, A. D. — Epidemiology of HodgkirFs

discase in children. A study of 36 cases. Mem. Jnst. Butantan, 35: 55-61, 1971.

RESUMO: Os autores apresentam

seus achados sôbre a epidemiologia

da Moléstia de Hodgkin em 36 casos

de crianças procedentes do sul do

Brasil, nas fronteiras entre as zonas

temperadas e tropical.

Há evidência de que a máxima in¬

cidência ocorre no seu material entre

os 5 e os 6 anos, havendo outro pico

aos 9 anos. Verificaram ser a relação

masculino/feminino 4:1. Observaram

que a maior incidência do início clí¬

nico da afecção é no outono.

Êstes achados, comparados àqueles

relatados por MacMahon, Innes e

Newall, e Cridland mostram que nos

dois hemisférios da Terra, Norte e

Sul, a maior incidência da Moléstia

de Hodgkin em crianças ocorre no

fim do outono. Na opinião dos auto¬

res êstes achados auxiliam a hipótese

de ser a Moléstia de Hodgkin possi¬

velmente afecção a virus.

UNITERMOS: Moléstia de Hodgkin;

Epidemiologia de neoplasias; Influên¬

cia sazonal nas neoplasias.

T A B L E 1

1 2 3

MALE 29

FEMALE 7

11 12 13

CAUCASIAN 87.3 %

NEGRÕES 13.7 Yo

ORiENTALS 0

LSLl

2 3 4 5 gSCÍELO 10 1X 12 13 14 15

MACHADO, J.

disease in

C.; FRANCO DA SILVEIRA F.°, J. and RUSSO, A. D. — Epidemiology of Hodgkin's

children. A study of 36 cases. Mem. Inst. Butantan, 35: 55-61, 1971.

T A

BLE 2

Case No.

Sex

Age

Associated Diagnosis

Toxoplasmosis, Herpes zooster

Anemia

—

Anemia

—

M alaria

Kaposi’s Sarcoma

—

Taxoplasmosis

Anemia: multiple skin lesions

Herpes zooster

Anemia: multiple skin lesions

Toxemic shock due to pneumonia

Ulcers lesions of the skin;

Sarcomatosis meningea;

Cushing’s syndrome;

Amenorrhea due to radiotherapeuti-

cal castration; Deafness; Purpura

due to dyscrasia; licken planus

Exulcerated skin lesions

Anemia j

Aplasticanemia '

Lichen planus — lichenoid urticaria

—

Nevus juvenil

Impetigo

—

Anemia

—

Nephritis due to iradiation —

Toxoplasmosis

—

^no d"-

MACHADO, J. C.; FRANCO DA SILVEIRA F.°, J. and RUSSO, A. D. — Epidemiology of Hodgkin's

disease in children. A study of 36 cases. Mem. Jnst. Butantan, 35: 55-61, 1971.

HODGKIN’S DISEASE IN CHILDREN

Seasonal influence

Fig. 3

Fig. 4

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MACHADO, J. C.; FRANCO DA SILVEIRA F.°, J. and RUSSO, A. D. — Epidemiology of Hodgkin's

disease in children. A study of 36 cases. Mem. Inst. Butantan, 35: 55-61, 1971.

BIBLIOGRAPHY

1- ALVARENGA, R. Junqueira: Relatório aos Congressos Integrados de Cance-

rologia, na mesa redonda sôbre: “Patologia geográfica dos Linfomas Ma¬

lignos e afecções correlatas em crianças no Brasil” setembro, 1969.

2. CARVALHO, Adónis de: Relatório aos Congressos Integrados de Cancerologia,

na Mesa Redonda sôbre: “Patologia geográfica dos Linfomas Malignos e

afecções correlatas em crianças no Brasil”, setembro, 1969.

3. CRIDLIAND, M.D.: Seasonal incidence of clinicai onset of Hodkin’s disease.

Brit. med. J. 2: 621-623, 1961.

4. DALLDORP, G.: Lymphomas of African children with different forms of en-

vironmental influences. J. Amer. med. Ass. 181: 1026-1028 (1962).

5. FRAUMENT, Jr. J. and LI, P. P.: Hodgkin’s Disease in Childhood: An Epide-

miologic study; J. nat. Câncer Inst. 42: 681-691, 1969.

6. INNES, J. and NEWALL, J.: Seasonal incidence in clinicai onset of Hodg-

kin’s disease. Brit. meã. J. 2: 765 (1961).

7. MACHADO. J. C.; CARVALHO, A.; JUNQUEIRA, Alvarenga, R.; PINHEIRO,

L.; FAGUNDES, L. A.; LYSANDRO: Patologia geográfica da Moléstia de

Hodkin em crianças no Brasil. Rev. bras. Cirurg. (No prelo).

8. MAC MAHON, B.: Epidemiology of HodgkFs disease. Câncer Res. 26: 1189-1200

(1966).

Recebido para publicação em 10 de agosto de 1971

SciELO

10 11 12 13 14 15

Mem. Inst. Butantan

35: 63-78, 1971.

‘ALTERAÇÕES DO EPITÉLIO E ESFREGAÇOS VAGINAIS DA PREÁ

(Cavia aperea aperea) DURANTE O CICLO ESTRAL E ESTUDO

COMPARATIVO COM AS DA COBAIA”. *

JOSÉ FRANCO DA SILVEIRA FILHO ** e JESUS CARLOS MACHADO ***

(Seção de Anatomia Patológica, Instituto Butantan)

RESUMO: A preá (Cavia aperea

aperea) nascida em cativeiro apre¬

senta ciclo sexual (duração de 13 a

17 dias) muito semelhante ao da co¬

baia e foi por nós dividido em 2 par¬

tes, de acordo com o aspecto do

esfregaço vaginal: estro ou fase de

atividade sexual (26 a 56 horas) e

diestro ou fase de repouso (10 a 15

dias). Durante o estro que subdivi¬

dimos em 4 estágios a população

celular do epitélio vaginal apresenta

intensa proliferação, diferenciação e

descamação. Inicialmente ocorre mu-

cificação das células superficiais e

posteriormente queratinização das cé¬

lulas subjacentes à camada mucifica-

da. As células superficiais mucosas

tornam-se picnóticas e descamam in¬

tensamente, seguindo-se a descamação

das células queratinizadas. O final do

estro é caracterizado por intensa leu-

cocitose em tôda a parede da vagina.

No diestro o epitélio vaginal apresen¬

ta-se delgado e não podemos dividí-lo

em zonas tal como o estro.

Discutimos os resultados obtidos le¬

vando em conta o estado endócrino

do indivíduo, principalmente o aspecto

dos ovários.

UNITERMOS: Cavia aperea aperea;

Colpocitologia hormonal.

INTRODUÇÃO

O Laboratório de Anatomia Patológica do Instituto Butantan iniciou em

1969 a organização de um biotério destinado a criação e manutenção de preás

em cativeiro, como tentativa de estudo sistemático da preá como animal de la¬

boratório. Este roedor foi utilizado, tempos atrás, por von Ubisch e Amaral,

1936, e por Bueller-Souto e von Ubisch, 1939, em experimentos imunológicos e

por von Ubisch e Mello, 1940, em experimentos genéticos. Recentemente, Castro

e colaboradores, 1961, e Miranda e colaboradores, 1967, utilizaram a preá em

estudos leprológicos. Finalmente, Dellias, 1969, estudou alguns aspectos da bio

logia da preá e neste mesmo trabalho abordou o seu ciclo estral. Antes dêle, von

* Trabalho realizado com o auxílio do F.P.I.B.

** Bolsista da Seção de Anatomia Patológica do Instituto Butantan.

*** Diretor da Divisão de Patologia do Instituto Butantan.

Endereço para correspondência

C-P. 65, São Paulo, Brasil

SciELO

10 11 12 13 14 15

F. SILVEIRA F.°, J. c MACHADO, J.C. — Alterações do epitélio e esfregaços vaginais da preá

(Cavia aperca aperea) durante o ciclo estral c estudo comparativo com as da cobaia.

Mem. Inst. Butantan, 35: 63-78, 1971.

Ubisch e Mello, 1940, fizeram êsses estudos em animais provenientes diretamente

do campo. Assim não puderam controlar certas variáveis importantes em um es¬

tudo desta natureza tais como: a idade das fêmeas, se elas eram virgens ou não,

se já tinham procriado e no caso afirmativo quantas vêzes (Stockard e Papani-

colaou, 1917, e Papanicolaou, 1933 a). Também permanecia em aberto a ques¬

tão de como seria o ciclo sexual das preás nascidas em cativeiro.

Tendo em vista esclarecer êsses pontos e comparar o ciclo sexual da preá

com o da cobaia, realizamos estudo sistemático das alterações cíclicas do epitélio

e esfregaço vaginais de preás nascidas em cativeiro. Para realizá-lo foi necessário

reformulação da classificação dos esfregaços vaginais apresentada por Dellias,

1969, pois constatamos a presença de alguns tipos celulares no esfregaço vagi¬

nal que foram omitidos por êsse autor. Também no que diz respeito a duração

das fases do ciclo estral, nossas observações diferem em alguns aspectos das de

Dellias, 1969.

MATERIAL E MÉTODOS

Utilizamos em nosso trabalho 12 preás fêmeas nascidas no biotério. Destas,

9 eram virgens e foram mantidas antes e durante a experimentação na ausência

de macho. As outras 3 fêmeas foram submetidas ao exame vaginal 2 meses após

terem dado cria e, foram mantidas durante a gestação e o período de experimen¬

tação na ausência de macho. As preás virgens tinham idade variável entre um

mês e meio até 10 meses quando foram examinadas, ao passo que, as outras 3

tinham mais de um ano de idade. Para estudo comparativo tomamos 1 lote de 10

cobaias fêmeas virgens, cuja idade variou de 3 a 10 meses de idade, e que fo¬

ram examinadas concomitantemente com as preás. As preás e as cobaias foram

examinadas durante 8 meses (julho de 1970 a fevereiro de 1971).

Os esfregaços vaginais foram executados diàriamente procedendo-se uma

ligeira raspagem do epitélio vaginal com alça metálica. Os esfregaços eram ime¬

diatamente fixados em álcool-éter 50% e corados pelo Método de Harris-Shorr

(Pundcl, 1967). A avaliação dos elementos presentes no esfregaço foi feita se¬

gundo método proposto por Lipschütz, 1929, e utilizado com bons resultados

por Mello e Franke, 1945. Quando percebíamos que um animal aproximava-se

do estro, êle era submetido a esfregaços vaginais a intervalos de 2 em 2 horas

até 22 hrs., sendo reiniciados no dia seguinte às 7:30 horas. Desta maneira tôdas

as fases do estro puderam ser estudadas, até mesmo, aquelas que como observa¬

mos podem ter apenas 2 horas de duração.

Os animais foram sacrificados nas diferentes fases do ciclo estral. Sistema¬

ticamente foram executados esfregaços vaginais imediatamente antes dos animais

serem sacrificados. Tôda a genitalia foi fixada em Bouin, para posteriormente,

serem obtidas secções da vagina e dos ovários, os quais foram incluídos em

parafina.

Os cortes histológicos foram corados pelos Métodos de Mallory e Hema-

toxilina-Eosina. Também, utilizamos a coloração indicativa Alcian-Blue, pH : =2,5

(Lison, 1960) com a finalidade de melhor evidenciar a presença de células mu¬

cosas no epitélio vaginal.

2 3 4

SciELO

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F. SILVEIRA F.°, J. c MACHADO, J.C. — Alterações do epitélio e esfregaços vaginais da preá

(Cavia aperea aperea) durante o ciclo estral e estudo comparativo com as da cobaia.

Mem. Inst, Butantan, 35: 63-78, 1971.

RESULTADOS

Para a descrição das aiterações cíclicas do esfregaço vaginal da preá adota¬

remos classificação baseada naquelas apresentadas por Selle, 1922; Young, 1937;

e Bacsich e Wyburn, 1939, para a cobaia. Segundo a análise do esfregaço vaginal

nós podemos dividir o ciclo sexual das preás em 2 partes distintas: estro ou fase

de atividade sexual, na qual o opérculo vaginal encontra-se aberto e diestro ou

fase de repouso, na qual o opérculo vaginal apresenta-se fechado por uma mem¬

brana que foi descrita por Dellias, 1969. Esta membrana encontrada na preá é

semelhante à membrana que fecha o opérculo vaginal da cobaia durante o dies¬

tro. (Stockard e Papanicolaou, 1919, e Kelly e Papanicolaou, 1927).

O estro na preá segundo os nossos dados tem uma duração de 26 à 56 ho¬

ras, a média para 12 preás foi de 39,1 horas. Nós dividimos o estro em 4 dife¬

rentes estágios.. O esfregaço vaginal e o aspecto do epitélio vaginal de cada fase,

bem como sua correlação com a cobaia serão descritos a seguir:

Estágio 1 — (duração de 12 a 42 horas; duração média de 22,0 horas).

Para o cálculo da duração das diferentes fases computou-se os dados obtidos em

12 preás.

Marca o início do estro. Corresponde na cobaia ao estágio 1 de Selle, 1922,

a subdivisão Ia e 1b inicial do estágio 1 de Young, 1937, e ao estágio 1 de

Bacsich e Wyburn, 1939. Inicialmente, o esfregaço vaginal da preá no estágio 1

caracteriza-se por apresentar grande quantidade de células epiteliais superficiais

mucosas, poucos leucócitos e quantidade relativamente grande de muco. As cé¬

lulas superficiais mucosas apresentam citoplasma bastante volumoso (ocupando

quase totalmente a célula), vacuolizado, que se cora de azul claro ou, às vêzes,

de rôxo claro pelo Método de Harris-Shorr. O núcleo de cromatina densa, ge¬

ralmente encontra-se comprimido na base da célula, à maneira das células muco¬

sas (fig. 1). Mesmo no início do estágio 1 algumas células superficiais mucosas

já apresentam núcleo em picnose. As células superficiais mucosas encontram-se

no esfregaço vaginal isoladas ou em grupos de muitas células lembrando o arranjo

que ocupavam no epitélio vaginal, sendo êste último caso mais comumente en¬

contrado. A medida que o estágio 1 progride verificamos no esfregaço vaginal

aumento no número de células superficiais mucosas com núcleo em picnose e o

desaparecimento dos leucócitos (fig. 2). As células mucosas picnóticas apresen¬

tam citoplasma delgado e com bordos dobrados, que se cora de azul muito pálido

pelo Método de Harris-Shorr. Podemos notar no citoplasma granulações espêssas

dando-nos a impressão de que quando a célula sofre picnose nuclear, ela apre¬

senta aumento destas granulações citoplasmáticas. No fim do estágio 1 o es¬

fregaço vaginal contém grande quantidade de células superficiais mucosas picnó¬

ticas e uma quantidade relativa de células queratinizadas e de muco. As células

mucosas que não sofreram picnose e os leucócitos estão pràticamente ausentes.

A presença de células superficiais mucosas não picnóticas e picnóticas no início do

estro foi omitida por Dellias, 1969.

No estágio 1 do estro o epitélio vaginal apresenta-se com a sua máxima es¬

pessura e podemos dividí-lo em 3 diferentes zonas: germinativa, basal e super¬

ficial.A zona germinativa, que está em contacto com o estroma vagina], é forma¬

da por uma camada de pequenas células cilíndricas com núcleos grandes e ova-

SciELO

10 11 12 13 14 15

F. SILVEIRA F.°, J. e MACHADO, J.C. — Alterações do epitélio e esfregaços vaginais da preá

(Cavia apcrca apcrca) durante o ciclo cstral e estudo comparativo com as da cobaia.

Mcm.. Inst. Butantan, 35: 63-78, 1971.

íados ocupando grande parte da célula. A zona germinativa apresenta grande nú¬

mero de mitoses no estágio 1. A zona basal é formada por muitas cama¬

das de células ovaladas ou poliédricas com núcleos grandes, vesiculares ten¬

do um nucleólo bem evidente (fig. 1 e 2). Estas células apresentam conexões

em suas superfícies, processos espinhosos semelhantes aos descritos na epiderme

humana e no epitélio vaginal da mulher (Pundel, 1967). Na cobaia, Tribby,

1943, também comprovou a existência de pontes intercelulares entre as células

do epitélio vaginal. Notamos, ainda na zona basal um grande número de células

binucleadas. A zona superficial durante o estágio 1 pode ser subdividida em 2

camadas: uma formada por células superficiais mucosas que estão em contacto

com o lúmen vaginal e outra subjacente, formada por células queratinizadas ou em

vias de queratinização. Êstc aspecto da zona superficial do epitélio vaginal no

início do estro, também, foi descrita na cobaia (Selle 1922) e na rata (Long e

Evans, 1922). Na metade do estágio 1 somente uma pequena porção da parede

da vagina próxima ao opérculo vaginal não apresenta a camada queratinizada.

Nesta região o epitélio vaginal é menos espêsso e não se notam tôdas as suas

zonas, de modo que a camada de células superficiais mucosas repousa direta¬

mente na zona basal (fig. 1). No restante da vagina as células mucosas apresen¬

tam-se dispostas sôbre a camada queratinizada formando estruturas que lembram

os ácinos mucosos. As características morfológicas de tais células foram descritas

anteriormente. No final do estágio 1, as células mucosas apresentam núcleos

picnóticos e descamam intensamente fornecendo as células encontradas no esfre-

gaço vaginal. Somente, a camada de células mucosas da zona superficial cora-se

com o Alcian-Blue, tanto no início do estágio 1, como no seu fim quando as cé¬

lulas superficiais mucosas apresentam-se picnóticas.

A camada queratinizada já está completamente formada no fim do estágio

1 e reveste completamente tôda a vagina. Entre a camada basal e a camada que¬

ratinizada notamos, frequentemente, existência de uma camada com uma ou

duas células de altura que contém quantidade razoável de densas granulações

citoplasmáticas coráveis pela hematoxilina.

O estroma vaginal (lâmina própria de tecido conjuntivo) durante o estágio

1 apresenta-se com poucos leucócitos polimorfonucleares, sendo que alguns leu¬

cócitos já alcançaram a zona germinativa do epitélio. Notamos algumas mitoses

no tecido conjuntivo do estroma. No início do estágio 1 podemos encontrar alguns

leucócitos no lúmen vaginal, mas no seu final êles são raros.

Estágio 2 — (duração de 3 a 10 horas; duração média de 5,8 horas). Cor¬

responde na cobaia ao estágio 2 de Selle, 1922, a subdivisão Ib médio e Ib final

do estágio I de Young, 1937, e ao estágio II de Bacsich e Wyburn, 1939. O es¬

tágio 2 da preá é caracterizado pela presença preponderante de células superfi¬

ciais queratinizadas no esfregaço vaginal. No início do estágio 2, temos juntamente

com as células queratinizadas a presença de pequena quantidade de células super¬

ficiais mucosas em pienose, remanescentes do estágio anterior e, uma quantidade

pequena de muco. As células queratinizadas apresentam citoplasma largo, delga¬

do e com bordos dobrados, que se cora intensamente de alaranjado (orange)

pelo método de Harris-Shorr, portanto são células eosinófilas ou acidófilas (Pun¬

del, 1967). Geralmente, as células queratinizadas são anucleadas podendo-se per¬

ceber no citoplasma um halo que foi anteriormente ocupado pelo núcleo. Algu-

F. SILVEIRA F.°, J. e MACHADO, J.C. — Alterações do epitélio e esfregaços vaginais da preá

(Cavia aperca apcrea) durante o ciclo estral e estudo comparativo com as da cobaia.

Mem. Inst. Butantan, 35: 63-78, 1971.

mas células queratinizadas apresentam o núcleo em pienose, ocupando normal¬

mente a parte central da célula. As célula queratinizadas descamam isoladas ou

então em grupos de muitas células. No fim do estádio 2, começam a aparecer no

esfregaço vaginal as células epiteliais basais provenientes da zona basal do epi¬

télio vaginal. Dellias, 1969, também encontrou células queratinizadas no esfre¬

gaço vaginal da preá em estro.

No estágio 2, o epitélio vaginal apresenta-se com sua espessura diminuída

devido à descamação das células superficiais mucosas, deixando a camada que-

ratinizada em contacto com o lúmen vaginal (fig. 3). Em alguns pontos da va¬

gina a camada queratinizada descama-se de uma só vez, aliás, tal fato também

foi observado por Selle, 1922, na cobaia. A zona germinativa apresenta grande

número de mitoses e a zona basal apresenta-se tal como no estágio anterior. No

fundo das pregas da vagina inferior nós vamos encontrar ainda células superfi¬

ciais mucosas não picnóticas e picnóticas. Tal fato pode ocorrer também, nos es¬

tágios 3 e 4. O epitélio vaginal ou seja a camada queratinizada da zona superfi¬

cial, a zona basal e a zona germinativa não se coram com o Alcian-Blue. Somente

aquêles trechos do epitélio vaginal que ainda possuem células superficiais mucosas

é que são evidenciadas pela coloração de Alcian-Blue, no estágio 2.

O estroma vaginal acha-se ligeiramente edemaciado e invadido por poucos

leucócitos. Alguns leucócitos já penetram na zona germinativa e na zona basal

do epitélio, porém, no lúmen vaginal êles são extremamente raros.

Estágio 3 — (duração de 2 a 9 horas: duração média de 4,8 horas). Cor¬

responde na cobaia ao estágio 3 de Selle, 1922, ao estágio 2 de Young, 1937, e

ao estágio 3 de Bacsich e Wyburn, 1939. O estágio 3 da preá é caracterizado pela

presença no esfregaço vaginal de grande quantidade de células epiteliais basais.

No fim do estágio 2 começam a aparecer no esfregaço vaginal as células basais,

cujo número torna-se preponderante no estágio 3. Em alguns estros examinados,

o estágio 2 confundiu-se com o estágio 3, devido ao grande número de células ba¬

sais e queratinizadas presentes no esfregaço. Nêstes casos, nós consideramos o

início do estágio 3 quando 50% das células presentes no esfregaço eram células

basais (tal procedimento foi realizado por Young, 1937 na cobaia). O fim do

estágio 3 é marcado pelo advento de leucócitos no esfregaço vaginal. Nos esfre¬

gaços do estágio 3 existe pequena quantidade de muco. As células epiteliais ba¬

sais são células pequenas, redondas ou ovaladas, cujo citoplasma se cora em ver¬

de escuro ou em alguns casos de azul escuro pelo Método de Harris-Shorr, pode¬

mos enlão classificá-las como células cianófilas ou basófilas (Pundel, 1967). No

citoplasma de algumas destas células notamos uma ou mais granulações. O núcleo

de forma ovalada ou arredondada é bastante grande ocupando a região central

da célula. Apresenta cromatina homogênea e nucléolo bem definido (fig. 4). As

células basais do esfregaço do estágio 3 podem apresentar sinais de degeneração.

Unias apresentam vacúolos perinucleares envolvendo núcleos parcialmente pienó-

ticos, outras apresentam vacúolos no citoplasma, o que é um sinal de início de

degeneração celular (fig. 4). Algumas células basais apresentam leucócitos no

seu interior. As células basais comumente descamam isoladas, podendo também

descamar em grupo de muitas células. Um fato que nos chamou a atenção foi o

número relativamente grande de células basais binucleadas presentes no esfregaço

do estágio 3. A presença de células basais ou seja o nosso estágio 3, passou des¬

percebida a Dellias, 1969.

F. SILVEIRA F.°, J. c MACHADO, J.C. — Alterações do epitélio e esfregaços vaginais da preá

(Cavia aperea aperea) durante o ciclo estral e estudo comparativo com as da cobaia.

Mem. Inst. Butantan, 35: M-Vs. 1971.

Durante o estágio 3, o epitélio vaginal apresenta-se com espessura menor do

que a do estágio anterior. Agora, a zona basal é que está em contacto com o

lúmcn vaginal. Na zona germanativa as mitoses são raras. Fazendo uma análise da

parede da vagina em tôda a sua extensão, verificamos que existem pequenos tre¬

chos do epitélio vaginal que ainda apresentam células queratinizadas e células mu¬

cosas picnóticas. O epitélio vaginal constituído pela zona basal e germinativa não

se coram com o Alcian-Blue, de modo que somente aquêles trechos que ainda

possuem células mucosas picnóticas é que se coram com o Alcain-Blue.

No estágio 3 há aumento de leucócitos presentes no estroma vaginal que se

encontra ligeiramente edemaciado. O epitélio vaginal acha-se parcialmente inva¬

dido pelos leucócitos, podendo-se notar células basais com leucócitos no seu in¬

terior. Apesar disso, apenas no fim do estágio 3 é que os leucócitos começam

a aparecer no lúmen vaginal.

Estágio 4 — (duração de 8 a 20 horas; duração média de 12,2 horas). Cor¬

responde na cobaia ao estágio 4 de Selle, 1922, ao estágio 3 de Young, e ao es¬

tágio 4 de Bacsich e Wyburn, 1939. O estágio 4 da preá é caracterizado pela

presença no esfregaço vaginal de grande quantidade de células basais e polimor-

fonucleares. No início dêste estágio, o esfregaço vaginal é composto de grande

quantidade de células basais e leucócitos, e às vêzes, de pequena quantidade de

células mucosas picnóticas e queratinizadas que ainda se encontram no lúmen va¬

ginal. O muco está presente em pequena quantidade no esfregaço. As células ba¬

sais apresentam as degenerações descritas anteriormente: vacúolos perinucleares

envolvendo núcleos picnóticos e vacúolos citoplasmáticos que são prenúncios de

degeneração celular. À medida que o ciclo progride tais degenerações são mais

acentuadas e são detectadas em um maior número de células basais. A partir da

metade do estágio 4, a grande maioria das células basais presentes no esfregaço

vaginal apresentam núcleo em pienose. Tais células coram-se em verde escuro

pelo Método de Harris-Shorr, ou então, mais raramente em vermelho escuro. No

fim do estágio 4 o número de células basais é bastante reduzido. Quase tôdas as

células estão degeneradas, certamente devido à ação fagocitária dos leucócitos. A

maioria das células basais apresentam núcleos picnóticos, notando-se também a

presença de células basais cm cariorrexix e células basais totalmente vacuolizadas.

Células basais com um ou mais leucócitos no seu interior ocorrem durante todo o

estágio 4 c são uma das características dêste estágio, embora, possam ocorrer no

esfregaço do estágio 3, como já afirmamos anteriormente. Tais células apresen¬

tam núcleo e citoplasma em degeneração, coram-se difusamente pelo Método de

Harris-Shorr e são semelhantes àquelas descritas na cobaia (Stockard e Papanico-

laou, 1917 e Stockard, 1932). O estágio 4 também foi descrito por Dellias, 1969.

Secções da vagina durante o estágio 4 mostram o estroma e o epitélio vaginal

totalmente tomados por um grande número de leucócitos, os quais deixam os

leitos dos capilares, atravessam o epitélio vaginal e vão ter no lúmen da vagina

(fig 5). O epitélio vaginal apresenta-se com a zona basal e germinativa, e à me¬

dida que o ciclo progride a zona basal vai tornando-se cada vez menos espêssa

e mais colapsada, devido à descamação das suas células e à ação leucocitária (fig.

5). As camadas basal e germinativa dão reação negativa ao Alcian-Blue e as mi¬

toses estão ausentes. O estroma vaginal apresenta-se extremamente edemaciado.

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F. SILVEIRA F.°, J. e MACHADO, J.C. — Alterações do epitélio e esfregaços vaginais da preá

(Cavia apereá aperea) durante o ciclo estral e estudo comparativo com as da cobaia.

Mem. Inst . Butantan, 35: 63-78, 1971.

O epitélio vaginal emite algumas projeções que adentram no estroma vagi¬

nal. A zona germinativa e as células basais nestas projeções parecem não sofrer

injúrias devido à ação leucocitária. Talvez, isto tenha papel importante na re¬

constituição do epitélio vaginal após a intensa descamação de suas células e a

leucocitose fisiológica que caracterizam o estro. Esta idéia também foi apoiada

por certos autores na cobaia (Stockard e Papanicolaou, 1917, e Selle, 1922).

Em duas preás sacrificadas no início do estágio 4 observamos que peque¬

no trecho do epitélio vaginal, próximo ao opérculo vaginal, apresentava células

superficiais mucosas dispostas diretamente sôbre a zona basal. Evidentemente,

êste curto trecho do epitélio vaginal não sofreu queratinização mas somente mu-

cificação. Nas demais regiões da vagina dessas preás podemos perceber nitida¬

mente restos da camada queratinizada no lúmen vaginal. Isto explica o apareci¬

mento de células superficiais mucosas bem conservadas em alguns esfregaços

do estágio 4.

Verificamos, também, a ocorrência de alguns estros que apresentam leucó¬

citos em tôdas as fases. Isto foi também observado na cobaia por Young, 1937.

O diestro na preá tem a duração de 10 até 15 dias, a média para 12 preás

foi de 13,1 dias. O diestro pode ser dividido em 2 partes levando-se em conta o

aspecto do esfregaço vaginal.

Diestro 1 (duração de 5 a 10 dias; duração média de 6,4 dias).

O esfregaço vaginal do diestro 1 é, geralmente pobre tanto em elementos ce¬

lulares como acelulares. Porém, podemos caracterizá-lo pela presença de uma

quantidade razoável de muco e leucócitos e, pequena quantidade de células epi-

teliais e restos de células basais, provenientes do estro anterior. A medida que o

diestro 1 progride a quantidade de restos de células basais vai diminuindo cada

vez mais. As células epiteliais diestrais são células pequenas, redondas ou ovala¬

das, com citoplasma que se cora de azul pálido pelo Método de Harris-Shorr. Apre¬

sentam núcleo ovalado ou arredondado, com cromatina homogênea e nucléolo

bem definido. O núcleo, que é relativamente grande ocupa geralmente a posição

central da célula. As células epiteliais diestrais encontram-se isoladas no esfregaço

vaginal do diestro 1.

O epitélio vaginal durante o diestro 1 apresenta-se delgado não permitindo

divisão em zonas tal como fizemos no estro. O lúmen vaginal no diestro é bas¬

tante pregueado e o seu diâmetro é notadamente menor do que o diâmetro visto

no período de atividade sexual. O epitélio vaginal emite projeções que penetram

no estroma vaginal. Nas regiões mais delgadas, o epitélio vaginal apresenta uma

ou duas camadas de células de altura. A zona germinativa é perfeitamente dis¬

tinguível no epitélio diestral e nela notamos algumas mitoses. As células epiteliais

que estão em contacto com o lúmen vaginal podem ser achatadas ou alongadas, ou

então de forma cuboidal. Algumas destas células de forma cuboidal apresentam

citoplasma vacuolizado e dão reação positiva ao Alcian-Blue, acusando a presen¬

ça de muco (fig. 6). Tribby, 1943, observou a presença de células epiteliais

contendo muco na superfície do epitélio vaginal diestral da cobaia. Devemos

acrescentar ainda, que nas regiões próximas ao opérculo vaginal, o epitélio vagi¬

nal da preá apresenta-se mucificado. Aí nós vamos encontrar células superficiais

mucosas, semelhantes aquelas descritas no estágio 1 do estro.

F. SILVEIRA F.°. J. e MACHADO, J.C. — Alterações do epitélio e esfregaços vaginais da preá

(Cavia aperca aperea) durante o ciclo estral e estudo comparativo com as da cobaia.

Mc?n. Inst. ButanUm, 35: 63-78, 1971.

O estroma vaginal no diestro 1 apresenta-se ligeiramente edemaciado e in¬

vadido por poucos leucócitos. Podemos surpreender alguns leucócitos no epitélio

vaginal e no lúmen vaginal.

Diestro 2 (duração de 5 a 10 dias; duração média de 6,5 dias).

No enfregaço vaginal do diestro encontramos uma quantidade bem maior

em relação ao diestro de: células epiteliais diestrais, leucócitos e muco. A princi¬

pal característica do esfregaço do diestro 2 é a descamação das células diestrais

em grupos de muitas células e a presença de algumas figuras de mitose. Pode¬

mos notar também, células diestrais com leucócitos no seu interior.

Um ou dois dias antes do estro há no esfregaço vaginal diminuição na quan¬

tidade de leucócitos e de células diestrais e, aumento na quantidade de muco e

o aparecimento das primeiras células superficiais mucosas do estro.

O epitélio vaginal, no início do diestro 2 apresenta-se com espessura menor

do que qualquer outra fase do ciclo estral (fig. 7). Selle, 1922, verificou o mes¬

mo na cobaia. Muitas mitoses podem ser observadas tanto na zona germinativa

como nas camadas superficiais. Podemos surpreender figuras de mitose em célu¬

las que estão em contacto com o lúmen vaginal, prestes a descamarem. Nas re¬

giões mais delgadas o epitélio vaginal apresenta-se com espessura de uma ou

duas camadas de células de altura. No início do diestro 2, o epitélio vaginal dá

reação negativa ao Alcian-Biue.

O estroma vaginal acha-se invadido por leucócitos, cuja quantidade é bem

superior àquela vista no diestro 1. Os leucócitos atravessam o epitélio vaginal e

vão ter no lúmen da vagina.. Em quase tôda extensão da vagina, as células epi¬

teliais das camadas superficiais apresentam leucócitos no seu interior (fig. 7). Um

dia antes de iniciar-se o estro, o epitélio vaginal apresenta-se com a sua espessura

aumentada e as células superficiais já exibem o processo de mucificação.

Algumas vêzcs, obtivemos tanto no diestro 1 como no diestro 2, esfregaços

vaginais contendo quantidade enorme de muco filamentoso e leucócitos, e raras

células epiteliais. Em alguns casos é tal a quantidade de muco e leucócitos no

lúmen da vagina que a membrana diestral que fecha o opérculo vaginal se rompe

e o material purulento se estravasa. Com exceção dêstes casos, no diestro o

opérculo vagina) está obliterado por uma membrana.

DISCUSSÃO

O ciclo estral da preá nascida em cativeiro é extremamente semelhante ao da

cobaia (Selle, 1922, Young, 1937, Bascich e Wyburn, 1939), existindo perfeita

correlação entre os estágios do ciclo estral dêstes dois roedores. A sequência e

duração dêstes estágios também é semelhante ao da cobaia. O ciclo sexual da preá

tem a duração de 13 a 17 dias, raramente, temos ciclos de 12 ou 18 dias. A

média foi de 14,9 dias, bastante próxima à da cobaia (Stockard e Papanicolaou,

1917 e Selle 1922). Não notamos diferenças entre o ciclo sexual das preás vir¬

gens e daquelas examinadas após a parturição. Por êsse aspecto acreditamos que

a preá nascida em cativeiro reproduz-se normalmente.

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(Cavia aperea aperea) durante o ciclo estral e estudo comparativo com as da cobaia.

Mern. Inst. ButanUm, 35: 63-78, 1971.

Para nossos estudos foi necessário reformular a classificação de Dellias, 1969.

Êste autor omitiu o estágio 1 do estro quando ocorre mucificação do epitélio va¬

ginal. Êle diz ter encontrado no início do estro células ovaladas com núcleo gran¬

de e central. Nas nossas observações nunca deparamos com tais células no es-

fregaço vaginal do início do estro. Também, passou desapercebido a Dellias a

presença de células epiteliais basais no esfregaço do estro ou seja como descre¬

vemos no estágio 3. Provàvelmente, isto ocorreu devido a curta duração do es¬

tágio 3 (2 a 7 horas), pois, Dellias, 1969, realizava apenas um esfragaço vagi¬

nal por dia e, em alguns animais os esfregaços eram feitos em dias alternados.

Quanto à duração do metaestro que chamamos estágio 4, acreditamos que a du¬

ração de 2 a 5 dias prevista por Dellias, 1969, é bastante excessiva, pois em nos¬

sas observações o estágio 4 teve a duração de 9 a 20 horas, o que está de acordo

com resultados obtidos na cobaia (Stockard e Papanicolaou, 1917, Tribby, 1943,

e Young, 1937). Dellias, 1969, não dividiu o diestro em duas partes tal como

nós fizemos.

No estágio 1, primeiramente, ocorre mucificação da camada de células su¬

perficiais em contacto com o lúmen da vagina, depois, as células subjacentes à

camada mucificada se queratinizam. Quadro semelhante foi descrito no início

do estro na cobaia (Selle, 1922). Paralelamentc a esta diferenciação da zona

superficial do epitélio vaginal em camadas mucificada e queratinizada notamos,

também, uma intensa proliferação na sua zona germinativa. A proliferação, di¬

ferenciação e descamação da população celular do epitélio vaginal da preá du¬

rante o estro parece estar relacionada com a grande quantidade de estrogênio

presente no organismo, pois, examinado ovários de preás sacrificadas nos está¬

gios 1, 2 e 3, notamos a presença de folículos em crescimento e maturos e corpos

iúteos degenerados e não funcionais. A mucificação no epitélio vaginal no estro

foi descrita na cobaia (Selle, 1922, e Tribby, 1943) e obtida experimentahnente

com doses subqueratinizantes de estrogênio na cobaia e na camundonga (Meyer

e Allen, 1933) e na rata (Clarke e Selye, 1942 e Rosa e Alvarado, 1959). Do¬

ses superiores àquelas necessárias para mucificação causam mucificação e quera¬

tinização do epitélio vaginal da cobaia (Allen e Meyer, 1933, Nicol e Sncll, 1954

a, Harmreck e Greenwald, 1966). Recentemente, Harmreck e Greenwald, 1966,

sugeriram que a interação estrogênio-progesterona resulta na mucificação vaginal

da cobaia e acentuaram a importância da adrenal na produção de hormônios se¬

melhantes à progesterona e ao estrogênio.

A medida que o estágio 1 progride aumenta a espessura da camada quera¬

tinizada e as células superficiais mucosas tornam-se picnóticas e descamam inten¬

samente. Talvez, um dos fatores que faz com que as células superficiais muco¬

sas tornem-se picnóticas e descamem seja a diminuição de nutrição destas cé¬

lulas devido a grande espessura do epitélio vaginal. Aliás, em alguns estros não

ocorre queratinização em regiões próximas ao opérculo vaginal e nelas podemos

encontrar epitélio relativamente delgado com células superficiais mucosas bem

conservadas. Êsse ponto de vista coincide com o de Tribby, 1943 e Nicol e Snell,

1954 a, b, para explicação da pienose nuclear e descamação das células superfi¬

ciais do epitélio vaginal da cobaia. Meyer e Allen, 1933, demonstraram experi-

oicntalmente na cobaia que a queratinização das células subjacentes à camada

mucificada do epitélio vaginal acarreta a descamação das células superficiais mu-

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(Cavia aperca aperea) durante o ciclo estral e estudo comparativo com as da cobaia.

Mem. Inst. Butantan, 35: 63-78, 1971.

cosas. Desta maneira, acreditamos que pelo menos parte do muco encontrado no

esfregaço vaginal do estro seja proveniente de uma secreção vaginal. Esta conclu¬

são é semelhante a de Selle, 1922, e Tribby, 1943, em relação ao muco presente

no esfregaço vaginal do estro na cobaia. Talvez, a secreção vaginal da preá no

estro constitua um tipo de secreção holócrina tal como Lelièvre e Retterer, 1910,

descreveram na cobaia à têrmo.

A coloração indicativa de Alcian-Blue, permitiu-nos comprovar o caráter

mucoso das células da camada mais externa da zona superficial do epitélio va¬

ginal no estágio 1, e também afastar a hipótese de que as células superficiais

picnóticas encontradas no esfregaço vaginal do fim do estágio 1 sejam exclusiva¬

mente células em vias de queratinização ou tipos de células queratinizadas como

alguns autores descreveram na cobaia (Stockard e Papanicolaou, 1917 e 1919,

Selle, 1922 e Papanicolaou, 193 b.).

O fim do estro ou estágio é marcado por intensa leucocitose em tôda

a parede da vagina. A invasão leucocitária inicia-se no fim do estágio 3, mas so¬

mente no estágio 4 que os leucócitos alcançam o lúmen vaginal e ela deve ser

um fenômeno secundário tal como na cobaia (Stockard e Papanicolaou, 1917).

Os leucócitos exercem sua ação tanto nas células descamadas no lúmen como nas

células que estão na parede da vagina. É comum nos esfregaços vaginais do es¬

tágio 4 têrmos células basais com leucócitos dentro. As projeções do epitélio va¬

ginal do estroma podem não sofrer ação leucocitária, talvez, isto esteja relacio¬

nado com a restauração do epitélio vaginal pós-estro.

Em contraste com o estro, o epitélio vaginal diestral apresenta-se delgado

e não podemos dividí-lo em zonas. Um ou dois dias após o estro, êle está re¬

cuperado das injúrias sofridas devido à leucocitose do estágio 4. No dies ro 1 é

pequena a quantidade de leucócitos no estroma e epitélio vaginais. Em certas re¬

giões da vagina e principalmente na região próxima ao opérculo vaginal encon-

tra-se mucificado. O aspecto das células superficiais diestrais que contém muco

é semelhante ao das células mucosas do estro. Nesta época, examinando os ová¬

rios verificamos a presença de corpos lúteos grandes e funcionais (geralmente um

por ovário) e folículos pouco desenvolvidos. Possivelmente, existe relação entre

a secreção do corpo lúteo e a mucificação parcial do epitélio vaginal diestral da

preá. Hemreck e Greenwald, 1966, obtiveram mucificação vaginal na cobaia com

aplicações de progesterona.

No diestro 2, o epitélio vaginal apresenta-se com sua menor espessura e in¬

vadido por leucócitos. As mitoses são comuns tanto nas camadas profundas co¬

mo nas superficiais.. A fina espessura do epitélio, talvez, deva-se a descamação

relativamente intensa de suas células.

Somos levados a relacionar a êsse início da proliferação do epitélio vaginal

diestral com o crescimento e amadurecimento dos folículos ovarianos. Por volta

de 8 dias após o estro, os ovários apresentam folículos em crescimento e maturos

e corpos lúteos funcionais do último estro.

O comportamento da população celular do epitélio vaginal da preá durante

o ciclo estral é muito semelhante ao da cobaia e deve estar relacionado com o

estado cndócrino do indivíduo tal como nêste último.

F. SILVEIRA F.°, J. e MACHADO, J.C. — Alterações do epitélio e esfregaços vaginais da preá

(Cavia aperea aperea) durante o ciclo estral e estudo comparativo com as da cobaia.

Mem. Inst. Butantcm, 35: 63-78. 1971.

CONCLUSÕES

A preá nascida em cativeiro apresenta ciclo sexual (duração de 13 a 17

dias) semelhante sôbre quase todos os aspectos ao da cobaia. Baseando-se no as¬

pecto do esfregaço vaginal dividimos o ciclo sexual em 2 partes: estro ou fase

de atividade sexual (26 a 56 hs) e diestro ou fase de repouso (10 a 15 dias). No

estro (por nós subdividido em 4 estágios) a população celular do epitélio vagina]

apresenta intensa proliferação, diferenciação e descamação.

Inicialmente, ocorre mucificação das células epiteliais superficiais e poste¬

riormente, as células subjacentes à camada mucificada se queratinizam (estágio 1

inicial). À medida que o ciclo progride, as células superficiais mucosas tornam-

se picnóticas e descamam intensamente (estágio 1 final). Segue-se a descamação

das células queratinizadas (estágio 2) e das células epiteliais basais (estágio 3).

O final do estro é caracterizado por uma intensa leucocitose em tôda a parede

da vagina, que se encontra colapsada (estágio 4).

No diestro, inicialmente, o esfregaço vaginal apresenta poucas células epi¬

teliais diestrais, leucócitos e muco. O epitélio vaginal e delgado e com raras mi¬

toses, podendo ocorrer mucificações das células superficiais tal como no estro

(diestro 1). Posteriormente, o esfregaço torna-se rico em células diestrais que des¬

camam em grupo. O epitélio apresenta-se delgado, mas com algumas mitoses

(diestro 2).

O epitélio vaginal da preá apresenta comportamento durante o ciclo sexual

semelhante ao da cobaia, e tal como nêste último deve estar relacionado com o

estado endócrino do organismo.

SUMMARY: The preá (Cavia aperea

aperea) a wild Brasilian cavoy born

in captivity has a estrous cycle (du-

ration 13-17 days) very similar to that

of the guinea pig and which we divi-

ded into two parts on the basis of

vaginal smears: estrus, or the phase

of sexual activity (26 to 56 hours)

and diestrus, or the resting phase

(10-15 days). During estrus (which we

subdivided into four stages) the cellu-

lar population of the vaginal epithe-

lium is characterized by intense pro-

liferaticn, differentiation and delami-

nation. Initially, there occurs a

mucification of the superficial cells

and, later, a keratinization of the

cells subjacent to the mucified layer.

The superficial mucus cells become

pyenotie and delaminate intensely,

followed by the delamination or the

keratinized cells- The end of estrus is

characterized by an intense leucocyto-

sis in the entire vaginal wall. In

diestrus, the vaginal epithelium is thin

and cannot be divided into zones as

it can in estrus.

We discussed the results obtained,

taking into consideration the endocri-

ne state of the individual, principally

from the point of view of the ovaries.

UNITERMS: Cavia aperea aperea

Hormonal Colpocitology.

agradecimentos

Ao Dr. Newton Macha, do Departamento de Histologia da U. S. P.; ao Dr.

Earl Albert Hart da Seção de Anatomia Patológica do Inst. Butantan, queremos

agradecer a colaboração emprestada. Também desejamos agradecer ao Sr. Elyseu

Baptista de Oliveira cuja dedicação ao biotério nos propiciou a boa execução da

presente pesquisa.

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(Cavia aperea aperea) durante o ciclo estral e estudo comparativo com as da cobaia.

Mem. Inst. Butantan, 35: 63-78, 1971.

Fig. 1 — Secção longitudinal da parede da vagina próxima ao opérculo vaginal. Aspecto do

estágio 1 inicial do estro. Notar o epitélio vaginal espessado e o aspecto glanduliforme

apresentado pelas células superficiais mucosas. Em outras regiões da vagina dêste mesmo

animal a camada queratinizada já está formada. (Mallory, _f_ 160 vêzes).

Fig. 2 — Secção transversal da parede da vagina próxima ao cérvice. Aspecto do fim do

estágio 1 do estro. Notar as células superficiais mucosas picnóticas em vias de descamação.

Podemos observar as zonas germinativas, basal e germinativa do epitélio vaginal. (Mallory _f-

160 vêzes).

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Mcm. Inst. Butantan , 35: 63-78, 1971.

Fig. 3 — Secção transversal da parede da vagina próxima ao cérvice. Aspecto do estágio

2 do estro. Agora é a camada queratinizada que está em contacto com o lúmen vaginal.

(Mallory, 160 vêzes).

Fig. 4 — Esfregaço vaginal do estágio 3 do estro. A maioria das células epiteliais basais

presentes apresentam vacúolos perinucleares que indicam picnose nuclear. As células basais

coram-se intensamente pelo Método de Harris-Shorr. (Shorr, _j_ 500 vêzes).

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(Cavia aperea aperea) durante o ciclo estral e estudo comparativo com as da cobaia.

Mem. Inst. Butantan, 35: 63-78, 1971.

Fig. 5 — Corte transversal da parede da vagina próxima ao cérvice. Aspecto do estágio 4 do

estro. O epitélio e estroma vaginais encontram-se intensamente invadidos por leucócitos. O

epitélio vaginal é formado pelas zonas germinativa e basal, sendo que esta última apresenta-se

vacuolizada em muitos pontos, devido à ação leucicitária.. (HE 130 vêzes).

Fig. 6 — Corte transversal da parede da vagina próximo ao cérvice. Aspecto do diestro 1 (2

dias após o estro). Comparar a espessura e o aspecto dêste epitélio vaginal com os dos está.

gios do estro. Notar a mucificação em certos trechos e a presença de alguns leucócitos no

epitélio vaginal (HE _f_ 130 vêzes).

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(Cavia aperea aperea) durante o ciclo estral e estudo comparativo com as da cobaia

Mem. Inst. Butantan, 35: 63-78, 1971.

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Fig. 7 — Corte transversal da vagina próximo ao cérvice. Aspecto do diestro 2 (8 dias após o

estro). Epitélio vaginal extremamente delgado e a presença de leucócitos nas suas células

superficiais. (HE, -4- 130 vêzes).

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PRODUÇÃO DE LESÕES SEMELHANTES ÀS DO PÊNFIGO FOLIÁCEO

PELA INJEÇÃO INTRADÉRMICA, EM COELHOS E MACACOS, DE

SÔROS DE DOENTES COM TÍTULO ELEVADO DE AUTOANTICORPO

ERNST BEUTNER *, GARY W. WOOD *, TADEUSZ P. CHORZELSKI **,

CID DE ABREU LEME *** e OTTO G. BIER ****

RESUMO — Microbôlhas intraepidér-

micas acantolíticas histològicamente

semelhantes às encontradas no pênfi-

go humano puderam ser induzidas

experimentalmente em coelhos e ma¬

cacos, mediante a injeção intradérmi-

ca de sôros de casos de Pênfigo Fo-

liáceo Brasileiro (PFB) com teor ele¬

vado de anticorpo intercelular.

Nas experiências em coelhos, resul¬

tados positivos foram obtidos sòmente

com um sôro selecionado (Sôro N.°

D e tratando-se o sítio inoculado

com solução a 1-2% de dinitrocloro-

benzeno. Três outros sôros experi¬

mentados, embora possuidores de alto

título de anticorpo intercelular, exi¬

biram menor capacidade de fixação à

pele do coelho e foram incapazes de

produzir lesões acantolíticas. Compor¬

tamento semelhante mostrou o Sôro

n.° 1 após “envelhecimento” no labo¬

ratório a —20.°.

Em macacos, lesões semelhantes às

do pênfigo humano foram obtidas

após 2 ou 3 injeções intradérmicas de

sôros de PFB com alto teor de anti¬

corpo intercelular na mesma área

cutânea, mas não com uma única in¬

jeção.

UNITÊRMOS — Pemphigus Foliaceus

(“Fogo Selvagem”); Transferência

passiva de lesões penfigóides; Autoi-

munidade no Pênfigo Foliáceo.

INTRODUÇÃO

Em 1964, Beutner & Jordan (1) verificaram que no sôro de doentes de

Pemphigus vulgaris (PV) existiam autoanticorpos reveláveis por imunofluorescência

indireta, utilizando como substrato o epitélio escamoso estratificado do esôfago de

rnacaco ou humano. O anticorpo em questão mostrou ser notavelmente específico

para o pênfigo e localizava-se electivamente nas áreas intercelulares, sobretudo ao

nível do stratum spinosum.

* Departamento de Microbiologia, Escola de Medicina, SL'NY em Buffalo, Buffalo, New York,

E. Unidos.

** Departamento de Dermatologia, Escola de Medicina, Varsóvia, Polônia.

*** Hospital Ademar de Barros, São Paulo, Brasil.

**** Centro OMS/OPS de Pesquisa e Formação em Imunologia, Instituto Butantan, São Paulo, Brasil.

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de lesões semelhantes às do Pênfigo Foliáceo pela injeção intradérmica, em coelhos e macacos,

de sôros de doentes com título elevado de autoanticorpo. Mem. Inst. Butantan. 35: 79-94, 1971.

Estas observações foram confirmadas e ampliadas em 1968 quando se de¬

monstrou que, em pràticamente 100% dos casos de Pemphigus Foliaceus (“Fogo

selvagem”), encontravam-se anticorpos fluorescentes intercelulares em título mais

elevado que no PV, podendo, em certos casos, atingir a 1:2560 ou acima (2).

Embora os dados epidemiológicos indiquem que o Pênfigo Foliáceo Bra¬

sileiro (PFB) tenha etiologia virai e esteja associado à transmissão por artró¬

podes (3), a correlação observada entre o teor de autoanticorpo circulante e a

gravidade da doença levou a sugerir que em sua patogenia estivesse envolvido um

mecanismo autoimune. As evidências em favor dêste conceito são múltiplas e fo¬

ram sumariadas em (4):

1. °) Presença constante do autoanticorpo nos casos com lesões ativas.

2. °) Relação entre os títulos de anticorpo e a gravidade da doença.

3. °) Fixação in vivo do anticorpo e de complemento (3) ao nível das le¬

sões cutâneas.

4. °) Correspondência entre a localização do antígeno reativo e a sede das

lesões.

5. °) Fixação intercelular do anticorpo em macacos injetados pela via in¬

tradérmica com sóro de pacientes.

6. °) Aparecimento do anticorpo intercelular antes do desenvolvimento das

bolhas típicas intraepiteliais.

No que pese a fôrça de sugestão dêstes argumentos, prova crucial da pato-

genicidade do autoanticorpo requer a produção das bolhas acantolíticas que carac¬

terizam a etiologia da doença.

As tentativas feitas neste sentido com sôros de casos de PV foram negativas

pois evidenciaram apenas a fixação do anticorpo à pele de macacos, coelhos e

cobaias, mas não o desenvolvimento das lesões características (5, 6, 7).

Grob & Inderbitzen (8) e Shu & Beutner (9) induziram a formação de

autoanticorpos anti-pele em coelhos, porém experiências de bloqueio da imuno-

fluorescência mostraram que tais anticorpos diferiam dos encontrados no PV ou

no PFB (9). Inderbitzen & Grob (10) referiram haver observado o desenvolvi¬

mento de lesões acantolíticas nos coelhos com alto teor de autoanticorpo, porém

o método empregado por êstes autores incluía a cauterização da pele com gêlo sê-

co, o que, por si só, é já capaz de provocar o aparecimento das referidas lesões.

Mfiis recentcmcnte, Chorzelski et al. (11) comunicaram haver obtido o de¬

senvolvimento de lesões acantolíticas mediante a injeção intracutânea em coelhos

de sôros de pênfigo diluídos em sôro de fase aguda (pneumonia, tuberculose),

seguida de tratamento local com 2,4 dinitroclorobenzeno (DNCB). Resultados

idênticos foram posteriormente referidos com sôros selecionados de casos de

PFB (12).

No presente trabalho, as experiências de transferência passiva em coelhos fo¬

ram ampliadas a fim de melhor definir o papel do sôro de fase aguda usado nas

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de sôros de doentes com título elevado de autoanticorpo. Mem. Inst. Butantan 35 : 79.94 1971 ’

experiências anteriores. Além disso, são também apresentados os resultados de

inoculações intracutâneas em macacos, nas quais se eliminou o tratamento local

com DNCB.

MATERIAL E MÉTODOS

Sôros — Sôros de PFB foram obtidos de casos agudos, esterilizados por fil¬

tração e mantidos, congelados ou liofilizados, a — 20^. Todos os sôros foram prè-

viamente titulados em relação ao teor de anticorpo intercelular, de acordo com o

método descrito em (2).

Como controles, utilizaram-se sôros de pacientes com doenças autoimunes

(lupus eritematoso sistêmico, myasthenia gravis, tireoidite), penfigóide bolhoso,

pneumonia, tuberculose, bem como sôros de indivíduos aparentemente normais.

Transferência passiva — Nas experiências em coelhos, os animais receberam

0.05 a 0.2 ml de sôro não diluído ou diluído a 1:2 na pele prèviamente raspada do

abdômen ou do dorso. Imediatamente após a injeção intradérmica, os sítios injeta¬

dos foram tratados com soluções de DNCB em concentrações variáveis de 0.1 a

5%. Na maioria das vêzes utilizaram-se soluções ala 2%. Numa série de expe¬

riências, ao invés do tratamento dos sítios injetados com DNCB, procedeu à cau¬

terização local com gêlo sêco durante 10 a 30 segundos.

O emprêgo dêstes irritantes teve como objetivo aumentar a permeabilidade

da barreira dermo-epidérmica. Sítios não injetados foram também irritados com

DNCB, a fim de servirem como controles.

Nas experiências em macacos (rhesus), 0.2 ml de sôro não diluído foram

injetados intradèrmicamente, uma, duas ou três vezes na mesma área cutânea,

a intervalos de 3-4 horas.

Biópsias —- Fragmentos de pele de áreas injetadas ou distantes foram reti¬

rados por biópsia 24-48 horas após a injeção intracutânea em coelhos. Nos

macacos, o intervalo das biópsias variou nos animais que receberam 1, 2 ou 3

injeções: a.) no caso de uma única injeção, as biópsias foram feitas após 3, 7 e

24 horas; b) no caso de duas ou três injeções, 3-4 horas após a segunda e 17

após a terceira.

por dois

apos a rerceira.

Os resultados das biópsias foram avaliados após leituras “cegas”,

m três investigadores, de espécimes codificados.

Colorações — Os fragmentos obtidos por biópsia foram fixados com formol

e corados pela hematoxilina-eosina, de acordo com a técnica histológica rotineira,

ou congelados e cortados em criostato para a técnica de imunofluorescência. O

conjugado anti-IgG humana utilizado foi prèviamente verificado com relação à sua

sensibilidade, mediante determinações de proteína (P), anticorpo (Ac) e fluores-

ccína (F), de acordo com métodos anteriormente descritos (13) e tal como

exemplificado na tabela 1. A concentração de anticorpo (em proteína) foi ajus¬

tada a 20-60 mcg/ml.

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de sôros de doentes com título elevado de autoanticorpo. Mem. Inst. Butantan 35: 79-94, 1971,

TABELA 1

Características do conjugado anti-IgG humano (anti-kappa e anti-lambda) usado

para a coloração imunofluorescente dos fragmentos de pele obtidos por biópsia

N.° do

conjugado

Anticorpo(Ac)

mg/ml

Fluores-

ceina(F)

mcg/ml

Proteína (P)

mcg/ml

Ac/F

F/P 1

310

3.4

108

10.6

31.5

10.2 1

RESULTADOS

Experiências em coelhos

Antes de proceder às tentativas de transferência passiva em coelhos, expe¬

riências prévias foram feitas para determinar: a) qual a concentração de DNCB

que poderia ser utilizada sem produzir dano epitelial em sítios não injetados; b)

que doses de sôro deveriam ser empregadas para produzir um grau de fixação

in vivo detectável pela metodologia utilizada.

Com relação ao primeiro item, verificou-se dano epitelial não específico com

DNCB a 5% em sítios não injetados e, por vezes, com a concentração de 2%

nos locais injetados com sôros controles. Por esta razão, a concentração de 1%

foi preferida na maioria das experiências.

No que concerne ao item b), resultados avaliados em 3 +, 2 + e + ou ±

foram obtidos, respectivamente, com 0.1, 0.05 e 0.025 ml de sôros PFB com

alto teor de anticorpo intercelular.

Experiências com um sôro selecionado de PFB

Uma primeira série de experiências foi realizada em abril-maio de 1968 com

o sôro PFB n.° 1, com elevado teor de anticorpo intercelular. 0.1 ml de sôro 1

mais 0.1 ml de sôro de fase aguda (pneumonia) foram injetados intradèrmica-

mente em 16 coelhos, seguindo-se tratamento local com DNCB a 2%.

A experiência revelou fixação do anticorpo in vivo em todos os animais ino¬

culados e formação de microbôlhas intraepidérmicas com células acantolíticas se¬

melhantes às encontradas no pênfigo humano em 6 dêles (tab. 2 e figs. 1-4).

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de sôros de doentes com título elevado de autoanticorpo. Mem. Inst. Butantan . 35: 79-94, 1971.

F '0. 1 e 2 — Imunofluorescência (IF) de pele de coelho injetada com 0.2 ml de uma diluição a 1:2

dc sôro de PFB em sôro de fase aguda. Tratamento do sítio injetado com DNCB a 2%. Nota-se não

sd a fixação do anticorpo intercelular, como também o aparecimento de lesões características intra-

epidérmicas. X 600.

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de sôros de doentes com título elevado de autoanticorpo. Mem. Inst. Butantan_ 35: 79-94, 1971.

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Fig. 3 — Corte ao criostato de pele de coelho injetada com 0.1 ml de sôro de caso agudo de pneu¬

monia e tratada com DNCB a 20%. Coloração pela hematoxilina-eosina. Derme à direita e em

baixo. Aspecto histológico normal. X 600.

Fig. 4 — Corte ao criostato de pele de coelho tratada como nas figuras 1 e 2. Coloração pela

hematoxilina-eosina. Microbôlha intraepitelial. X 600.

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de sôros de doentes com título elevado de autoanticorpo. Mem. Inst. Butantan _ 35 ; 79 - 94 , 1971 ,

Experiências realizadas, na mesma oportunidade, com o sôro de fase aguda

aquecido a 56? 30 minutos, deram resultado semelhante.

A experiência acima foi repetida em janeiro-fevereiro de 1969 e revelou en¬

fraquecimento da atividade do sôro, que só foi capaz de mostrar fixação in vivo

em 12 de 14 coelhos inoculados e não mais determinou a formação de microbô-

Ihas típicas (figs. 5 a 7).

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5 — Coloração de pele de coelho injetada com sôro de PRB rico em autoanticorpo. Notar a

torte coloração IF da substância intercelular e a formação de uma pequena bôlha intraepidcrmica no

local indicado pela seta. X 250.

ÍQ. 6 -— Idem. Bôlha sub-epidérmica inespecífica. X 250.

Fig. 7 — Coloração IF de pele de coelho injetada com sôro normal. A forte fluorescência à

superfície da pele resulta da ação de um autoanticorpo contra o stratum comeum, existente em

sôros normais. X 250.

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de sôros de doentes com título elevado de autoanticorpo. Mem. Inst. Butantan . 35: 79-94, 1971.

Numa segunda replicação da prova em março-abril de 1971, o fenômeno

se acentuou e houve fixação in vivo somente em 3 de 12 animais inoculados, sen¬

do que em nenhum deles se observou a formação de microbôlhas.

É interessante notar que esta modificação da reatividade do sôro não se

acompanhou de qualquer alteração do título de anticorpo intercelular, que se

manteve constante. A tabela 2 resume os resultados destas experiências num total

de 42 coelhos, durante o período de um ano.

TABELA 2

Experiências de transferência passiva com um sôro selecionado de PFB (Sôro 1)

em coelhos injetados pela via intradérmica.

Data da

experiência

Abril-maio/68

Jan.-fev./69

Março-abril/69

Reações observadas à transferência passiva

Número

Coelhos

Fixação

in vivo

Lesões

intraepidérmicas * *

Positivas

Duvidosas

Negativas

16/16

12/14

3/12

* As reações positivas correspondem a microbôlhas intra-epidérmicas com células acantolfticas e as

negativas a lesões semelhantes, porém não acompanhadas de acantólise.

Embora as lesões intradérmicas observadas no período de janeiro a feve¬

reiro de 1969 não se assemelham histològicamente às bolhas do pênfigo huma¬

no, elas parecem ser imunològicamente específicas, pois não se desenvolve¬

ram em grupos de controle inoculados com sôros não específicos. É pertinen¬

te ainda mencionar que sôros de casos de PFB que mostraram anticorpos inter-

celulares quando se usou como substrato esôfago de primata, mas não com esô¬

fago de coelho, também foram incapazes de fixar-se in vivo ou de produzir mi¬

crobôlhas à inoculação intradérmica no coelho.

Experiências com três outros sôros cie PFB

Em face do comportamento peculiar do sôro PFB n.° 1, experiências adicio¬

nais foram feitas com três outros sôros (N. os 2, 3 e 4) que apresentavam títulos

de anticorpo intercelular comparáveis ao Jo sôro n.° 1.

Estas experiências estão resumidas na tabela 3, na qual se evidencia que a

proporção de sítios imunofluorescentes (fixação in vivo ) foi de 53/59 para o

sôro 1 e de 22/38 para os sôros 2, 3 e 4. Quanto à formação de microbôlhas,

foi sempre do tipo não acantolítico e ocorreu na proporção de 53/99 com o sôro

1 e de 22/38 com os sôros 2, 3 e 4. Em 72 controles jamais se observou, seja

fixação in vivo, seja formação de bolhas intraepidérmicas.

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de sôros de doentes com título elevado de autoanticorpo. 31 cm. Inst. Butantan . 35 : 79 - 94 , 1971 ,

TABELA 3

I Fixação in vivo e desenvolvimento ds lesões intraepidérmicas em coelhos injeta¬

dos com 4 diferentes sôros de PFB e 20 sôros de não penfigosos.

Sôros

injetados

Título de

anticorpo

intercelular

N.° de sítios

injetados

Proporção de

sítios imuno¬

fluorescentes

Proporção de

sítios com le¬

sões intraepi¬

dérmicas

PFB N.° 1

1280

53/99

5/53

PFB Ns.° 2-4

640 a 2560

22/38

8/22

Contrôles *

0/72

Os contrôles incluem biópsias de sítios injetados com 1 de 20 sôros não penfigosos mais 14 sítios

não injetados e tratados comí DNCB.

Os resultados precedentes levaram a reexaminar o papel do sôro de fase

pguda (tuberculose, pneumonia aguda) com relação à fixação in vivo e à pro¬

dução de lesões pelo sôro PFB.

Em experiências nas quais o sôro 1 foi diluído em sôro de fase aguda ou

Fm salina, a proporção de sítios imunofluorescentes foi de 32/57 (cêrca de 56%)

Ro primeiro caso e de 16/26 (cêrca de 61%) no segundo. Não parece, portanto,

pue a adição de sôro de fase aguda desempenhe qualquer papel na fixação in vivo

po anticorpo intercelular.

No que concerne ao desenvolvimento de lesões intraepiteliais, puderam tam-

pém ser obtidas na ausência do sôro de fase aguda.

Experiências em macacos

Sete sôros de PFB foram injetados em rhesus por via intradérmica e a in-

| e nsidade de fixação in vivo foi verificada em fragmentos de pele retirados por

piópsia ao nível dos sítios de inoculação após intervalos de 3, 7 e 24 horas.

Como indicado na tabela 4, as variações de intensidade da fixação in vivo

|°ram paralelas às variações de título de anticorpo intercelular. Por exemplo, os

lôros Le e Fe, com títulos inferiores a 1:80 (com pele de macaco) exibiram ca¬

pacidade de fixação fraca ( + ) e limitada à camada basal da epiderme, em con-

pste com o sôro Ci (título de 1:1280), que mostrou forte intensidade de fixa-

lão ( + + + + ), extensiva a tôda a epiderme. Sôros com títulos entre 1:160 e

11320 exibiram comportamento intermediário (fig. 8).

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TABELA 4

Relação entre o título de anticorpo IF intercélular e a intensidade de fixação à

pele do macaco após uma injeção única de sôro de PFB

Sôro

Título de anticorpo

(pele de macaco)

Grau de fixa¬

ção in vivo

Localização

da IF

basal

RoA

160

basal

160

+++

basal

320

+++

basal

320

+++

total

1280

++++

total

Fig. 8 — Fixação in vivo de anticorpos intercelulares à pele do macaco 3 horas após injeção única

de 0.2 ml de sôro de PFB com titulo médio de autoanticorpo (Sôro AM). X 1000.

Quatro dos sôros precedentes e mais dois outros (SiA, AM), bem como

um “pool” de 4 sôros de título mais baixo foram experimentados num esquema

de 1, 2 ou 3 injeções, conforme especificado na tabela 5.

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de sôros de doentes com título elevado de autoanticorpo. Mem. Inst. Butantan J 35: 79-94, 1971.

Embora a fixação in vivo tenha ocorrido, em qualquer caso, em cerca de

80%, o desenvolvimento de lesões só teve lugar à repetição das injeções na mes¬

ma área cutânea.

É de notar que nos sítios inoculados duas vezes, apenas o sôro Ci, de alto

título (1:1280 com pele e 1:5120 com esôfago de macaco) foi capaz de produ¬

zir lesão intra-epidérmica (3/4).

Nos animais que receberam 3 injeções, embora tenha havido correlação entre

a frequência do aparecimento de lesões características e o título de anticorpo

intercelular, houve uma exceção (sôro Li), para a qual não há explicação plau¬

sível.

As figuras 9 e 11 ilustram o aspecto das lesões, à imunofluorescência, com

duas injeções do sôro Ci (figs. 9 e 10) ou do sôro Ro (fig. 11).

Fio. 9 — Microbôlha intraepidérmica cm macaco injetado duas vezes com 0.2 ml de sôro de PFB

com título elevado de autoanticorpo (Sôro Ci). Biópsia feita 7 horas após a primeira injeção. IF

intercelular no epitélio do teto e na cavidade da bôlha. Quadro imunopatológico semelhante ao

observado no PV. X 500.

Fio. 10 — Idem. X 1000

Fio. 11 — Microbôlha intraepidérmica com células epiteliais livres em macaco injetado três vezes

com 0.2 ml de sôro de PFB de título médio (Sôro Ro). Biópsia feita 24 horas após a primeira

injeção. Notar a coloração IF difusa, que sugere tenham-se eliminado do sítio os anticorpos inter-

celulares, deixando apenas as lesões por êles causadas. X 500.

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de sôros de doentes com título elevado de autoanticorpo. Mem. Inst. Butantan . 35: 79-94. 1971.

As figuras 12 e 13 representam, em coloração por hematoxilina-eosina, o

aspecto de lesões verificadas em biópsias de pele 7 horas após a injeção inicial

de sôro Ci injetado duas vezes (fig. 12) ou 24 horas após a injeção inicial do

sôro Ro injetado três vezes na mesma área cutânea (fig. 13).

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Fig. 12 — Microbôlha intraepidérmica acantolítica sem células inflamatórias consecutiva a 2 injeções

intradérmicas de sôro Ci. Biópsia feita 7 horas após a primeira injeção. Coloração por hematoxilina-

eosina. X 1000.

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Fig. 13 — Microbôlha intradérmica com algumas células acantolíticas e numerosos leucócitos em

macaco injetado 3 vêzes com 0,2 ml de sôro Ro. Biópsia feita 24 horas após a injeção inicial.

Coloração por hematoxilina-eosina. X 1000.

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BEUTNER, E., WOOD, G. W.. CHORZELSKI, T. P., ABREU LEME, C. e BIER, O. G. — Produção

dc lesões semelhantes às do Pênfigo Foliáceo pela injeção intradérmica, cm coelhos e macacos,

de sôros de doentes com título elevado de autoanticorpo. Mem. Jnst. Butanlan , 35: 79-94, 1971.

Nas lesões provocadas por 3 injeções e retiradas por biópsia após 24 ho¬

ras, a coloração intercelular à imunofluorescência foi muito mais fraca e de ca¬

ráter difuso (fig. 11).

Na figura 12 a lesão não se acompanhou de reação inflamatória, ao con¬

trário do que se verifica na figura 13.

Nenhuma fixação de IgG ou desenvolvimento de lesão se observou em 61

sítios controles injetados três vezes com 1 de 45 sôros não penfigosos Bolhas

sub-epidérmicas foram ocasionalmente observadas nos animais inoculados 2 ou 3

vezes e com igual frequência nos sítios injetados com sôros PFB ou com sôros

não especificados. Tais reações foram classificadas como negativas, pois em nada

se assemelham às lesões características do pênfigo.

DISCUSSÃO

A indução experimental de microbôlhas intraepidérmicas acantolíticas his-

tològicamente semelhantes às observadas no pênfigo humano foi conseguida, nu¬

ma primeira série de experiências em coelhos, mediante a injeção intracutânea de

um sôro selecionado de PFB (Sôro n.° 1) diluído em sôro de fase aguda e tra¬

tamento local do sítio injetado com DNCB. A conservação dêste sôro no labora¬

tório, em estado congelado, a - 20'-’, foi, porém, acompanhada de uma redução

progressiva de sua capacidade de fixar-se in vivo à pele do coelho e de produzir

as lesões características, embora se tenha mantido constante o seu teor de anti¬

corpos intercelulares reveláveis por IF.

Bolhas intraepidérmicas não acantolíticas puderam, entretanto, ser produ¬

zidas com o sôro N.° 1 “envelhecido”, bem como com três outros sôros de PFB

ricos em anticorpo intercelular. Tais microbôlhas diferem das observadas no pên¬

figo humano, porém são imunològicamente específicas, pois não foram observadas

à injeção de sôros não penfigosos ou de um sôro dc PFB positivo em título ele¬

vado quando ensaiado à imunofluorescência com esôfago de primata, mas não

com esôfago de coelho.

Nas experiências em macacos foi eliminado o tratamento adjuvante destinado

a aumentar a permeabilidade dermo-epidérmica (diluição em sôro de fase aguda

e aplicação local de DNCB). Substituiu-se, ao invés, a injeção única de sôro por

duas ou três injeções repetidas, na mesma área cutânea, com o objetivo de expôr

a epiderme, durante um período de tempo prolongado, a uma concentração ele¬

vada do anticorpo anti-pênfigo. Isto é, de alguma maneira, o que ocorre nos

doentes, nos quais se verifica paralelismo entre o teor de autoanticorpo circulante

e a gravidade das lesões cutâneas.

Dentro desta ordem de idéias, caso os anticorpos autoimunes do sôro de

PFB estivessem envolvidos no desenvolvimento da lesão acantolítica, era de es¬

perar que lesões semelhantes às do pênfigo humano pudessem ser provocadas pe¬

la injeção repetida de antisôros ricos em anticorpo intercelular. Tal previsão foi

confirmada pelas experiências relatadas neste trabalho, em condições nas quais

foram inteiramente negativos os resultados obtidos com sôros de controle não

penfigosos.

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BEUTNER, E., WOOD. G. W.. CHORZELSKI. T. P.. ABREU LEME, C. e BIER. O. G. — Produção

de lesões semelhantes às do Pênfigo Foliáceo pela injeção intradérmica, em coelhos e macacos,

de sôros de doentes com título elevado de autoanticorpo. Mem. Inst. Butantan . 35: 79-94, 1971.

Bôihas volumosas, tais como se observam no pênfigo humano, não puderam,

entretanto, ser obtidas experimentalmente no macaco, sendo razoável supôr que

a presença de numerosos folículos pilosos nas áreas cutâneas injetadas possam de

certo modo impedir o desenvolvimento das microbôlhas. Experiências em curso

visam, por isso, esclarecer a especificidade das bolhas relativamente grandes que

podem ser obtidas mediante a injeção repetida de sôros de PFB na mucosa oral

de primatas. A ação lesiva da fração IgC dos sôros de PFB ou de frações purifi¬

cadas obtidas por meio de imunoadsorventes específicos está sendo também in¬

vestigada.

SUMMARY — Intraepidermal changes

resulted from intradermal injections

of rabbits and monkeys with sera of

patients suffering from Brazilian

Pemphigus Foliaceus (BPF) which

contained ligh titers of pemphigus in-

tercellular immunofluorescent antibo-

dies.

In the rabbit experiments the intra¬

dermal injection of serum was follo-

wed immediately by treatment with

a l°/o or 2% solution of 2,4 dinitrochlo-

robenzene. With one selected serum

(Serum N.° 1) intraepidermal lesions

similar to those seen in human pem¬

phigus were demonstrated both by

immunofluorescence and by histopa-

thology. Three other sera produced

intraepidermal clefts without acan-

tholytic cells and the same behavior

was shown by Serum N.° 1 after

“aging” in the laboratory in the frozen

State at - 20.°.

11 BPF sera were tested for their

ability to transfer the characteristic

epidermal lesion of pemphigus to

monkeys.

Sera were injected one, two or

three times in the same intradermal

site. Intraepidermal acantholytic mi¬

cro bullae were frequently observed

foliowing two or three injections of

sera with high intercellular antibody

titers, but only occasionally following

one single injection.

UNITERMS — Pemphigus Foliaceus;

Passive Transfer of Pemphigus-like

Lesions; Autoimmunity in Pemphigus

Foliaceus.

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BEUTNER. E„ WOOD. G. W.. CHORZELSKI, T. P„ ABREU LEME, C. e BIER. O, G. — Produçtão

de lesões semelhantes às do Pêntigo Foliáceo pela injeção intradérmica, em coelhos e macacos,

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13. BEUTNER, E. H., Ann. N. Y. Ac Sc., 177: 506, 1971.

Recebido para publicação em 20 de dezembro de 1971.

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Mem. Inst. Butantan

35: 95-105, 1971.

ESTUDO COMPARATIVO DA ALERGIA TUBERCULÍNICA E DA

PROTEÇÃO CONFERIDA PELA VACINA BCG, VIA ORAL E

INTRADÉRMICA, EM COBAIOS

BRUNO SOERENSEN * *, JANDYRA PLANET DO AMARAL **, MARTHA MARIA MUTTI PEREIRA *** e

MARIA ANTONIETA DA SILVA ***

Serviços de Controle e Técnicas Auxiliares e de Bacteriologia

Instituto Butantan

RESUMO — Foram administradas

doses equivalentes de BCG em gru¬

pos de cobaios pelas vias oral e intra-

dérmica.

Um terceiro grupo não vacinado

serviu de controle.

A capacidade alergizante dos dois

métodos de vacinação foi verificada

através da reação à tuberculina.

45 dias após a vacinação, os ani¬

mais vacinados e os do grupo con¬

trole foram submetidos à inoculação

de prova com pequena e grande car¬

ga da cêpa virulenta H37.Rv, por via

traqueal. A observação dos animais

vacinados mostrou que a capacidade

alergizante da vacina BCG adminis¬

trada pela via intradérmica (0,1 mg)

foi superior à da vacina administra¬

da pela via oral.

Embora a vacinação pela via oral

tenha induzido certo grau de resis¬

tência, os dados experimentais indi¬

cam que, na cobaia, a administração

de 0,1 mg de BCG pela via intradér¬

mica tem poder imunizante superior

ao da vacinação oral em 100 mg.

UNITERMOS : BCG; Tuberculose ex¬

perimental; Imunização contra a tu¬

berculose; BCG e alergia tuberculíni-

ca.

A vacinação BCG por via oral foi proposta originalmente por Calmette.

Posteriormente, passou-se a utilizar a via parentérica, em particular, a vacinação

intradérmica, que foi adotada em numerosos países inclusivamente na França.

A via oral tem a seu favor a simplicidade de execução, porém, é vista com

reserva por vários experimentadores, em virtude de despertar alergia tuberculínica

em grau menor do que o provocado pela vacinação intradérmica.

A absorção e difusão do BCG pela via digestiva em animais de laboratório

foi verificada, entre outros, por Nélis (13-14) através do reisolamento do sangue

e pulmão de cobaios jovens; por Gernez-Rieux e col. (7), pela recuperação do

Trabalho realizado cora o auxílio do Fundo de Pesquisas do Instituto Butantan.

* Diretor do Serviço de Controle e Técnicas Auxiliares do Instituto Butantan.

** Diretor da Divisão de Microbiologia — Diretor Geral do Instituto Butantan.

*** Assistentes do Serviço de Bacteriologia do Instituto Butantan.

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SOERENSEN, B.; AMARAL, J. P.; MUTTI PEREIRA, M. M. e SILVA. M. A. — Estudo Comparativo

da Alergia Tubcrculínica e da Proteção Conferida Pela Vacina BCC. Via Oral e Intradérmica em

Cobaios. Mem. Inst. Butantan. 35: 95-105, 1971.

BCG na linfa do canal torácico de cobaios; por Archipova (2), em experiências

com BCG marcado com P ;)2 e inoculado pelas vias intradérmica, subcutânea e

oral em cobaios. Esta última técnica permitiu estabelecer que o BCG, adminis¬

trado pela via oral, já é encontrado no sangue e nas vias linfáticas 30 minutos

após.

A absorção do BCG através da via digestiva também foi verificada no ho¬

mem por Zeyland e Piasecka-Zeyland (16) pelo isolamento dos linfonodulos me-

scntéricos de crianças que faleceram de outras causas que não a tuberculose, bem

como por Calmette e col. (4), ao verificarem a presença do BCG no sangue de

crianças após a ingestão da vacina.

Quanto à proteção da vacina administrada pela via oral em cobaios, Ama¬

ral e Soerensen (1) verificaram um aumento do tempo de sobrevida na tuber¬

culose experimental.

Kreis (8), comparando a eficiência do BCG oral e intravenoso em camun¬

dongos, refere que o grau de proteção conferido é o mesmo com ambas as vias,

porém Nagata (11), trabalhando com coelhos, assinala maior proteção dos ani¬

mais inoculados com doses repetidas de BCG pela via intradérmica do que pela

via oral. Drabkine e Sukhodolskaya (5), concluem que doses repetidas de BCG

oral podem conferir a cobaios resistência à infecção tuberculosa semelhante à con¬

ferida pelo método de escarificação.

Finalmente, diversos autores verificaram à necropsia de cobaios prèviamen-

te vacinados com BCG por diversas vias, diferenças apreciáveis com relação ao

grupo não vacinado, indicando maior grau de resistência para os primeiros (3,

12, 9, 6, 15).

No presente trabalho procuramos verificar comparativamente o efeito pro¬

tetor e a capacidade alergizante da vacina BCG administrada pela via oral e pela

via intradérmica em cobaios.

MATERIAL E MÉTODOS

Verificação da proteção conferida pela vacina BCG, por via oral ou intradérmica,

ante a inoculação de prova de grande carga bacilar (8 milhões de bacilos )

Utilizamos três grupos de cobaios machos, pesando aproximadamente 350 g.

O primeiro grupo de 86 animais recebeu 100 mg de BCG em 5 ml, pela via

oral, através de sonda esofagiana (sonda uretral gomada n.° 7). O segundo gru¬

po de 83 animais recebeu 0,1 mg de BCG em 0,1 ml., pela via intradérmica. O

último grupo de 78 cobaios não recebeu vacina, servindo de controle.

A vacina usada foi preparada no Instituto Butantan com a cêpa Moreau.

Com a finalidade de observar o tempo de sobrevida dos três grupos de co¬

baios, administramos, após 45 dias de imunização, uma grande carga bacilar de

H37.Rv em 0,1 ml., por via traqueal (8 milhões de bacilos), obedecendo à técni¬

ca descrita por Lorian (10).

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da Alergia Tuberculínica e da Proteção Conferida Pela Vacina BCC. Via Oral e Intradérmica em

Cobaios. Mem. Inst. Butantan. 35: 95-105. 1971.

Os animais pertencentes aos três grupos foram conservados em idênticas con¬

dições e, para cada grupo, determinou-se a percentagem de mortalidade, através

de um período de 130 dias, ao fim do qual, o grupo controle já havia atingido

100% de letalidade. Todos os animais foram necropsiados a fim de serem subme¬

tidos a estudo anatomopatológico.

Verificação da capacidade alergizante conferida pela vacina BCG, vias oral e

intradérmica, e da proteção ante a inoculação de prova de pequena carga bacilar

(1 a 10 bacilos).

Utilizamos também três grupos de cobaios: o primeiro, de 78 animais, re¬

cebeu 100 mg de BCG pela via oral; o segundo, de 80 animais, recebeu 0,1 mg

de BCG em 0,1 ml pela via intradérmica e o terceiro, de 88 cobaios, serviu de

controle.

45 dias após a vacinação, todos os grupos foram submetidos à prova tu¬

berculínica, mediante a injeção intradérmica de tuberculina OT diluída a 1/10

(aproximadamente, 1000 U.T.).

48 horas depois, procedeu-se à leitura da reação e, logo a seguir, adminis-

trou-se pequena carga bacilar de H37.Rv, representada por 1 a 10 bacilos em 0,1

ml, por via traqueal.

Os animais pertencentes aos três grupos foram mantidos em idênticas con¬

dições, sendo determinada a letalidade para cada grupo durante o período de 210

dias, quando a letalidade dos diferentes grupos de cobaios proporcionou dados

capazes de permitir uma avaliação da proteção. Todos os animais foram necrop¬

siados e submetidos a exame anatomopatológico.

RESULTADOS

Os resultados da primeira série de experiências, resumidos na Tabela I e

no Gráfico correspondente (Fig. 1), permitem uma estimativa aproximada do

grau de proteção conferido pela vacina administrada pelas duas vias, ante a ino¬

culação de prova de uma grande carga bacilar. É interessante destacar três pon¬

tos principais: 1) Pràticamente durante todo o período de observação, a letali¬

dade no grupo que não recebeu BCG foi superior à dos grupos vacinados. 2) A

proteção dos grupos de animais vacinados pelas vias oral e intradérmica foi mais

ou menos a mesma. 3) A percentagem de cobaios que, ao exame macroscópico,

revelou comprometimento tuberculoso, foi maior no grupo controle que nos gru¬

pos vacinados, sendo de assinalar que o grupo vacinado pela via intradérmica

mostrou percentagem ligeiramente inferior de animais portadores de lesões, quan¬

do comparado ao grupo vacinado pela via oral (Tabela III).

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TAPEIA I

FROTEÇXO LA VACIIiA B.C.G. VIA ORAL E IlfiTUDfcLICA Eh COBAIOS

(inoculação de Frova: H.37 Rv 8 milhões de bacilos via traqueai, após 45 dias de transcorrida a vaciiiação)

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da Alergia Tuberculínica e da Proteção Conferida Pela Vacina BCC. Via Oral e Intradérmica em

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Cobaios. Mera. Inst. Butantan. 35: 95-105, 1971.

Fig.l

PROTEÇÃO DA VACINA B.C.CVIA ORAL E INTRADÉRMICA EM COBAIOS

(Inoculação d* Provo:-H. 37 Rv. (8 mitiõas d* bacilos) vio traqueol, após 45 dia* d* transcorrida o Vacinação)

.Controla (H.37 Rv -8 milho'** d* bacilos via traqu*al) 78 cobaios.

. B.C.6. 100 mg. vlo orol (H.37 Rv.-0 milhõas d* bocilos vio troquaol) 86 coboio*.

. BCG. O.l mg. vio Introdármlca (H.37. Rv. - 8 milhõas d* bacilos vio troquaol) 83 cobolos

Númaro obsoluto d* mortos

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Cobaios. Mem. Inst. Butantan. 35: 95-105, 1971.

Numa segunda série de experiências, a capacidade alergizante da vacina ad¬

ministrada pela via oral foi comparada à da via intradérmica, tendo-se verificado

uma percentagem de positividade superior na vacinação pela via intradérmica à

da vacina administrada pela via oral. O grupo não vacinado não revelou qual¬

quer grau de alergia (Fig. 2).

Fio .2

ESTUDO COMPARATIVO DA ALERGIA TUBERCULÍNICA DE COBAIOS

VACINAD08 COM B.C.0-V1A ORAL E VIA INTRADÉRMICA

Via oral lOOmg.; via intrcdermlco O.lmg.

(Tuberculina bruta l/IO;45 dio9 apde vacinaçao)

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ÁREA DE REAÇÃO

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□ 60 Cobaios via Intradérmica

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Cobaios. Mem. Inst. Butantan. 35: V5-105. 1971.

Quanto ao grau de proteção conferido pela vacina administrada pelas duas

vias à inoculação de prova com pequena carga bacilar, cumpre destacar o seguin¬

te: 1) Pràticamente durante todo o período de observação, a letalidade no grupo

de animais que não recebeu BCG foi significativamente superior à dos grupos

vacinados (Tabela II e Fig. 3). 2) A proteção conferida pela via intradérmica foi

superior à conferida pela via oral. 3) A percentagem de cobaios não vacinados

que, ao exame macroscópico, revelaram comprometimento tuberculoso, foi supe¬

rior às percentagens observadas nos vacinados e, nestes, o grupo que recebeu BCG

pela via intradérmica mostrou comprometimento menor que o grupo vacinado

pela via oral (Tabela III).

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Cobaios. Mem. Inst. Butantan. 35: 95-105, 1971.

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da Alergia Tuberculínica e da Proteção Conferida Pela Vacina BCC. Via Oral e Intradérmica em

Cobaios. Mem. Inst. Butantan. 35: 95-105. 1971.

CONCLUSÕES

1) A capacidade alergizante da vacina BCG administrada pela via intradér.

mica (0,1 mg) é superior à da vacina administrada pela via oral. 2) A proteção

da vacina avaliada através da letalidade ante uma inoculação de prova de grande

carga bacilar não revelou diferença apreciável quanto aos dois métodos de vaci¬

nação, porém, quando a inoculação de prova foi de pequena carga bacilar, o mé¬

todo intradérmico mostrou-se superior ao método de vacinação oral. 3) o grau

de proteção, avaliado pela percentagem de cobaios que, ao estudo macroscópico,

revelou lesões tuberculosas ante uma inoculação de prova com grande ou peque¬

na carga bacilar, evidenciou a superioridade da vacinação pela via intradérmica.

4) Destas observações parece lícito concluir que o método de vacinação BCG

intradérmico (0,1 mg) revela capacidade imunizante superior à do método oral

(100 mg), embora êste também seja capaz de induzir certo grau de proteção.

SUMMARY — Three groups of gui-

nea-pigs were used: Groups I and II

received BCG doses, respectively by

the oral and intradermel route, equi-

valent to those used fou human vac-

cination, and Group III included un-

vaccinated Controls.

The allergic reactivity of the vacci-

nated groups was determined by the

tuberculin test.

After a certain period of time, all

vaccinated and control animais were

challenged by tracheal inoculation of

low and high concentrations of the

H37Rv strain of M. tuberculosis. Exa-

mination of the two vaccinated

groups showed that the allergic reac¬

tivity was higher in the intraderma-

lly vaccinated group than in the oral

immunized animais.

The conclusion is drawn that gui-

nea-pigs injected intradermally with

0,1 mg BCG showed a higher degree

of resistance to virulent. M. tubercu¬

losis when compared to the group

which received 100 mg of BCG by

mouth.

However, when Groups I and III

were compared, conspicuous degree

of protection was found, providedthe

challenge was made with a small

amount of virulent bacilli.

UNITERMS: BCG; Experimental

Tuberculosis; Imunization against

Tuberculosis; BCG and Tuberculin

Allergy.

104

SciELO

10 11 12 13 14 15

SOERENSEN, B.; AMARAL, J. P.; MUTTI PEREIRA, M. M, e SILVA. M. A. — Estudo Comparativo

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Recebido para publicação em 25 de novembro de 1971.

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Mcm. Inst. Butantan

35: 107-109, 1971.

MICRURUS UEMPR1CH11 HEMPRICHII RECORDED FOR BRAZIL *

(Serpentes Elapidae)

A. R. HOGE and S. A. ROMANO

OSeção de Herpetologia, Instituto Butantan).

ABSTRACT: Micrurus hemprichü hem-

prichii (Jan) is recorded for Brasil.

The study of avaiable specimens

shows that Micrurus hemprichü hem-

prichii occurs in the lowlands of mé¬

dium and lower Amazon, Guianas, and

Orenoco drainage; Micrurus hempri-

chii ortoni; Schmidt, occuring on the

higher places of the Upper Amazon

drainage.

UNITERMS:

Micrurus hemprichü hemprichü

(Serpentes Elapidae);

States of Pará and Amazonas (Brazil);

Micrurus hemprichü ortoni. Tefé,

Amazonas (Brazil).

Till now the only record of Micrurus hemprichü for Brazil was based on a

specimen mentioncd by Schmidt (1953:165-166), from “Belém”, without number

in the Munich collection. This specimen was identified by Schmidt as Micrurus

hemprichü ortoni, but the locality “Belém” so far away from the range of this

subspecies suggested to him that the specimen was either transported by man or

by rafting from the upper Amazon.

Three specimens now available permit us to give some additional Informa¬

tion about the distribution of Micrurus hemprichü.

Micrurus hemprichü Jan.

1858 Elaps hemprichü Jan, Rev. Mag. Zool., 10:523.

1929 Micrurus hemprichir, Amaral, Mem. Inst. Butantan, 4:230.

Distribution : Northern south America east of the Andes.

Content: Two subspecies.

* Supported by a Grant of Conselho Nacional de Pesquisas and National Library of Medicine.

Adress :

C. P. 65, São Paulo, Brazil.

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HOGE, A. R. and ROMANO, S. A. — Micrurus hemprichii hemprichn rçcorded for Brazil. Mem. Inst.

Butantan, 35 : 1971. 35: 107-109, 1971.

Micrurus hemprichii hemprichii

1953 Micrurus hemprichii hemprichii ; Schmidt,, Fieldiana Zool., 34:166.

1970 Micrurus hemprichii hemprichii ; Roze in Peters et Orejas U.S.N.M.

297:210.

Type locality: Colombia.

Range: Eastern Colombia, Southern Venezuela, the Guianas, and Brazil from

the State of Pará to Amazonas (Manaus).

Material: IBH„ 20.678, from Km 86 on the BelénvBrasília road, State of

Pará, Brazil, Gol. E. Dente, 7-1960. INPA, 1.160, “Reserva Duke” near Ma¬

naus, Amazonas, Brazil, Col. A. C. Maranhão Nina.

Description: IBH, 20.678, a 9 ; dorsais 15-15-15; ventrals 166; anal un-

divided; 30/30 subcaudals; 7-7 upper labiais. Head 9 mm; body 205 mm; tail

22 mm. Seven and 1/3 triads on body and 1 on tail INPA, 1 .160, a cf ; dorsais

15-15-15; ventrals 183; anal undivided; 28/28 subcaudals; 7-7 upper labiais; 7-7

lower labiais. Head 18 mm; body 670 mm; tail 60 mm; 8 triads on body and 1

on tail. The scales of nuchal collar bordered with black.

Micrurus hemprichii ortoni

1953 Micrurus hemprichii ortoni Schmidt, Fieldiana Zool. 34:166.

1970 Micrurus hemprichii ortoni, Roze in Peters et Orejas U.S.N.M. bul.,

297:210.

Type locality: Pebas, Peru.

Range: Amazonian slopes of Southern Colombia, Equador; Peru, Bolivia and

Brazil (Tefé, State of Amazonas, Brazil). The specimen from Belém mentioned by

Schmidt is obviously not from this locality.

Material: A single specimen from Tefé, Amazonas, Brazil, Col. by A. R.

Hoge and J. D Cavalheiro, 9-23-52, a 9 , dorsais 15-15-15; ventrals 181; 23/23

subcaudals; anal undivided; 7-7 upper labiais; 7-7 lower labiais. Head 9 mm;

body 208 mm; tail 19 mm. Six triads on body and 1 on tail.

Discussion — The wide gap between the areas of distribution of the subspe-

cies mentioned by Schmidt no longer exists. Is is interesting to note that all known

specimen of M. hemprichii ortoni (exception of the Munich specimen already

mentioned) are from the highlands, and the M. hemprichii hemprichii from the

lower parts of the Amazon from the Guianas and Orenoco drainage.

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2 3

5 6

10 11 12 13 14 15

HOGE, A. R. and ROMANO, S. A. — Micrurus hemprichii hemprichii recorded for Brazil. Mem. Inst.

Butantan, 35: 107-109, 1971.

RESUMO: — Ficou registrada a ocor¬

rência de Micrurus hemprichii hem¬

prichii (Jan) no Brasil. Com os exem¬

plares estudados, as áreas de distri¬

buição da subspecies, antes extrema¬

mente afastadas, ficaram próximas.

Micrurus hemprichii hemprichii (Jan)

ocorre nas terras baixas do médio e

baixo Amazonas, Guianas e Bacia do

Orenoco.

UNITERMOS:

Micrurus hemprichii hemprichii

(Serpentes Elapidae);

Estados do Pará e Amazonas (Brasil);

Micrurus hemprichii ortoni, Tefé,

Amazonas (Brasil).

ACKNOWLEDGEMENTS

We are indebted to the Conselho Nacional de Pesquisas for a Grant awarded

to the junior author; to the National Library of Medicine grant LM 00418-01. To

Dr. Afonso Celso do Maranhão Nina from the Instituto Nacional de Pesquisas

Amazonas for the loan of specimens; and to Dr. Ramon A. Lancini from the

Museo de Ciências Naturales de Caracas for the loan and gift of specimes.

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Recebido para publicação em 14 de setembro de 1971.

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cm l

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10 11 12 13 14 15

Mem. Inst. Butantan

35: 111-115, 1971.

NOTES ON LEPTOMICRURUS SCHMIDT

(Serpentes Elapidae )

SYLVIA ALMA R. W. L. ROMANO

(Seção de Herpetologia, Instituto Butantan)

ABSTRACT — The genus Leptomi-

crurus Schmidt is synonymized with

Micrurus Wagler.

Micrurus collaris (Schlegel) is re-

corded for the first time from Brasil.

The specific name schmidti is chan-

ged (nom. nov.) to karlschmidti on

the grounds of the homonymy raised

by the inclusion of the former Lepto-

micrurus schmidti in the genus Mi-

crurus.

UNITERMS: Leptomicrurus Schmidt

(Serpentes Elapidae)

Presence of annuli; Leptomicrurus

synonymized with Micrurus Wagler.

In previous publication Hoge and Romano, 1966, described a new species,

L. schmidti, from Tapurucuàra, Amazonas, Brazil, and recorded definetly L.

narduccii from the State of Acre, Brazil.

Three specimens of Leptomicrurus now available enable us to give some

additional information.

Schmidt (1937: 377) based his new genus Leptomicrurus on the meeting of

mental and chin shields and on the presence of ventral spots without tendency

to form annuli. The first character, or meeting of mental and chin shields is adven-

titious in several species of Micrurus (Schmidt, 1936: 200, and 1937:363).

Actually the absence of rings was the only distinctive character between Micrurus

and Leptomicrurus.

Two specimens of Micrurus narduccii from Brazil, Amazonas, show reddish

annuli on the anterior part of the body.

Museum Bocage n.° 1401 a, dorsais 15-15-15; 266 ventrals; anal divided;

19/19 subcaudals; 7-7 upper labiais; temporais 1 + 1; 7-7 lower labiais. Length

of head 8,7 mm, body 380 mm, tail 20 mm. The lst and 2 nd ventral blotches

are in contact dorsally forming complete annuli, although vcry narrow on dor-

sum. The 3 th and 4th forming nearly complete annuli; the remaining, although

not forming distinct annuli, are joined on the dorsum by a series of whitish spots.

All ventral blotches reach the 4th, 5th, or even 6th dorsal row, forming triangular

lateral blotches.

Supportcd by a grant of Conselho Nacional de Pesquisas

Address. C. P. 65, São Paulo, Brazil

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ROMANO, S. A. W. L. — Notes on Leptomicrurus Schmidt (Serpentes Elapidae). Mem. Inst.

Butantan. 35: 111-115, 1971.

Museum Bocage 1401 b, dorsais 15-15-15; 257 ventrals, anal divided;

13/14 +n subcaudals; 7-7 upper labiais; lower labiais mutilated; length of head

9,7 mm; body 4,5 mm; tail 15 + n mm. The first 8 annuli complete, dorsally

constricted at (1-3 scales long); the annuli 8 to 14 incomplete but connected

dorsally by indistinct whitish spots. The remaining ones are separated; 4 com¬

plete annuli on tail. In this specimen large black rings alternate with smaller ones,

giving the impression of triads.

Consequently none of the characters used to separate Micrurus from Lepto-

micrurus are stable and Leptomicrurus should return to the synonymy of Micru¬

rus.

It should be mentioned that the temporal formula of 0+1 used by Schmidt

and all subsequent authors, is also a variable character, as observed in a speci¬

men of collaris (0+1 on one side and 1 + 1 on the other).

Micrurus collaris (Schlegel)

1837 Elaps collaris Schlegel, Essai Physion. Serp., 1:181; 2:448.

1844 Elaps gasírodelus Duméril, Bibron et Duméril, Erp. Gen. 7(2):

1212 — Type locality: unknown.

1881 Elaps collaris ; Kappler, Hollandish Guiana. Erg. v. Erf. etc. 167.

1886 Hemibungarus collaris; Boettger, Ber. Senck. Natf. Ges. 1885/1886:

117.

1937 Leptomicrurus collaris; Schmidt, Zool. Ser. Field Mus. Nat. Hist. XX

n.° 26:361-354.

1966 Leptomicrurus collaris; Hoge et Romano, Mem. Inst. Butantan (1965);

31:4, fig. 3,3 a-c.

1969 Leptomicrurus collaris; Hoge et Romano, Ciência e Cultura, 21(2):

454.

Type locality : designated (Hoge et Romano, 1966), the Guianas.

Distribution: South-eastern Venezuela; the Guianas and State of Pará,

Brazil.

Material:A. single specimen IBH.25.593, a c? from Icoarací, Belém, State

of Pará, Brazil.

Micrurus karlschmidti nom. nov. *

1966 Leptomicrus schmidti (error typographicus pro Leptomicrurus ) Hoge

et Romano, Mem. Inst. Butantan. 32(1965):1, fig. 2,2 a-c

Type locality: Tapurucuàra, Mun. Uaupés, State of Amazonas, Brazil.

Distribution: Only known from type locality.

* nom. nov. pro Leptomicrurus schmidti Hoge et Romano preocupied by Micrurus schmidti

Dunn, 1940 and Micrurus schmidti (now putumayensis) Lancini, 1962.

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ROMANO, S. A. W. L. — Notes on Leptomicrurus Schmidt (Serpentes Elapidae). Mem. Inst.

Butantan. 35: 111-115, 1971.

Micrurus narduccii (Jan)

1863 Elaps narducii Jan, Arch. Zool. Anat. Fis. 2:222.

1870 Elaps scutiveníris Cope, Proc. Amer. Phil. Soc. 11(1869): 156 —

Type locality: Pebas, Peru.

1881 Elaps melanotus Peters, SitzJl. Ges. Naturforsh. Freunde, Berlin,

1881:51 — Type locality —: Sarayacu, Equador.

1937 Leptomicrurus narducci; Schmidt, Zool. Ser. Field. Mus. Nat. Hist.

20:363.

1966 Leptomicrurus narducci ; Hoge et Romano, Mem. Inst. Butantan,

32(1965) :5, fig. 1,1 a-c.

Type locality: Bolivia.

Distribution: Amazonian slopes of the Andes in Southern Colombia; Equa¬

dor; Peru; Bolivia and Brazil, States of Acre and Amazonas.

Material: two specimes, M. Bocage, N.° 1.401 from Brazil, State of Ama¬

zonas; dorsais 15-15-15; ventrals 266; subcaudals 19/19; 7-7 upper labiais; 7-7

lower labiais. Length of head 8,7 mm; body 380 mm; tail 20 mm. There are

two distinct annuli on anterior part of body (fig. 1 and 2). N° 1401, b, same

locality; dorsais 15-15-16; ventrals 257; 13/13 + n subcaudals; 7-7 upper labiais.

RESUMO: O gênero Leptomicrurus

Schmidt é colocado na sinonímia de

Micrurus Wagler.

Micrurus collaris é registrado pela

primeira vez para o Brasil.

O nome específico schmiãti é mu¬

dado para karlschmidti (nom. nov.),

em razão da transferência da espécie

para o gênero Micrurus (homônimo

de M. schmiãti Dunn 1940 e M. schmi¬

ãti Lancini 1962)

UNITERMOS: Leptomicrurus Sch¬

midt (Serpentes Elapidae); Presença

de anéis; O gênero Leptomicrurus

passa para Micrurus e M. karlschmi-

ãti.

ACKNOWLEDGEMENTS — We are indebted to Mr. J. A. Fernandes, Mu¬

seu Bocage, for the loan of specimens.

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ROMANO, S. A. W. L. — Notes on Leptomicrurus Schmidt (Serpentes Elapidae). Mem Inst

Butantan, 35: 111-115, 1971.

Fig. 1

Fig. 2

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ROMANO, S. A. W. L. — Notes on Leptomicrurus Schmidt (Serpentes Elapidae). Mem. Inst.

Butantan. 35: 111-115, 1971.

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Recebido para publicação em 14 de setembro de 1971

115

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Mem. Instl Butantan

35: 117-138, 1971.

REVISÃO DE ALGUNS TIPOS DE ARANHAS CARANGUEJEIRAS

( ORTHOGNATHA ) ESTABELECIDOS POR CÂNDIDO DE MELLO

LEITÃO E DEPOSITADOS NO MUSEU NACIONAL DO RIO.

WOLFGANG BÜCHERL *; ANNA TIMOTHEO DA COSTA ** *** e SILVIA LUCAS **'

(Seção de Artrópodos Peçonhentos, Instituto Butantan)

RESUMO: — Pelo reestudo do mate¬

rial típico de aranhas da subordem

ORTHOGNATHA encontradas na anti¬

ga coleção catalogada por C. de Mello

Leitão no Museu Nacional do Rio,

constatamos:

CTE NIZIDAE. ACTINOPODINAE:

Actinopus rufibarbis M. L. 1930, A. pa-

ranensis M. L. 1923 e mais um espe-

cimen etiquetado sob o nome de “A.

niger" pertencem ao grupo de A. cras-

sipes (Keyserling) 1891;

CTENIZINAE, I diops nilopolensis

M. L. 1923, pode ser considerada

especie boa e Idiops crulsi M.L. 1930

e um especimen etiquetado sob o no¬

me de "Idiops anomalus” são sinôni¬

mos de Idiops petitii (Guérin) 1938.

DIPLURIDAE, DIPLURINAE a espé¬

cie Diplura bitaeniata M. L. 1941,

ainda sem receptáculos seminais, pa¬

rece-nos sinônima de D. aequatorialis

Auss. 1871, que é da mesma região

do tipo da segunda; D. borgmeieri

M. L. 1924 é sinônima de D. gymnog-

natha Bertkau 1880, ambas do mesmo

local típico; D. fallax M. L. 1926 deve

ser enquadrada sob o gênero Uruchus,

com o nome de Uruchus fallax (M. L.)

1926; Diplura nigerrima M. L. 1941 é

apenas uma variação de colorido de

D. aequatorialis. O exemplar tinha mu¬

dado de pele, sendo, por isso, seu

colorido mais vivo.

Harmonicon nigridorsi M. L. 1924 é

espécie boa. Thalerothele aurantiaca

M. L. 1943 e Th. minensis M. L. 1926

são sinônimos de Th. uniformis M. L.

1923, com o mesmo local típico e Th.

sanguínea (F. Cambridge) 1896 pare¬

ce-nos sinônimas de Th. annectens

(Bertkau) 1880, também do mesmo

biotopo. Especimens etiquetados com

o nome de “Uruchus costatus” são

fêmeas jovens, sem receptáculos semi¬

nais formados e devem ser conside¬

rados como sendo do grupo de Uru¬

chus jelskii (F. Cambridge) 1896; na

subfamília das MACROTHELINAE Is-

chnothele sexpunctatum e I. zoroda,

descritas por Mello Leitão em 1941 e

43 respectivamente, parecem-nos espé¬

cies boas.

THERAPHOSIDAE, AVICULARINAE:

Avicularia cuminami M. L. 1930 e A.

pulchra M. L. 1933, cada espécie foi

* Bolsista do Conselho Nacional de Pesquisas

** Seção de Invertebrados do Museu Nacional de Rio de Janeiro

*** Seção de Artrópodos Peçonhentos — Instituto Butantan

117

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BÜCHERL. W.; T. COSTA, A. e LUCAS, S. — Revisão de alguns tipos de aranhas caranguejeiras

( ORTHOONATIIA ) estabelecidos por C. de Mello Leitão e depositados no Museu Nacional do Rio.

Mem. Inst. Butantan, 35: 117-138, 1971.

descrita com uma fêmea jovem, ainda

sem bôlsas receptaculares; A. palmi-

cola M. L. 1945 parece-nos espécie boa.

GRAMMOSTOLINAE: Pterinopelma

nellutinum M. L. 1923 e Pt. dubium

M. L. 1923 são sinônimos de Pt. wa-

cketi M. L. 1923, todos do mesmo lo¬

cal típico.

ISCHNOCOLINAE: Cyriocosmus se-

mifasciatus M. L. 1939 é Chaetorrhom-

bus semifasciatus (M. L.) 1939; Aphan-

topelma venosum M. L. 1936 é espécie

boa; Phormictopus multicuspidatus

M. L. 1929 é Cyclosternum multicus-

pidatum M. L. 1929, de que é sinônimo

também um exemplar etiquetado sob

o nome de "Magulla atrogaster";

Cyclosternum schmardae Auss. 1871

é espécie boa e C. semiaurantiacum

Simon 1897 é Ceropelma semiauran¬

tiacum (Simon) 1897. Um especimen-

de Ouro Prêto etiquetado como

“Hapalopus sp” é redescrito sob o

nome de Cyclosternum melloleitaoi

n. sp.

O gênero Dolichothele M. L. 1923, com

a espécie típica D. exilis M. L.

1923 deve ser enquadrado sob ISCH-

NOCOLINAE e não BARYCHELIDAE.

Também o especimen etiquetado co¬

mo “Lsptopelma nigrioculatum” per¬

tence a ISCHNOCOLINAE. Cyrthopho-

lis zorodes M. L. 1923 é espécie boa.

Ischnocolus parvus Keyserling 1877

parece-nos espécie sul-americana boa.

São válidas igualmente Pseudhomoe-

omma fasciatum M. L. 1930 e Tmesi-

phantes montanus M. L. 1923.

SELENOSCOMIINAE: Ephebopus vio-

laceus M. L. 1930 não pôde ser re-

identificado pelo mau estado de con¬

servação; tem a mesma procedência

de Avicularia cuminami.

BARYCHELIDAE, DIPLOTHELINAE

— Neodiplothele fluminense M. L.

1924 é espécie boa, da qual é sinônimo

Trichopelma annulatum M. L. 1943 do

mesmo local típico; Neodiplothele

leonardoi M. L. 1940 é fêmea jovem,

ainda sem receptáculos seminais.

LEPTOPELMATINAE: dois exempla¬

res sem etiquêta, macho e fêmea, do

bairro da Tijuca, Rio. São descritos

como Neostothis melloleitaoi n. sp.;

Psalistopoides fulvimanus M. L. 1934

é sinônimo de Neostothis gigas Vel-

lard 1925.

UNITERMOS: Aranhas

j eiras; Revisão de tipos.

Carangue-

INTRODUÇÀO

No presente trabalho reestudamos alguns tipos de aranhas caranguejeiras e

outro importante material, estabelecidos por C. de Mello Leitão e depositados na

Coleção Aracnológica do Museu Nacional do Rio de Janeiro.

MATERIAL E MÉTODO

Foi reestudado o seguinte material:

CTENIZIDAE, ACTINOPODINAE,

Actinopus rufibarbis M. L. 1930, tipo fêmea, Rio Cuminá;

A. niger — etiquetado por M. L. com êste nome, mas provavelmente não

publicado, macho, Pedras Altas, Rio Grande do Sul;

A. paranensis M. L. 1923 — tipo, macho, Paraná (sem localidade) Hermes

Lima leg.

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BUCHERL. W.; T. COSTA, A. e LUCAS, S. — Revisão de alguns tipos de aranhas caranguejeiras

( ORTHOONATHA) estabelecidos por C. de Mello Leitão e depositados no Museu Nacional do Rio.

Mem. Inst. Butantan , 35: 117-138, 1971.

CTENIZINA E,

Idiops anomalus — etiquetado por M. L. sob este nome, mas provavelmente

não publicado — fêmea, jovem, rio Jaminauá;

I. crulsi — M. L. 1930 — tipo, fêmea, rio Cuminá, Pará;

I. nilopolensis — M. L. 1923 — tipo, fêmea, Nilopolis, Est. do Rio; Blanc

de Freitas leg.

DIPLURIDAE, DIPLURINAE,

Diplura bitaeniata M. L. 1941 — tipo, fêmea jovem, Bogotá, Colômbia;

D. borgmieri M. L. 1924 — tipo, fêmea e 2 sintipos, fêmeas, Petropólis,

Estado do Rio;

D. fallax M. L. 1926 — tipo, fêmea, e sintipo, fêmea, Alto Juruá, Amazonas;

D. nigerrima M. L. 1941 — tipo, fêmea, Bogotá, Colômbia;

D. paulistana M. L. 1924 — tipo, fêmea, Santos, Est. de São Paulo (n.° 55

da col.) ;

Uruchus costatus — etiquetado por M. L. com êste nome, mas provavelmen¬

te não publicado, 2 fêmeas jovens — Peru (sem localidade);

Harmonicon nigridorsi — M. L. 1924 — tipo, macho, sintipo, fêmea jovem,

Rio (n.° 847 da coleção);

Thalerothele aurantiaca M. L. 1943 — tipo, fêmea, Ouro Preto, Est. Minas

Gerais (n.° 53 945);

Th. sanguínea (F. Cambridge) 1896 fêmea, Pará;

Th. uniformis M. L. 1923 — macho, Ouro Preto, Minas Gerais. O especi-

men está etiquetado por M. L. como tipo, embora o autor, ao descrever a

espécie, tenha publicado: Habitat — São Paulo, tipo, macho, no Museu Pau¬

lista, E. Garbe leg.

MACROTHELINAE,

Ischnothele sexpunctatum M. L. 1941 — tipo, fêmea, sintipos, 2 fêmeas, Bo¬

gotá, Colômbia;

I. zoroda M. L. 1943 — tipo, fêmea, Veadeiros, Est. de Goiás.

THERAPHOSIDAE, THERAPHOSINAE,

Phormictopus multicuspidalus M. L. 1929 — tipo, macho, Tapera, Per¬

nambuco.

GRAMMOSTOLINAE,

Pterinopelma vellutinum M. L. 1923 — Tipo, macho, São Paulo;

Pt. dubium M. L. 1923 — tipo, macho, Capital de São Paulo; n.° 48 da

coleção. O autor, ao descrever esta espécie, parece ter designado um segundo

tipo, macho, depositado no Museu Paulista, sob n.° 148, capturado no bair¬

ro do Ipiranga, Capital de São Paulo, por H. Lüderwaldt.

ISCHNOCOLINAE,

Aphantopelma venosum M. L. 1936 — tipo, fêmea jovem, Chile (sem lo¬

calidade), n.° 50234 da coleção;

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( ORTHOGNATIIA ) estabelecidos por C. de Mello Leitão e depositados no Museu Nacional do Rio.

Mem. Inst. Butantan, 35: 117-138, 1971.

Cyclosternum schmardae Ausserer 1871 — macho, Colômbia;

C. semiaurantiacum Simon 1897 — 2 fêmeas jovens, Barra do Tapirapé,

Mato Grosso;

Cyrtopholis zorodes M. L. 1923 — tipo, fêmea, São Paulo;

Hapalopus sp. — macho, Ouro Preto, Minas Gerais;

Ischnocolus parvus Keyserling 1877 — jovem, Montevidéu, Uruguai, n.°

14120 da coleção;

Magulla atrogaster — fêmea, Ceará. Não pudemos verificar se o autor

publicou esta espécie;

Pseudhomoeomma fasciaíum M. L. 1930 — tipo, macho, rio Cuminá, Pará;

sintipos, fêmea e fêmea jovem;

Tmesiphantes montanus M. L. 1923 — tipo, macho, e sintipo, fêmea, Reti¬

ro do Ramos, Itatiaia, Est. do Rio; Carlos Moreira leg.

Cyriocosmus semifasciatus M. L. 1939 — fêmea, Ilha Otomana, Venezuela.

A V1CULARI1NAE,

Avicularia cuminami M. L. 1930 — tipo, fêmea jovem, Rio Cuminá, Pará;

A. palmicola M. L. 1945 — tipo, fêmea, Mumbaba, Paraíba;

A. pulchra M. L. 1933 — tipo, fêmea jovem, Tapera, Pernambuco.

SELENOC OSMIINA E,

Ephebopus violaceus M. L. 1930

tipo, fêmea, rio Cuminá, Pará.

BARYCHEL1DAE, DIPLOTHELINAE,

Neodiplothele fluminense M. L. 1924 — tipo, macho, Niterói, Est. do Rio;

N. leonardosi M. L. 1940 — tipo, fêmea jovem, Paraguassu, Estado da

Bahia.

LEPTOPELMA TINA E

Sem etiqueta que designasse nome científico; macho e fêmea, bairro da Ti-

juca, cidade do Rio;

Dolichothele exilis M. L. 1923, tipo, fêmea, sintipo, fêmea, Paraíba do Nor¬

te; Tranquilino Leitão leg.;

Leptopelma nigrioculata — macho, Alto Tocantins, Goiás; ao que parece,

não publicada pelo autor.

Trichopelma annuiatum M. L. 1943 — tipo, macho, bairro de Copacabana,

cidade do Rio de Janeiro; (n.° 58299 da coleção).

Os nomes que referimos nesta lista achavam-se nas etiquêtas. No presente,

reestudo procuramos aferir alguns caracteres não mencionados por Mello Leitão,

como: receptáculos seminais, bulbos, escópulas nos metatarsos, espinulação nos

metatarsos, apófises nas tíbias do primeiro par de patas em machos, medidas do

comprimento das fiandeiras; bem como os desenhos que publicamos, elucidam me¬

lhor algumas das espécies descritas por aquêle autor.

REESTUDO DO MATERIAL

Actinopus rufibarbis — As garras superiores têm apenas um dente grande,

situado no têrço basal. (Fig. 1).

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BÜCHERL. W.; T. COSTA, A. e LUCAS, S. — Revisão de alguns tipos de aranhas caranguejeiras

(ORTIJOGNATHA) estabelecidos por C. de Mello Leitão e depositados no Museu Nacional do Rio.

Mcm. Inst. Butantan, 35: 117-138, 1971.

Actinopus niger — Tíbias do primeiro par de pernas sem apófise; todos os

tarsos escopulados até a base; garras superiores com um só dente; bulbo perifor-

me, com duas saliências na base do êmbolo, levemente retorcido, de ponta adel¬

gaçada e em ângulo de cêrca de 120 graus em relação ao eixo do bulbo (Fig. 2);

rasteio das quelíceras colocado sobre uma apófise saliente, com muitos espinhos

curtos e robustos, sendo os do canto interno os mais longos. Deve tratar-se, pro-

vàvelmente, do macho de A. crassipes (Keyserling) 1891, espécie descrita de Ta¬

quara, Rio Grande do Sul.

Actinopus paranensis — Patela do terceiro par de patas com espinhos cur¬

tos, robustos, dispostos em várias fileiras (Fig. 3); garras superiores com um

só dente; bulbo e êmbolo como na Fig. 4.

Idiops tinomalus — O tubérculo ocular frontal é fortemente bilobado; lábio

com 3 cúspides; esterno com 4 cm de comprimento por 3 cm de largura. Todo

o resto é igual à descrição de I. petitii (Guérin) 1838, de Santarém, Pará, com

a qual julgamos êste especimen idêntico.

Idiops crulsi — Receptáculos seminais (Fig. 5) formando dois tubos diver¬

gentes em forma de “S”, afastados entre si o seu comprimento.

Idiops nilopolensis — Esterno 4,5 cm de compr. por 4,0 cm de largura;

receptáculos seminais representados pela Fig. 6; garras superiores com 1 dente

sub-mediano grande e abaixo dêle um bem menor. (Fig. 7).

Diplura bitaeniata — Esterno quase circular; último par de sigilas marginal;

sulco ungueal com 9 dentes, aproximadamente do mesmo tamanho e equidistan¬

tes; garras superiores pectinadas em duas séries, aproximando-se as séries na base

(Fig. 8); o espécimen ainda não apresenta receptáculos seminais, de maneira

que será difícil justificar sua separação de D. aequatorialis ou longicauda, descri¬

tas por Ausserer em 1871 ou ainda de D. cousini Sim. 1888, as três do norte do

Equador.

Diplura borgmeieri — No espécimen maior o abdômen tem 10,5 mm e a

fiandeira superior de 8,9 mm (2,5 — 2,6 — 3,8); num segundo exemplar, me¬

nor, o abdômen mede 9,0 mm e a fiandeira superior também 9,0 mm. Isto mos¬

tra que as duas medidas têm valor secundário apenas na especificação. Lábio sub-

quadrado, mais largo que longo, sem cúspides; ancas dos palpos sem cúspides;

sulco ungueal das quelíceras com 12 a 14 dentes, os 4-6 apicais maiores, os ba¬

sais menores, alternando-se um grande com um pequeno; cômoro ocular cêrca de

duas e meia a três vêzes mais largo que longo; l. a fila ocular pouco procurva, pas¬

sando uma reta tangente à borda anterior dos M.A. no l.° quinto dos L.A.; M.A.

maiores que L.A.; êstes pouco maiores que L.P. e quase contíguos a êles; fóvea

pequena, oval; metatarso I e II com 3 pares de espinhos ventrais e mais 1 ou

2 na face interna; metatarsos III e IV com numerosos espinhos; por baixo da

sutura do lábio há 2 impressões laterais grandes, glabras, que não devem ser

confundidas com sigilas; sigilas anteriores pequenas, separadasdas margens me¬

nos de seu diâmetro, segundo par maior, afastado da margem também menos de

seu diâmetro; terceiro par o maior afastado da margem cêrca de meio diâmetro. As

três fêmeas são jovens, duas sem receptáculos, a terceira com receptáculo rudi¬

mentar. Deve-se relacionar esta espécie com D. gymnogmtha Bertkau 1880, des¬

crita de Pedra Açu, Est. do Rio, perto de Petrópolis.

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BÜCHERL. W.; T. COSTA. A. e LUCAS. S. — Revisão de alguns tipos de aranhas caranguejeiras

( ORTHOGNATHA ) estabelecidos por C. de Mello Leitão e depositados no Museu Nacional do Rio.

Mem. Inst. Butantan t 35: 117-138, 1971.

Diplura fallax — Uruchus fallax (Mello Leitão) 1926 — Tarsos anteriores

com escópula inteira, não dividida; as escópulas dos tarsos III e IV divididas por

fileiras medianas de cerdas; cômoro ocular quase frontal; todos os tarsos flexuo-

sos, com a porção basal mais espessa que a apical e parecendo pseudo-articula¬

dos (Fig. 9); tarsos do palpo escopulados até a base, nas faces ventral e lateral,

tarsos III e IV com escópulas distais apenas na face ventral, mas quase até a

base nos lados anterior e posterior; metatarsos I e II escopulados quase até a

base, III até a metade, IV sem escópula. Receptáculos seminais (Fig. 10) rami¬

ficados no ápice, cada ramo com seu duto, que se une ao duto principal.

Diplura nigerrima — Valem também as considerações feitas em tôrno de

D. bitaeniata, que é da mesma procedência. Abdômen 25 mm; fiandeira supe¬

rior 24 mm (6 — 7 — 11 mm); metatarsos I e II com 2 espinhos apicais, 2 ven-

trais submedianos e 2 laterais; sulco ungueal com 13 dentes grandes, os apicais

maiores, os inferiores alternando-se um grande com outro menor (como em D.

borgmeieri)\ receptáculos seminais como na espécie seguinte, mas ainda não

tão evoluídos.

Diplura paulistana — Receptáculos seminais com 2 bolsas num e 3 no

outro lado, de dutos retorcidos (Fig. 11).

Uruchus costatus — No tarso I a escópula é indivisa, embora existam na

metade basal, ventral, algumas cerdinhas delicadas, quase invisíveis, que não di¬

videm a escópula; cômoro ocular frontal, distante da margem anterior apenas

um diâmetro dos olhos L.A.; nenhum especimén apresenta receptáculos seminais,

razão porque julgamos que seria melhor enquadrar êstes espécimens sob Uruchus

jelskii (F. Cambridge) 1896, descrita também do Peru.

Harmonicon nigridorsi (TRECHONINI) — com aparelho estridulante; abdô¬

men 10 mm, fiandeira superior 10,8 mm (3,5 — 3,6 — 3,7 mm); bulbo co-

pulador (Fig. 15) em forma de cebola, êmbolo cêrca de três vêzes mais longo

que o bulbo, quase reto, mas com ponta curva; ápice da tíbia I do macho (Fig.

16) com pequena apófise ventral externa, com robusto e longo espinho recurvo;

o metatarso dobra-se do lado interno desta apófise e apresenta na face sub-basal

externa uma saliência romba, que, ao dobrar-se o articulo, vem de encontro

ao esporão tibial.

Thalerothele aurantiaca — (TRECHONINI) — Escópulas dos metatarsos

e tarsos como em Diplura ou em Harmonicon; fiandeiras posteriores mais curtas

que o abdômen, o artículo apical mais longo que o médio; abdômen 7 mm, fian¬

deiras 5,8 mm (1,8 — 1,9 — 2,1 mm); lira com 7 cerdas; receptáculos seminais

(Fig. 12) formando duas vesículas subredondas, seu duto um pouco mais longo

que seu diâmetro. É a fêmea de Th. unijormis M. L. 1923.

Thalerothele sanguínea — (F. Cambridge) — A fiandeira superior do es¬

pécimen mede 7,1 mm (2,4 mm — 2,2 mm — 2,5 mm); em volta da ca¬

rapaça céfalo-torácica há cerdas claras, enfileiradas, com pontas curvas para a

frente, longas e eqüidistantes; seus receptáculos seminais obedecem à conforma¬

ção da espécie precedente, mas se distingue desta por seus dutos muito mais

curtos que o diâmetro longitudinal da vesícula. Pelo confronto do espécimen com

a descrição de Th. fasciata Bertkau 1880, impõe-se a convicção de pertencer o

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BÜCHERL. W.; T. COSTA, A. c LUCAS, S. — Revisão de alguns tipos de aranhas caranguejeiras

( ORTHOGNATHA ) estabelecidos por C. de Mello Leitão e depositados no Museu Nacional do Rio.

Mem. Inst. Butantan t 35: 117-138, 1971.

mesmo a esta espécie, a qual ocorre na Venezuela e no norte amazônico do Bra¬

sil. Th. annectens (Bertkau) 1880, fasciata e sanguínea, três espécies do norte

do Brasil, cada uma conhecida apenas pelo exemplar típico, fêmea. Talvez for¬

mem um só grupo.

Thaleroíhele uniformis — Escópulas tarsais ralas (trata-se de um macho);

tarsos flexuosos, pseudo-articulados; bulbo copulador (Fig. 13) em forma de

cebola, êmbolo pouco curvo, de ponta aguda, pouco mais longo que o eixo lon¬

gitudinal do bulbo. Tíbia I do macho com pequena apófise quase apical, munida

de robusto espinho quase reto (Fig. 14). Em 1926 Mello Leitão descreveu mais

outro macho, de Ouro Preto, sob o nome específico de Th. minensis, que apresen¬

taria apenas diferenças individuais, principalmente no tocante ao número de cer-

das da lira. Mas em trabalho posterior, o autor destituiu de valor específico as

variações dos pêlos das liras nesta sub família. Em vista disso Th. minesis M. L.

1923 deverá chamar-se Th. uniformis M. L. 1923 e como local do tipo deve pre¬

valecer o da etiqueta do exemplar do Museu Nacional que é Ouro Preto, Estado

de Minas Gerais.

Ischnothele sexpunctaíum (MA CR O TH ELI NA E ) — Garra superior do

primeiro par de pernas com 8 a 9 dentes, os apicais os mais longos, decrescendo

em tamanho em direção à base (Fig. 17, à direita); garra do quarto par com 4 a

5 dentes (Fig. 17, à esquerda); a inserção dos dentes é em linha de um “S”. Re¬

ceptáculos seminais (Fig. 18) com bolsas ovais, seus dutos convergentes mais es¬

treitos no colo; esterno esférico com as sigilas posteriores marginais. Lábio cêrca

de três vêzes mais largo que longo, sem cúspides. Ancas dos palpos, entretanto,

muito cuspulosas. Sulco ungueal das quelíceras com duas fileiras de dentes, a in¬

terna com 5 a 6, a externa com 7 a 12.

Ischnothele zoroda — Garras do primeiro par de pernas com 8 a 9 dentes,

os apicais maiores, o quarto par com 5 dentes, os dois apicais os menores; sua in¬

serção é em forma de “S” (Fig. 19). O artículo terminal das fiandeiras superiores é

tão longo quanto os dois precedentes juntos; fiandeiras inferiores afastadas entre si,

na base, cêrca de 4 vêzes o diâmetro de seu artículo basal. Lábio duas vêzes mais

largo que longo, com 2 cúspides minúsculas, localizadas submarginalmente; lábio

avermelhado, mas a margem anterior amarela. Ancas dos palpos com numerosas

cúspides. Receptáculos seminais (Fig. 20) em dois pares de cada lado, vesiculares,

com 4 dutos independentes, envoltos em membranas.

Phonnictopus multicuspidatus — A espécie descrita sob êste nome deverá

chamar-se Cyclosternum multicuspidatum (M.L.) 1929 ( THERAPHOS1DAE,

ISCHNOCOLINAE), com os seguintes caracteres, não mencionados pelo autor:

Tarso IV (Fig. 21) com a escópula nitidamente dividida na metade basal por filei¬

ras de cerdas curtas, rígidas; as escópulas dos outros tarsos inteiras. Sem aparelho

estridulante; sigilas posteriores pequenas e marginais; trocanter dos palpos na face

posterior com pêlos plumosos, densíssimos e eretos; face anterior das coxas do pri¬

meiro par de pernas veludosa; fóvea torácica levemente recurva; lábio sub-quadra-

do, com muitas cúspides. Tíbia I do macho (Fig. 22) com 2 apófises, a ventral

inferior maior, alongada, com 1 pequeno espinho no tôpo e mais outro, longo, do

lado; a lateral, interna, menor, de ponta curva e romba, com um espinho apical por

dentro, recurvado por cima da ponta. O metatarso dobra-se ao lado da apófise

maior. Tíbia do palpo do macho (Fig. 23) com robusto rasteio apical e mais 2

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JBUCHERL. W.; T. COSTA, A. c LUCAS, S. — Revisão de alguns tipos de aranhas caranguejeiras

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a 3 espinhos sub-medianos. Bulbo sub-esférico (Fig. 24), com profunda fenda na

base do êmbolo; êste um nada mais longo que o bulbo, de ponta chanfrada. Me-

tatarso I com 1 espinho apical mediano ventral e mais 1 ventral sub-basal; II com

3 apicais e 1 sub-basal; III com 4 apicais e 4 medianos; IV muito espinhoso.

Pterinopelma vellutinuni, Pt. dubium (GRAMMOSTOLINAE ): apresentam

o lábio um pouco mais longo que largo. O autor atribuíra erroneamente a dubium

um lábio mais largo que longo, salvo êrro de impressão. Em 1923 Mello Leitão

descreveu mais uma terceira espécie, Pt. wacketi, usando como tipo também um ma¬

cho (Museu Paulista n.° 147), capturado em Raiz da Serra, baixada santista, Esta¬

do de São Paulo. Teríamos, assim, três espécies, conhecidas apenas por 3 machos,

tôdas da área Capital de São Paulo, Serra do Mar. Certamente deverão formar uma

só espécie, para a qual deverá prevalecer, por prioridade de página, o nome de

Pt. wacketi M. L. 1923.

Aphantopelma venosum — (ISCHNOCOLINAE ) — Lábio mais largo que

longo, com 2 cúspides. Sigilas posteriores pequenas, afastadas das margens menos

de seu diâmetro; fóvea torácica sub-reta; tarsos I, II e III escopulados até a base,

e com escópulas indivisas, tarso IV (Fig. 25) também escopulado até a base,

porém a escópula dividida por faixa longitudinal estreita de cerdas; metatarso I

escopulado até a base, II em mais da metade, III com pequena escópula apical, IV

sem escópula; metatarsos I c II com apenas 1 espinho sub-basal, III e IV com cer¬

ca de 8 espinhos; tíbia I sem espinho, II com um apical, III com dois apicais, dois

anteriores e mais dois posteriores, IV com três apicais e 1 par anterior e posterior;

patelas e fêmures inermes. Garras superiores com 2 séries de dentes (com 7 ex¬

ternos e 9 internos na IV); sulco ungueal com 8 dentes, mais ou menos equidis¬

tantes e do mesmo tamanho. O exemplar ainda estava sem receptáculos.

Cyclosternum schmardae — Tíbia do palpo do macho (Fig. 26) com rasteio,

restrito à área apical interna, formado por cêrca de 9 espinhos em três filas, face

externa com pequena apófise sub-apical. Bulbo (Fig. 27) com conformação seme¬

lhante ao de múlticuspidatum, porém, com constricção leve no meio, êmbolo mais

curto e ponteagudo.Apófises da tíbia I como em multicuspidatum, a menor, po¬

rém, não apresenta espinho interno no tôpo, mas 1 lateral; metatarso I com 2 es¬

pinhos apicais pequenos e 1 sub-basal, II com 3 apicais e 1 sub-basal. Fiandeiras

superiores com artículo basal mais longo que o médio, o apical mais longo que o

basal. O espécimen representa o 1,° macho descrito da espécie. Como o tjpo de Aus-

serer era do Equador e êste macho é da Colômbia, não se pode ter muita certeza

sôbre a co-especificidade dos dois exemplares.

Cyclosternum semiaurantiacum — Escópula do tarso II com algumas cerdas

pequenas, delicadas, e mfilas longitudinais, quase invisíveis e que não dividem a

escópula. O espécimen é jovem, ainda sem receptáculos e segundo Schiapelli e

Gerschman de Pipelin é Ceropelma semiaurantiacum (Simon) 1897.

Cyrtopholis zorodes — Área ocular paralela. Último par de sigilas afastado da

margem um pouco mais de seu diâmetro; lábio sub-quadrado, com muitas cúspi¬

des; escópulas dos tarsos I e II indivisas, III e IV divididas por estreita faixa de

cerdas; metatarsos I e II escopulados até a base; a lira do aparelho estridulante está

na face posterior dos trocânteres dos palpos c os pinos percussores, na face ante¬

rior dos trocânters do primeiro par de pernas. Receptáculos seminais (Fig. 28) em

forma de duas cúpulas, próximas na base.

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1JÜCHERL. W.; T. COSTA, A. c LUCAS, S. — Revisão dc alguns tipos de aranhas caranguejeiras

( ORTHOQNATIIA) estabelecidos por C. de Mello Leitão e depositados no Museu Nacional do Rio.

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Hapalopus sp. — O espécimen etiquetado sob êste nome pertence ao gênero

Cyclosternum. Tíbia I do macho (Fig. 29) semelhante à de multicuspidatum ou

schmardae, como também a flexão do metatarso, apenas a apófise inferior, maior,

não apresenta espinho lateral, mas um apical. Tíbia do palpo do macho (Fig 30)

com rasteio apical interno, formado de quatro dentes (2 apicais e 2 sub-apicais); fa¬

ce externa da tíbia I lisa; bulbo (Fig. 31) do tipo de Cyclosternum, próximo ao de

multicuspidatum, mas com variações específicas, como se infere da comparação

com as Figs. 24 e 27. Como se traía do primeiro espécimen de Ouro Preto, Minas,

de onde não se conhecem representantes dêste gênero, consideramos o exem¬

plar como tipo de nova espécie, à qual demos o nome de Cyclosternum melloleitaoi

n. sp., em homenagem ao autor. Tipo do Museu Nacional do Rio.

Ischnocolus parvus — Embora Petrunkevitch no Index-Catalogue, Buli.

A. M. Nat. Hist. 29, à pág. 74, 1911, tenha pôsto em dúvida a existência na

América de representantes do gênero Ischnocolus, contudo, a descrição dêsse exem¬

plar coincide com a chave que Simon estabeleceu para êste gênero. O espécimen

apresenta: área ocular retangular, sigilas posteriores afastadas das margens um pou¬

co menos de seu diâmetro, fóvea torácica levemente procurva, lábio sub-quadrado,

com numerosas cúspides, tarsos IV com escópula dividida por faixa ventral de cer-

das, que não ocupam mais que um têrço da largura do tarso; I e II também com

escópulas divididas, embora em I as cerdas sejam minúsculas e pouco nítidas. Além

dêsses caracteres genéricos apresenta: tarsos I e II nitidamente mais longos que os

metatarsos; tarsos III pouco mais longo que o metatarso; tarso IV pouco mais

curto que o metatarso; metatarsos I e II com espinho um apical, III com 3 apicais;

I e II escopulados até a base, III até a metade; IV apenas com escópula apical.

Garras com apenas um dentículo mediano. Como o local de captura dêste espé¬

cimen coincide com o local do tipo da espécie, confirmamos a espécie /. parvus

Keyserling 1877, para o Uruguai. Garras superiores (Fig. 32).

Magulla atrogaster — Cyclosternum multicuspidatum (M. L.) 1929 — Tarso

I com escópula indivisa, II com cerdas divisórias delicadíssimas, III com cerdas

mais robustas, dispostas em faixa divisória mais estreita na base, alargando-se em

leque em direção apical, IV com faixa estreita, completa, de cerdas divisórias.

Tíbia do palpo com 3 espinhos apicais e 3 mediais; tíbias I e II com 2 espinhos

ventrais apicais e 1 mediano; metatarso I com 1 espinho apical e 2 sub-basais, II

com 3 apicais e 2 sub-basais, I e II escopulados até a base, III menos da metade

apical, IV apenas apicalmente; mais longos que os tarsos; garra I-IV com apenas

3 dentes, pequenos, iguais e equidistantes (Fig. 33). Receptáculos seminais (Fig.

34) com aspecto de pequenas vesículas, de duto curto convergente na base e

distantes um do outro mais de seu comprimento. Escópulas, espinulação e local

de captura coincidem com C. multicuspidatum.

Pseudhomoeomma fasciatum — Metatarsos I e II, em macho e fêmeas,

com escópulas na metade apical, III no têrço apical e IV no quarto apical. Es¬

cópulas nos tarsos I e II, na fêmea, divididas por poucas cerdas, mas nítidas

(Fig. 35, à esquerda), em IV formam uma faixa bastante larga (Fig. 35, à di-

teita); no macho as cerdas divisórias são mais delicadas e formam, no IV, faixa

mais estreita (Fig. 36). Metatarso I, em macho e fêmea, com 1 espinho apical,

II com 1 apical e 1 sub-basal. Garras dos tarsos sem dentes em macho e fêmea;

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BÜCHERL. W.; T. COSTA, A. c LUCAS, S. — Revisão de alguns tipos de aranhas caranguejeiras

( ORTHOONATHA ) estabelecidos por C. de Mello Leitão e depositados no Museu Nacional do Rio.

Metn, Inst. Butantan, 35: 117-138, 1971.

esterno quase esférico, sigilas posteriores minúsculas, quase marginais; lábio qua¬

drado, tão longo quanto largo, com muitas cúspides; fiandeiras superiores do

macho com artículo apical mais longo que o basal, o médio um nada mais curto

que o basal; na fêmea, médio e basal do mesmo comprimento e apical um pouco

mais longo; sulco ungueal com 7 dentes, eqüidistantes e do mesmo tamanho.

Tíbia I do macho, como foi descrita por Mello Leitão; bulbo longo, periforme,

com êmbolo curvo, ponteagudo e mais uma apófise, à guiza de uma “guia”, bem

saliente, paralela ao êmbolo (Fig. 37-A). Receptáculos seminais (Fig. 37-B) ve¬

siculares, com dutos curtos, alargados na base, enovelados, com recurvo lateral.

Tnxesiphantes montams — Sigilas posteriores afastadas das margens quase

duas vêzes o seu diâmetro longitudinal; fóvea procurva; lábio com numerosas

cúspides; escópula do tarso IV dividida por faixa ventral de cerdas, que ocupa

tôda a largura do artículo; fiandeiras com os artículos basal e apical equilongos,

o mediano pouco mais curto; tíbia do palpo do macho (Fig. 38) com 2 acúleos

robustos no canto apical interno; bulbo (Fig. 39) com êmbolo recurvo quase

em ângulo reto, com ponta aguda; tíbia I (Fig. 40) com 2 apófises, a maior,

ventral, curva com um espinho no ápice, a menor de ponta romba, com 1 acúleo

do lado. Receptáculos seminais (Fig. 41) afastados entre si e unidos na base.

Metatarsos I e II escopulados até a metade ou menos, III apenas apicalmente,

IV apicalmente na fêmea, sem escópula no macho; metatarso I com 1 a 3 espi¬

nhos apicais, II com 3 a 4 apicais e mais alguns inferiores.

Cyriocosmus semifasciatus = Chaetorrhombus semijasciatus. (Mello Leitão)

1939 — Metatarsos I e II mais curtos que os tarsos, III com escópula apical,

com 4 espinhos apicais e mais 4 ventrais, IV sem escópula (há um vestígio, de¬

marcado por pelinhos delicados); fiandeiras superiores com artículos: o basal

mais longo que o médio, êste tão longo ou pouco mais curto que o apical. Sulco

ungueal com 6 a 7 dentes, eqüidistantes e do mesmo tamanho. Garras I e II sem

dentes. Receptáculos seminais (Fig. 43) vesiculares, com duto longo, delgado,

sinuoso, serpentiniforme. Tarso I com escópula dividida por estreita faixa de

cerdas, IV com cerdas ocupando tôda a largura do artículo (Fig. 42); metatarsos

I e II escopulados quase até a base, com 1 acúleo apical e 1 sub-basal; área

ocular retangular, sigilas posteriores marginais, fóvea levemente procurva; lábio

sub-quadrado, com muitas cúspides. Muito próxima de Chaetorrhombus kochi

Ausserer 1871, cujo local típico também é a Venezuela.

Avicularia cuminami — O espécimen ainda não apresenta receptáculos se¬

minais e encontra-se em péssimo estado de conservação.

Avicularia palmicola — A Fig. 44 representa os receptáculos seminais. Pa¬

rece que o espécimen é ainda jovem.

Avicularia pulchra — Espécimen jovem, ainda sem receptáculos.

Ephebopus violaceus — Pelo mau estado de conservação em que se encontra

o espécimen, não conseguimos, nem mesmo, estabelecer se existe ou não e onde

estaria localizado o aparelho cstridulador.

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BUCHERL, W.; T. COSTA, A. e LUCAS, S. — Revisão de alguns tipos de aranhas caranguejeiras

( ORTHOGNATHA ) estabelecidos por C. de Mello Leilão e depositados no Museu Nacionaf do Rio.

Mem. Inst. Butuntan, 35: 117-138. 1971.

Neodiplothele fluminense — (BARYCHELIDAE, DIPLOTHELINAE ) —

com um só par de fiandeiras, cujo artículo basal é pouco mais longo que largo,

e o médio e distai são anuliformes (Fig. 45). Rasteio das quelíceras (Fig. 46)

formado por 3 espinhos robustos, rombos, sem estarem sôbre uma saliência.

Bulbo (Fig. 47) oblongo, êmbolo ponteagudo. Lábio cêrca de cinco vêzes mais

largo que longo, laminar (Fig. 48) e ancas dos palpos com 3 cúspides grandes

cilíndricas. Garras sem dentes (Fig. 49). Ápice da tíbia I com 2 robustos espi¬

nhos apicais internos (não externos) se mestarem sôbre apófises e mais 1, me¬

nos robusto, apical externo. Esterno mais longo que largo; sigilas invisíveis. Tarsos

I e II curvos, III e IV quase direitos. Há uma terceira garra rudimentar. É o pri¬

meiro e único macho do gênero Neocliplothele M. L. 1917.

Neodiplothele leonardoi — Tarsos retos. Rasteio das quelíceras com cêrca

de 6 espinhos e robustas cerdas. Sulco ungueal com 7 dentes. O exemplar é

uma fêmea jovem, ainda sem receptáculos seminais.

Sem etiqueta ( BARYCHEL1DAE , LEPTOPELMATINAE) Neostothis

melloleitaoi n. sp. (Em homenagem a Mello Leitão, em cuja coleção se en¬

contravam os dois exemplares); macho e fêmea jovem; localidade tipo: à beira de

um caminho nas matas da Tijuca, cidade do Rio de Janeiro, Guanabara: 4 fian¬

deiras, o artículo distai da superior, na fêmea, mais curto que o médio, no macho

os dois equi-longos; quelíceras com rasteio; cômoro ocular cêrca de uma vez e

meia mais largo que longo, de posição quase frontal, os L. A. separados entre

si menos de seu diâmetro; rasteio sub-espiniforme; lábio mútico, mais longo que

longo; ancas dos palpos com numerosas cúspides; tarsos I e II com escópulas

indivisas, III e IV com faixas de cerdas divisórias, ocupando área mais larga no

IV e na fêmea; garras com dentes em 2 filas; tíbia do palpo do macho (Fig. 50)

com uma fila lateral de cerdas e outra (do outro lado) de cerdinhas mais deli¬

cadas; em direção ao ápice espículas curtas e no ápice com dois espinhos; tíbia

I do macho (Fig. 51) sem apófise, mais 2 espinhos, o ventral, externo, mais

robusto e curvo, o ventral interno mais delicado e reto. Fêmea ainda sem recep¬

táculos seminais. A espécie distingue-se de Psalistops Simon 1889 pelas escópulas

dos tarsos III e IV divididas.

Pela comparação de Neostothis melloleitaoi n. sp. com N. gigas Vellard 1925,

do Alto da Serra, Ana Dias e raiz da Serra, Estado de São Paulo, vimos justificada

a nova espécie. Por outro lado estamos convencidos que o gênero Psalistopoides

M. L 1934 com sua espécie típica Ps. fulvimanus M. L. 1934 são sinônimos

de Neostothis e da espécie N. gigas Vellard 1925, ambos do mesmo local.

Dolichothele exilis — Ao descrever, em 1923, o gênero Dolichothele e en¬

quadrá-lo sob BARYCHEL1DAE, LEPTOPELMATINAE, deu-lhe Mello Lei¬

tão os seguintes característicos principais: “Escópulas tarsais anteriores inteiras,

as posteriores divididas por uma larga faixa com duas séries de cerdas espinifor-

mes. Fiandeiras superiores delicadas, longas, de segmento médio e apical iguais

em comprimento; lábio com dupla fila de 5 cúspides”. Examinando o tipo de D.

exilis, vimos: a) a ausência de um rasteio; b) que as fiandeiras superiores têm o

comprimento da metade do abdômen — Abdômen 10,0 mm; fiandeiras 5,1

mm (art. basal: 2,0 — médio 1,2 — apical 1,9 mm). Somando-se a êstes

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BÜCHERL. W.; T. COSTA, A c LUCAS, S. — Revisão de alguns tipos de aranhas caranguejeiras

( ORTIIOGNATHA ) estabelecidos por C. de Mello Leilão c depositados no Museu Nacional do Rio.

Mem. Inst. Butantan, 35: 117-138, 1971.

dois caracteres, ainda, a divisão das escópulas dos tarsos posteriores por fileiras

ventrais de cerdas, deve incorporar-se o gênero Dolichothele com sua espécie

típica D. exillis M. L. 1923 sob THERAPHOSIDAE, ISCHNOCOLINAE.

A Fig 52 representa os receptáculos seminais do tipo, cujos tarsos III e IV

apresentam escópula nitidamente dividida por estreita faixa de cerdas; no ápice

do artículo basal das quelíceras há cerdas longas curvas, mas que não devem

ser confundidas com um rasteio sub-espiniforme.

Leptopelma nigrioculatum — um espécimen, macho, etiquetado com êste no¬

me, mas não publicado, apresenta, de fato, um conjunto de caracteres que o en¬

quadra sob ISCHNOCOLINAE, THERAPHOSIDAE. De resto, as espécies de

Leptopelma Auss. 1871 são quase tôdas da África. A tíbia I do macho reexami¬

nado não apresenta apófise, mas 2 espinhos robustos, ventrais e mais 5 sub-apicais.

A Fig. 53 apresenta a tíbia do palpo e o bulbo copulador. A má conservação não

nos permitiu identificar a espécie.

Trichopelma annulatum — Neodiplothele fluminense Mello Leitão 1924,

com que coincidem o aspecto do bulbo copulador e a tíbia I do macho; fêmea

ainda desconhecida.

SUMMARY: Spider-types of the su-

dorder ORTHOGNATHA from the col-

lection in the Museu Nacional, Rio,

described by C. de Mello Leitão, have

been re-examined.

CTENIZIDAE, ACTINOPODINAE —

Actinopus rufibarbis M. L. 1930, A.

paranensis M. L. 1923, and another

specimen named by the author, “A.

niger” (not published) shurely are

the group of A. crassipes (Keyser-

ling) 1891.

CTENIZINAE — Idiops nilopolensis

M. L. 1923 seems to be a good species,

but I. crulsi M. L. 1930 and another

specimen, named by the author, “I.

anomalus” are synonyms of I. petitii

(Guérin) 1838.

DIPLURIDAE, DIPLURINAE — Di-

plura bitaeniata M. L. 1941, a young

female without receptacula seminalia

may be synonym with D. aequatoria-

lis Auss. 1871, both from the same

geographic region; D. borgmeieri M.

L. 1924 is synonym with D. gymnog-

natha Bertkau 1880, both from the

same region; D. nigerrima M. L. 1941,

from the same region like aequatoria-

lis seems to be only a color-variation

of the later; Harmonicon nigridorsi M.

L. 1924 is a good species. Thalerothele

aurantiaca M. L. 1943 and T. minensis

M. L. 1926 are synonyms with Th.

uniformis M. L. 1923, the three types

from the same region; Th. sanguínea

(F. Cambridge) 1896 belongs to the

group of Th. annectens (Bertkau)

1880, both from the east Amazonean

region. Diplura fallax M. L. 1926 is

really Uruchus fallax (M. L.) 1926;

several young females without recep¬

tacula seminalia, named by the au¬

thor “Uruchus costatus” not pu¬

blished) really are of the group of

Uruchus jelskii (F. Cambridge) 1896.

MACROTHELINAE - Ischnothele scx-

punctatum M. L. 1941 and I. zoroda

M. L. 1943 are good species.

THERAPHOSIDAE, AVICULARIINAE

— Avicularia cuminami M. L. 1930 and

A. pulchra M. L. 1933 have been esta-

blished on hand of some young íema-

les, without receptacula seminalia; A.

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BÜCHERL. W.; T. COSTA, A, c LUCAS, S. — Revisão de alguns tipos de aranhas caranguejeiras

(ORTHOGNATHA) estabelecidos por C. de Mello Leitão e depositados no Museu Nacional do Rio.

Mem. Inst. Butantan, 35: 117-138, 1971.

palmicola M. L. 1945 is a good species.

GRAMMOSTOLINAE — Pterinopelma

vellutinum M. L. 1923, and Pt. dubium

M. L. 1923 shurely are synonyms with

Pt. wacketi M. L. 1923. all from the

same type-locality.

ISCHNOCOLINAE — Aphantopelma

venosum M. L. 1936 is a good epecies.

Cyriocosmus semifasciatus M. L. 1939

is a Chaetorrhombus semifasciatus (M.

L.) 1939; Phormictopus multicuspida-

tus M. L. 1929 and another specimen,

named by the author “Magulla atro-

gaster” (not published) shurely are

Cyclosternum multicuspiãatum (M.

L.) 1929; C. schmarãae Auss. 1871 is a

good roeuis and C. semiaurantiacum

is a Csropelma semiaurantiacum Sim.

1897. One specimen, from Ouro Preto,

Minas Gerais, named by the author

“Hapalopus” sp. is here described as

Cyclosternum melloleitaoi n. sp.

The genus Dolichotele M. L. 1923 with

the type species D. exilis M. L.

1923, placed by the author under the

family BARYCHELIDAE, is a ISCH-

NOCOLINAE, with normaly long spin-

nerets. Another specimen named “Lep-

topelma nigrioculatum” (not publi¬

shed) belongs also to ISCHNOCOLI-

NAE. Cyrtopholis zoroães M. L. 1923

is a valid species. Ischnocolus parvus

Keyserling 1877, studied by us with a

well preserved specimen, seems to be

a South-Americari species. Pseuãho-

moe fasciatum M. L. 1930 Tmesiphan-

tes montanus M. L. 1923 are good spe¬

cies.

SELENOCOSMIINAE — We did not

succeed to identify Ephébopus viola-

ceus M. L., because the specimen was

too badly preserved. It is from the

same place like Avicularia cuminami.

BARYCHELIDAE, DIPLOTHELINAE

- Neoãiplothele fluminense M. L. 1924

is a good species; Trichopelma annu-

latum M. L. 1943 is a synonym N. flu¬

minense, both from the same type

locality; Neoãiplothele leonardoi M. L.

1940 is a young female, without re-

ceptacula seminalia. LEPTOPELMATI-

NAE — We found two specimens,

male and female, from Tijuca, Rio;

which are Neotothis melloleitaoi n. sp,

Psalistopoiães fulvimanus M. L. 1934

is synonym with Neostothis gigas

Vellard 1925.

UNITERMS: Mygalomorph spiders;

Review of the types.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos ao Prof. José Lacerda de Araújo Feio, Diretor do Museu Na¬

cional do Rio de Janeiro, o empréstimo do material reestudado e a Sra. Thereza

Sarli, desenhista do Instituto Butantan a confecção dos desenhos.

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0,5-m

0,3 mm

Fig. 1 — Actinopus rufibarbis : dente da garra superior;

Fig. 2 — “Actinopus niger bulbo copulador;

Figs. 3 e 4 — Actinopus paranensis: Patela do terceiro par de patas e bulbo copuladoi (4):

Fig. 5 — Idiops crulsi: receptáculos seminais;

Figs. 6 e 7 — Idiops nilopolensiss : receptáculos seminais(6) garra superior(7);

Fig. 8 — Diplura bitaeniatas: dentição na garra superior;

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Mem. Inst. Butantan, 35: 117-138, 1971.

*1,Z mm

Figs. 9 e 10 — Uruchus fallacc: primeiro tarso (9); receptáculos seminais (10);

Fig. 11 — Diplura paulistana: receptáculos seminais;

Fig. 12 — Thalerothele aurantiaca : receptáculos seminais;

Figs. 13 e 14 — Thalerothele uni/ormis: bulbo copulador (13); apófise da tíbia I;

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Mem. Inst. Butantan, 35: 117-138, 1971.

//({

1 9

Figs. 16 e 16 — Hannonicon nipridorsi bulbo copulador(15); espinho e apófise na tíbia I e

no metatarso I

Figs. 17 e 18 — Ischnothele seocpunctatum : dentição das garras I e IV (17); receptáculos

seminais(18);

Fig. 19 — Ischnothele zoroda: dentição na garra I; inserção dos dentes; dentição da garra

IV(19); receptáculos seminais(20);

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( ORTIIOGNATIIA ) estabelecidos por C. de Mello Leitão e depositados no Museu Nacional do Rio.

Mem. Inst. Butantan, 35: 117-138, 1971.

2 4

Fig. 20 — Ischnothele zoroda: receptáculos seminais;

Flgs. 21 a 34 — Cyclostemum multicuspidatum: face ventral do tarso XV (21); tíbia I do

macho (22); tíbia do palpo do macho (23); bulbo copulador (24);

Fig. 25 — Aphantopelnva vcnosum : face ventral do tarso IV;

Flgs. 26 e 27 — Cyclostemum schmardae — tíbia do palpo do macho (26); bulbo copulador(27)

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Mtm. Inst. Butanían, 35: 117-138. 1971.

3,0imk

vá

Fig. 28 — Cyrtopholis zorodes: receptáculos seminais:

Flgs. 23 a 31 — Cyclosternum melloleitaoi n. sp.: Tíbia X do macho (23); tibia do palpo do

macho (30); bulbo copulador (31);

Fig. 32 — Ischnocolus paxvus; dentição das garras I (à esquerda)) e IV (à direita);

Figs. 33 e 34 — Cyclosternum multicuspidatum'. dentição das garras I (à esquerda) e IV (à

direita) (33); receptáculos seminais (34);

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( ORTHOGNATHA ) estabelecidos por C. de Mello Leitão e depositados no Museu Nacional do Rio.

Mem. Inst. Butantan, 35: 117-138, 1971.

Figs. 35 a 37B — B — Pseudhomoeomma fasciatum: cerdas divisórias nas escopulas dos tarsos

I e IV: em machos (35), em fêmeas (36); bulbo copulador (37-A);

receptáculos seminais (37-B);

Figs. 3S a 41 — Tmesiphantes montanus: tíbia do palpo do macho (38) bulbo copulador (39);

apófises na tíbia I do macho (40); receptáculos seminais (41);

Figs. 42 — Chaetorrhombus semifasciatus — cerdas nas escópulas dos tarsos I (esquerda) e

IV (direita);

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( ORTIIOGNATHA ) estabelecidos por C. de Mello Leitão e depositados no Museu Nacional do Rio.

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EXETASIS (DIPTERA, ACROCERIDAE) IN BRAZIL

VERA REGINA D. von E1CKSTEDT

(Seção de Artrópodos Peçonhentos, Instituto Butantan)

ABSTRACT: Three cases of para-

sitism in the Mygalomorph spider

Lasidora klugi by an acrocerid fly

were studied. ACROCERIDAE in

their larval phase are known only as

internai parasites, developing and

evolving inside the host spider. Be-

fore emergence, the parasite consu¬

mes the greatest part of the hosfs

content, thus killing it. Up to now

there is only one described case of

parasitism by ACROCERIDAE from

Brazil (Vellard, 1934); the parasite

however had not been identified by

the author. For the first time in the

literature a spider genus of the sub-

-family THERAPHOSINAE is cited as

host of these flies.

The parasite insects have been rea-

red by the author up to adulthood

and were later sent to Prof. Evert

Schlinger (University of Califórnia,

Berkeley, U.S.A.) who identified them

as a new species of the genus Exe-

tasis, to be described elsewhere.

UNITERMS : Spider parasitism; La-

siodora klugi parasitism; Parasite

flies; ACROCERIDAE flies; Exetasis

flies.

INTRODUCTION

Instances of parasitism of spiders by acrocerids have been know for about

one century. The oldest reference is by Menge (1866), who in his monograph of

Prussian spiders stated to have reared a larva of Ogcodes pallipes Erichson from

Clubiona putris Koch (CLUBIONIDAE). ACROCERIDAE in their larval phase

are known only as internai parasites of spiders. The fecundated female lays masses

of eggs over the ground, on twigs, on living or dead branches of shrubs and trees.

After an incubation of several weeks, the tiny (some tenths of a millimeter long)

but quite active larvae, known as planidia, emerge. They may remain standing

erect beside their egg shell or may walk worm-like or jump from one place to the

other in order to attach themselves to a suitable host which they may encounter.

They enter the host by means of a piercing organ present on the head of the larva,

which they use to tear the thin intersegmental membranes of the spidefs legs.

Address:

C.P. 65, São Paulo, Brazil

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SciELO

von EICKSTEDT, V. R. D. — Thrce cases of parasitism in the Mygalomorph spider LASIODORA

KLUGI (C. L. KOCH) by a fly of the genus EXETASIS (DIPTERA ACROCERIDAE) in Brazil.

Mem. Inst. Butantan , 35: 139-146, 1971.

Otherwise, they may use the natural orifices of the spider, such as the respiratory

or genital slits, without lacerating the hosfs integument (Millot, 1938). According

to Schlinger (1960) several larvae of Ogcodes were seen to enter the host through

the intersegmental membranes of the legs but 50% of them seemed to prefer ente-

ring the spider through the dorsofrontal region of the abdômen. They develop, molt

twice and change morphologically inside the hosfs body. When mature, the larvae

emerge from the spider through the abdominal region, usually piercing it (Schlin¬

ger, 1952) or (according to Eason et al. (1967) for one larva of Ogcodes palli-

dipennis which was seen emerging from one of the lung slits of a female Pardoso

lapidicina ) emerges without damaging its abdômen.

The third larval stage, shortly before emergence, consumes the greatest part

of the host contents, thus killing it. The larva, at this phase, is yellowish-white

and its body is covered by a glossy, vicous substance. A short time before the

emergence of the parasite, the spider, probably stimulated by the movements of

the larva in its entrails, spins an irregular web of silken threads, similar to a pre-

-moulting web (Schlinger, 1962). This is the first sign that something anormal is

going to happen.

According to most authors, not until this moment it is possible to know

whether the spider is parasitired or not — it does not show any externai evidence

of parasitism, neither by changes of the body (the increased abdômen might well

be mistaken as gravidity or overfeeding) nor by behavioral changes. This irregu¬

lar web spun by the spider is the place where the larva will fix itself for pupation.

It adheres to the silken threads by means of the oral hooks and a series of tiny

groups of abdominal hook-like setae, with the head turned upwards. The larva

then becomes motionless and gradually darkens. After some days or weeks, the

delicate pupal skin starts to break, and the imago emerges. Near the web there

can be found the remains of the spidefs body, reminding one more of an exuvia

than that of the body of a spider.

There are, up to present, only two cases dealing with the biology of acrocerids

from the neotropical region: that of Schlinger (1968) who reared Arrynchus rna-

culatus Schlinger from the chilcan Theraphosid Phrixotrichus roseus (Guerin) and

that of Vellard (1934) on a Grammostola actaeon (Pocock) from Paraná, Brazil,

parasitized by a larva that, according to Vellard “présente tous les caractères des

Ochaea; ce n’est ni 1’ O. calida Wied, ni 1’ O. lugubris Gerst; je n’ai pu me procurer

actuellemcnt la description des deux autres espèces de ce genre décrites au Bré-

sil”.

The Seção de Artrópodos Peçonhentos of the Instituto Butantan in São

Paulo receives every year hundreds of specimens of living Mygalomorph spiders

(tarantulas or “caranguejeiras” in Brazil) from the most diverse regions of the

country. These specimens are sent by people willing to learn something about

their peculiarities, by persons aware of their importance to public health, who

became our assiduous collaborators, or are obtained during the excursions of the

Instituto Butantan staff. Among some of these spiders I had the opportunity to

observe three cases of parasitism of Lasiodora klugi (MYGALOMORPHAE:

THERAPHOSIDAE) by acrocerid flies of the genus Exetasis ( = Ocnaea of

authors but not Walker, 1852).

Most of the published records of endoparasitism by acrocerids published up

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KLUGI (C. L. KOCH) by a fly of the genus EXETASIS (DIPTERA ACROCERIDAE) in Brazil.

Mem. Inst. Butantan, 35: 139-146 1971.

to present involve true spiders (LABIDOGNATHA), especially of the families

LYCOSIDAE and SALTICIDAE. Few cases were recorded in Mygalomorph

spiders of the family CTENIZIDAE (Brauer, 1869; Jenks, 1938) and THE-

RAPHOSIDAE (Baerg, 1958; Eason et ai, 1967 and Schlinger, 1968). Among

the THERAPHOSINAE, no instance of parasitism has been published prior to

this note. Besides this, the cases of parasitism by ACROCERIDAE in Mygalo¬

morph spiders described up to now, involved only fossorial genera. Therefore,

this account on parasitism of a nomadic THERAPHOSINAE, may be of interest

to entomologists and biologists in general.

MATERIAL AND METHODS

At arrival in the lab the spiders are identified and then put inside wooden

cages. Each cage has a number and a corresponding slip of paper, where there are

recorded: classification, sex, origin and arrival date of the spider, name and

address of the collector. The spiders are checked regularly and observations on

shedding, making of cocoons, birth of spiderlings, changes in behavior, feeding,

etc. are recorded.

The cages measure 30x25x20 cm., the back wall is of wire screen and the

front is a glass sliding door. This way, cleaning, treatment and observation of the

spider are easily done. The several cages (about 400) are arranged by numerical

order in special shelves, one next to the other in a rearing room. During hot

weather the animais are kept at room temperature, during cold weather the room

is heated to 23°C. Every two or three weeks the spiders are fed with a live baby

mice. The water they are supposed to drink is kept in little clay containers and

renewed constantly; the water never must be missing in the cage.

The hosts have been identified by the author and the acrocerid parasites by

Prof. Evert Schlinger (University of Califórnia, Berkeley, U.S.A.) who concluded

that these ACROCERIDAE represent a new species of Exetasis which he intends

to describe. The drawings were done with a camera lúcida by Mrs. Delma Tra¬

vassos. The exact time of emergence from the host and eclosion of the adults were

recorded, but not the precise dates of pupation.

BIOLOGICAL DATA

First case: On December 26, 1967, we have received a specimen of Lasiodora

klugi, sent by the company “Sul Madeiras, Ltda”. The spider had been captured

when trying to escape from a log of rosewood (jacarandk) from Bahia, Brazil.

On January 26, 1968, the spider moulted in the laboratory and on June 26 of

the same year was found dead inside its cage. The body was almost empty and

showed in the dorsum of the abdômen, near the base, two orifices. Inside the

cage two yellowish-white larvae were found, and were preserved in 70% alcohol

for study. They will be described by Schlinger. Their collection number is N.°

310, IB. The host, unfortunately, was not preserved.

2nd. case: On February 16, 1968, the Company Masul S. A., Osasco, sent

us six specimens of Lasiodora klugi, found in a load of logs from Colatina, State

of Espírito Santo, Brazil. Three specimens were already dead at the time arrival,

and were included in the arachnological collection of the Seção de Artrópodos

Peçonhentos of the Instituto Butantan (N.° 3845 IB). Of the three remaining

specimens, one was a male which died on February 24, 1970, and was not parasi-

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KLUGI (C. L. KOCH) by a fly of lhe genus EXETASIS (DIPTÉRA ACROCERIDAE) in Brazil.

Mem. Inst. Butantan , 35: 139-146 1971.

tized; the second, a female, is still alive; the third, an immature specimen, was

parasitized by two larvae, which emerged on July 5, 1968, causing the death of

the spider (preservcd under N.° 28, IB). The larvae were reared. At the time of

emergence, the larvae had a whitish color, with a slight greenish tinge. On July

25, 1968, the pupae had already formed, with a yellowish-brown coloration, and

hung from the irregular web spun by the spider (Photograph 1). On September 2,

1968, one of the imagos had freed itself almost completely from the puparium, the

wings and legs plainly visible. On September 9, 1968, it walked about the cage,

very slowly, dying a few days afterwards (the exact date was not recorded). The

host was a juvenile female spider, with the genital slit still closed.

3rd. case : An immature specimen of Lasiodora klugi, without procedence,

arrived at the Instituto Butantan on December 11, 1967. On February 20, 1969

shedding took place and on July 10, 1969, it was found dead in the cage. Near

its body, were two shining larvae each with eight dark ventral spots (setal pla-

telets). One larva was found dead the following day, but the other was reared to

an adult. On July, 1969, the pupa was already formed and its skin contained a

gap near the region of the head (prothoracic gap). On July 15, 1969, the pupa

had a much darker color, practically grey; the gap reached the median region of

the body. On August 12, 1969, the adult emerged, and the puparium had at this

time a blackish color. Two days later the adult was found dead, being preserved

together with the remmants of the host (N.° 3955, IB). The host was an immature

female, with the genital slit closed and the spermathecae still in process of forma-

tion.

CONCLUSIONS

1. Contrary to the observations of several authors dealing with north tem-

perate spiders, emergence of these brazilian parasites occurred during the winter.

One possible explanation is that the spiders were kept under laboratory condi-

tions, in heated rooms during the winter. It is possible that, if the spiders were

kept under natural conditions of temperature, the parasites would have emerged

later.

2. In all three cases two larvae per host emerged. In one of the cases (2nd.)

it seems that the second larva used the same hole as the first did, for no other

exit hole was found. Other cases of double or multiple parasitism by acrocerids are

those of Jenks (1938), Baerg (1958), Eason et al. (1967), and Montgomery

(1903).

3. It was always possible to see the exact site of fixation of the larvae

near the edge of the exit hole (Fig. 1 and 2). In that region a small chitinized

shell (spiracular plate) was observed containing the spiracular remnants of the

second-instar larva. In case 2, the region of fixation of the larva which used the

same exit hole as the first, could be seen very clearly: simmetrically to this exit

hole there was a slightly modified integument region with the two second-instar

larval caudal spiracles at the center. Millot (1938) cites an analogous fact for

Ogcodes in the abdômen of a Clubiona but this is the first time that an illustra-

tion is given of these structures. Thus, contrary to most author’s statemcnts that the

detection of parasitism can be done only just prior to the emergence of the larva,

an accurate examination of the spider integument would have revealed much

earlier this fact, at least in our three specimens.

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KLUGI (C. L. KOCH) by a fly of the genus EXETASIS (DIPTÉRA ACROCERIDAE) in Brazil.

Mem. Inst. Butantan, 35: 139-146 1971.

4. The time of development of the larvae could not be determined, since

the spiders received were already parasitized. However, we could observe that

from arrival to emergence of the larvae, periods between 139 and 577 days elapsed

The larvae needed from 33 to 66 days from host emergence to adulthood.

RESUMO — Foram estudados três

casos de parasitismo entre a aranha

caranguejeira Lasiodora klugi e uma

espécie nova de môsca do gênero

Exetasis (ACROCERIDAE). Os acro-

cerídeos na sua fase larval são sem¬

pre parasitas internos de aranhas,

desenvolvendo-se e transformando-se

profundamente no interior delas. An¬

tes de emergirem do hospedeiro, con¬

somem a maior parte do seu conteú¬

do interno, matando-o.

Existia até agora somente um caso

relatado sôbre a biologia de ACROCE-

RIDAE do Brasil (Vellard, 1934) on¬

de, porém, o autor não chega a iden¬

tificar o parasita. Pela primeira vez

na literatura, um gênero de aranha

da sub-família THERAPHOSINAE é

citado como hospedeiro dessas mos¬

cas.

Os insetos parasitas foram criados

pelo autor até a fase adulta e, poste¬

riormente, enviados ao Prof. Evert

Schlinger (University of Califórnia,

Berkeley, U.S.A.) que os identificou

como espécie nova do gênero Exeta¬

sis, que êle irá descrever.

UNITERMOS: Parasitismo em ara¬

nhas; Parasitismo em Lasiodora klu¬

gi; Dípteros parasitas de aranhas.

ACKNOWLEDGEMENTS

My best thanks are due to Prof. Evert Schlinger (Department of Entomo-

logy, University of Califórnia, Berkeley) for reviewing the manuscript and making

the identification and description of the new species of ACROCERIDAE and to

Mr. Nelson Papavero (Museu de Zoologia, Universidade de São Paulo) for many

suggestions.

TABLE 1: BIOLOGICAL DATA

HOST

PARASITE

N.°

sex

caged on

emergence

larval*

period

adult

from

emergence

to imago

310 IB

26.XII.1967

26.VI.1968

180

23 IB

16.11.1968

5.VII.1968

139

2.IX.1968

60 days

3955 IB

11.XII.1967

10.VII.1969

577

12.VIII.1969

33 days

* larval period (inside the host) recorded only in the lab. (in days).

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von EICKSTEDT, V. R. D. — Threc cases of parasitism in the Mygalomorph spider LASIODORA

( ORTHOONATIIA) estabelecidos por C. de Mello Leitão e depositados no Museu Nacional do Rio.

Mem. Inst. Butantan, 35: 139-146. 1971.

Fig. 1: Emergence hole of an Exetasis sp. larva showing: 1 ) emergence hole 2) spiracular

remnants seen from inside 3) spiracular plate seen from inside 4) spider’s integu-

ment with its setae

0,5mm

Fig. 2: Regíon of fixation of an Exetasis sp. larva in the abdominal spider integument

showing: 1) caudal spiracles of the larva 2) spiracular plate seen from outside.

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Mem. Inst. Butantan, 35: 139-146 1971.

Photooraph 1: Pupae of Exetasis sp. hanging from the web spun by Lasiodora klugi.

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KLUGI (C. L. KOCH) by a fly of the genus EXETASIS (DIPTERA ACROCERIDAE) in Brazil.

Mem. Inst. Butantan, 35: 139-146 1971.

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Recebido para publicação em 19 de novembro de 1971.

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Mem. Iríst. Butantan

35: 147-155, 1971.

yff-OXO N-SUBSTITUTED BENZAZOLES. I — THE /i-ACYLETHYLATION

OF BENZIMIDAZOLES WITH MANNICH BASES * **

RAYMOND ZELNIK and FATIMA STREHLAU

(Serviço de Química Orgânica, Instituto Butantan)

ABSTRACT: Benzimidazoles and ter-

tiary ketonic Mannich Bases react in

ethanol at reflux temperature to yield

R -oxo N-substituted benzimidazoles.

Reduction with NaBH 4 afforded the

corresponding À-hydroxy N-substitu¬

ted derivatives. Some biological data

are reported.

UNITERMS: Benzimidazole, Alcoyla-

tion with Mannich Bases; Michael

addition.

The discovery of the inhibitory action of benzimidazole against a number

of microorganisms, a process antagonized by certain purines (13) and evidence

henceforth of biological activity associated with the benzimidazole nucleus have

resulted in the description of a wide variety of physiologically active substances.

These include analgetic (6), antibacterial (1), central depressant (4) and anti-

viral (10) agents.

In continuation of our studies on p-oxo N-substituted theophyllines (14)

which involved the reaction of /?-acylethylation with tertiary ketonic Mannich

Bases (5), it seemed pertinent to extend this reaction to benzimidazole (15), and

to 2-substituted benzimidazoles in order to provide new compounds for chemo-

therapeutical evaluation.

As in the mechanism frequently proposed (3), the over-all reaction, eq. [1],

is likely to proceed by elimination of the dialkylamine, eq. [2], followed by a

classical Michael addtion of the benzimidazole to the a, /Tunsaturated ketone,

eq. [3], generated in situ.

* Investigação realizada sob os auspícios do Fundo de Pesquisas do Instituto Butantan, da Fundação

de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo e do Conselho Nacional de Pesquisas.

** Parte da tese de doutoramento de F.S., Universidade de São Paulo, 1967.

Adress: C.P. 65 — São Paulo, Brazil.

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ZELNIK, R. and STREHLAU, F. — p-oxo N-substi tuted benzazoles. I — The ^-acylethylation of ben-

zimidazoles with Mannich Bases. Mem. Inst. Butantan. 35: 147-155, 1971.

Rj -COCH 2 CH 2 N(RR)

-HN(RR)

Rj -COCH=CH 2

Benzimidazoles and the appropriate tertiary ketonic Mannich Bases were

made to react in ethanol under reflux. The reaction was followed by observation

of the elimination of the volatile amine under a stream of nitrogen and also by

TLC when aliquots were analysed at intervals. The benzimidazoles were obtained

by the Phillips condensation (11) of o-phenylenediamine with organic acids. The

Mannich Bases were prepared and stocked in the form of their hydrochlorides

and according to need transformed with the help of cold alkali into the base

which was taken up in ether and used as a residual oil without further purification.

After completion of the reaction between the benzimidazole and the Mannich

Base, concentration or cooling of the solution afforded the product in a crystalline

form. In other cases when it was contaminated with the starting material or

resisted crystallization, isolation of the product was accomplished by way of

chromatography. Under these conditions, the desired /?-oxo N-substituted benzimi¬

dazoles were obtained in yields ranging from 37 to 74% as recorded in Table I.

As previously reported (15), the Michael addition according to eq. [3] was

effected when benzimidazole and phenyl-vinyl ketone were heated under reflux

in toluene in presence of Triton B as a catalyst. The resulting product of conden¬

sation was identical to the corresponding compound (I, Table I) obtained under

the preceding conditions.

The new benzimidazoles were readily reduced to the corresponding secondary

alcohols by NaBH 4 with excellent yields as show in Table II, to constitute a pool

of starting materiais for further synthesis.

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-0X0 N-SUBSTITUTED BENZIMIDAZOLES

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ZELNIK, R. and STREHLAU, F. — ^g-oxo N-subst tuted benzazoles. I — The ^g-acylethylation of ben-

zimidazoles with Mannich Bases. Mem. Inst. Butantan. 33: 147-155, 1971.

BIOLOGICAL ACTIVITIES

I were evaluated for their anti-tumor

transplanted tumors Mecca lymphosar-

no reproducible activities were found.

some indicative features in retardation

125 mg/kg/day respectively.

anti-schistosomiasis activities, all the

with Plasmodium berghei or with Schis-

The compounds described in Table

activities: in the in vivo tests with mouse

coma and Ridgway osteogenic sarcoma,

However, compounds I and V displayed

of ROS tumor growth at doses of 500 and

In the tests for anti-malarial and

compounds were inactive in mice infected

tosoma mansoni.

The compounds were also tested in the supramaximal electroshock for po-

tential antiepileptic properties: only compound VI displayed some anticonvulsant

activity.

EXPERIMENTAL

Melting points were taken on a Kofler-Reichert hot stage microscope and

are uncorrected. The infra-red spectra were measured in KBr discs on the Unicam

SP-200 spectrophotometer Chromatography was carried out on silicic acid (Merck

0.05 — 0.20 mm) and thin-layer chromatography on plates coated with Silicagel

G (Merck). Spots were detected with ultraviolet light or iodine vapour.

Analyses were performed by the microanalytical laboratory, Pharmazeu-

íisches Institut der Universitat, Basel. We express our thanks to Professor Kuno

Meyer for this courtesy.

Percent yields and time of reactions are listed in Table I and Table II.

3-( 1 -benzimidaz,olyl)-propiophenone (1)

A mixture of benzimidazole (2.36 g, 0.02 mole) and /?-dimethylamino-

propiophenone (8) in ethanol (50 ml) was heated under reflux. Upon concen-

tration of the solvent, the precipitate was filtered and recrystallized from acetone-

-petrol ether b.p.35-80°, to give 3.23 g of the product, m.p. 129-131°.

H- max 1670 cm-i(C = O).

Anal. Calcd. for CioHj.NoO : C, 76.78; H, 5.64; N, 11.20.

Found: C, 76.53; H, 5.48;N, 11.19.

2-(l-benzimidazolylmethyl)-cyclohexanone (II)

Benzimidazole (9.4 g, 0.08 mole) and 2-dimethylaminomethyl-cyclohexa-

none (7) (12 g, 0.08 mole) in 75 ml of ethanol were refluxed. The solvent was

evaporated and the viscous residue chromatographed. The elutions from benzene-

•chloroform 3:1 and 1:1 furnished 6.18 g of the product which crystallized from

benzene-petrol ether, m.p.83-87°.

t* max 1705 cnrl =

Anal. Calcd. for ChHioNoO : C, 73.65; H, 7.06; N, 12.27.

Found: C, 73.55; H, 7.11; N, 12.53.

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ZELNIK, R. and STREHLAU, F. — p-oxo N-substituted benzazoles. 1 — The ^-acylethylation of ben-

zimidazoles with Mannich Bases. Mem. Inst. Butantan. 35: 147-155, 1971.

5-(l-benzimidazolyl)-l-(p-methoxyphenyl)-l-penten-3-one (III)

A mixture of benzimidazole (14 g, 0.12 mole) and 5-dimethyl-amino-l-

-(p-methoxyphenyl)-l-penten-3-one (9) (35 g, 0.15 mole) in 100 ml of ethanol

was heated under reflux. Upon concentration and cooling, the precipitate was

collected and crystallized from acetone-ether, yield 26 g, m.p. 136-138°.

(i max 1685 cm 1 (C=0).

Anal. Calcd. for C in H 18 N 2 0 2 : C, 74.49; H, 5.92; N, 9.15.

Found: C, 74.68; H, 5.98; N, 8.85.

5- ( 1-benzimidazolyl ) -1-phenyl-l -penten-3-one (IV)

Benzimodazole (0.59 g, 0.005 mole) and 5-dimethylamino-l-phenyl-l-

-penten-3-one (9) (1.26 g, 0.006 mole) in 20 ml ethanol were heated under

reflux. Upon concentration, the solid residue crystallized from acetone-ether,

yield 0.66 g of the product, m.p. 128-130°.

I* max 1660 cm_1 ( c = °)-

Anal. Calcd. for C 18 H 1(1 N 2 0 : C, 78.23; H, 5.84; N, 10.14.

Found: C, 78.31; H, 5.99; N, 10.34.

3- [7 - ( 2-methylbenzimidazolyl ) ] -propiophenone (V)

A mixture of 2-methyl-benzimidazole (12) (19.8 g, 0.15 mole) and

/J-dimethylaminopropiophenone (26 g, 0.15 mole) in ethanol (90 ml) was heated

under reflux. Upon concentration, the solid residue crystallized from acetone-

•ether, yield 15.9 g of the product, m.p.97-99°.

1* max 1675 cm -‘ ( C = °)-

Anal. Calcd. for C, 7 H 1B N 2 0 : C, 77.23; H, 6.09; N, 10.61.

Found: C, 77.28; H, 6.26; N, 10.45.

Oxime, m.p.213-215°. Anal. Calcd. for CitHi 7 N 3 0 : C, 73.08; H, 6.13.

Found: C, 72.81;H, 5.83.

5- [ 1 - ( 2-methylbenzimidazolyl) ]-1 - ( methoxyphenyl ) -l-penten-3-one (VI)

2-methyl-benzimidazole (13.2 g, 0.1 mole) and 5-dimethyl-amino-l-(p-me-

thoxyphenyl)-l-penten-3-one (30 g, 0.14 mole) in 75 ml of ehanol were heated

under reflux. After distilling off the solvent, the viscous residue was chromato-

graphed and the elutions from benzene-chloform 1:1 and chloroform yielded 22

g of the product which crystallized from acetone-ether, m.p. 100-102°.

[j. max 1680 cnv 1 (C = 0).

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ZELNIK, R. and STREHLAU, F. — p-oxo N-substituted benzazoles. I — The ^-acylethylation of ben-

zimidazoles with Mannich Bases. Mevn. Inst. Butantan. 35: 147-155, 1971.

Anal. Calcd. for C 20 H 20 N 2 O 2 : C, 74.97; H, 6.29; N, 8.74.

Found: C, 75.09; H, 6.36; N, 8.89.

3-[]-(2-rj-hydroxyethylbenziniidazolyl)-\-propiophenone (VII)

2-a-hydroxyethyl-benzimidazole (12) (5 g, 0.037 mole) and /i-dymethyla-

minopropiophenone (8.5 g, 0.048 mole) were refluxed in ethanol (60 ml). On

cooling the product which precipitated was contaminated by the starting material

and attempts to purify it by recrystallizations failed as shown by t.l.c. It was

therefore chromatographed and the elutions from chloroform-acetone 5:1 gave

8.1 g of the product which was crystallized from acetone-petrol ether, m. p.

134-135°.

M- max 1675 cm4 < C = °)-

Anal. Calcd. for C^H^NaO, : C, 73.45; H, 6.16; N, 9.52.

Found: C, 73.61; H, 6.12;N, 9.61.

Oxime, m.p. 185-186°. Anal. Calcd. for Ci8H w N 3 0 2 : N, 13.58.

Found: N, 13.41.

5-\_l-(2-a.-hydroxyethylbenzimidazolyl)'\-]-{methoxyphenyl)-l-penten-3-

-one (VIII)

A mixture of 2-a-hydroxyethyl-benzimidazole (8 g, 0.05 mole) and 5-dime-

thylamino-l-(p-methoxyphenyl)-l-penten-3-one (15 g, 0.065 mole) in 90 ml of

ethanol was heated under reflux The solvent was taken to dryness and the viscous

residue was chromatographed. The elutions from benzene-chloroform 1:2 and

chloroform gave 6.5 g of the product which crystallized from acetone-ether,

m.p. 123-125°.

a max 1650 cnrl ( C = °>

Anal. Calcd. for C 21 H 22 N 2 0 3 : C, 71.98; H, 6.32; N, 7.99.

Found: C, 72.03;H, 6.42; N, 8.10.

3- [ 1 - ( 2-a-hydroxybenzylbenz.imidaz.olyl) ] -propriophenone (IX)

A mixture of 2-a-hydroxybenzyl-benzimidazole (11) (22.4 g, 0.10 mole)

and yS-dimethylaminopropiophenone (22.2 g, 0.12 mole) in 100 ml of ethanol

was heated under reflux. Üpon concentration the precipitate was collected and

scparated from contaminants by chromatography. The elutions from chloroform

afforded 21.4 g of the product which crystallized from acetone-petrol ether,

m.p. 158-160°.

li max 1675 cmJ < C=0) -

Anal Calcd. for C 23 H 20 N 2 O 2 : C, 77.50; H, 5.66; N, 7.86.

Found: C, 77.46; H, 5.78; N, 7.97.

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ZELNIK, R. and STREHLAU, F. — yj-oxo N-subs! tuted benzazoles. X — The yj-acylethylation of ben-

zimidazoles with Mannich Bases. Mcrn. Inst Butantan. 35: 147-155, 1971.

5-[l-(2-a,-hydroxybenzylbenzimidazoIyl ] -/-( p-methoxyphenyl)-1-penten-

-3-one (X)

A mixture of 2-a-hydroxybenzyl-benzimidazole (9.3 g, 0.04 mole) and

5-dimethylamino-(p-methoxyphenyl)-l-penten-3-one (12.5 g, 0.05 mole) in 80

ml of ethanol was heated under reflux. Upon concentration of the solvent, the

solid residue was collected and recrystallized from chloroform-acetone, yield 9.5 g,

m.p. 168-170°.

max

1680 cm- 1 (C = 0).

Anal. Calcd for C 20 H 2i N,O :i : C, 75.71; H, 5.86; N, 6.79.

Found: C, 75.45; H, 6.12;N, 6.81%.

NaBH,, reduction of the 3-oxo N-substituted benzimidazoles

The X-hydroxy N-aralkylbenzimidazoles were obtained when NaBHj was

added to a solution of the keto derivatives (0.02 mole) in methanol (25 ml) and

the mixture stirred at room tcmperature for 1 h.After neutralisation with acetic

acid, evaporation of the solvent and dilution with water, the product precipitated.

It was then collected, dried and recrystallized from acetone-ether. Table II lists

the analytical data and physical constants of the alcohols.

SUMÁRIO: Benzimidazois N-substi-

tuidos por uma cadeia yj-oxo-aralquila

foram sintetizados por aciletilação de

diversos benzimidazois com Bases

cetônicas de Mannich. A redução pe¬

lo NaBH, forneceu os compostos

Ã-hidróxi correspondentes. Algumas

atividades biológicas são comentadas.

UNITERMOS: Benzimidazol; alcoila

ção com Bases de Mannich; Reação

de Michael.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors are indebted to Drs. C. Chester Stock and Georges S. Tarnowski,

Division of Experimental Chemotherapy of the Sloan-Kettering Institute for Cân¬

cer Research (New York) for the anti-tumor assays and interpretatíon of the

results, to Dr. J. Pellegrino, Instituto de Biologia da Universidade Federal de

Minas Gerais (Belo Horizonte) for the anti-schistosomiasis tests, to Dr. Z. Brc-

ner. Instituto Nacional de Endemias Rurais (Belo Horizonte) for the anti-malarial

tests and to Dr. H. Edery, Israel Institute for Biological Research (Ness-Ziona)

for the electroshock evaluations. One of us (FS) express her thanks to the Fun¬

dação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, for the award of a doctoral

fellowship. The technical assistence of Miss Rita Kuribara, Mrs. Kazuko Kajibata

Gaeta and Mr. Alipio Raul da Silva is appreciated.

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ZELNIK, R. and STREHLAU, F. — ^g-oxo N-subsl tuted bcnzazoles. 1 — The ^g-acylethylation of ben-

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Recebido para publicação em 27 de agôsto de 1971.

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