As “MEMÓRIAS DO INSTITUTO BUTANTAN" têm por finalidade a apre¬

sentação de trabalhos originais que contribuam para o progresso nos campos das

Ciências Biológicas, Médicas e Químicas, elaborados por especialistas nacionais

e estrangeiros.

São publicadas sob a orientação da Comissão Editorial, sendo que os con¬

ceitos emitidos são de inteira responsabilidade dos autores.

The “MEMÓRIAS DO INSTITUTO BUTANTAN" are the vehicle of com-

munication for original papers written by national and foreign specialists who

contribute to the progress of Biological, Medicai and Chemical Sciences.

They are published under the direction of the Editorial Board which assu¬

mes no responsibility for statements and opinions advanced by contributors.

Diretor do Instituto Butantan

Dr. Willy Beçak

Comissão Editorial

Henrique Moisés Canter — Presidente

Adolpho Brunner Júnior — Membros

Olga Bohomoletz Henriques

Raymond Zelnik

Sylvia Lucas

Denise Maria Mariotti - Bibliotecária

Indexado/lndexed: Biosis Data Base, Chemical Abstract, Current Contents, In¬

dex Medicus.

Periodicidade: irregular

Permuta/Exchange: são feitas entre entidades governamentais, com publicações

congêneres, mediante consulta prévia. Exchanges with similar publications can

be settled with academic and governmental institutions through prior mutual

agreement.

Endereço/Address. Instituto Butantan - Biblioteca. Av. Vital Brasil, 1.500

05504 — São Paulo, SP — Brasil

Telefone/Telephone: (011) 813-7222 — R. 129 — Telex: (011) 83325 BUTA-BR

Telefax: (011)815-1505

7SCÍELO3 2.1 12 13 14 15 16

Governo do Estado de São Paulo

Secretaria de Estado da Saúde

Coordenação dos Institutos de Pesquisa

Instituto Butantan — São Paulo — SP — Brasil

MEMÓRIAS

INSTITUTO BUTANTAN

Volume 51, número 3,1989

São Paulo, SP — Brasil

1989

MEMÓRIAS do INSTITUTO BUTANTAN. (Secretaria de Estado da Saúde)

São Paulo, SP — Brasil, 1918 —

1918 - 1983/84, 1 - 47/48

Publicação interrompida de 1985a 1986.

1987, 49(1-3)

1988, 50(1-3, supl.)

1989, 57(1-3,

ISSN0073-9901

MIBUAH CDD 614.07205

Solicita-se permuta/Exchange desired

SciELO

Mem. Inst. Butantan

51 ( 3 ), 1989

SUMÁRIO/CONTENTS

Lauro Pereira Travassos Filho

Adaptações em armadilha entomológica luminosa de sucção.

Adaptations in the entomological suction light trap.

Roberto Henrique Pinto MORAES; Rosa Maria de Oliveira

VEIGA; Ana Maria MARASSÁ.

Hiperimunização de cavalos soroprodutores com venenos botró-

picos e crotálico tratados por glutaraldeido.

Hiperimmunization of horses with Bothrops and Crotalus ve-

noms treated by glutaraldehyde.

Rosalvo GUIDOLIN; Wilmar DIAS da SILVA; Hisako Gondo

HIGASHI; Celso Pereira CARICATI; Maria Laura S. Rodrigues

LIMA; Josefina Farina MORAIS; José Ricardo PINTO; José

Roberto MARCELINO.

Produção de anticorpos antiveneno total de Crotalus durissus

terrificuse m cavalos por fosfolipase A 2 .

Production of antibodies against Crotalus durissus terrificus

whole venom in horses by its phospholipase A 2 moiety.

Hisako Gondo HIGASHI; Rosalvo GUIDOLIN; Amélia Keiko

NISHIKAWA; Ivone Kazuko YAMAGUCHI; Marco Antonio

STEPHANO; Maristela JOSÉ dos SANTOS; Wilmar DIAS da

SILVA; Celina M.P.M. UEDA.

Chemistry of the brazilian Labiatae. Terpenoids constituents of

Lepechinia speciosa (St. Hil.) Epling.

Química das Labiatas brasileiras. Constituintes terpenoides de

Lepechinia speciosa (St. Hil.) Epling.

Raymond ZELNIK; Flávia MARTELLINI-LANDSHOFF; Ema

RABENHORST. 101

Venenos botrópicos pré-tratados com inibidores ativos para os

sítios enzimáticos de proteases e com substância quelante pre¬

servam seu poder imunogênico.

Pretreatment of Bothropsve noms with proteases active direct si¬

te inhibitors or with cations chelator did not impairs their immu-

nogenic properties.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

Hisako Gondo HIGASHI; Rosalvo GUIDOLIN; Amélia Keiko

NISHIKAWA; Ivone Kazuko YAMAGUCHI; Maria Laura S.

Rodrigues LIMA; Josefina Farina MORAIS; WilmarDIAS da SILVA 107'

Presença de Hepatozoon plimmeri (Sambon, 1909)-Coccidia,

Flaemogregarinidae — em exemplar de Bothrops jararaca (Wied,

1824) — Serpentes, Viperidae, Crotalinae — mantido em cativeiro.

Presence of Hepatozoon plimmeri (Sambon, 1909)-Coccidia,

Flaemogregarinidae — in a specimen of Bothrops jararaca

(Wied, 1824) — Serpentes, Viperidae, Crotalinae — maintained

in captivity.

Pérsio De BIASI; Rubens Pinto CARDOSO JUNIOR; Selma

Maria de Almeida SANTOS . 117

SciELO

Mem. Inst. Butantan

51 ( 3 ), 1989

LAURO PEREIRA TRAVASSOS FILHO

1918 — 1989

"Quando alguém faz uma coisa porque gosta,

a gente tem tudo para se sentir bem ao lado dele"

Estas simples palavras de autor desconhecido, estavam bem a vista na

sala de Lauro Pereira Travassos Filho e retratam perfeitamente o espírito de

união desse magnífico homem que foi para nós muito mais que um chefe.

Mestre e amigo, Dr. Lauro partiu para sempre em maio de 1989.

SciELO

MORAES, R.H.P. Lauro Pereira Travassos Filho (1918-1989). Mem. Inst. Butantan,

57(31:73-78, 1989.

Lauro Pereira Travassos Filho, nascido aos 7 de fevereiro de 1918 no

Rio de Janeiro, teve desde pequeno a benéfica influência científica de seu

pai Lauro Pereira Travassos, eminente helmintologista que o introduziu ain¬

da em idade pré-universitária na Zoologia Médica do Instituto Oswaldo

Cruz, ao que se seguiu a formação em Medicina (Escola Paulista de Medici¬

na) e Ciências Naturais (Universidade de São Paulo), simultâneos com a

frequência na Parasitologia Animal do Instituto Biológico de São Paulo

( SP ), orientando-se definitivamente para a Entomologia, com preferência

inicial para os lepidópteros.

Desde o início de sua carreira, participou de viagens científicas para co¬

leta e estudo de material zoológico, integrando três das expedições biomé-

dicas do Instituto Oswaldo Cruz, e organizou outras, com ênfase aos inse¬

tos de sua predileção — lepidópteros e mantódeos — desenvolvendo pes¬

quisas zooecológicas de amplo espectro, dando incremento a várias cole¬

ções de lepidópteros noturnos do Museu de Zoologia, ex-Departamento de

Zoologia da Secretaria da Agricultura do Estado de São Paulo, com mais

de 30.000 exemplares. Graças a esses conhecimentos e a sua experiência,

foi convidado a colaborar com a equipe de combate aos gafanhotos em

1947.

Em 1959, colaborou na instalação da Estação Biológica de Boracéia do

Departamento de Zoologia.

Na sua especialidade, enfatizou a morfologia microscópica como efi¬

cientes recursos em taxonomia. Desenvolveu técnicas de conservação e

procurou criar as espécies em laboratório, com conclusões valiosas em ca¬

sos de dimorfismo e dicromatismo sexual, além dos dados das etapas evo¬

lutivas de significação bionômica, anotando os parasitos com vistas ao

controle biológico.

Sendo fitófagas as larvas dos lepidópteros, estudou botânica para o co¬

nhecimento das plantas alimentícias, freqüentando o Instituto de Botânica,

com o útil e recíproco entrosamento, adquirindo conhecimentos que o le¬

varam a participar da Sociedade Brasileira de Floricultura, na qual, pela ex¬

periência editorial, foi também editor da revista Flores do Brasil, publicando

artigos entomológicos e sobre o cultivo de plantas.

Quando na presidência da Sociedade Brasileira de Entomologia, editou

os volumes 11 a 13 da Revista Brasileira de Entomologia e o Catálogo dos

Papilionídeos Americanos. Por perda irreparável em 1976 do ilustre ento-

mólogo e amigo Frei Walter Kempf, editor da Revista Studia Entomológi-

ca, foi solicitado a editar dois volumes (19 e 20), que foram os últimos des¬

sa revista internacional de entomologia.

Pelas atividades próprias às suas pesquisas e contatos com laboratórios

congêneres, participou de sociedades científicas, mais ativamente nas de

entomologia. Por esse relacionamento foi indicado em 1959 pelo então Rei¬

tor da USP, para a Comissão de Risco de Vida e Saúde, primeiro com atua¬

ção nas áreas de pesquisas não diretamente relacionadas à Saúde Pública

e, depois, como presidente, entrosando-se com a maioria dos Institutos do

Estado de São Paulo.

Convidado em 1969 para o Instituto Butantan, reabriu a Seção de Para¬

sitologia, fechada desde 1963 por falecimento do titular Prof. Dr. Flavio da

Fonseca, retornando às pesquisas de combate à vetores, ao estudo de in¬

setos e ácaros parasitos, além de iniciar um manual prático sobre insetos

agressivos e larvas urticantes, que infelizmente não chegou a ver con¬

cluído.

SciELO

MORAES, R.H.P. Lauro Pereira Travassos Filho (1918-1989). Mem. Inst. Butantan,

57(31:73-78, 1989.

Devido à amplitude de seus trabalhos, foi convidado e devidamente

credenciado professor de Taxonomia de Insetos no Curso de Pós-

graduação em Entomologia da Faculdade de Agronomia Luiz de Queiroz da

LJSP — Piracicaba, de 1972 a 1977, desenvolvendo e consolidando seus

conhecimentos de taxonomia de insetos, incentivando a colaboração de

seus alunos e participando de bancas de teses. Participou ainda de cursos

referentes a insetos agressivos e urticantes no Instituto Butantan e em Fa¬

culdades Médicas e Biomédicas.

Em fins de 1977, classificou-se por concurso em nível VI, ingressando

na Carreira de Pesquisador Científico, passando a dar total dedicação à Se¬

ção de Parasitologia do Instituto Butantan.

Aposentado compulsoriamente aos 70 anos em 1988, e com a saúde

abalada, não suportou o desligamento com a instituição e principalmente o

afastamento do convívio diário de seus amigos. Pouco aproveitou de sua

aposentadoria, porém tenho certeza de que partiu gratificado pela missão

científica que cumpriu.

Ao amigo Travassos a nossa saudade e os nossos agradecimentos pe¬

los ensinamentos legados.

Roberto Henrique Pinto Moraes

Pesq. Científico — Seção de Parasitologia

1, | SciELO

MORAES, R.H.P. Lauro Pereira Travassos Filho (1918-1989). Mem. Inst. Butantan,

57(31:73-78, 1989.

LISTA DE TRABALHOS PUBLICADOS

1. CARRERA, M. Et TRAVASSOS FILHO, L.P. Dados morfológicos e bionômicos sobre

Hylemya poeciloptera (Malloch, 1921) (Dip. Anthomydae), minadora das folhas de

beterraba (Betavulgaris L.) Pap. Avulsos Dep. Zool., S(4):49-60, 1947.

2. D'ANDRETTA, M.A.V. & TRAVASSOS FILHO, L.P. Romualdisca dalmedai n.g., n.sp.

de Ctenuchidae (Lepidoptera). Liv. Homenagem R.F. d'Almeida SP, n.° 3:17-40,

1946.

3. Pd. MOURE, J. & TRAVASSOS FILHO, L.P. Notas sobre a nomenclatura dos grupos

superiores e gêneros. Publ. Avulsas Mus. Paranaense, n.4. nov. 1947. 19p.

4. MUNAÔ DINIZ, L.S.; BELLUOMINI, H.E.; TRAVASSOS FILHO, L.P.; ROCHA, M.B.

da. Presence of the ear mite Otobius megnini in the externai ear canal of lions (Pan-

theraleo). J. Zoo Animal Med., 75(4): 154-155, 1987.

5. SANTOS, N. Et TRAVASSOS FILHO, L.P. Aspecto médico e comentários sobre a loca¬

lidade de Salobra (Estado de Mato Grosso). Mem. Inst. Osw. Cruz, 39 3) :31 1 -20,

1941.

6. PEREIRA, C. Et TRAVASSOS FILHO, L.P. O emprego de "Tatuzinhos", Oniscidae

(Crustacea, Isopoda) na preparação de crânios de vertebrados. Rev. Biol. Hyg.,

9 2):67-8, 1934.

7. PEREIRA, C. Et TRAVASSOS FILHO, L.P. Sobre a ação anticulicídica das Planárias.

Rev. Biol. Hyg., 6(1):22-30, 1935.

8. TRAVASSOS FILHO, L.P. Contribuição ao conhecimento dos Euchromiidae. Gênero

Corematura Bult., 1876. (Lepidoptera). Mem. Inst. Osw. Cruz, 33. 2):259-62, 1938.

9. TRAVASSOS FILHO, L.P. Contribuição ao conhecimento dos Euchromiidae. Gênero

Cosmosoma Hübner, 1827 (Lepidoptera). Arq. Inst. Biológico, 9(6):59-66, 1938.

10. TRAVASSOS FILHO, L.P. Contribuição para o conhecimento dos Euchromiidae. V.

Gênero Isanthrene Huebner, 1826. (Lepidoptera). Boi. Biol., N.S. 4(31:454-72, 1939.

11. TRAVASSOS FILHO, L.P. Nova espécie de Ecdemus (Herrich-Schaffer, 1854)

(Lepidoptera-Euchromiidae). Arq. ZooL Est. S. Paulo, 7(71:318-30, 1940.

12. TRAVASSOS FILHO, L.P. Lepidoneiva, novo gênero da família Euchromiidae. (Lepi¬

doptera). Rev. Entomol., 77(1-21:477-87, 1940.

13. TRAVASSOS FILHO, L.P. Notas de uma expedição realizada de fevereiro a março de

1940, às localidades de Ilha Seca, no Estado de São Paulo, e Salobra, no Estado de

Mato Grosso. Pap. Avulsos Dep. Zool., 7:57-64, 1940.

14. TRAVASSOS FILHO, L.P. Euchromiidae de Salobra. (Lepidoptera). Arq. Zool. Est. S.

Paulo, Z(9):261-80, 1940.

15. TRAVASSOS FILHO, L.P. Contribuição à zoogeografia dos Euchromiidae brasileiros. I.

Material colhido na Ilha Seca, Estado de São Paulo, e Salobra, Estado de Mato Gros¬

so, de fevereiro a março de 1940. Arq. Zool. Estado S. Paulo, 2{ 101:281-98, 1940.

16. TRAVASSOS FILHO, L.P. Et CARRERA, D.M. Xanthozona melanopyga (Widman,

1830) (Diptera. Tachinidae), predadora de Brassolisastyra Godart, 1824 (Lep. Brasso-

lidae), praga das palmeiras. Dados bionômicos dos dois insetos e morfológicos do ta-

chinideo. Arq. Zool. Est. S. Paulo, 5(3):43-74, 1941.

17. TRAVASSOS FILHO, L.P. Nota sobre Lepidoneiva erubescens { Butler, 1876) (Lep. Cte¬

nuchidae). Rev. bras. Biol. , 3(3):337-9, 1943.

18. TRAVASSOS FILHO, L.P. Excursão científica a Porto Cabral, margem paulista do rio

Paraná. Arq. Zool. Est. S. Paulo, 4(11:1-32, 1944.

19. TRAVASSOS FILHO, L.P. Interessante anomalia em um Cosmosoma teuthras(\Na\kex,

1854) (Lepidoptera-Ctenuchidae). Pap. Avulsos Dep. Zool., 4(131:187-96, 1944.

20. TRAVASSOS FILHO, L.P. Ctenuchidae de Monte Alegre. Pap. Avulsos Dep. Zool.,

5(4): 29-36, 1944.

21. TRAVASSOS FILHO, L.P. Sobre as datas de publicações das "Mélanges Orthoptérolo-

giques", de Henri de Saussure, com referência à Ordem Mantodea Burmeister, 1838.

Pap. Avulsos Dep. Zool., 6(14): 157-162, 1944.

22. TRAVASSOS FILHO, L.P. Última ecdise e período de fixação dos caracteres cromáti¬

cos alares no Mantodea. Parastagmatoptera unipunctara (Burmeister, 1838). Manti-

dae: Vatinae. Pap. Avulsos Dep. Zool., 5(121:95-106, 1945.

23. TRAVASSOS FILHO, L.P. Técnicas gerais seguidas no estudo da Ordem Mantodea.

Burmeister, 1838. Arq. Zool. Est. SP., 4(5): 113-156, 1945.

24. TRAVASSOS FILHO, L.P. Sobre a família Acanthopidae. Burmeister, 1838. emend.

(Mantodea). Arq. Zool. Est. SP., 4(6): 157-232, 1945.

MORAES, R.H.P. Lauro

57(3):73-78, 1989.

Pereira Travassos Filho (1918-1989). Mem. Inst. Butantan,

25.

26.

27.

28.

29.

30.

TRAVASSOS FILHO, L.P. & CARRERA, M. Segunda expedição científica a Porto Ca¬

bral, margem paulista do rio Paraná. Arq. Zool. Est. SP., 5(2):89-134, 1946.

TRAVASSOS FILHO, L.P. Notas de nomenclatura. I — Estado atual dos gêneros

Methysia Butler, 1876 e Metamya, novò nome para Paramya Druce, 1898 (Lep. Cte-

nuchidae). Pap. Avulsos Dep. Zool., 7123):257-266, 1946.

TRAVASSOS FILHO, L.P. & PEREIRA, C. Comportamento da unidade em recipientes

de barro poroso para a criação de artrópodos. Pap. Avulsos Dep. Zool.,

6(101:123-126, 1947.

TRAVASSOS FILHO, L.P. Redescrição de Pericopis picta (Guerin, 1844) (Lep. Perisco-

pidae), estudo de suas fases cromáticas e dados bionômicos. Arq. Zool. Est. SP.,

5(7) :483-538, 1947.

TRAVASSOS FILHO, L.P. & CARRERA, M. Contribuição para o conhecimento de

Pseudogavrax longilineatus Sabrosky., parasita de ooteca de Mantodea (Dip. Chloro-

pidae). Rev. bras. Biol., 9(11:97-101, 1949.

TRAVASSOS FILHO, L.P. On the priority of Ctenuchidae Kirby, 1837. Lep. News.,

6(3):32, 1949.

TRAVASSOS FILHO, L.P. Líquido para preservação das estruturas internas de lepidop-

teros e demais insetos que habitualmente se montam em alfinetes. Arq. Zool. Est.

SP., 7(7):439-444, 1950.

32. TRAVASSOS, L. & TRAVASSOS FILHO, L.P. Disschematidae, novo nome para Peri-

copidae Walker, 1869 (Lep. Heterocera). Pap. Avulsos Dep. Zool. SP., 7CK2):77-91,

1951.

33. TRAVASSOS FILHO, L.P. Joaquim Franco de Toledo: 31-1-1905-17-5-1952. Dusenia,

Curitiba, PR., 3i 51:330-342, 1952.

34. TRAVASSOS FILHO, L.P. Redescrição de Corematura Butler, 1876 e de suas duas es¬

pécies. (Lepidoptera-Ctenuchidae). Arq. Zool. Est. SP., 8(31:89-108, 1952.

35. TRAVASSOS FILHO, L.P. Riccia, novo gênero para Corematura aliaria (Druce, 1890) e

descrição do alótipo dessa espécie. (Lep. Ctenuchidae). Pap. Avulsos Dep. Zool.,

1 7( 17) :279-88, 1953.

36. TRAVASSOS FILHO, L.P. Baratas, indesejáveis insetos domésticos que somente criam

problemas para o homem. Folha da Manhã, S. Paulo, Assuntos Gerais, 23 ago. 1953,

p.5.

37. TRAVASSOS FILHO, L.P. "Distribuem-se por cerca de 150 mil espécies as borboletas e

mariposas”, (reportagem). Folha da Manhã, S. Paulo, Assuntos Especiais. 20 set.

1953, p.13.

38. TRAVASSOS FILHO, L.P. "Apresenta aspectos dos mais curiosos a evolução das bor¬

boletas e mariposas. (Reportagem). Folha da Manhã, S. Paulo, Assuntos Gerais. 10

out. 1953, p.5.

39. TRAVASSOS FILHO, L.P. & URBAN, H. Sobre a criação de pequenos Mantodea com

insetos da Ordem Collemboia. Rev. bras. Ent., 7:159-161, 1954.

40. TRAVASSOS, L. & TRAVASSOS FILHO, L.P. Contribuição ao conhecimento dos Arc-

tiidae. (Lepidoptera) XXXIII — Rhipha curicosilvai n.sp. Rev. bras. Ent., 7:213-219,

1954.

41. TRAVASSOS FILHO, L.P. Notas de Nomenclatura. II. Prioridade de Druce (1898) em

alguns gêneros de Ctenuchidae (Lep.) atribuídos a Hampson (1898). Arq. Zool. Est.

SP., 8( 101:333-340, 1954.

42. TRAVASSOS FILHO, L.P. "Algumas palavras". Flores do Brasil, SP. 7(1):5-7, maio-

1954.

43. TRAVASSOS FILHO, L.P. "Uma borboleta inimiga da Giesta". Flores do Brasil, SP.,

7(1 ):40-42, maio-1954.

44. TRAVASSOS FILHO, L.P. "As lagartas que comem as folhas das palmeiras". Flores do

Brasil, SP. 7(31:35-38, 1954.

45. TRAVASSOS FILHO, L.P. Mirandisca, novo gênero para Cosmosoma harpalyce

Schaus, 1892, com descrição do allotypus. (Lep. Ctenuchidae). Vol. Homenagem A.

Mir. Ribeiro. Arq. Mus. Nacional, RJ, 42669-682, 1955.

46. TRAVASSOS FILHO, L.P. A criação de abelhas indígenas sem ferrão (Meliponinae). P.

Nogueira Neto, Ed. Chac. Et Quintais, SP, 280p. 44 fig., 1953. (comentário-

bibliográfico). Boi. Soc. Brasil. Ent., SP, 7(6):46-47, 1955.

47. TRAVASSOS FILHO, L.P. Vermiculite — O grande recurso da moderna floricultura.

Flores do Brasil, SP, 22):83-87, 1956.

48. TRAVASSOS FILHO, L.P. Borboletas e mariposas (bruxas) — Insetos da Ordem Lepi¬

doptera. Chácarase Quintais, SP., 6849-851, 1956.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

MORAES, R.H.P. Lauro Pereira Travassos Filho (1918-1989). Mem. Inst. Butantan,

57(31:73-78, 1989.

49. TRAVASSOS FILHO, L.P. — Contribuição ao conhecimento dos Ctenuchidae. (Lep.).

VII: Gênero Dinia Walker, 1854. Arq. Zool. Est. SP., 70(2): 185-207, 1957.

50. TRAVASSOS FILHO, L.P. "Em setembro provavelmente ocorrerá invasão ainda maior

de mariposas (Morpheissmerintha). (Reportagem). Folha da Manhã, S. Paulo 23 abril

1958. p.20.

51. TRAVASSOS FILHO, L.P. Novas experiências com Vermiculite. Flores do Brasil, SP,

.2(4): 187-191, 1958.

52. TRAVASSOS FILHO, L.P. & CAMARGO, H.F.A. A Estação Biológica de Boracéia.

Arq. Zool. Est. S. Paulo, SP., 77(1): 1-21, 1958.

53. TRAVASSOS FILHO, L.P. "Da crisálida sombria sai a borboleta luminosa", (reporta¬

gem). Diário de S. Paulo, SP., p. 8-9, 1958.

54. TRAVASSOS FILHO, L.P. & CASTRO, M.P. "Clemente Pereira": 1-1-1906 - 30-10-

1958. Anhembi, SP. 34 (100). 16p., mar. 1959.

55. TRAVASSOS FILHO, L.P. Comentários bionômicos e proteção pupal de Dinia aeagrus

(Cr.) — Lep. Ctenuchidae. Pap. Avulsos Dep. Zool., 731201:245-249, 1959.

56. TRAVASSOS FILHO, L.P. & HEITZMANN, T.J. Bionomia de Mantodea (Ins.) em labo¬

ratório. I - Parastagmatoptera unipunctata (Burn, 1838) (Mantidae — Vatine). Arq.

Zool. Est. S. Paulo, 7 7(8): 171-192, 1960.

57. TRAVASSOS FILHO, L.P. Apresentação in Cat. Papilionidae Ame. Edição Soc. Bras.

Ent., SP., maio 1966.

58. TRAVASSOS FILHO, L.P. & URBAN, H. Bionomia de Dinia aeagrus ( Cr., 1779) (Lep.

Ctenuchidae). Pap. Avulsos Dep. Zool. SP., 20(181:217-222,1967.

59. TRAVASSOS FILHO, L.P. Variação das manchas das asas de Dirphia multicolor iêmea.

(Lep. Hemileucidae). fíev. bras. Entomologia, 72113-116,1967.

60. TRAVASSOS FILHO, L.P. "Romualdo Ferreira d'Almeida": 1891-1969. Studia

Entomológica, 721-41:441-442, 1969.

61. TRAVASSOS FILHO, L.P. Dados bionômicos de Gonioterma chlorina e G. exquisita.

(Lep. Stenomidae). Studia Ent., 75(1-41:485-496, 1972.

62. TRAVASSOS FILHO, L.P. Triatoma williani Galvão & Cols., 1965, capturado em Mato

Grosso, BR., novo vetor da Moléstia de Chagas. Mem. Inst. Butantan, 36: 263-266,

1972.

63. TRAVASSOS FILHO, L.P. Sobre um ginandromorfo de Citheronia laocoon Cr., 1777.

(Lep. Adelocephalidae.) Studia Entom., 76(1-4):523-528, 1973.

64. TRAVASSOS FILHO, L.P.; SOERENSEN, B.; HEITZMANN-FONTENELLE, T.J. Ação

Larvi e Molusquecida do TEGO-51. Mem. Inst. Butantan, 37.317-325, 1973.

65. TRAVASSOS FILHO, L.P.; SOERENSEN, B. & alii. Sobre a erradicação da sarna de

coelhos. II Jornada Cient. FCMBB, Botucatu, SP. Sec. L, p. 185, 1973.

66. TRAVASSOS FILHO, L.P. & HEITZMANN-FONTENELLE, T.J. Ouriço cacheiro

(Coendu villosus) em laboratório. In: P. Nogueira Neto, A criação de animais indíge¬

nas vertebrados. SP. Ed. Tecnapis, 1973. p.270.

57. TRAVASSOS FILHO, L.P. "Borbolet, Lepidoptera, Mariposa". Enc. Mirador Intern.,

SP. pgs. 1476-1479, 6735-6737, 7253-7254, 1975.

68. TRAVASSOS FILHO, L.P. Brocada banana já tem nome! O Biológico, SP., 4 7(12):364,

1975.

69. TRAVASSOS FILHO, L.P. "As abelhas africanas". Supl. Cult. "O Estado de S. Paulo",

ano II, pgs. 11-12, 1978.

70. TRAVASSOS FILHO, L.P. "Frei Walter Kempf visto por amigo em tempo de pesquisa".

Studia Ent., 20(1-4):23-26, 1978.

71. TRAVASSOS FILHO, L.P. "Mensagem aos colaboradores". Studia Ent., 20(1-41:31-32,

1978.

72. MORAES, R.H.P.; TRAVÂSSOS FILHO, L.P.; SOERENSEN, B.; FARINA, F.B. Pre¬

sença de Listrophorus gibbus Pagenstecher, 1861 (Acarina, Listrophoridae), em cria¬

ção de coelhos. Rev. Latino-americana Cunicultura, SP, 7:49-52, 1980.

73. TRAVASSOS FILHO, L.P. "Vida dos insetos é debatida por congressistas". (Reporta¬

gem.) Correio BrazUiense, DF, 1 fev. 1983, p.12.

74. TRAVASSOS FILHO, L.P. "Encerrado encontro de Entomologia". (Reportagem.)

Correio BrazUiense, DF, 5 fev. 1983, p. 11.

75. VEIGA, R.M.O.; BORBA, H.L.; TRAVASSOS FILHO, L.P.; DOBBIN Jr., J.E. Contri¬

buição para o conhecimento dos Triatominae Hemiptera, Reduviidae. I — Triatoma

melanocephalaNe'\\/a & Pinto, 1923. Mem. Inst. Butantan, 44/45. 355-365, 1980/81.

76. MORAES, R.H.P. & TRAVASSOS FILHO, L.P. Contribuição para o conhecimento das

lagartas urticantes. I — Cerodirphia avenata araguensis Lemaire, 1971 (Lep. Attaci-

dae.) Mem. Inst. Butantan, 44/45: 367-376, 1980/1981.

2 3 4

SciELO

Mem. Inst. Butantan

51 ( 3 ): 79 - 84,1989

ADAPTAÇÕES EM ARMADILHA ENTOMOLOGICA

LUMINOSA DE SUCÇÃO

Roberto Henrique Pinto MORAES*

Rosa Maria de Oliveira VEIGA*

Ana Maria MARASSÁ*

RESUMO: Os autores descrevem no presente trabalho algumas modifi¬

cações funcionais e estruturais, feitas em armadilha entomológica lumi¬

nosa de sucção, objetivando um bom desempenho, fácil manejo e baixo

custo na confecção do aparelho.

UNITERMOS: Armadilha luminosa. Flebotomíneos.

INTRODUÇÃO

As armadilhas entomológicas empregadas em levantamentos popula¬

cionais de espécies vetoras de moléstias ou pragas de lavouras variam

quanto à forma e ao funcionamento.

Muitos são os modelos, podendo-se citar como exemplos os descritos

por Lumsden 5 , Minter 6 , Thatcher 9 e Silveira Neto & Haddad 7 .

Sendo tais armadilhas, de modo geral, utilizadas em trabalhos de cam¬

po, torna-se fator imprescindível a simplicidade na montagem, transporte e

funcionamento. Com relação a esses aspectos, pode-se apontar a armadi¬

lha luminosa de sucção CDC-miniatura, desenvolvida por Sudia & Cham-

berlain 8 , com modificações realizadas por Gomes et ai 4 , que é prática e de

bom desempenho, porém de custo pouco acessível.

Uma variação da armadilha de Chaniotis & Anderson 2 , descrita por Fal¬

cão 3 , e posteriormente modificada por Aguiar etal.\ foi utilizada pelos au¬

tores em levantamentos flebotomínicos no Horto Oswaldo Cruz do Institu¬

to Butantan - SP e na Fazenda São Joaquim do mesmo Instituto em São

Roque - SP, demonstrando ter os quesitos necessários para uma boa cole¬

ta.

O presente trabalho tem como objetivo apresentar novas modificações

* Seção de Parasitologia

Instituto Butantan, C.P. 65 01051 — São Paulo — SP — Brasil

Recebido para publicação em 19.1.1989 e aceito em 4.5 1989.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

MORAES, R.H.P.; VEIGA, R.M. de O.; MARASSÁ, A.M. Adaptações em armadilha ento-

mológica de sucção. Mem. Inst. Butantan, 57(3):79-84, 1989

e adaptações desta armadilha que se julgaram adequadas para um melhor

funcionamento, fácil manejo e menor custo de fabricação.

MATERIAL E MÉTODOS

Basicamente a estrutura gerai da armadilha é a mesma descrita por Fal¬

cão 3 , que consiste de: um tubo de PVC de 4", com 20cm de comprimento,

tendo numa extremidade uma "luva” de PVC de 4", onde é acoplado o

motor, e na outra um "cap" de 4" (também de cano para esgoto), do mes¬

mo material contendo uma válvula para pia, por onde entram os insetos

que são impedidos de atingir a hélice, devido a uma tela situada na câmara

coletora.

Quanto ao "chapéu" protetor da armadilha, também se utilizou um su¬

porte para plantas como o descrito por Aguiar et ai. 1

As modificações realizadas foram as seguintes:

— Modificações na estrutura da armadilha (Desenho 1 e Foto 1).

1 — A haste de sustentação, o suporte do motor e o suporte da lâmpada

foram confeccionados em PVC. Originalmente estes eram feitos de

alumínio.

2 — Na armadilha de Falcão 3 modificada por Aguiar et ai 7 , a haste de sus¬

tentação era conectada à luva ou ao cap, o que não era muito seguro,

visto que essas duas peças são encaixadas no corpo da armadilha.

Dessa forma idealizou-se nova haste inteiriça que é presa ao chapéu

por um único parafuso e conectada ao corpo por dois parafusos.

3 — Para que haja firmeza entre o corpo e a haste, colocaram-se nessas

partes fitas aderentes autocolantes*.

4 — Um funil de plástico branco foi adaptado à entrada da câmara coletora

para ampliar a área de sucção.

5 — A armadilha foi revestida externamente por papel colante** preto,

excetuando-se apenas os frisos do cap e da luva, bem como todo o

funil.

— Modificações no funcionamento (Desenho 1 e Foto 1).

1 — Utilizou-se um motor de 9 Volts de toca-fitas, alimentado por duas pi¬

lhas de 1,5V. Na armadilha original, o motor era de 6V. O motor pode

ser operado com duas pilhas grandes ou pequenas, ou ainda, em 110

ou 220V, por meio de um conversor para 6V, colocado no chapéu,

juntamente com os suportes para pilhas grandes. O suporte para pi¬

lhas pequenas foi colocado na luva, onde está o motor.

2 — A posição da fonte luminosa também foi modificada, sendo a lâmpa¬

da de 6,3V, colocada dentro da câmara coletora, logo acima da entra¬

da, alimentada por quatro pilhas grandes de 1,5V, colocada também

no chapéu.

‘ Conhecidas comercialmente por Velfix ou Fixa Fácil

'* Marca Contact-

2 3 4 5 6 SClELO o 1X 12 13 14 15 16

MORAES, R.H.P.; VEIGA, R.M. de O.; MARASSÁ, A.M. Adaptações em armadilha ento-

mológica de sucção. Mem. Inst. Butantan, 5/(31:79-84, 1989.

Foto 1

— Armadilha luminosa de sucção, utilizada para captura de flebotomíneos, na mata

do Horto Oswaldo Cruz do Instituto Butantan — SP.

.0 11 12 13 14 15 16

MORAES, R.H.P.; VEIGA, R.M. de O.; MARASSÁ, A.M. Adaptações em armadilha ento-

mológica de sucção. Mem. Inst. Butantan, 57(31:79-84, 1989.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Com as modificações estruturais, obteve-se maior segurança na sus¬

tentação do aparelho e maior facilidade quando da troca (se necessária) da

câmara coletora, ou somente da posição desta, com a entrada para cima

ou para baixo, bastando para isso girá-la e fixá-la por meio das fitas aderen¬

tes.

A substituição das partes feitas em alumínio, por PVC, reduz o custo de

fabricação.

O funil, colocado na entrada da. câmara coletora, torna o diâmetro de

sucção maior e, sendo este de cor branca, quando colocado em local escu¬

ro, reflete a luz interna, podendo ser visto a longa distância.

Julgou-se importante a transferência da lâmpada para dentro da arma¬

dilha visto que, numa eventual pane do motor, os insetos continuam no in¬

terior da armadilha, atraídos pela luz.

Com a armadilha revestida de papel colante preto, evita-se que a luz in¬

terna seja transmitida para todo o aparelho, ficando concentrada apenas

no funil.

Com relação às modificações funcionais, pode-se dizer que o rendimen¬

to do motor de 9V, alimentado por duas pilhas de 1,5V, é significativo, vis¬

to que com esta voltagem (3V), o motor desenvolve 2.000 RPM, o que,

além de não sobrecarregar as pilhas, é o suficiente para a sucção de insetos

leves, como os flebotomíneos.

Foram testados alguns tipos de pilhas pequenas e grandes de 1,5V,

sendo recomendadas para o motor as alcalinas, cujo rendimento médio foi

de 36 horas com as pilhas pequenas, sendo o dobro para as grandes.

Para a lâmpada, obteve-se bons resultados com quatro pilhas grandes

alcalinas de 1,5V, cujo rendimento médio foi de 44 horas, divididas em

períodos de 11 horas, com repouso de 24 horas em refrigerador.

No conversor de voltagem 110/220 para 6 volts, fez-se outra saída além

da original, tornando bastante funcional a operação do motor e da lâmpada

com apenas um conversor, sem interferir na qualidade de sucção e ilumina¬

ção.

ABSTRACT: The authors describe in this paper some functional and

structural modifications in the entomological suction light trap, providing

a good performance and easy employment, without high costs.

KEYWORDS: Light trap. Sand flies.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos ao Dr. Fernando de A. Corrêa, do Laboratório Especial

de Zoonoses e Endemias Parasitárias do Instituto Butantan, pelas suges¬

tões apresentadas.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

SciELO 1 ;,

Mem. Inst. Butantan

51(31:85-90, 1989

HIPERIMUNIZAÇÃO DE CAVALOS SOROPRODUTORES

COM VENENOS BOTRÕPICOS E

CROTÁLICO TRATADOS POR GLUTARALDEIDO

Rosalvo GUIDOLIN*

Wilmar DIAS da SILVA**

Hisako Gondo HIGASHI*

Celso Pereira CARICATI***

Maria Laura S.R. LIMA*

Josefina Farina MORAIS*

José Ricardo PINTO****

José Roberto MARCELINO*

RESUMO: Veneno de Crotalus durissus terrificus (5mg) e a mistura de

veneno (5mg) de sete espécies do gênero Bothrops (B. jararaca, B. jara¬

racuçu, B. neuwiedi, B. moojeni, B. alternatus, B. cotiarae B pradoi),

não tratados e insolubilizados pela ação de 0,34% de glutaraldeido, in¬

corporados em adjuvante oleoso tipo emulsão múltipla, foram utilizados

para imunizar cavalos. Uma semana após os animais foram reinoculados

com o antígeno incorporado ao adjuvante emulsão múltipla incompleto e

depois, com o intervalo acima citado foram reinoculados com os mesmos

antígenos adsorvidos ao hidróxido de alumínio. A reimunização dos ani¬

mais foi feita 30 dias após a última dose do ciclo básico, constando de:

uma dose de antígenos incorporados em adjuvante oleoso e três doses

de antígenos adsorvidos ao hidróxido de alumínio, com um intervalo de

sete dias entre a primeira e a segunda dose e de dois dias entre as de¬

mais. Amostras de sangue foram coletadas imediatamente antes de cada

inoculação e os anticorpos circulantes foram determinados pelos méto¬

dos de floculação e neutralização frente aos venenos de referência, cor¬

respondentes. As reações locais e sistêmicas observadas nos cavalos fo¬

ram consistentemente reduzidas ou ausentes, nos animais que recebe¬

ram os venenos tratados pelo glutaraldeido quando comparadas com

aquelas dos animais imunizados com venenos não tratados. Por outro la¬

do, o título de anticorpos no soro de todos os animais foi praticamente o

mesmo. Esta experiência indica que o glutaraldeido reduziu a atividade

tóxica dos venenos sem alterar a sua imunogenicidade.

UNITERMOS: Veneno serpentes. Glutaraldeido. Antiveneno

Seção de Concentação e Fracionamento de Soros

Seção de Imunoquímica

Seção de Soros - Fazenda São Joaquim

Seção de Veterinária - Fazenda São Joaquim - Instituto Butantan

Recebido para publicação em 11.8.1988 e aceito em 16.5.1989.

C.P. 65 — 01051 — São Paulo-SP-Brasil

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

GUIDOLIN, R.; DIAS da SILVA, W.; HIGASHI, H.G.; CARICATI, C.P.; LIMA, M. L. S.

R ; MORAIS, J. F.; PINTO, J. RMARCELINO, J.R. Hiperimunização de cavalos so-

roprodutores com venenos botrópicos e crotálico tratados por glutaraldeido. Mem.

Inst. Butantan, 57(3):85-90, 1989.

INTRODUÇÃO

Para a obtenção de plasmas hiperimunes antibotrópicos e anticrotáli-

cos, os cavalos são inoculados com diversas doses dos venenos desseca¬

dos que normalmente possuem atividade tóxica elevada. Com relativa fre-

qüência são observadas reações locais e sistêmicas que podem levar, inclu¬

sive, o animal à morte. O presente trabalho tem por finalidade a verificação

do nível de resposta imunitária em cavalos hiperimunizados segundo um

esquema básico, para o qual os venenos tiveram a sua atividade tóxica re¬

duzida pela ação de glutaraldeido (GA) 2 ' 7 e, a seguir, reimunizados com os

mesmos venenos não destoxicados.

MATERIAL E MÉTODO

1. Animais-,

1.1 Soroprodutores: cavalos, machos, jovens de um ano a um ano e

meio, pesando entre 110 e 150 quilos, divididos em quatro grupos de cinco

animais, segundo as espécies de venenos inoculados e esquemas de vaci¬

nação.

1.2 Testes! pombos de 250 a 320g.

2. Antígenos (AG):

— botrópico: mistura de 50% de veneno de B. jararaca e de 8.33% de

cada um dos seguintes venenos:

B. alternatus, B. cotiara, B. jararacuçu, B. moojeni, B. neuwiedi e B.

pradoi

— crotálico: veneno de Crotalus durissus terrificus

— atividade tóxica dos venenos: determinada pela inoculação endove¬

nosa em pombos 5 , demonstrou ser para os venenos considerados, as se¬

guintes:

B. jararaca

— 30 iug

B. alternatus

— 45 mo

B. cotiara

— 45 mo

B. jararacuçu

- 7,5 Mg

B. neuwiedi

- 25 Mg

B. pradoi

- 4 Mg

Crotalus durissus terrificus

- 1,5 mo

3. Preparação dos Antígenos:

3.1 botrópico: a mistura de venenos botrópicos, nas proporções acima

indicadas, foi dissolvida em solução salina estéril de modo a conter:

3.1.1 5mg em 2,5ml (grupo I)

3.1.2 10 mg em 2,5rml (grupo II)

3.2 crotálico: foi dissolvido em solução salina estéril de modo a conter:

3.2.1 5mg em 2,5ml (grupo III)

3.2.2 10mg em 2,5ml (grupo IV)

Os volumes preparados foram suficientes para todas as inoculações

previstas nos esquemas básicos de hiperimunizações. As soluções foram

centrifugadas a 800g a 4°C durante 15 minutos para eliminação de partícu-

SciELO

.0 11 12 13 14 15 16

GUIDOLIN, R.; DIAS da SILVA, W.; HIGASHI, H.G.; CARICATI, C.P.; LIMA, M. L. S.

R,; MORAIS, J, F.; PINTO, J. R,; MARCELINO, J.R. Hiperimunização de cavalos so-

roprodulores com venenos botrópicos e crotálico tratados por glutaraldeido. Mem.

Inst. Butantan, 57(3):85-90, 1989,

las insolúveis. Durante os intervalos entre uma e outra fase de tratamento,

as soluções eram mantidas a 4°C.

3.3 Tratamento pelo glutaraldeido: foi utilizada a técnica de Weir 8 .

4. Adjuvantes : Foram utilizados como potencializadores o adjuvante

oleoso emulsão múltipla 4 completo (AOEM-C) e incompleto (AOEM-I) em

volumes de 2,5ml, na primeira e segunda doses, respectivamente. Às de¬

mais doses foram adicionados 2,0mg/100ml de hidróxido de alumínio às

soluções de venenos com pH 7,0 e 7,5 para a mistura de botrópicos e cro¬

tálico, respectivamente. Os volumes totais foram de 5ml para as duas pri¬

meiras doses e 10ml para as restantes, sendo que nestas o volume foi com¬

pletado com solução a 0,85% de NaCI.

5. Técnica e Vias de inoculação: As duas primeiras doses de 5ml (com ad¬

juvante oleoso) foram inoculadas por via subcutânea, no dorso do animal,

em dois pontos (2,5 ml em cada ponto) separados por uma distância apro¬

ximada de 25cm. As doses subseqüentes (10ml) foram subdivididas em

quatro porções, igualmente distribuídas ao redor dos pontos de inoculação

das duas primeiras doses.

6. Esquema de hiperimunização:

6.1 básica: uma dose com AOEM-C e a seguinte com AOEM-I e sete

doses com hidróxido de alumínio. O intervalo entre as doses foi fixado em

sete dias.

6.2 reimunização: efetuada após 30 dias de repouso para recuperação

dos animais com: uma dose de 7,5mg da mistura de venenos botrópicos ou

do veneno crotálico normal (sem tratamento pelo GA), em AOEM-I, volu¬

me total de 5ml, preparada e inoculada como antes indicado. As 2. a , 3. a e

4. a doses continham 2,5mg dos venenos e hidróxidos de alumínio, volume

total de lOml, preparadas como anteriormente indicado. Os intervalos en¬

tre as doses foram os seguintes: entre a primeira e a segunda doses, 7 dias.

Entre as demais doses, 2 dias.

7. Sangrias: O sangue foi extraído 10 dias depois da última dose de Ag,

por punção da veia jugular e o soro separado após a coagulação em câmara

fria.

8. Testes:

8.1 Atividade neutralizante dos soros:

8.1.1 "in vitro" para o soro anticrotálico pela técnica de floculação 1 ;

8.1.2 "in vivo" para os soros antibotrópico e anticrotálico pelo método

de Vital Brazil 3 .

9. Estudo comparativo: Duas turmas de cavalos soroprodutores, uma de

plasma antibotrópico e a outra de plasma anticrotálico, serviram como re¬

ferência. Os esquemas de hiperimunização básica e reimunização foram

efetuados como descrito para os grupos I e III de cavalos, com venenos

não tratados pelo glutaraldeido. Para a avaliação dos resultados foram utili¬

zados os mesmos testes indicados anteriormente, item 8.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As atividades tóxicas para pombos inoculados intravenosamente com a

mistura de venenos botrópicos e com o veneno crotálico normais foram 40

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

GUIDOLIN, R.; DIAS da SILVA, W.; HIGASHI, H.G.; CARICATI, C.P.; LIMA, M. L. S.

R.; MORAIS, J. F.; PINTO, J. R.; MARCELINO, J.R. Hiperimunização de cavalos so-

roprodutores com venenos botrópicos e crotálico tratados por glutaraldeldo. Mem.

Inst. Butantan, 5/(31:85-90, 1989.

e 1,5 ug, respectivamente. Após o tratamento pelo GA, como indicado,

pombos semelhantes não apresentaram qualquer sintoma de envenena¬

mento ao receberem 80 e 3,0 ^g, por via intravenosa da mistura de venenos

botrópicos e de veneno crotálico, respectivamente.

As tabelas I e II demonstram os resultados obtidos pela titulação dos

plasmas dos animais pelo método de Vital Brazil 3 , expressos em mg de ve¬

neno de referência neutralizados por 1 ml de plasma. Deve ser ressaltado

que a morte de 3 animais entre 5 inoculados, pertencentes ao Grupo I, im¬

possibilitou estudo comparativo quanto à eficácia de doses de 5mg de ve¬

neno (Grupo I) e 10mg (Grupo II).

A mortalidade observada entre os animais do Grupo I, não está relacio¬

nada à inoculação do veneno, pois ela não ocorreu entre os animais do

Grupo II que receberam doses de lOmg. Os animais disponíveis para os tes¬

tes eram ainda muito jovens e de baixo peso para a finalidade de produção

de soros. Entre os animais imunizados com o veneno crotálico verifica-se

(Tabela II) que as doses de 5mg (Grupo III) foram mais satisfatórias, nas

condições da experiência. Se compararmos estes resultados com aqueles

obtidos pela imunização de cavalos adequados à soroprodução (turmas de

produção rotineira), tratados com o mesmo esquema, com doses de 5mg

de venenos, observamos que no serviço de plasma antibotrópico, o trata¬

mento dos venenos pelo GA parece não ser a técnica de escolha. No en¬

tanto, para os animais produtores de plasma anticrotálico os resultados ob¬

tidos com o veneno tratado pelo GA foram mais satisfatórios. A turma 3 de

serviço anticrotálico, produção normal, apresentou em média (50 cavalos)

atividade neutralizante de 0,24mg e 0,40mg nos ciclos básicos e de reimu-

nização, respectivamente. Uma outra observação que merece destaque é

quanto à redução das reações locais observadas, em comparação com as

reações desenvolvidas nos animais de produção normal. Além do trata¬

mento dos venenos pelo GA, acreditamos que a utilização do adjuvante

oleoso tipo emulsão múltipla, em volume de 2,5ml, contribuiu com grande

parcela na redução das reações.

TABELAI

Atividade neutralizante dos soros de cavalos hiperimunizados com a mistu¬

ra de venenos botrópicos tratada pelo GA. Ciclos básico e de reimuniza-

ção.

Grupo

Cavalo

N.°

Título *

mg/ml

Ciclos

Básico

Reimuniz.

<0,2

0,4

<0,2

0,3

<0,2

1,0

<0,2

2,0

<0,2

0,3

<0,2

0,3

<0,2

* 10 dias após a última dose

+ morto

GUIDOLIN, R.; DIAS da SILVA, W.; HIGASHI, H.G.; CARICATI, C P.; LIMA, M. L. S.

R.; MORAIS, J. F.; PINTO, J. R.; MARCELINO, J.R. Hiperimunização de cavalos so-

roprodutores com venenos botrópicos e crotálico tratados por glutaraldeido. Mem.

Inst. Butantan, 57(31:85-90, 1989.

TABELA

Atividade neutralizante dos soros de cavalos, hiperimunizados com o vene¬

no crotálico tratado pelo GA. Ciclos básico e de reimunização.

Título

mg/ml

Grupo

Cavalo

Ciclos

n.°

Básico

Reimunização

"in vitro"

"in vivo"

"in vitro"

"in vivo”

0,4

0,9

>0,8

0,2

—

0,6

>0,8

III

0,2

—

0,5

>0,8

0,0

—

0,7

>0,8

0,2

—

0,6

>0,8

0,0

—

0,2

0,5

0,2

—

0,1

—

0,5

0,0

—

0,6

0,5

0,0

—

0,3

0,5

* 10 dias após a última dose

+ morto

- não feito

ABSTRACT: Crotalus durissus terrificus (5mg) venoms and the mixture

(5mg) of seven species from the genus Bothrops (B. jararaca', B.

jararacuçu ; B. neuwiedi; B. moojeni ; B. alternatus; B. cotiara and B.

pradoi) untreated and insolubilized by cross-linking with 0,34% of gluta-

raldehyde incorporated in complete oil adjuvant multiple emulsion were

used to immunize horses. One week later the animais were reinjected

with the same antigens incorporated in incomplete oil adjuvant multiple

emulsion. After one week they were reinjected with the same antigens in¬

corporated in aluminium hidroxyde. Thirty days later a new boosters cicie

with two antigen injections were given subcutaneously: the first injection

of antigens in oil adjuvants and the three ones incorporated in aluminium

hidroxyde, at intervals of one week the first and the second injections.

Samples of blood were collected just before each injections and the sera

were used to determine the antibodies titers against the correspondent

whole venoms by the floculation and neutralization methods. The local

tissues damage and the systemic reactions were consistently reduced or

even absents in the animais receiving the cross-linking antigens as com-

pared with those injected with crude venoms. Nevertheless, the titers of

antibodies in the sera from all animais were almost the same. This experi-

ment indicates that the cross-linking of the venoms with glutaraldehyde

reduced their toxic activities but did not change their immunogenic ca-

pacity.

KEYWORDS: Cross - linking venoms. Snake venoms. Glutaraldehyde.

Antivenoms.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

GUIDOLIN, R.; DIAS da SILVA, W.; HIGASHI, H.G.; CARICATI, C.P.; LIMA, M. L. S.

R.; MORAIS, J. F.; PINTO, J. RMARCELINO, J.R. Hiperimunização de cavalos so-

roprodutores com venenos botrópicos e crotálico tratados por glutaraldeido. Mem.

Inst. Butantan, 57(31:85-90, 1989.

AGRADECIMENTOS

Aos funcionários e servidores do Setor de Imunização e Seção de Con¬

centração e Fracionamento de Soros, pela valiosa colaboração no decorrer

do desenvolvimento do presente trabalho.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. ARANTES, J.B.; KARMANN, G.; BIER, O.R. Emprêgo da reação de floculação específi¬

ca na dosagem do antiveneno crotálico. Mem. Inst. Butantan, 18:21-26, 1944/45.

2. AVRAMEAS, S. Et TERNYNCK, T. The cross-linking of proteins with glutaraldehyde and

its use for the preparation of immunobsobents. Immunochemistry, 6: 53, 1969.

3. BRAZIL, V. Dosagem do valor antitóxico dos seruns antipeçonhentos. Rev. med. S. Pau¬

lo, 10. 457-62, 1907.

4. FARMACOPÉIA dos Estados Unidos do Brasil. 2 ed. São Paulo, Indústria Gráfica Siquei¬

ra S.A., 1959. p. 1027-35.

5. PIERBERT, W.J. Multiple emulsions. Form of mineral-oil antigen adjuvant. The Lancet,

2771, 1965.

6. HUANG, R.J.; CHEN, S.W.; CHEN, T.K.; LION, M.Y. The detoxification of Naja naja

afravenom and preparation of potent antivenin. Chung Hua Min Kuo Wei Sheng Wu

Chi Mien I Hsuch Tsa Chin, 18(3): 177-83, 1985 (Resumo)

7. RELYVELD, E.H. & BEN — EFRAIM, S. Preparation of vaccines by the action of glutaral¬

dehyde on toxins, bactéria, viruses, allergens and cells. In: LANGONE, J.J. Et VAN VU-

NAKIS, H. Methods in Enzymology. New York, Academic Press, 1983. v. 93( F), p. 24-

60.

8. WEIR, D. M. Flandbook of experimental immunology. 3. ed. Oxford, Blackweel Scientific

Publication, 1978.

SciELO

.0 11 12 13 14 15 16

Mem. Inst. Butantan

51(31:91-100, 1989.

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTIVENENO TOTAL DE

CROTALUS DURISSUS TERRIFICUS

EM CAVALOS POR FOSFOLIPASE A 2

Hisako Gondo HIGASHI

Rosalvo GUIDOLIN

Amélia Keiko NISHIKAWA

Ivone Kazuko YAMAGUCHI

Marco Antonio STEPHANO

Maristela JOSÉ dos SANTOS

Wilmar DIAS da SILVA

Celina M. P. M. UEDA * *

RESUMO: Fosfolipase A 2 purificada de veneno de Crotalus durissus

terrificus ou veneno integral foram usados, como antígenos, para imuni¬

zar cavalos e burros. A imunização de base foi feita injetando os animais,

pela via subcutânea, com 5mg do antígeno emulsionado em adjuvante de

Freund completo. Quatro meses depois, os animais foram reimunizados

injetando-se os antígenos correspondentes, dissolvidos em salina, ao re¬

dor dos granulomas resultantes da imunização primária. Esta injeção foi

repetida por mais cinco vezes a intervalos de uma semana. Amostras de

sangue eram colhidas antes de cada injeção e os soros congelados a —

20°C. Anticorpos antiveneno crotálico integral contendo crotamina fo¬

ram titulados, em todas as amostras de soro, pelos métodos de flocula-

ção, imunodifusão, e por ELISA.

Os animais injetados, quer com fosfolipase A 2 quer com o veneno inte¬

gral, produziram anticorpos contra o veneno crotálico bruto, os títulos

obtidos sendo praticamente os mesmos. A análise eletroforética em celo-

gel dos soros mostrou: — consistente redução nos valores percentuais

da fração albumina e um correspondente aumento na fração de globuli-

nas, principalmente das globulinas d 2; as globulinas a 1 tornam-se mais

evidentes enquanto as globulinas a 2 reduzem-se. Esses resultados indi¬

cam que a fosfolipase A 2 é capaz de induzir uma boa resposta primária

dos antígenos do veneno crotálico e que ela pode ser usada nas imuniza¬

ções de rotina para a produção de soros antiveneno crotálico para fins te¬

rapêuticos.

UNITERMOS: Fosfolipase A 2 . Veneno crotálico. Anti-soro. Veneno de cascavel.

* Laboratório Especial de Imunoquímica

* Seção de Concentração e Fracionamento de Soros

* Laboratório Especial de Biotecnologia

Instituto Butantan — CP 65 — 01051 — São Paulo-SP — Brasil.

Recebido para publicação em 13.9.1988 e aceito em 19.5.1989.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

HIGASHI, H.G.; GUIDOLIN, R.; NISHIKAWA, A.K.; YAMAGUCHI, I.K.; STEPHANO, M.

A.; JOSÉ dos SANTOS, M.; DIAS da SILVA, W.; UEDA, C. M. P. M. Produção de an¬

ticorpos antíveneno total de Crotalus durissus terrificus em cavalos por fosfolipase A 2 ,

Mem. Inst. Butantan, 57(3):91-100, 1989.

INTRODUÇÃO

A Crotoxina, o principal componente neurotóxico do Crotalus durissus

terrificus, é composta por duas proteínas, uma altamente básica, a fosfoli¬

pase A 2 (fosfatidato 2 — acilhidrolase, EC 2.1. 1.4) e outra ácida, a crota-

potina 3 . Quando o complexo é dissociado em seus componentes fosfolipa¬

se A 2 e crotapotina, sua atividade neurotóxica original desaparece enquan¬

to sua atividade hemolítica in vitro ensaiada na presença de lecitina perma¬

nece restrita à fosfolipase A 2 ; ambas atividades, são, contudo, restauradas

de maneira sinérgica, quando fosfolipase A 2 e crotapotina se reassociam 5 '

6 ' 10 ' 11 . Tem sido também demonstrado, usando crotoxina radioativamente

marcada, que a porção crotapotina serve como transportador para a fosfo¬

lipase A 2 e, como ligante, servindo de ponte entre o complexo neurotóxico

e os tecidos sobre os quais a toxina atua 7 - 3 - 1 . Coelhos imunizados com fos¬

folipase A 2 purificada de veneno de C.d. terrificus produzem anticorpos ca¬

pazes de neutralizar a atividade neurotóxica presente na crotoxina purifica¬

da 4 ou no veneno crotálico bruto 2 . Camundongos imunizados com fosfoli¬

pase A 2 tornam-se resistentes à ação letal do veneno crotálico bruto, a re¬

sistência adquirida estando diretamente relacionada aos títulos de anticor¬

pos séricos específicos para a crotoxina determinados pelo método de ELI¬

SA 12 .

O presente trabalho foi delineado com o objetivo de verificar se prepara¬

ções purificadas de fosfolipase A 2 podem ser usadas na imunização de ba¬

se, nos esquemas de imunização destinados à produção de soros hiperimu-

nes antiveneno crotálico.

MATERIAL E MÉTODOS

Animais: Foram usados 8 equídeos sendo 4 muares (M) e 4 cavalos (C). Os

animais M-84, M-85, C-334 e C-364 (Grupo I) e M-220, M-381, C-394 e C-

548 (Grupo II) foram mantidos na "Fazenda São Joaquim” do Instituto Bu¬

tantan nas mesmas condições e recebendo os mesmos cuidados que os

animais utilizados para a produção de soros hiperimunes.

Antígenos: Veneno crotálico contendo crotamina foi obtido de serpentes

C.d. terrificus mantidas no serpentário do Instituto Butantan. O veneno foi

colhido pelo método de rotina, dessecado e mantido a 4°C sob ambiente

seco até o uso. A fosfolipase A 2 gentilmente cedida pelo Dr. Isaías Raw,

Centro de Biotecnologia, Instituto Butantan, foi purificada pelo método

descrito por Rübsamen 10 . As preparações, tanto de veneno crotálico bruto

como de fosfolipase A 2 , foram preparadas imediatamente antes do uso,

em NaCI 0.15M a 1 mg/ml. A incorporação de antígeno em adjuvante com¬

pleto de Freund (ACF) foi realizada, ajuntando, sob agitação, gota a gota,

um volume da solução de veneno ou de fosfolipase A 2 a um volume do ad¬

juvante.

Imunização dos Animais: Os animais do Grupo I foram imunizados com ve¬

neno crotálico bruto enquanto os animais do Grupo II foram imunizados

com fosfolipase A 2 .

SciELO

.0 11 12 13 14 15 16

HIGASHI, H.G.; GUIDOLIN, R.; NISHIKAWA, A.K.; YAMAGUCHI, I.K.; STEPHANO, M.

A.; JOSÉ dos SANTOS, M.; DIAS da SILVA, W.; UEDA, C. M. P. M. Produção de an¬

ticorpos antiveneno total de Crotalus durissus terrificus em cavalos por fosfolipase A 2 .

Mem. Inst. Butantan, 57(31:91-100, 1989.

ESQUEMA DE IMUNIZAÇÃO

Solução A: Emulsão contendo 50% das soluções de veneno crotálico

bruto ou de fosfolipase A 2 a 1 .Omg/ml em NaCI 0.Í5M e 50% de ACF.

Solução B: Soluções de veneno crotálico bruto ou de fosfolipase A 2 a

1 mg/ml em NaCI 0.15M. As soluções eram preparadas um dia antes da in¬

jeção cuidando-se, no caso dos antígenos estarem sendo incorporados ao

ACF, de verificar se realmente, tratavam-se de emulsões.

Imunização de base : 10ml da "Solução A" foram injetados, pela via

subcutânea, distribuindo-os em dez diferentes pontos do dorso dos cava¬

los, distanciados um do outro o suficiente para prevenir a confluenciação

dos granulomas que viessem a se organizar. Nesta imunização cada animal

recebeu 5.0mg de veneno ou de fosfolipase A 2 .

7. a imunização de reforço'. Foi realizada cento e vinte quatro dias mais

tarde injetando-se, também pela via subcutânea e no dorso dos cavalos,

10ml da "Solução B" ao redor dos granulomas que se organizaram nos lo¬

cais onde se injetou os antígenos incorporados em ACF. Nesta imunização

cada animal recebeu 5.0mg de veneno crotálico bruto ou de fosfolipase A 2 .

2. a , 3. a , 4. a e 5. a imunizações de reforço: A 2. a imunização de reforço

foi realizada 8 dias depois enquanto que as subseqüentes 3. a , 4. a e 5. 3

imunizações de reforço foram realizadas a intervalos de oito dias entre uma

e outra. Nestas quatro últimas imunizações de reforço cada animal recebeu

20mg de veneno crotálico bruto ou de fosfolipase A 2 .

Um dia antes do início do processo de imunização e imediatamente an¬

tes de cada imunização de reforço, os animais foram sangrados por punção

da veia jugular. Após coagulação, os soros eram removidos por centrifuga¬

ção a 1.000 x G por 30 minutos, divididos em alíquotas de 5ml e armazena¬

dos a —20°C até o uso.

O período de imunização foi, portanto, de 148 dias e cada animal rece¬

beu um total de 30mg de veneno crotálico bruto ou de fosfolipase A 2 .

MÉTODOS IMUNOLÓGICOS

a) Método de ELISA: Cem microlitros de veneno total de Crotalus duris¬

sus terrificus (1 Mg/ml) eram depositados nos orifícios das placas de plásti¬

co Nuclon (Delta, Holanda) e as placas mantidas a 4°C por uma noite. O

conteúdo dos orifícios era removido e substituído por um volume equiva¬

lente de tampão fosfato-salina contendo 3% de soro albumina bovina

(BSA) e 0.05% de Tween 20 e as placas deixadas em repouso por 3h à tem¬

peratura ambiente, condições adequadas ao completo recobrimento da su¬

perfície dos orifícios não ocupados pelo veneno. Os orifícios eram lavados

por três vezes, por sucção, com tampão fosfato-salina pH 7.5 contendo

0.05% de BSA. Cem microlitros das diferentes diluições dos soros a serem

testados eram adicionados aos orifícios e as placas incubadas à temperatu¬

ra ambiente por 45 minutos. Deixavam-se sempre, como controles,

orifícios não tratados ou com veneno ou com o soro nas menores diluições.

Após lavagem dos orifícios por três vezes com tampão fosfato-salina, pH

7.5, contendo 0.05% de BSA, adicionava-se a cada orifício 100 *4 de orto-

fenilenediamine (Sigma Co, USA) (1mg/ml) e 4 *4 de H 2 O 2 , incubando-se

as placas a temperatura ambiente por 15-20 minutos, a intensidade das rea¬

ções sendo determinada a 492 nm no espectrofotômetro Titertek, Multis-

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

HIGASHI, H G.; GUIDOLIN, R.; NISHIKAWA, A K.; YAMAGUCHI, I.K.; STEPHANO, M.

A.; JOSÉdos SANTOS, M.; DIAS da SILVA, W.; UEDA, C. M. P. M. Produção de an¬

ticorpos antiveneno total de Crotalus durissus terrificus em cavalos por fosfolipase A 2 .

Mem. Inst. Butantan, 5/(31:91-100, 1989.

kan. Os títulos dos soros eram dados pelo inverso das diluições de soro on¬

de ocorriam reações com absorvância igual ou acima de 0,200.

b) Floculação: A uma série de tubos contendo I.Oml das soluções de

veneno crotálico bruto nas concentrações de 0.1 a 1.0mg/ml eram adicio¬

nados 1 .Oml dos soros não diluídos. Após agitação os tubos eram transferi¬

dos para banho-maria a 56°C e incubados por 45 minutos. Os títulos dos

soros eram dados pela concentração de veneno em mg/ml nos tubos con¬

tendo a maior concentração em que havia nítida formação de flóculos com

aspecto de nuvem.

c) Eletroforese em acetato de celulose: Sobre fitas de acetato de celulo¬

se (Cellogel, Itália) previamente embebidas em tampão barbital sódio

0.04M, pH 8.6, eram aplicadas 5 ^1 de soro. Procedia-se uma separação

eletroforética em corrente de 200v por 25 minutos. As fitas eram, então,

imersas em solução corante (0.5% de amidoschwarz 10B Merck, 47,5% de

metanol, 47,5% de água destilada e 5% de ácido acético glacial) por 8 mi¬

nutos e diferenciadas na solução descorante (47.5% de metanol, 47.5% de

água e 5% de ácido acético). A seguir, as fitas eram desidratadas em meta¬

nol absoluto por 30 segundos e depois transferidas para a solução transpa-

rentizadora (85% de metanol, 14% de ácido acético glacial e 1 % de gliceri¬

na) e secadas em estufa a 37°C. Após a transparentização as fitas eram li¬

das no densitômetro (Tecnow) e as densidades óticas grafadas em papel

milimetrado. Por este processo sete bandas foram identificadas e as suas

concentrações relativas determinadas; albumina, a'\' a2 /31 e fi2 yl e y2.

d) Imunodifusão: Lâminas de vidro recobertas com gel de agarose a

0,8% em tampão barbital sódio 0.056M, pH 8.6 e contendo conjuntos de

sete orifícios com 3mm de diâmetro, sendo um central e seis periféricos cir¬

cularmente dispostos foram usadas neste método. Depositavam-se amos¬

tras de 20 mI das diferentes diluições do soro nos orifícios periféricos e 20

da solução de veneno crotálico a 6mg/ml no orifício central. As lâminas

eram mantidas em câmara úmida por 24h, lavadas sequencialmente em so¬

lução salina e em água destilada para remover completamente as proteínas

não precipitadas, secadas em estufa a 37°C e imersas na solução corante

(0.2% de azul de Coomassie brilhante G-250, 50% de metanol, 40% água e

10% de ácido acético). Os títulos correspondem ao inverso das maiores di¬

luições dos soros onde as bandas de precipitação eram nítidas à inspeção

visual.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Tanto o veneno crotálico bruto obtido de Crotalus durissus terrificus

contendo crotamina como a fração de fosfolipase A 2 purificada a partir

deste veneno são capazes de produzir anticorpos. Estes anticorpos, avalia¬

dos por três diferentes métodos, o método imunoenzimático de ELISA, a

dupla difusão em gel de agarose e a floculação, reconhecem epitopos pre¬

sentes no veneno crotálico bruto quer tenham sido induzidos pelo próprio

veneno quer pela fosfolipase A 2 .

A Tabela I mostra os títulos de anticorpos presentes nas amostras de

plasma dos cavalos imunizados com veneno crotálico bruto ou com a fos¬

folipase A 2 colhidas oito dias depois da última imunização de reforço.

Quando os níveis de anticorpos foram determinados pelo método de ELISA

apenas o animal M-84 discrepou dos demais-apresentando um título de 400

SciELO

.0 11 12 13 14 15 16

HIGASHI, H.G.; GUIDOLIN, R.; NISHIKAWA, A.K.; YAMAGUCHI, I.K.; STEPHANO, M.

A.; JOSÉ dos SANTOS, M.; DIAS da SILVA, W.; UEDA, C. M. P. M. Produção dean-

tícorpos antiveneno total de Crotalus durissus terrificus em cavalos por fosfolipase A 2 .

Mem. Inst. Butantan, 57(31:91-100, 1989.

x 10 3 enquanto nos demais quer imunizados com veneno crotálico bruto

quer com fosfolipase A 2 os títulos giravam em torno de 32 a 64 x 10 3 . Estes

resultados, tomados em conjunto, sugerem que o potencial imunogênico

tanto da fosfolipase A 2 como do veneno crotálico bruto seria semelhante.

Quando, entretanto, os mesmos soros foram analisados pelo método da

dupla difusão em gel de agarose, os soros de três animais imunizados com

veneno crotálico bruto tinham.títulos elevados sendo um de 128 e dois de

256; já os soros dos animais imunizados com fosfolipase A 2 variaram de 8 a

64. Tal discrepância poderia ser explicada pela maior sensibilidade do mé¬

todo de ELISA que é capaz de detectar quantidades de antígeno ou de anti¬

corpo da ordem de Mg/ml enquanto que pelo método da dupla difusão em

gel de agarose os imunocomplexos somente podem ser visualizados se os

reagentes antígeno e anticorpo estiverem na concentração de 2-5 ng/ml

Bier et ai.' 1 Já no ensaio de floculação, à exceção dos animais M-84 e M-85,

os títulos foram homogêneos: no primeiro caso 1 .Oml de soro foi capaz de

flocular 1 .Omg ou mesmo mais de veneno botrópico bruto enquanto no se¬

gundo caso não se observou floculação. É interessante salientar que no so¬

ro do animal M-84 houve correspondência entre os títulos de anticorpos re¬

velados pelos métodos de ELISA e de imunodifusão. De qualquer modo,

TABELA I

Título de anticorpos antiveneno de Crotalus durissus terrificus em cavalos

imunizados com a fração fosfolipase A 2 deste veneno ou com veneno bruto.

Grupo

Título de anticorpos no soro determinado por: (b, c)

(n.° animal)

Imunização

ELISA

Imunodifusão

Floculação

A 292 0.200

Kdil) x 1

(1/dil) x 10 3

Grupo 1

M-84

Veneno

400

128

1.0

crotálico

M-85

bruto

256

C - 334

256

0.4

C - 364

0.4

Grupo II

M - 220

Fosfolipase

a 2

0.5

M - 381

0.2

C - 394

0.5

C - 548

0.4

a. Imunização de base: 5mg de veneno crotálico bruto contendo crotamina ou de

fosfolipase A 2 emulsionados em adjuvante completo de Freund; imunização de

reforço realizada 4 meses depois: cinco injeções subcutâneas a intervalos de 8

dias de 5mg do antígeno correspondente dissolvidos em salina.

b. Os valores incluídos na tabela correspondem às titulações feitas nas amostras

de soro colhidas 8 dias depois da última injeção de veneno crotálico bruto ou

fosfolipase A 2 na imunização de reforço.

c. A e D correspondem, respectivamente, aos valores obtidos nos ensaios reali¬

zados nas amostras dessoro colhidas imediatamente antes do início da imuniza¬

ção e 8 dias depois da última injeção de antígeno na imunização de reforço.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

HIGASHI, H.G.; GUIDOLIN, R.; NISHIKAWA, A.K.; YAMAGUCHI, I.K.; STEPHANO, M.

A.; JOSÉ dos SANTOS, M.; DIAS da SILVA, W.; UEDA, C. M. P. M. Produção de an¬

ticorpos antlveneno total de Crotalus durissus terrificus em cavalos por fosfolipase A 2 .

Mem. Inst. Butantan, 5/(31:91-100, 1989.

excetuando o animal M-85, nos demais os títulos em anticorpos floculantes

se encaixam bem dentro dos limites exigíveis nos soros hiperimunes antive-

neno crotálico produzidos para fins terapêuticos.

Os resultados da análise eletroforética desses soros em acetato de celu¬

lose acham-se na Figura 1 e na Tabela II. A análise desses resultados reve¬

lou: a) consistente e acentuada redução dos valores percentuais da albumi¬

na entre as amostras de misturas de soros colhidas após a 6. a inoculação

de reforço e as amostras obtidas antes da imunização de base; b) redução

de fração m nas amostras de soro obtidas após a 6. a inoculação de refor¬

ço; c) não houve modificações consistentes da fração a 2 nas amostras de

soro após a 6. a inoculação de reforço; e, d) houve nítido aumento da fra¬

ção da gamaglobulina decorrente de maior produção das \ 2 globulinas. Es¬

sas modificações concordam com os resultados obtidos nos ensaios pelos

métodos de ELISA, imunodifusão e floculação.

TABELA II

Distribuição Eletroforética das Proteínas do Plasma de Cavalos

Imunizados com Veneno Crotálico Bruto ou com um dos seus

componentes, a enzima Fosfolipase A 2

Animal

Proteínas

Distribuição das

proteínas plasmáticas na eletroforese (%)

totais (g%)

n.°

Alb

1.°S

6.°S

1.°S

6.°S

1.°S

6.°S

1.°S

6.°S

1.°S

6.°S

1.°S

6.°S

1.°S

6.°S

M -

11.0

12.5

26.9

24.8

10.6

5.1

10.7

8.9

27.3

20.2

14.3

13.1

10.2

27.9

M -

11.2

10.4

33.9

28.9

7.4

5.4

11.7

12.0

24.4

17.6

12.5

9.7

9.6

27.4

C-

334

10.6

44.0

28.1

10.1

2.8

13.5

15.0

17.9

14.2

10.6

11.2

3.9

28.7

C -

364

9.9

9.5

39.8

28.5

7.0

5.3

11.7

19.5

21.0

18.5

9.2

10.3

11.3

17.9

M -

220

10.4

9.5

49.5

28.3

6.9

4.4

11.5

14.0

19.2

23.5

9.3

9.7

3.6

20.1

M -

381

11.0

10.4

33.2

19.3

7.1

3.1

13.1

12.8

22.8

30.5

11.7

11.9

12.1

22.4

C -

394

9.9

13.2

36.3

20.1

2.8

3.1

11.9

11.3

17.1

19.3

10.2

14.3

21.7

31.9

c -

548

10.6

11.5

38.5

19.3

11.5

4.4

12.2

15.7

15.9

19.7

11.0

15.2

10.9

25.7

Os resultados apresentados neste trabalho são compatíveis com outros

já existentes na bibliografia especializada mostrando que a fosfolipase A 2 ,

conquanto seja praticamente atóxica, preserva, quase integralmente, a ca¬

pacidade imunogênica do veneno crotálico bruto. Esta propriedade da fos¬

folipase A 2 indica-a como o imunógeno alternativo nas imunizações de ani¬

mais para a obtenção de soros antiveneno crotálico: a sua baixa toxidez

permitiria a injeção de doses maiores garantindo assim adequada resposta

imune primária. A ausência de possíveis grupamentos tóxicos para os quais

obviamente não seriam produzidos anticorpos neutralizantes se somente a

fosfolipase A 2 fosse utilizada como antígeno, seria compensada

substituindo-se a fosfolipase A 2 , nas imunizações de reforço, por veneno

crotálico bruto contendo crotamina 8 . Permitiria, também, a formação de

anticorpos anticrotamina, completando-se as exigências para um soro anti-

crotálico ideal. Tal soro deveria conter anticorpos neutralizantes para todos

os grupamentos toxóforos presentes no veneno integral.

Assim, os resultados apresentados neste trabalho indicam que nos es¬

quemas de imunização de cavalos para a produção de soros antiveneno

crotálico a melhor estratégia seria fazer-se uma boa imunização de base

SciELO

.0 11 12 13 14 15 16

HIGASHI, H.G.; GUIDOLIN, R.; NISHIKAWA, A.K.; YAMAGUCHI, I.K.; STEPHANO, M.

A.; JOSÉ dos SANTOS, M.; DIAS da SILVA, W.; UEDA, C. M. P. M. Produção de an¬

ticorpos antiveneno total de Crotalus durissus terrificus em cavalos por fosfolipase A 2 .

Mem. Inst. Butantan, 57(31:91-100, 1989.

A (M-84)

A x (14-84)

A(M-85)

AjCH-85)

J vW \ [ ' 1

A(C-334)

At(0-334)

UC-3641

3(1.1-220)

3^(1,1-220)

3(14-381)

13Z

B^tt-381)

3(0-394)

ata

\ A aaj

, - aa

aji

1 hf \

\ a A as

\ Ar/ -ui

f\./V \ ai

M/v Y \ m

v 1 ãs

M ai

1/ m

-oi

W 1 m

? 11

Viua.

1 \ in.q

[

^ V.pm

B 1 (0-394)

B(C-548)

B 1 (0-548)

Figura 1: Perfis eletroforéticos dos soros de cavalos imunizados com veneno crotálico bruto

contendo crotamina painéis AIM-84), A^M-84), A(M-85) Ai(M-85), AIC-334),

Ai(C-334), AIC-364) e A,(C-364) ou com fosfolipase A 2 isolada deste veneno pai¬

néis BIM-220), Bi(M-220), BIM-381), B n (M-381), B(C-394), B 1 (C-394), BIC-548) e

Bi(C-548).

Os símbolos sem e com o subscrito (1) colocado ao lado de A ou de B, designam,

respectivamente, as amostras de soro colhidas imediatamente antes da imuniza¬

ção ou uma semana depois da última imunização de reforço. Os números à direita

de cada painel indicam, de cima para baixo, os valores percentuais para albumina e

para as globulinas ot\, o 2 , Pt, p 2 , n e y 2 5^1 de soro eram depositados sobre fitas de

acetato de celulose e a eletroforese realizada usando tampão barbital de sódio

0.04M, pH 8.6 em corrente elétrica de 200V por 25min.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

HIGASHI, H.G.; GUIDOLIN, R.; NISHIKAWA, A.K.; YAMAGUCHI, I.K.; STEPHANO, M.

A.; JOSÉ dos SANTOS, M.; DIAS da SILVA, W.; UEDA, C. M. P. M. Produção de an¬

ticorpos antiveneno total de Crotalus duríssus terrificus em cavalos por fosfolipase A 2 .

Mem. Inst. Butantan, 5/(31:91-100, 1989.

com a fosfolipase A 2 incorporada ao ACF e as imunizações de reforço com

veneno crotálico bruto. A imunização de base feita dessa maneira minimi¬

zaria os riscos de mortes dos cavalos mais sensíveis aos efeitos letais do ve¬

neno crotálico no início do processo de imunização. A produção inicial de

anticorpos permitiria a injeção do veneno crotálico bruto, nas imunizações

de reforço, sob condições mais seguras garantindo a formação de anticor¬

pos específicos para os grupos toxóforos relevantes, presentes no veneno

crotálico.

ABSTRACT: Phospholipase A 2 , purified from crotoxin obtained from

Crotalus duríssus terrificus venom or whole venom were used to imrnuni-

ze horses or burros. The primary immune response was elicited by injec-

tecting the animais with the antigens (5mg) incorporated in Freund's

complet adjuvant. Four months later the animais were reimmunized with

the antigens alone (5mg) for six times a week apart. Samples of blood

were collected just before each injection and the sera used to determine

the antibodis against whole venom by the floculation, immunodifusion,

and ELISA methods. The animais injected either with phospholipase A 2

or with the crude venom produced antibodies against the whole Crotalus

duríssus terrificus venom with almost the same titers. These sera when

analyzed by electrophoresis in cellogel showed a consistent reduction of

the albumin and a correspondent increase in the globulin fractions,

mostly of the y 2 globulins; and the a, globulins became reduced whereas

the a 2 globulins did not show appreciable changes. These results Show

that phospholipase A 2 is able to mount an effective primary immune res¬

ponse in horses or burros and indicate that it could be incorporated in the

immunization schedule to produce sera anti- Crotalus duríssus terrificus

venom for therapeutic purpouses.

KEYWORDS: Phospholipase A 2 . Crotalic venom. Antisera. Snake ve-

noms.

AGRADECIMENTOS

Aos funcionários e servidores do Setor de Imunização e Concentração

e Fracionamento de Soros pela colaboração prestada no decorrer do traba¬

lho.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. BIER, O.G.; DIAS da SILVA, W.; GOTZE, O.; MOTA, I. Antigen — antibody interac-

tion. In - Fundamentais of immunology. 2. ed. Berlin, Springer-

Verlag, 1986. p. 179.

2. BON, C. & JENG, T.W. Crotoxin; a possible mechanism of action. Adv. Cytopharmac.,

2231, 1979.

3. HABERMANN, E. Et BREITHAUP, H. Mini — review. The crotoxin complex; anexample

of biochemical and pharmacological protein complementation. Toxicon, 16: 19,1978.

4. HANASHIRO, M. A.; DA SILVA, M. H.; BIER, O. G. Neutralization of crotoxin and

crude venom by rabbit antiserum to Crotalus phospholipase A 2 . Immunochemistry,

15: 745, 1978.

5. HENDON, R. A. & FRANKEL — CONRAT, H. Biological roles of the two components

of crotoxin. Proc. nat. Acad. Sei., 68: 1560, 1971.

6. FIORST, J.; HENDON, R.A.; FRANKEL — CONRAT, H. The active components of

crotoxin. Biochem. biophys. Fies. Commun., 46: 1042, 1972.

7. JENG, T.W.; HENDON, R.A.; FRANKEL - CONRAT, H. Search for relationships

among the hemolytic, phospholipolytic and neurotoxic activities of snake venoms.

Proc. nat. Acad. Sei., 75: 600, 1978.

SciELO

.0 11 12 13 14 15 16

SciELO^o

Mem. Inst. Butantan

51(31:101-106, 1989

CHEMISTRY OFTHE BRAZILIAN LABIATAE* *.

TERPENOIDS CONSTITUENTS OF LEPECHINIA

SPECIOSAi St. Hil.) Epling

Raymond ZELNIK**

Flávia MARTELLINI-LANDSHOFF**

Ema RABENHORST**

ABSTRACT: Two terpenoids have been isolated from the aerial parts of

Lepechinia speciosa (St. Hil.) Epling and identified as carnosol and urso-

licacid by spectroscopical methods.

KEYWORDS: Lepechinia speciosa (St. Hil.) Epling; Labiatae; terpenoids;

carnosol; ursolicacid.

INTRODUCTION

The Labiatae constitute a family of plants widely distribúted over all the

continents and highly appreciated for their medicinal and culinary proper-

ties. A recent example is the description of forskolin, a labdane-type diter-

pene isolated from the Indian Coleus forskohüi Briq. 2 and useful in the

treatment of cardiac insufficiency, glaucoma and asthma 11 . In Brazil, al-

though 34 genus and 350 species of Labiatae have been recorded 1 , only

one representative of the genus LEPECHINIA, namely Lepechinia speciosa

(St. Hil.) Epling, has so far been catalogued as endemic in the mountainous

regions of Itatiaia, State of Rio de Janeiro 3 (see map in Fig. 1). .

* Part 7 in a series "Chemistry of the Brazilian Labiatae”.

For part 6, see M ATI DA, A. K. etal., fíev. bras. Farmacognosia, 7(2): 183, 1986.

* Serviço de Química Orgânica.

Instituto Butantan. CP 65 — 01051 — São Paulo — SP — Brasil.

Recebido para publicação em 22-3-1989 e aceito em 6-6-1989.

101

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

ZELNIK, R; MARTELLINI-LANDSHOFF, F.; RABENHORST, E. Chemistry of the brazilian

Labiatae. Terpenoids constituents of Lepechinia speciosa (St. Hil.) Epling. Mem. Inst.

Butantan, 5 7(31:101-106, 1989.

Fig. 1 — Distribution of the genus Lepechinia in South and Central

America according to Brade 3 .

102

2 3 4 5 6

SciELO

0 11 12 13 14 15 16

ZELNIK, R; MARTELLINI-LANDSHOFF, F.; RABENHORST, E. Chemistry of the brazilian

Labiatae. Terpenoids constituents of Lepechinia speciosa ( St. Hil.) Epling. Mem. Inst.

Butantan, 57(3): 101-106, 1989.

In the course of a continuous phytochemical survey of the Brazilian La¬

biatae, we have examined a sample of Lepechinia speciosa and we now re-

port the isolation of two terpenoids, carnosol 1 and ursolic acid 3.

FORSKOLIN

MATERIAL AND METHODS

The aerial parts of Lepechinia speciosa, a small shrub growing above

2400m, were collected in the mountainous regions of Itatiaia. A voucher

specimen is deposited in the Herbarium of the Institute of Biosciences, Uni-

versity of São Paulo. Melting points were determined on a Kofler-Reichert

hot-stage microscope and are uncorrected. Infra-red spectra were recor-

ded for KBr discs, using a Perkin-Elmer 737 instrument. Ultra-violet spectra

were performed on a Varian 634-S spectrophotometer. 1 H NMR spectra

were recorded at 60 MHz on a Varian T-60 apparatus, in d-DMSO Solutions

and TMS as internai standard, MS were obtained by probe inlet at 70 eV

from a VG Micromass MM 12F instrument. Microanalyses are from the Ins¬

titute of Chemistry, University of São Paulo. Column chromatographies

were carried out with Silica gel (Merck 0.05-0.20mm) and thin-layer chro¬

matographies on plates coated with Silica H (Merck), using iodine vapours

for revelation.

RESULTS AND DISCUSSION

The air-dried leaves (710 g) were ground and refluxed with 6 portions of

acetone (4 I each). Upon evaporation under reduced pressure, the combi-

ned acetonic extracts were treated with hexane (0,51), yielding a greenish

precipitate (43 g). The hexane filtrate was then concentrated to a viscous

residue (50 g). table 1 depicts the overall extraction procedure.

1, | SciELO

103

ZELNIK, R; MARTELLINI-LANDSHOFF, F.; RABENHORST, E. Chemistry of the brazilian

Labiatae. Terpenoids constituents of Lepechinia speciosa ( St. Hil.) Epling. Mem. Inst.

Butantan, 57(31:101-106, 1989.

TABLE1.

The final viscous residue was triturated with a small volume of hexane

to give a whitish precipitate (1.4 g) which was chromatographed on Silica

gel column. Elutions from hexane-ethyl acetate 1:3 and 1:4 afforded 0.58 g

(0.08% by dry weight) of a compound named LS-1, which crystallized from

Me0H-H 2 0 as colourless plates, m.p. 202-204°. Its molecular formula

C 20 H 26 O 4 was established from elemental analyses and low resolution MS

(M + m/z 330). In the IR spectrum, absorption bands at 3500 and 3300 cm -1

indicated the presence of two hydroxyl groups and at 1720 cm -1 the exis-

tence of a carbonyl group whereas sharp bands of médium intensities in

the region of 1500-800 crrr 1 characterized an aromatic-type structure. In

the UV spectrum, absorption at À 284 rim shifted to 304 nm upon

NaOH addition, a fact consistent with a catechol or a resorcinol moiety 7 . In

the 'H NMR spectrum, signals for four methyl groups could be observed,

two of which are at the same position (d 0.81 ppm) and two appear as a 7

Hz doublet centered at d 1.15 ppm, indicating an isopropyl group. A signal

at d 6.62 ppm (1 H, s) disclosed the presence of an aromatic proton.

Treatment of compound LS-1 with acetic anhydride and pyridine affor¬

ded an acetylated derivative as a gum. In the IR spectrum, its carbonyl ab-

sorptions at 1780 and 1760 cnr 1 fali in the range for y and d lactones and

overlaps with that of an acetate 9 . Its NMR spectrum displayed a signal

at d 2.21 ppm (6 H) for two acetyl groups.

From these results, an aromatic abietane skeleton, related to a

ferruginol-type structure 2 and retaining a lactone ring 4 , was attained for

compound LS-1. This view was strenghtened in the MS spectrum by the

intense peak at m/z 286, corresponding to the loss of a C0 2 fragment from

the molecular ion, attributed to the elimination of a C-10 substituent in di-

terpenes 5 and strongly suggesting that the remaining methyle of the abie¬

tane nucleus is part of the lactone ring.

104

SciELO

.0 11 12 13 14 15 16

ZELNIK, R; MARTELLINI-LANDSHOFF, F.; RABENFIORST, E. Chemistry of the brazilian

Labiatae. Terpenoíds constituents of Lepechinia speciosa ( St. Hil.) Epling. Mem. Inst.

Butantan, 5/(31:101-106, 1989.

Reviewing the spectroscopic data of various abietane diterpenes isola-

ted from the Labiatae, those of carnosol 6 configurate the same patterns as

those discussed hitherto for compound LS-1. The identity of their molecu¬

lar structures was then confirmed when the IR and ^ NMR spectra of LS-1

were superimposed with those of an authentic sample of carnosol 13 .

Further investigation of the precipitate from the acetonic extract was

subsequently undertaken. A portion of 2.5 g was chromatographed on a

Silica gel column and elutions from hexane-ethyl acetate 5:1 and 3:1 furnis-

hed a compound which crystallized from acetone-hexane as colourless

needles, m.p. 268-274.°, yield 0.6 g. Its IR spectrum was reminiscent of

that of ursolic acid 3, a triterpenic acid widely distributed in Brazilian Labia-

tae 8 ' 12 . Consequently a direct comparison with the IR spectrum of an au¬

thentic sample of ursolic acid settled such identity. This finding parallels

that of the constituents of Lepechinia chamaedryoides, a species native to

Chile and shown to produce ursolic acid 10 .

RESUMO: Dois terpenóides foram isolados das folhas de Lepechinia

speciosa (St. Hil.) Epling e identificados por métodos espectrométricos

como sendo o carnosol e o ácido ursólico.

UNITERMOS: Lepechinia speciosa (St. Hil.) Epling.* Labiatae. Terpe-

nos. Carnosol. Ácido ursólico.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors express their thanks to Professor Sylvio Panizza, Depart¬

ment of Botany, University of São Paulo, for the classification of the bota-

nical material and to Professor Alphonse Kelecom, Universidade Federal

Fluminense, Niterói (RJ) for helpful discussions. Thanks are also due to

Mr. Eduardo Miguez, NPPN, UniveYsidade Federal do Rio de Janeiro, for

the Mass spectra. One of us (FML) is grateful to the Institute Butantan fora

post-graduate research fellowship.

REFERENCES

1. ANGELY, J. Flora analítica e fitogeográfica do Estado de São Paulo. São Paulo,

Phyton, 1970. V.4.

2. BHAT, S.V.; BAJWA, B.S.; DORNAUER, H.; SOUZA, N.J. de; FEHLHABER, H.W.

Structures and stereochemistry of new labdane diterpenoids from Coleus forskohlii

Briq. Tetrahedron Letters, : 1689, 1977.

3. BRADE, A.C. A flora do Parque Nacional do Itatiaia. Rio de Janeiro, Ministério da Agri¬

cultura/Serviço Florestal, 1956. Boi. n.°5.

4. CAMPBELL, W.P. & TODD, D. The structure and configuration of resin acids. Podo-

carpic acid and ferruginol. J. Amer. Chem. Soc., 64: 928, 1942.

5. ENZELL, C.R. & WAHLBERG, I. Mass spectrometric studies of diterpenes. Acta

Chem. Scand., 23: 871, 1969.

6. INATANI, R.; NAKATANI, N.; FUWA, H.; SETO, H. Structure of a new antioxidative

phenolic diterpene isolated from Rosemary ( Rosmarinus officinalis L.). Agric. Biol.

Chem., 46: 1661, 1982 and references cited therein.

7. kELECOM, A. 6 /3-hydroxy-Carnosol. A new minor diterpene from the false boldo,

Coleus barbatus Bentham (Labiatae). Quim. Nova, 6: 117, 1983, and references cited

therein.

8. MATIDA, A.K.; ZELNIk, R.; PANIZZA, S. Presence of ursolic acid and2a — hydroxy-

ursolic acid in Hyptis umbrosa Salzman and Eriope crassipes Bentham. Rev. Bras.

Farmacognosia, 1(2): 183, 1986.

9. NAKATANI, N.; INATANI, R. A new diterpene lactone, rosmadial from Rosemary

(Rosmarinus officinalis L.). Agric. Biol. Chem., 47: 353, 1983.

í, | SciELO

105

ZELNIK, R; MARTELLINI-LANDSHOFF, F.; RABENHORST, E. Chemistry of the brazilian

Labiatae. Terpenoids constítuents of Lepechinia speciosa ( St. Hil.) Epling. Mem. Inst.

Butantan, 5/(31:101-106, 1989.

10. SILVA, M. Triterpenic constítuents of Lepechinia chamaedryoides, J. Pharm. Sei., 57:

864, 1968.

11. SOUZA, N.J. de; Forskolin: an example of innovative drug research on natural Pro¬

ducts. In: Harms, A.F. Innovative approaches in drug research. Amsterdam, Elsevier,

1986. p. 191.

12. ZELNIK, R.; MATIDA, A.K.; PANIZZA, S. Chemistry of the brazilian Labiatae. The oc-

currence of ursolic acid in Peltodon radicans Pohl. Mem. Inst. Butantan, 42/43: 357,

1978/79.

13. The authors are indebted to Professor A. Kelecom, Universidade Federal Fluminense,

Niterói (RJ) for kindly providing a sample of carnosol.

106

SciELO

.0 11 12 13 14 15 16

Mem. Inst. Butantan

51(3): 107-115,1989

VENENOS BOTRÕPICOS PRÉ-TRATADOS COM INIBIDORES

ATIVOS PARA OS SÍTIOS ENZIMÁTICOS DE PROTEASES

E COM SUBSTÂNCIA QUELANTE PRESERVAM

SEU PODER IMUNOGÉNICO.

Hisako Gondo HIGASHI* *

Rosalvo GUIDOLIN*

Amélia Keiko NISHIKAWA*

Ivone Kazuko YAMAGUCHI*

Maria Laura S. Rodrigues LIMA*

Josefina Farina MORAIS*

Wilmar DIAS da SILVA**

RESUMO: Estudou-se, no presente trabalho, o efeito de inibidores es¬

pecíficos para o centro ativo de proteases, o p-nitrofenil-p' -guanidino

benzoato (NPGB) e o fenil-metil-sulfonil fluoreto (PMSF) ou do quelante

ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA) sobre as propriedades imuno-

gênicas dos componentes dos venenos botrópicos. A mistura usada co¬

mo antígeno continha 50% de veneno de B. jararaca e 50% de uma mis¬

tura em partes iguais, dos venenos de B. alternatus, B.cotiara,

B. jararacuçu, B. neuwiedi, B. moojenie B. pradoi (MVB). Cinco cavalos,

pesando 400-450kg foram imunizados com essa mistura pré-tratada com

5/^M de NPGB, 5 de PMSF e 10 i^M de EDTA, (MVB-I) e cinco cava¬

los do mesmo porte foram imunizados com a mistura "in natura" (MVB).

A resposta primária foi induzida injetando-se 5 mg das misturas MVB —I

ou MVB incorporadas em adjuvante completo de Freund (ACF). Quatro

meses depois, os animais receberam cinco imunizações de reforço, cada

uma com 10 mg de MVB-I ou MVB, em NaCI a 0,15M, a intervalos de 8

dias entre as imunizações. Os resultados permitem concluir: a) que os ve¬

nenos botrópicos pré-tratados com esses inibidores de proteases deve¬

riam ser usados como antígenos em substituição ao veneno não tratado;

e, b) que o esquema de imunização de cavalos para a produção de soros

antivenenos poderia constar de uma imunização de base com 5 mg do

veneno incorporado em ACF seguida, 3-4 meses depois, por duas imuni¬

zações de reforço, cada uma com 10 mg de veneno em NaCI 0,15 M a in¬

tervalos de 8 dias, procedendo-se à sangria 8 dias depois.

UNITERMOS: Bothrops. Venenos botrópicos. Enzimas proteolíticas.

* Seção de Concentração e Fracionamento de Soros.

* Laboratório Especial de Imunoquímica

Instituto Butantan. C.P. 65 — 01051 — São Paulo-SP-Brasil

Recebido para publicação em 8.5.1989 e aceito em 27.6.1989.

107

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

HIGASHI, H.G.; GUIDOLIN, R.; NISHIKAWA, A.K.; YAMAGUCHI, I.K.; LIMA,

M.L.S.R.; MORAIS, J.F.; DIAS da SILVA, W. Venenos botrópicos pré-tratados com

inibidores ativos para os sítios enzimáticos de proteases e com substância quelante pre¬

servam seu poder imunogênico, Mem. Inst. Butantan, 57(31:107-115, 1989,

INTRODUÇÃO

O veneno das serpentes do gênero Bothrops contêm numerosas pro¬

teases entre as quais se incluem endopeptidase e proteases de baixa espe¬

cificidade, hidrolases de ésteres de arginina, ativadores de protrombina,

ativadores do Fator X e cininogenases (Deutsch e Diniz, 3 ; Iwanaga e Suzu¬

ki, 5 ; Mebs, 7 ; Kocholaty etal. 6 .)

Essas enzimas, quer por ação direta sobre tecidos e vasos quer liberan¬

do peptídios de proteínas teciduais ou plasmáticas, podem desempenhar

papel importante na mediação das alterações subseqüentes à introdução

dos venenos nos tecidos: aumento da permeabilidade vascular seguida de

edema; formação de coágulos e obstrução vascular; ruptura de estruturas

das paredes dos vasos e hemorragia; formação local de peptídios poten¬

cialmente capazes de promover efeitos locais e sistêmicos como a bradici-

nina e as anafilatoxinas (Rocha e Silva, et al. 9 : Slotta, 10 ; Dias da Silva, et

al 4 >

A bem documentada ação de algumas dessas enzimas proteolíticas so¬

bre os tecidos animais e sobre proteínas plasmáticas implicam-nas como

agentes potencialmente responsáveis por apreciável parte das lesões locais

e sistêmicas que ocorrem, quer durante os envenamentos por acidentes

ofídicos, quer incidentalmente nos locais das injeção dos animais que estão

sendo utilizados para a produção de soros antiofídicos.

Dispõe-se, hoje, de inibidores específicos de baixo peso molecular ca¬

pazes de inibir irreversivelmente os centros ativos de enzimas proteolíticas

sem produzir apreciáveis modificações conformacionais na sua estrutura

molecular ou de quelar íons fundamentais para a expressão da atividade

enzimática dessas enzimas. Entre os primeiros enquadram-se o "p -

nitrofenil-p'-guanidino-benzoato, (NPGB)" eo "fenil-metil-sulfonil fluoreto

(PMSF)'' e entre os segundos o ácido etileno-diamine-tetraacético (EDTA).

Os resultados obtidos neste trabalho mostram que venenos botrópicos

tratados com dois inibidores de baixo peso molecular ativos sobre o sítio

enzimático de enzimas proteolíticas, o "p - nitrofenil - p' - guanidino ben-

zoato" (NPGB) e o fenil - metil - sulfonil fluoreto (PMSF) e o agente que¬

lante para cations bivalentes, o ácido etileno-diamino-tetraacético (EDTA),

induzem a produção de antisoros, em cavalos, com títulos semelhantes aos

antisoros produzidos pelos mesmos venenos não submetidos ao tratamen¬

to com estes inibidores. Observou-se além disso, que as lesões usualmente

observadas no local da injeção dos venenos eram menos intensas, ou mes¬

mo ausentes, quando os venenos eram pré-tratados com os inibidores.

MATERIAL EMÉTODOS

Animais: Foram utilizados dez eqüideos adultos sendo seis muares (M)

e quatro cavalos (C) que haviam sido utilizados para a produção de soro

anti-rábico registrados com os números M-89, M-90, M-130, M-550, M-

594, M-650, C-375, C-385, C-588 e C-590.

108

SciELO

HIGASHI, H.G.; GUIDOLIN, R.; NISHIKAWA, A.K.; YAMAGUCHI, I.K.; LIMA,

M.L.S.R.; MORAIS, J.F.; DIAS da SILVA, W. Venenos botrópicos pré-tratados com

inibidores ativos para os sítios enzimáticos de proteases e com substância quelante pre-

servamseu poder imunogênico. Mem. Inst. Butantan, 57(3): 107-115, 1989.

Antígenos: Utilizou-se, como antígeno, a mistura de venenos botrópi¬

cos usualmente empregada no Instituto Butantan para a produção de soro

antibotrópico. Esta mistura foi preparada, adicionando-se a um volume de

solução de veneno de B. jararacaa 5 mg/ml em NaCI a 0,15M igual volume

de uma solução a 5 mg/ml, em NaCI a 0,15M, contendo partes iguais dos

venenos de B. alternatus, B. cotiara. B. jararacuçu, B. moojeni, B.

neuwiedi e B. pradoi. Esta mistura foi dividida em duas porções: uma, "in

natura" designada MVB e a outra contendo 5 *<M de NPGB, 5 *<M de PMSF

e 10 mM de EDTA, designada MVB-I. As duas misturas foram incubadas

por 30 minutos à temperatura ambiente, divididas em alíquotas e congela¬

das à -20°C. As soluções MVB-I foram diluídas em NaCI a 0,15 M para 1

mg/ml de veneno. Para a imunização de base 5 ml de cada solução de ve¬

neno foram emulsionados com igual volume de adjuvante completo de

Freund (ACF). Para as imunizações de reforço foi usada a solução de vene¬

no diluído em NaCI a 0,15M a 1 mg/ml.

Imunizações dos animais: Os animais M-89, M-90, M-130, C-375, e C-

385 foram imunizados com a mistura de venenos designada MVB e os ani¬

mais M-550, M-594, M-650, C-588 e C-590 foram imunizados com a mistura

MVB-I.

Imunização de base : Dez mililitros das emulsões MVB-AFC ou MVB-I-

AFC foram injetados, pela via subcutânea, em diferentes pontos do dorso

do animal distanciados um do outro o sufuciente para que não ocorresse

confluenciação dos granulomas que viessem a se desenvolver.

Imunização de reforço : Quatro meses depois os animais foram injeta¬

dos com 10 ml das soluções de venenos botrópicos MVB ou MVB-I a 1

mg/ml em NaCI 0,15M, pela via subcutânea, ao redor dos granulomas. Es¬

ta injeção foi repetida por mais quatro vezes a intervalos de 8 dias entre as

inoculações.

Amostras de sangue foram obtidas antes de cada injeção de veneno e

os soros obtidos foram aliquotados e armazenados a -20°C até o uso. O

período de imunização foi de 160 dias e cada animal recebeu um total de 60

mg de veneno.

Método de ELISA Theakston e col. 11 . Cem microlitros da solução da

mistura de venenos botrópicos contendo veneno das sete espécies de ser¬

pentes do gênero Bothrops, (conforme indicado no item "Antígenos"), na

concentração 1 jug/ml, foram adicionados aos poços em forma de D das

placas de plástico marca "Nuclon" (Delta, Dinamarca). As placas foram

mantidas a 4.°C durante a noite, tempo suficiente para que se realizasse a

adsorção do veneno à superfície dos poços. A seguir, as placas foram satu¬

radas com uma solução de albumina (BSA) a 3%, contendo em 0,05% de

Tween 20 em NaCI a 0,15M e deixando-as em repouso, à temperatura am¬

biente, por 3h. Após três lavagens com uma solução de PBS lOOmM pH

7,4, contendo 0,05% de Tween 20, a cada poço adicionou-se 100*4 dos so¬

ros de equídeos hiperimunizados com veneno botrópicos nas diluições de

1/100 a 1/12.000, deixando as placas em repouso por45min. à temperatu¬

ra ambiente. Após lavagem seguindo a metodologia descrita acima, 100 *4

de soro de coelho anti imunoglolinas de cavalo conjugado com peroxidase

(Cappel, Cochaville, USA) foram adicionados aos poços e as placas deixa-

109

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

HIGASHI, HG.; GUIDOLIN, R.; NISHIKAWA, A.K.; YAMAGUCHI, I.K.; LIMA,

M.L.S.R.; MORAIS, J.F.; DIAS da SILVA, W. Venenos botrópicos pré-tratados com

inibidores ativos para os sítios enzimáticos de proteases e com substância quelante pre¬

servam seu poder imunogênico. Mem. Inst. Butantan, 57(31:107-115, 1989.

das em repouso por 45 min. à temperatura ambiente. Após lavagem pelo

mesmo método descrito acima, 100 pI de ortho-fenildiamina (Sigma Co.

USA) na concentração de 1 mg/ml e 0,04^1 de H 2 0 2 foram adicionados

aos poços e as placas mantidas à temperatura ambiente por 15-20 minutos,

tempo suficiente para o desenvolvimento da cor. Como controles, em cada

placa, em um grupo de poços omitiu-se a adição da solução de veneno e

em outro omitiu-se a adição de soros de cavalos hiperimunizados. A inten¬

sidade da cor desenvolvida era determinada espectrofotometricamente a

492 nm.

Dupla-Difusão em Gel de Agarose Ouchterlony 8 . Placas de vidro de

4cm x 19cm foram recobertas com uma camada uniforme de gel de agaro¬

se (Sigma Chemical Co. St. Louis, USA) a 0,8% em tampão barbital sódio,

pH 8,6, 0,056 M. Em cada placa foram feitos conjuntos de orifícios com

3mm de diâmetro, havendo em cada conjunto um orifício central e seis

orifícios periféricos circularmente dispostos e distanciados 4mm um do ou¬

tro. Vinte microlitros da solução de veneno a 1 mg/ml, em NaCI a 0,15M,

foram depositados no orifício central e iguais quantidades de soro de cava¬

lo antiveneno botrópico em diferentes diluições, nos orifícios periféricos.

As placas, depois de transferidas para câmaras úmidas, foram deixadas em

repouso por 24h à temperatura ambiente. A seguir, as placas foram lavadas

sucessivamente em NaCI a 0,15M por 24h e em água destilada por 24h, se¬

cadas na estufa a 37°C e imersas em uma solução corante (0,2% de azul de

Coomassie, 45% de metanol, 45% de água e 10% de ácido acético glacial)

por 5min e descoradas até fundo transparente na solução descorante (45%

de metanol, 45% de água e 10% de ácido acético). Depois de secadas em

estufa a 37°C as bandas de precipitação foram identificadas e o título dos

soros imunes foram avaliados pela última diluição do soro que ainda forne¬

cia bandas de precipitação visíveis.

Eletroforese em acetato de celulose. Amostras de 5 pl de soro de cava¬

los hiperimunizados com venenos botrópicos obtidas um dia antes do início

do processo de imunização e oito dias após a última imunização de reforço

foram aplicadas sobre fitas de acetato de celulose pré-embebidas em tam¬

pão veronal de sódio, pH 8.6, 0,04M e submetidas a uma eletroforese a

200V por 25 minutos; logo a seguir, as fitas de acetato de celulose foram

imersas na solução corante (0,5% de amido-Schwars IOB em uma solução

com 47,5% de metanol, 47,5% de água e 5% de ácido acético glacial) por

8 min. e transferidas para a solução diferenciadora (47,5% de metanol,

47,5% de água e 5% de ácido acético glacial). A seguir, as fitas foram

imersas na solução transparentizadora (85% de metanol, 14% de ácido

acético glacial e 1 % de glicerol) e secadas na estufa a 37%C. A absorvãn-

cia foi determinada no densitômetro.

Neutralização da atividade letal dos venenos botrópicos N ital Brazil 2 . A

uma série de amostras de 1 ,0ml de soro de cavalo antiveneno botrópico,

não diluído, adicionou-se I.Oml de NaCI a 0,15M contendo diferentes

quantidades da mistura de venenos botrópicos. Após incubação das mistu¬

ras à temperatura ambiente por 1 h, 2,0ml de cada mistura foram injetados

intravenosamente em pombos adultos pesando 250g. O título neutralizante

do soro foi considerado como sendo a maior quantidade de veneno cuja

atividade letal foi neutralizada por 1 ,0ml do soro não diluído.

110

SciELO

.0 11 12 13 14 15 16

HIGASHI, H.G.; GUIDOLIN, R.; NISHIKAWA, A.K.; YAMAGUCHI, I.K.; LIMA,

M.L.S.R.; MORAIS, J.F.; DIAS da SILVA, W. Venenos botrópicos pré-tratados com

inibidores ativos para os sítios enzimáticos de proteases e com substância quelante pre¬

servam seu poder imunogênico. Mem. Inst. Butantan, 57(3): 107-115, 1989.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Anticorpos antiveneno botrópico estavam ausentes nas amostras de

plasma colhidas imediatamente antes do início da imunização dos cavalos.

Após a imunização de base já havia anticorpos circulantes com títulos va¬

riáveis de 8 a 3.2 x 10 3 no ensaio pelo método de ELISA ou de 1,6 a 3.2 x

10 1 no ensaio pelo método da dupla-difusão em gel de agarose. Após a 1. a

imunização de reforço houve brusca e acentuada ascensão nos títulos de

anticorpos detectáveis pelo método de ELISA passando para 128 a 512 x

10 3 , permanecendo estável ao redor desses valores mesmo após a 5. a e úl¬

tima imunização de reforço. Todavia, no ensaio pelo método da dupla-

difusão em gel de agarose não houve alterações apreciáveis em relação aos

títulos obtidos nas amostras de plasma colhidas após a imunização de base

(Tabelas 1 e 2).

TABELA I

Titulação de anticorpos pelo micrométodo imunoenzimático-ELISA

antiveneno botrópico em cavalos imunizados com venenos botrópicos

"in natura'' ou pré-tratados com inibidores enzimáticos de baixo

peso molecular ativos sobre o centro ativo de enzimas proteolíticas.

Mistura* de

Venenos

Botrópicos

Animal

n.°

Anticorpos a ntivenenos botrópicos (**)(***)

1104

Imunização de reforço

Imunização

de base

I a dose

2. 3 dose

3. 3 dose

4. 3 dose

5. 3 dose

MVB*

256

200

400

200

128

100

130

256

200

400

375

128

200

400

200

385

512

200

400

200

MVB-I*

550

512

200

400

100

200

594

128

200

100

—

650

256

400

200

100

588

256

200

100

590

512

400

200

100

200

* MVB: mistura de venenos botrópicos contendo um volume de uma solução de

veneno de B.jararaca a 5,0mg/ml em NaCI 0.15M e um volume de uma

solução de venenos de B.alternatus, B.cotiara, B.jararacussu, B.moojeni,

B.neuwiedi e B.pradoi a 5.0mg/ml contendo quantidades iguais de cada

um destes venenos.

* MVB-I — A solução MVB pré-incubada com 5 ^M de p-Nitrofenil-p'guanidino

benzoato (NPGB), 5 pM de fenil-metil-sulfonil fluoreto (PMSF) e 10

m M de ácido etileno-diamino tetracético (EDTA) a 32°, 30 min.

* * Última diluição dando reação nitidamente positiva (xlO 3 )

***As amostras de soro colhidas imediatamente antes da imunização de base não

deram reações positivas.

111

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

HIGASHI, H.G.; GUIDOLIN, R.; NISHIKAWA, A.K.; YAMAGUCHI, I.K.; LIMA,

M.L.S.R.; MORAIS, J.F.; DIAS da SILVA, W. Venenos botrópicos pré-tratados com

inibidores ativos para os sítios enzimáticos de proteases e com substância quelante pre¬

servam seu poder imunogênico. Mem. Inst. Butantan, 57(31:107-115, 1989.

TABELA 2

Titulação de anticorpos pelo método de dupla-difusão em gel de agarose

antiveneno botrópico em cavalos imunizados com venenos botrópicos

"in natura" ou pré-tratados com inibidores enzimáticos de baixo

peso molecular ativos sobre o centro ativo de enzimas proteolíticas.

Mistura* de

Venenos

Botrópicos

Animal

n.°

Anticorpos antivenenos botrópicos (’ *)

Imunização

de base

Imunização de reforço

1. a dose

2. a dose

3. a dose

4. 3 dose

5. 3 dose

MVB*

>32

130

>32

375

>32

385

>32

MVB-I*

550

>32

594

>32

650

>32

588

>32

—

590

>32

* MVB: mistura de venenos botrópicos contendo um volume de uma solução de

veneno de B.jararaca a 5,0mg/ml em NaCI 0.15M e um volume de uma

solução de venenos de B.alternatus, B.cotiara, B. jararacussu, B.moojeni,

B.neuwiedie B.pradoia 5.0mg/ml contendo quantidades iguais de cada

um destes venenos.

* MVB-I A solução MVB pré-incubada com 5 /zM de p-Nitrofenil-p'-guanidino

benzoato (NPGB), 5/uM de fenil-metil-sulfonil fluoreto (PMSF) e 10

de ácido etileno-diamino tetracético (EDTA) a 32°, 30 min.

**Todos morreram com um minuto após inoculação.

A enorme diferença entre os títulos de anticorpos detectáveis pelos mé¬

todos de ELISA e pela dupla-difusão em gel agarose poderia ser explicada

pela também notável diferença entre os limites de sensibilidade dos dois

métodos: os métodos imunoenzimáticos podem detectar anticorpos em

quantidades da ordem de MS-pg enquanto no método de dupla-difusão só

aparecem bandas de precipitação nitidamente visíveis quando a concentra¬

ção de anticorpos acha-se presente, pelo menos entre 5 a 10 ^g; Bier et a/. 1

Anticorpos neutralizantes dos efeitos letais presentes nos venenos bo¬

trópicos não existiam ou se achavam em quantidades indetectáveis nas

amostras de plasma colhidas antes do início da imunização e mesmo nas

amostras de plasma obtidas após a imunização de base. Entretanto, uma

semana depois da 1. a imunização de reforço houve um aumento abrupto

nos níveis de anticorpos neutralizantes em todos os cavalos imunizados,

1,0ml de soro foi capaz de neutralizar os efeitos letais para o pombo em

mais de 0,2mg e menos de 1,0mg da mistura de venenos botrópicos, à ex¬

ceção do soro do cavalo n.° 650, cujo título foi superior a 1,0 mg/ml de so¬

ro. Estes títulos não variaram apreciavelmente ao longo de todo o processo

de imunização de reforço (Tabela 3).

112

SciELO

.0 11 12 13 14 15 16

HIGASHI, H.G.; GUIDOLIN, R.; NISHIKAWA, A.K.; YAMAGUCHI, I.K.; LIMA,

M.L.S.R.; MORAIS, J.F.; DIAS da SILVA, W. Venenos botrópicos pré-tratados com

inibidores ativos para os sítios enzimáticos de proteases e com substância quelante pre¬

servam seu poder imunogênico. Mem. Inst. Butantan, 57(31:107-115, 1989.

TABELA 3

Titulação dos anticorpos neutralizantes das atividades letais presentes

nos venenos botrópicos em cavalos imunizados com venenos botrópicos

"in natura" ou pré-tratados com inibidores enzimáticos de baixo

peso molecular ativos sobre o centro ativo de enzimas proteolíticas.

Mistura* de

Venenos

Botrópicos

Animal

n.°

Anticorpos neutralizantes

Imunização

de base

Imunização de reforço

I a dose

2. 3 dose

3. a dose

4. a dose

5. a dose

* *<0,2 mg

>0,2<0,5

>1,0<1,5

>0,8<1,0

<0,8

>0,2<0,5

>0,5<0,8

>0,2<0,5

MVB*

130

>0,2<0,5

>1,0

>1,0<2,0

375

>0,2<0,5

>0,5<0,8

>1,0

>0,8<1,0

385

<0,2

>0,2<0,5

>0,5<0,8

550

**<0,2mg

>0,8<1,0

>1,0<1,5

>0,8<1,0

>0,5<0,8

MVB-I*

594

>0,5<0,8

>0,8<1,0

>0,5<1,0

<0,5

>0,2<0,8

650

>10

>1,5

>2,5<3,0

588

>0,2<0,5

>0,8<1,0

590

>0,8<1,0

<0,8

>0,5<0,8

* MVB: mistura de venenos botrópicos contendo um volume de uma solução de

veneno de B.jararaca a 5,0mg/ml em NaCI 0.15M e um volume de uma

solução de venenos de B.alternatus, B.cotiara, B.jararacussu, B.moojeni,

B.neuwiedi e B.pradoi a 5.0mg/ml contendo quantidades iguais de cada

um destes venenos.

* MVB-I A solução MVB pré-incubada com 5 /uM de p-Nitrofenil-p'-guanidino

benzoato (NPGB), 5piM de fenil-metil-sulfonil fluoreto (PMSF) e 10

ptM de ácido etileno-diamino tetracético (EDTA) a 32°, 30 min.

* ‘Última diluição dando nítidas bandas de precipitação.

Via de regra, não há diferenças apreciáveis nos títulos de anticorpos

quer nos animais imunizados com os venenos botrópicos "in natura" quer

nos animais imunizados com a mistura de venenos botrópicos pré-tratada

com inibidores enzimáticos. Assim, os inibidores NPGB e PMSF, compos¬

tos de baixo peso molecular, ativos sobre o centro ativo de enzimas pro¬

teolíticas, não interferiram com a imunogenicidade dos componentes dos

venenos botrópicos responsáveis por seus efeitos letais. É importante res¬

saltar que os venenos botrópicos pré-tratados com os inibidores enzimáti¬

cos, ao contrário dos venenos "in natura", produziram lesões muito discre¬

tas no local da injeção que logo se cicatrizavam Houve aumento da fração

v-globulinas após a 2.° imunização de reforço.

Os resultados apresentados neste trabalho sugerem: a) que a mistura

de venenos botrópicos utilizada para a produção de soros terapêuticos de¬

veria ser pré-tratada com inibidores enzimáticos de baixo peso molecular,

visando reduzir as ações das enzimas proteolíticas presentes nesses vene¬

nos e assim reduzir as lesões locais que expoliam desnecessariamente a

saúde dos animais em imunização; b) que o número de doses da imuniza¬

ção de reforço seja reduzido para duas, uma vez que não houve modifica-

113

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

Errata

Mem. Inst. Butantan,51(3), 1989.

Página

Onde se lê

112 Tabela 2 **Todos morreram com um minuto após Inoculação.

113 Tabela 3 **Última diluição dando nítidas bandas de precipitação.

Leia-se

** Última diluição dando nítidas bandas de precipitação.

** Todos morreram com um minuto após inoculação.

IMPRENSA OFICIAL DO ESTADO

SciELO

Errata

Mem. Inst. Butantan,51(3), 1989.

Página Onde se lê

112 Tabela 2 **Todos morreram com um minuto após Inoculação.

113 Tabela 3 **Última diluição dando nítidas bandas de precipitação.

Lela-se

** Última diluição dando nítidas bandas de precipitação.

** Todos morreram com um minuto após inoculação.

IMPRENSA OFICIAL DO ESTADO

SciELO

HIGASHI, HG.; GUIDOLIN, R.; NISHIKAWA, A.K.; YAMAGUCHI, I.K.; LIMA,

M.L.S.R.; MORAIS, J.F.; DIAS da SILVA, W. Venenos botrópicos pré-tratados com

inibidores ativos para os sítios enzimáticos de proteases e com substância quelante pre-

servamseu poder imunogênico. Mem. Inst. Butantan, 57(31:107-115, 1989.

ções apreciáveis nos títulos de anticorpos ensaiados tanto pelos métodos

imunoquímicos de ELISA e de imunodifusão como pelo método de neutra¬

lização das atividades letais dos venenos botrópicos.

ABSTRACT: The effect of protease active site direct inhibitors, the p-

nitrophenyl-p'-guanidino benzoate (NPGB) and the phenyl-methyl-

sulphonyl-fluoride (PMSF) or the chelator ethylenediaminetetraacetic

acid (EDTA) on the immunogenic properties of Bothropsve nom compo-

nents was studied. A group of 5 horses weighing 400-450 kg was immu-

nized with Bo throps ve no ms preteated with 5 pM NPGP, 5 pM PMSF and

lOmM EDTA. As control a similar group of horses was immunized with

untreated venom. The animais were primed with 5 mg of venom in com¬

plete Freund's adjuvant and restimulated 4 months later with five boos-

ters, each with 10 mg of venoms in NaCI 0,15 M, 8 days apart. During

the immunization procedure (160 days long) each animal received 55 mg

of venom. Serum samples were collected just before each venom injec-

tion and the antibodies leveis evaluated by three methods: the micro-

ELISA assay, the double immunodiffusion precipitin reaction and the ve¬

nom lethal effects neutralization test. Antibodies against Bothrops ve¬

noms were absent before immunization, were present in low titers 4

months after priming with the venom incorporated in FCA, increasing af-

ter the first two boosters and plateauing thereafter. Pretreatment with

NPGB, PMSF and EDTA did not interfered with the immunogenic pro¬

perties of the venoms but blocks therir local tissue damage effects. These

results lead to conclude that Bothrops ve nom pretreated with protease

active site direct inhibitors should be used as substitute for crude venom

as antigen and that the immunization schedule of horses for antivenoms

production should be constituted by a priming with 5 mg of venom in

FCA followed 3-4 month later by two boosters with 10 mg of venom in

0,15 M NaCI 8 days apart.

KEYWORDS: Bo throps venom. Proteolytic enzyme.

AGRADECIMENTOS

Aos funcionários e servidores do Setor de Imunização e Concentração

e Fracionamento de Soros, pela colaboração prestada no decorrer do tra¬

balho.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. BIER, O.G.; DIAS da SILVA, W.; GOTZE, D.; MOTA, I. Antigen-antibody interaction.

In: - Fundamentais of immunology. Berlin, Springer-Verlag, 1986.

Cap. 7, p. 179.

2. BRAZIL, V. Dosagem do valor antitóxico dos serums antipeçonhentos. Trib. méd. Rio

de Janeiro, 74(3): 39 - 44, 1908.

3. DEUTSCH, H.F. & DINIZ, C.R. Some proteolytic activitíes of snake venoms. J. Biol.

Chem., 216: 17 - 26, 1955.

4. DIAS da SILVA, W., EISELE, J.W.; LEPOW, I.H. Complement as mediator of inflam-

mation. III. Purification of the activity with anaphylatoxin properties generated by in¬

teraction of the first four components and its identification as a cleavage product of

C3. J. exp. Med., 126 1027 -1048, 1967.

5. IWANAGA, S. & SUZUKI, T. Enzymes in snakes venom. In: LEE, C.Y. Snake venoms.

Berlin, Springer-Verlag, 1979. Cap. 21. p. 684-750. (Handbook of experimental phar-

macology, 52).

6. KOCHOLATY, W.F.; LEDFORD, E.B.; DAYLY, J.G.; BILLINGS, T.A. Toxicity and so¬

me enzymatic properties and activities in the venoms of Crotalinae, Elapidae, and

Viperidae. Toxicon, 9: 31 - 138, 1971.

7. MEBS, D. A comparativo study of enzyme activities in snake venoms. Int. J. Biochem.,

1: 335-342, 1970.

114

SciELO

.0 11 12 13 14 15 16

HIGASHI, H.G.; GUIDOLIN, R.; NISHIKAWA, A.K.; YAMAGUCHI, I.K.; LIMA,

M.L.S.R.; MORAIS, J.F.; DIAS da SILVA, W. Venenos botrópicos pré-tratados com

inibidores ativos para os sítios enzimáticos de proteases e com substância quelante pre¬

servam seu poder imunogênico. Mem. Inst. Butantan, 57(3): 107-115, 1989.

8. OUCHTERLONY, O. Antigen-antibody reactions in gels. Acta. path. microbiol. scand.,

2& 507 1949.

9. ROCHA e SILVA, BERALDO, W.T.; ROSENFELD, G. Bradykinin, a hypotensive and

smooth muscle stimulating factor releases from plasma globulin by snake venoms and

trypsin. Amer. J. PhysioL, 156: 261 -273, 1949.

10. SLOTTA, k. Chemistry and biochemistry os snake venoms. Progr. Chem. Org. Nat.

Prod., 72:406, 1955.

11. THEAKSTON, R.D.G.; LLOYD-JONES, M.J.; REID, H.A. Micro-ELISA for detecting

and assaying venom and antivenom-antibody. Lancet, 2:639-641, 1977.

115

10 11 12 13 14 15 16

Mem. Inst. Butantan

51(31:117-121, 1989

PRESENÇA DE HEPATOZOON PLIMMERI( SAMBON, 1909) —

COCCIDIA, HAEMOGREGARINIDAE — EM EXEMPLAR

DE BOTHROPS JARARACA (\N\ED, 1824) — SERPENTES

VIPERIDAE, CROTALINAE — MANTIDO EM CATIVEIRO

Pérsio De BIASI*

Rubens Pinto CARDOSO JUNIOR**

Selma Maria de Almeida SANTOS***

RESUMO: Os autores relatam a presença de Hepatozoon pHmmeri (Sam-

bon, 1909) em serpente vivípara, Bothrops jararaca (Wied, 1824), natu¬

ralmente infectada e mantida em cativeiro ao longo de oito anos. Comen¬

tam sobre os mecanismos de transmissão do parasita por ingestão de

hospedeiros invertebrados (esporozoítos), predatismo, migração trans-

placentária (merozoftos e/ou endozoítos). Levantam a hipótese da exis¬

tência no ciclo biológico de Hepatozoon de formas responsáveis por ci¬

clos assexuados rápidos e lentos ou crônicos, lembrando taquizoítos e

bradizoítos dos Eimeriinae.

UNITERMOS: Hepatozoon, Haemogregarinidae. Serpentes: Bothrops

jararaca.

INTRODUÇÃO

Hepatozoon Miller 1908, tem, em seu ciclo biológico, a fase de reprodu¬

ção assexuada em órgãos viscerais do hospedeiro vertebrado. Segundo

Levine 8 , ocorrem várias gerações assexuadas nas células viscerais, mas o

número delas somente é conhecido em alguns casos.

Miller 9 , ao estudar em laboratório o ciclo de Hepatozoon muris (Bal-

four, 1905) 1 numa população de ratos brancos, mencionou que a esquizo-

gonia do parasita verifica-se no fígado do hospedeiro por três gerações e

só, ocasionalmente, há uma 4. a ou5. a geração.

Na infecção por predatismo, Landau 7 , constatou que a esquizogonia

* Divisão de Biologia

* * Seção de Venenos

" Bolsista FEDIB

Instituto Butantan — C.P. 65 — 01051 — São Paulo — SP, Brasil.

Recebido para publicação em 02/06/1989 e aceito em 03/08/1989.

117

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

BIASI, P. De; CARDOSO JÚNIOR, R.P.; SANTOS, S.M. de A. Presença de Hepatozoon

plimmeri (Sambon, 1909) — Coccidia, Haemogregarininidae — em exemplar de

Bothropsjararaca (Wied, 1824). Serpentes, Viperidae, Crotalinae — mantido em cati¬

veiro. Mem. Inst. Butantan, 57(31:117-121, 1989.

demanda pequeno número de dias, ao encontrar, no sangue de serpentes,

merozoítos de Hepatozoon resultantes de divisão esquizogônica após o vi¬

gésimo dia de alimentação. Todavia, não foram citadas referências quanto

ao número de gerações que ocorreram durante a presença do parasita no

hospedeiro vertebrado.

Os experimentos, em geral, têm sido acompanhados durante curto es¬

paço de tempo, não havendo menção de período em que a reprodução as¬

sexuada do Hepatozoon assegure a presença deste parasita na serpente.

Neste trabalho, relata-se a infecção por H. plimmeri (Sambon, 1909) em

serpente Bothrops jararaca (Wied, 1824) mantida em cativeiro durante oito

anos.

MATERIAL E MÉTODOS

Serpente Bothrops jararaca, fêmea, recebida em 4/7/1980, na Seção

de Venenos do Instituto Butantan, número NH-813 da série examinada pa¬

ra hematozoários, mantida no cativeiro (gaiola e sala adequadas) e alimen¬

tada com camundongos brancos provenientes do Biotério do Instituto Bu¬

tantan, foi submetida a exame de sangue colhido através de pequena sec-

cão da cauda, na mesma data de sua recepcão e, também, nos dias 20/7 e

04/10/1988.

Utilizaram-se as seguintes técnicas:

a) a fresco, por gota de sangue observada entre lâmina e lamínula;

b) esfregaços de sangue fixados com metanol e corados segundo Ro-

senfeld.

A classificação da parasitemia obedece ao seguinte critério:

a) infecção leve — esfregaços apresentando até um parasita para cada

três campos ópticos ( +);

b) infecção média — encontro entre o limite máximo de infecção leve

até três parasitas por campo óptico ( + +);

c) infecção grave — acima do índice máximo da infeccão média

(+ + +).

As fotos foram tomadas com fotomicroscópio Leitz Laborlu S, objetiva

de 100 x e ocular de 10 x, com sistema automático de microfotografia Wild-

SS e em seguida ampliadas. Filme Panatomic-X, ASA-32.

RESULTADOS

Em 4 de julho de 1980, no primeiro exame de sangue da serpente B.

jararaca, foram encontrados merozoítos intra e exoeritrocíticos de

Hepatozoon e, segundo critério adotado por Pessoa et al. 10 - 11 , identifica¬

dos como Hepatozoon plimmeri (Sambon, 1909).

A parasitemia mostrou-se grave ( + + + ) aos primeiros exames. Decor¬

ridos oito anos de sobrevida da serpente no cativeiro, alimentada exclusiva¬

mente com camundongos brancos provenientes de biotério, novos exames

de sangue revelaram a presença do Hepatozoon pelo encontro de mero¬

zoítos intra e exoeritrocíticos encapsulados e desencapsulados (figuras 1 a

118

SciELO

.0 11 12 13 14 15 16

SciELO^o

BIASI, P. De; CARDOSO JÚNIOR, R.P.; SANTOS, S.M, de A. Presença de Hepatozoon

plimmeri (Sambon, 1909) — Coccidia, Haemogregarininidae — em exemplar de

Bothropsjaracaca (Wied, 1824). Serpentes, Viperidae, Crotalinae — mantido em cati¬

veiro. Mem. Inst. Butantan, 57(31:117-121, 1989.

COMENTÁRIOS E CONCLUSÕES

O ciclo biológico de Hepatozoon requer dois hospedeiros: um inverte¬

brado para a reprodução sexuada e outro vertebrado para a assexuada.

Os mecanismos de transmissão em serpentes vivíparas, nas quais estão

incluídas as serpentes Bothrops, ocorrem por esporozoítos através da in¬

gestão do invertebrado infectado, por merozoítos e/ou endozoítos no pre-

datismo (Landau) 7 ,

Biasi 2 ).

e na transmissão transplacentária (Biasi et al. 3 ' 4 e

Citação bibliográfica mostra que as gerações do ciclo esquizogônico no

hospedeiro vertebrado se repetem em pequeno número de dias (Landau) 7 .

Em hospedeiro serpente, não há referência quanto ao número de gera¬

ções esquizogônicas possíveis de se realizar ao longo da sobrevida do

Hepatozoon nesse vertebrado, pois todos os acompanhamentos nas pes¬

quisas realizadas processaram-se por curto espaço de tempo.

A continuidade, num período de oito anos, de infecção na Bothrops

jararaca, naturalmente infectada por H. plimmeri, evidencia a capacidade

do Hepatozoon em manter-se presente no hospedeiro vertebrado (serpen¬

te) durante longo espaço de tempo, através de várias gerações assexuadas

(esquizogônicas ou endogênicas) em infecção considerada crônica.

Os organismos parasitas encontrados no ciclo assexuado de

Hepatozoon têm sido referidos como microzoítos (merozoítos) e macro-

zoítos (endozoítos), gerados respectivamente nos macro e microcistos. Os

primeiros têm sido responsabilizados pela origem de gametócitos, enquan¬

to que os segundos pela manutenção do ciclo assexuado. Nada tem sido

mencionado pelos autores a respeito de formas merozoíticas e/ou endo-

zoíticas causadoras de fases agudas e crônicas nas infecções por

Hepatozoon.

A presente constatação leva à suspeita de que na fase de reprodução

assexuada no hospedeiro vertebrado, o Hepatozoon no seu ciclo biológico

tenha organismos que realizem ciclos reprodutivos rápidos e lentos, res¬

ponsáveis, respectivamente, por infecção aguda e crônica, lembrando a

existência de taquizoítos e bradizoítos de Eimeriinae como Toxopiasma,

Sarcocystise outros (Frenkel) 6 .

Devido a presença durante longo período de tempo de H. plimmeri em

B. jararaca, e aos mecanismos de transmissão do Hepatozoon no hospe¬

deiro vertebrado (ingestão de esporozoítos, ingestão de mero e/ou endo¬

zoítos e transmissão congênita), os experimentos biológicos em laboratório

devem ser realizados com serpentes examinadas e negativas para

Hepatozoon. Se possível, utilizar não apenas técnicas de rotina para exame

de sangue, mas também métodos como o xenodiagnóstico com emprego

de hospedeiro invertebrado adequado para o desenvolvimento do ciclo es-

porogônico do Hepatozoon. Como já relatado anteriormente (Biasi et al.) 5 ,

este hematozoário pode estar presente sob forma latente ou baixo índice

de parasitemia.

120

SciELO

.0 11 12 13 14 15 16

BiASI, P. De; CARDOSO JÚNIOR, R.P.; SANTOS, S.M. de A. Presença de Hepatozoon

piimmeri' ISambon, 1909) - Coccidia, Haemogregarininidae — em exemplar de

Bothropsjaracaca (Wied, 1824). Serpentes, Viperidae, Crotalinae - mantido em cati¬

veiro. Mem. Inst. Butantan, 57(3): 117-121, 1989.

ABSTRACT: The authors relate the presence of Hepatozoon piimmeri

(Sambon, 1909) in a naturally infected viviparous snake Bothrops

jararaca (Wied, 1824) maintained in captivity for 8 years. They comment

on the transmission mechanisms of the parasite through ingestion of in-

vertebrate hosts (sporozoites) predatory behaviour, transplacentary mi-

gration (merozoites and/or endozoites). They raise the hypothesis of the

existence, in the biological cycle of Hepatozoon, of forms responsable

for assexúal cycles, rapid, slow or chronic, reminding tachyzoites and

bradyzoites of Eimeriinae.

KEYWORDS: Hepatozoon. Haemogregarinidae. Snakes: Bothrops jara¬

raca.

AGRADECIMENTOS

Á Wild Leitz Instrumental de Precisão pelo acesso ao equipamento

óptico e fotográfico.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

10 .

11 .

BALFOUR A. Haemogregarina of mammals, H. jaculi (H. balfouri Laveran). J. trop.

Med. Hyg., 5(16): 24Í-244, 1905.

BIASI, P. De. Estudo sobre mecanismo de transmissão transplacentária "in vivo" de

Hepatozoon Miller, 1908 em serpentes vivíparas Crotalinae ( Crotalus Linnaeus, 1758 e

Bothrops Wagler; 1824) e algumas observações nomenclaturais sobre os hospedeiros

e parasitas. (Tese, 1986) não publicada.

BIASI, P. De; PESSÔA, S.B.; BELLUOMINI, H.E. Nota sobre a transmissão congênita

de hemogregarinas em duas espécies de serpentes peçonhentas vivíparas. Atas da

Soc. Bioi., Rio de Janeiro, 75(1): 27-28, 1971.

BIASI, P. De; PESSÔA, S.B.; BELLUOMINI, H.E. Novas observações sobre transmis-

são congênita de hematozoários de serpentes vivíparas. Mem. Inst. Butantan, 36:

245-249,'1972.

BIASI, P. De; PESSÔA, S.B.; VIEIRA, F.C.G. Nota sobre longa latência de infecção por

hemogregárina em uma serpente peçonhenta: Bothrops moojeni Hoge, 1965. Atas da

Soc. Bioi, Rio de Janeiro, 75(2): 71-73, 1972.

FRENKEL, J.K. Advances in the biology of Sporozoa. Z. Parasitenk., 45: 125-162, 1974.

LANDAU,' I. Diversité des mecanismes assurant la pérennité de 1'infection chez les spo-

rozoairés coccidiomorphes. Mém. Mus. Nat. D'Histoire Naturelle, N.S. (Série A.

Zoologie), 77: 1-62, 1973.

LEVINE, N.D. Protozoan parasites of domestic animais and of man. 2. ed. 1973. Min-

neapolis Burgess Publishing Co., 1973.

MILLER, W.W. Hepatozoon perniciosum (n.g., sp.): a haemogregarine pathogenic for

whiterats with a description of the sexual cycle in the intermediate host a mite

( Laelaps echidninus). Buli. Hyg. Lab. Washington, 46: 51, 1908.

PESSÔA, S.B. Notas sobre hemogregarinas de serpentes brasileiras. III. Novas obser-

vações sobre hemogregarinas de serpentes das Famílias Colubridae e Crotalidae. Rev.

bras. Bioi, 27(2): 159-164, 1967.

PESSÔA, S.B.; BELLUOMINI, H.E.; BIASI, P. De; SOUZA, D.M. Notas sobre hemo¬

gregarinas de serpentes brasileiras. XIV. Esporogonia da Hemogregarina da Bothrops

moojeni Hoge, 1965, no Culex(Culex) dolosusiL. Arribálzaga, 1891). Arq. Inst. Bioi,

São Paulo, 36(4): 253-258, 1971.

121

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

COMPOSIÇÃO. FOTOLITO E IMPRESSÃO

IMPRENSA OFICIAL

DO ESTADO SAIMESP

Rua da Mooca, 1921 Fone: 291-3344

Vendas, ramais: 257 e 325

Telex: 011 34557 DOSP

Caixa Postal: 8231 — São Paulo

C.G.C. (M.F.) N.° 48.066.047/0001-84

N0V0 TEMPO

GOVERNO DE SAO PAULO

SciELO

INSTRUÇÕES AOS AUTORES

1. Somente serão aceitos trabalhos inéditos e que se destinem extlusivamenrc à revista. Ê proibida a reprodução

com fins lucrativos. Os artigos de revisão serão publicados a convite da Comissão Editorial.

2. Os trabalhos deverão ser redigidos cm português, inglês ou francês, datilografados preferencialmente em má¬

quina elétrica, em espaço duplo em 3 (três) vias, em papel formato ofício c numerados no ângulo superior direi¬

to.

3 No preparo do original será observada, sempre que possível, a seguinte estrutura: Página de rosto: título do arti¬

go, nomc(s) do(s) autor(es) c filiação científica. Texto: introdução, material c métodos, resultados, discussão,

conclusões, agradecimentos e referência bibliográfica. Material de referência: resumos (em português e inglês);

unitermos (palavras ou expressões que identificam o conteúdo do artigo; devem ser incluídas até um limite máxi¬

mo de três, cm português e inglês).

4. As referências bibliográficas deverão ser ordenadas alfabeticamente e numeradas.

Exemplos:

Para livros: autor, título, edição, local de publicação, editor, ano, páginas.

7, BIER, O. Microbiologia c imunologia. 24.ed. São Paulo, Melhoramentos, 1985. 1234p.

Para artigos: autor, título do artigo, título do periódico, volume, página inicial c final, ano.

8. MACHADO, J.C. & SILVEIRA F.°, J.F. Obtenção experimental da pancreatite hemorrágica aguda no cão

por veneno escorpiônico. Mem. Inst. Butantan, 40/41: 1-9, 1976/77.

As citações no texto devem ser por números-índices correspondentes às respectivas referências bibliográficas.

Exemplos:

... método derivado de simplificação de armadilha de Disney 1

... segundo vários autores 2,3 ' 1

5 As ilustrações (fotos, tabelas, gráficos etc.) deverão ser originais c acompanhadas de legendas explicativas. As le¬

gendas serão numeradas c reunidas cm folha ã parte. Os desenhos deverão ser a nanquim e as fotografias bem

nítidas, trazendo no verso o nome do autor e a indicação numérica da ordem a ser obedecida no texto. As ilustra¬

ções deverão ser organizadas de modo a permitir sua reprodução dentro da mancha da revista (22 x 12,5cm).

6. Os artigos deverão conter no máximo 6 (seis) ilustrações (branco e preto). De cada trabalho serão impressas 50

(cinquenta) separatas, sendo 10 para a Biblioteca do Instituto e 40 para os autores.

7. Os textos originais não serão devolvidos e os originais das ilustrações estarão à disposição dos autores.

INSTRUCTIONS TO AUTHORS

1. Manuscripts submitted to the Editorial Board should be unpublished texts and should not be under considera-

tion for publication elsewherc. Rcproduction for commercial purposes is not allowed. The Editorial Board will

plan the publication of rcvtsion articles.

2. The original and two copies of papers should be typewritten in Portuguese, English or Frcnch, double spaccd,

on typing paper (31 x 21 cm). Pages should be numbered consccutively at the upper right corncr.

3. The following structure should be considcrcd in the preparation of the manuscript: Title page: with article ti-

tlc, name of author(s), profcssional address. Text: with introduction, material and mcthods, tcsults, discuv

sion, conclusions, acknowledgmcnts, refercnces, abstraets (in Portuguese and English), and keywords. A maximal

number of 03 keywords should be includcd in Portuguese and English.

■i. Refercnces in alphabetical order should be numbered conscc utively.

Examples:

Books

7. BIER, O. Microbiologia e imunologia. 24.ed. São Paulo, Melhoramentos, 1985. 1234p.

Articles

8. MACHADO, J.C. Sc SILVEIRA F.°, J.F. Obtenção experimental da pancreatite hemorrágica aguda no cão

por veneno escorpiônico. Mem. Inst. Butantan, 40/41: 1-9, 1976/77.

Citations in the text should be identified by the referente number.

Examples:

... método derivado de simplificação de armadilha de Disney 1

... segundo vários autores 2 ' 3 '" 1

5. lllustrations (photographs, tables, figures etc.) should be the originais and legends should be submitted typew¬

ritten on a separate shcct. Linc-drawings should be with China ink and photographs must be of top quality. On

the back of each figure or photograph the name of the author(s) should be lighly written and the number indi-

cating the sequente in the text. lllustrations should fit in a page measuring 22 x 12,5cm.

No more than 6 illustrations will be accepted and photographs should be black and white. Fifty rcprinrs of each

article are provided without charge, and 10 will be kept at the library.

Submitted manuscripts will not be returned to the author(s) but the original illustrations are availablc to au-

thor(s) by request.

6 .

SciELO

11 12 13 14 15 16 17