As "MEMÓRIAS DO INSTITUTO BUTANTAN" têm por finalidade a apre¬

sentação de trabalhos originais que contribuam para o progresso nos campos das

Ciências Biológicas, Médicas e Químicas, elaborados por especialistas nacionais

e estrangeiros.

São publicadas sob a orientação da Comissão Editorial, sendo que os con¬

ceitos emitidos são de inteira responsabilidade dos autores.

The "MEMÓRIAS DO INSTITUTO BUTANTAN" are the vehicle of com-

munication for original papers written by national and foreign specialists who

contribute to the progress of Biological, Medicai and Chemical Sciences.

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2 3 4

5 6 7

KJ —I 1—I J—l \

11 12 13 14 15 16

Governo do Estado de São Paulo

Secretaria de Estado da Saúde

Coordenação dos Institutos de Pesquisa

Instituto Butantan — São Paulo — SP — Brasil

MEMÓRIAS

INSTITUTO BUTANTAN

Volume 51, número 1,1989

São Paulo, SP — Brasil

1989

'SciELO

D 11 12 13 14

MEMÓRIAS do INSTITUTO BUTANTAN. (Secretaria de Estado da Saúde)

São Paulo, SP — Brasil, 1918 —

1918 - 1983/84,1-47/48

Publicação interrompida de 1985 a 1986

1987, 49(1-3)

1988, 50(1-3)

1989, 51(1

ISSN 0073-9901

MIBUAH

CDD 614.07205

Solicita-se permuta/ Exchange desired

7 SCÍELO) 1:l 12 13 14 15 16 17

Mem. Inst. Butantan

51 ( 1 ), 1989 .

SUMÁRIO/CONTENTS

Preparação e teste da toxina botulínica tipo "E" e do seu anti-

soro específico.

Preparation and test of botulinum type "E" toxin and its

specific antiserum.

Hisako Gondo HIGASHI; Edison Paulo Tavares de

OLIVEIRA; Raymundo ROLIM ROSA; Maria Antonieta da

SILVA; Fernando FRATELLI; Naomi ENOKI; Hideyo IIZUKA 5-13

Sobre a evolução de Ascaris lumbricoides Linnaeus, 1758, na

fase larvar endovular.

Larval development of Ascaris lumbricoides Linnaeus, 1758,

within the egg.

Paulo de Toledo ARTIGAS; Marlene Tiduko UETA. 15-24

Estudo comparativo entre os venenos de serpentes do gênero

Bothrops, procedentes do Estado de São Paulo e do Estado do

Paraná com algumas espécies morfologicamente duvidosas.

Comparative study among snake venoms of Bothrops genus

including some morphologically dubious species from States of

São Paulo and Paraná.

Maria Amélia Lopes PERRONE; Medardo SILES

VILLARROEL; Maria de Fátima Domingues FURTADO. 25-32

Sobrevivência de Bothrops jararacussu (Serpentes, Viperidae,

Crotalinae) mantidas em cativeiro.

Bothrops jararacussu (Serpentes, Viperidae, Crotalinae)

surviving under captivity conditions.

Frederico Fontoura LEINZ; Thelia Rosana Forte JANEIRO-

CINQUINI; Masaio Mizuno ISHIZUKA, Luiza Vasconcelos

LANG. 33-38

SciELO

11 12 13 14 15 16 17

Mem. Inst. Butantan

51 ( 11 : 5 - 13 , 1989

PREPARAÇÃO E TESTE DA TOXINA BOTULÍNICA

TIPO “E” E DO SEU ANTI-SORO ESPECIFICO

Hisako Gondo HIGASHI*

Edison Paulo Tavares de OLIVEIRA*

Raymundo ROLIM ROSA

Maria Antonieta da SILVA*

Fernando FRATELLI*

Naomi ENOKI*

Hideyo IIZUKA*

RESUMO: Os autores descrevem o método utilizado na preparação do

soro antibotulínico tipo E, que não apresenta reação cruzada com a toxi¬

na heteróloga, pela hiperimunização de eqüídeos, através do antígeno

adsorvido pelo alúmen de potássio (sulfato duplo de alumínio e potássio).

Empregando o esquema de imunização anteriormente proposto, conse¬

guiram obter mistura de plasma hiperimunes o qual, após purificado pelo

método de Pope, modificado, concentrou até níveis na ordem de 750 a

1.000 Ul/ml. Este produto foi diluído convenientemente para que conti¬

vesse 500 Ul/ml de antitoxina.

UNITERMOS: Botulismo; Clostridium botulinum tipo E, intoxicação ali¬

mentar, toxina eanatoxina, antitoxina.

INTRODUÇÃO

O botulismo é uma intoxicação fatal que pode acometer os homens e os

animais, causada pela ingestão de alimentos contaminados por diferentes

cepas de Clostridium botulinurrP ' 4 ' 6 - 7 • 8 ' 9 ' 11 onde liberam toxinas potentes

que, eletivamente, agridem os tecidos do sistema nervoso central (SNC).

Após a penetração das toxinas nas células do SNC, dificilmente elas são

neutralizadas pelos anticorpos. Convém ainda ressaltar que não se estabe¬

lece imunidade cruzada entre as diferentes toxinas. Como a cura do botu¬

lismo, até o momento, somente pode ser obtida pela aplicação de soros hi¬

perimunes específicos e, face ao exposto acima, o êxito da soroterapia resi¬

de na utilização do sorotipo — específico e na precocidade de sua aplica¬

ção ou, em outras.palavras, o soro deve ser aplicado antes da penetração

das toxinas nas células nervosas.

A partir de 1972 o Instituto Butantan começou a produzir o soro antibo¬

tulínico tipo A 19 e, posteriormente, o tipo B 15 . Devido à especificidade das

antitoxinas 18 e a eficácia do seu emprego depender de diagnóstico labora-

* Instituto Butantan - Av. Vital Brasil, 1500 CEP 05504 — São Paulo — Brasil.

Recebido para a publicação em 15-6-1988 e aceito em 4-10-88.

SciELO

HIGASHI, H.G.; OLIVEIRA, E.P.T. de; ROHM ROSA, R.; SILVA, M.A. da; FRATELLI, F.; ENOKI, N.;

IIZUKA, H. Preparação e teste da toxina botulinica tipo "E" e do seu anti-soro específico. Mem.

Inst. Butantan, 51 (11:5-13, 1989.

torial que demanda tempo, incompatível com a evolução clínica do pacien¬

te em nosso meio, foi introduzida a preparação do soro bivalente A e B.

Em face do isolamento de um novo tipo de toxina 14 ' 17 , denominada co¬

mo tipo E e do surgimento de diversos casos de intoxicação humana em di¬

ferentes países V ' n pelo consumo de pescados contaminados com este ti¬

po de toxina e, ainda, pela crescente utilização do peixe e seus derivados

enlatados, no Brasil, propusemo-nos a preparar o soro antibotulínico tipo E

que é o objetivo do presente trabalho.

É importante ressaltar também a possibilidade de produção do soro tipo

ABE.

MATERIAIS E MÉTODOS

7 — Cepas utilizadas

1.1 — Exame e caracterização

Para a obtenção da toxina tipo E adequada à produção de

soros foi necessária a seleção de cepas mais toxigênicas.

Este trabalho foi desenvolvido entre dez amostras a saber:

— amostra n° 63 IP, existente na Germoteca do Instituto Butantan, rece¬

bida do Instituto Pasteur, Paris, enviada pelo Prof. A. R. Prevot em

1962.

— amostras 1E, 2E, 38E, 42E, 44E e48E cedidas pelo Instituto Tecnológico

de Alimentos de Campinas (ITAL); São Paulo — Brasil*.

— cepa liofilizada de Nanaimo, recebida do Microbiological Research Esta-

blishment, Porton Down Salisbury, Weltshire England**.

— cepa liofilizada EK e EKX, recebida da World Health Organization —

Department of Biological Standardization — Copenhagen-Denmark.

Todas as amostras foram examinadas e encontradas satisfatórias quan¬

to à pureza, por repicagem em meio de TPGY 10 e incubadas durante 48h a

30°C em anaerobiose.

Quando semeadas em meio de agar-sangue, apresentam colônias

translúcidas, com um diâmetro em torno de 0,5 milímetro após 48h de in¬

cubação a 37°C, podendo evidenciar uma discreta reação de hemólise 1 .

Em meio de cultura contendo gema de ovo, as colônias são irregulares exi¬

bindo uma superfície iridiscente quando examinada sob luz oblíqua. Esta

zona lustrosa é também denominada camada aperolada (pearly layer),

apresentam uma zona de precipitação maior do que aquelas das colônias

do tipo A e cepas proteolíticas do tipo B e F, medindo de 2,0 a 4,0 milíme¬

tros circundando-as 24 . A gelatina é hidrolisada, são capazes de provocar,

uma suave coagulação do leite, o qual no entanto não é digerido 22 . Final¬

mente, a produção de gás sulfídrico não é evidenciada, o que é característi¬

co ao grupo a qual o C. botulinum tipo E pertence 16 ' 22 ' 23 .

2 — Obtenção de toxina

2.1

Meios de cultura utilizados

Os seguintes meios foram utilizados em nossas experiên¬

cias:

meio de Müller modificado por Lathan

meio de TPGY 10

Por gentileza da Dra. Ivone Delazari — Pesquisadora do ITAL.

Por gentileza do Dr. J. Bawmer — Canadá.

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— meio de Duff modificado 12

2.2 — Preparação do "inoculum”

As cepas liofilizadas eram ressuspensas com 2 ml do meio a

ser utilizado e semeadas em 20ml do mesmo meio. Os tu¬

bos, após 48 horas de incubação a 30°C em jarras anaeróbi-

cas (sistema Gas-pack — BBL em atmosfera de CO 2 e H 2 ),

eram repicados cinco vezes sucessivamente, nas mesmas

condições mencionadas. O material total da 5 a passagem,

após 24 horas de incubação, era utilizado como inóculo para

produção de dois litros de toxina após 6 dias de incubação a

30°C. O pH dos meios era = 7,0, e o volume contido no ba¬

lão era de 3/4 do volume total do Erlemmeyer. Durante o

período de incubação havia formação de gases que eram ex¬

pulsos por agitação.

3 — Provas efetuadas

3.1 — Prova de pureza: — exame microscópico de cultura em lâmi¬

nas coradas pelo método de Gram apresentavam forma de

bastonetes gram positivos, com bordas arredondadas isola¬

das ou aos pares e com algumas formas esporuladas subter-

minais.

3.2 — Titulação da Toxina:

3.2.1 — Tripsinização do material

Após a inoculação nas condições anteriormente

mencionadas, removia-se assepticamente 5ml do

sobrenadante da cultura com evidência de cresci¬

mento, que eram centrifugados a lõ.OOOrpm a 4°C

durante 20 minutos. Após a centrifugação 2ml do

sobrenadante eram colocados em tubos de en¬

saio, eopH acertado para 6,0 com HC1 IN 10 . A

seguir adicionava-se 1% de Tripsina (Difco 1:250)

e a mistura era incubada a 37°C por 45 minutos,

com agitação nos primeiros 15 minutos e depois

mantida em repouso por trinta minutos.

3.2.2 — Testes para detecção de Toxina

Camundongos de 14 a 16g eram inoculados intra-

peritonealmente com 0,5ml do produto obtido

conforme descrito no item 3.2.1., com diluições

em série em solução-tampão de gelatina fosfata¬

da. A observação da morte dos camundongos era

feita e anotada a partir de 24 horas até um período

máximo de 96 horas.

4 — Preparação da A na toxina

Foram selecionadas toxinas com título de 100.000 DMM/camun-

dongos ou mais. A destoxificação da cultura foi obtida pela adição

de formaldeído (conc. de 37%) na concentração final de 0,5%. O

processo de destoxificação era completado na estufa a 37°C reque¬

rendo normalmente um período de incubação de 30 dias, com agita¬

ção a cada dois dias.

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5 — Prova de destoxificação

Pela inoculação de 1 ,0ml do material por via intraperitoneal em 5 ca¬

mundongos de 18 a 20g. O resultado era considerado satisfatório

quando os animais sobreviviam sem sintomas, durante um período

de vinte dias de observação. Caso os animais em testes morressem

ou apresentassem sintomas, retornávamos o produto à estufa por

mais 15 dias e repetíamos a prova. Se os sintomas persistissem era

adicionado mais 0,5% de formaldeído e levado à estufa a 37°C por

mais 10 dias e repetia-se a prova "in vivo”.

6 — Filtração da A na toxina

Era obtida por passagem seriada em filtros e membranas Millipore

de 0,45 e de 0,22 micra, respectivamente, pois o filtro 90S da AMF

reduzia o título do produto.

7 — Provas efetuadas após a filtração

7.1 — Toxicidade em cobaios: cinco cobaios de 250g recebiam cin¬

co (5,0) ml da anatoxina por via subcutânea. A prova era

considerada satisfatória desde que não ocorressem mortes

ou sintomas durante 30 dias de observação.

7.2 — Esterilidade: Em meio de Tioglicolato Brewer e Sabouraud,

onde eram semeados dois (2,0)ml do produto em 20ml do

meio.

8 — Preparação do antígeno para hiper/munização de cavalos

8.1 — As anatoxinas com o pH corrigido para 6,0 com HC1 IN

eram adicionadas de solução a 10% de sulfato duplo de

alumínio e potássio (alúmen) em água destilada. A solução

era previamente esterilizada por filtração em membrana de

0,22 micra. O volume adicionado com agitação constante

era suficiente para obter-se concentração final de alúmen de

1,25%. Verificava-se no final da adição uma variação de pH

que era corrigido a 5,8 com solução de hidróxido de sódio a

40% v/v. O precipitado resultante, após 24 horas de sedi¬

mentação, era recolhido e ressuspenso em solução salina,

suficiente para recompor o volume inicial de anatoxina. Este

procedimento era repetido quatro vezes ou até a obtenção

de sobrenaaante límpido.

8.2 — Avaliação do poder imunogênico do antígeno

Dez cobaios de 450g — 550g eram inoculados por via subcu¬

tânea com Iml de antígeno. Após 40 dias os animais eram

sangrados por punção cardíaca e os soros misturados em

volumes iguais e titulados frente à toxina padrão. Foram se¬

lecionadas as anatoxinas que induziram títulos iguais ou su¬

periores a duas Unidades Internacionais por ml no soro das

cobaias.

Antes da utilização do antígeno em cavalos, as amostras

eram selecionadas por hiperimunização de coelhos, com

inoculações subcutâneas a cada 3 dias, iniciando-se com

0,1ml na primeira dose e 0,2ml, 0,3ml, 0,4ml, 0,5ml, Iml,

1,5ml até 2,0ml nas doses subseqüentes.

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— Hiperimunização de equídeos

A antitoxina botulínica tipo E foi obtida pela hiperimunização de qua¬

tro cavalos sadios pesando cerca de 400kg, com idade média de dois

anos (304, 825, 837 e 997).

Esquemas de Hiperimunização

Foi adotada a técnica de produção de antitoxina botulínica tipos A e

B que havia dado bons resultados 20 ’ 15 .

Básico:

A sangria explorada, realizada sete dias após a última dose, indicava

quais os animais que deveriam ser sangrados. O sangue era lecebido

sobre uma solução a 17% de citrato de sódio na proporção de 10%

dessa solução em relação ao volume de sangue a ser colhido. Foram

aproveitados os animais que apresentaram níveis de anticorpos ao re¬

dor de 100 Ul/ml de soro. Após a sangria os animais eram colocados

em recuperação por 45 dias.

Hiperimunização:

Foram aproveitados para a produção de antitoxina os plasmas de ani¬

mais com níveis de anticorpos igual ou superior a 100 Ul/ml. As rei -

imunizações eram feitas sistematicamente após 45 dias de recupera¬

ção, segundo o mesmo esquema de hiperimunização.

9.1 -

9.2

Obtenção do plasma hiperimune

Após a sedimentação das hemácias por 24 horas a 4°C, o

plasma era separado e adicionado de solução de fenol, para

concentração final de 0,4g%. Os plasmas eram mantidos a

4°C até o momento do processamento.

Purificação e concentração do plasma

Obtidas por digestão enzimática segundo o método de

Pope 21 .

10 — Provas efetuadas

10.1 — Titulação de antitoxinas do plasma e soro purificado

Os plasmas e os soros purificados e concentrados eram ti¬

tulados em camundongos, de acordocom o método padro¬

nizado pelo National Institute of Health 5 , utilizando um so¬

ro padrão proveniente do "International Laboratory of Bio-

logical Standards by Statens Serum Institute", de Cope-

nhagem. A toxina de referência era preparada em nosso

próprio laboratório e padronizada frente ao soro padrão

acima mencionado, ao nível de L + /100. Esta toxina era

conservada pela adição em partes iguais soro/glicerina

neutra e mantida a -20°C.

O soro antibotulínico tipo E produzido foi diluído de modo a

conter 500 Ul/ml 5 e submetido aos controles químicos e

biológicos exigidos pela Farmacopéia Brasileira 13 .

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Como o título antitóxico obtido pela hiperimunização de cavalos está di¬

retamente relacionado à toxigênese do antígeno, procuramos selecionar as

cepas de diferentes procedências.

As cepas de Nanaimo 1E, 42E e 48E não se apresentaram tóxicas para

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o meio utilizado, enquanto que as 38E, 44E e 2E eram pouco tóxicas, titu¬

lando ao redor de 1000 DMM em camundongo. Mesmo após tripsinização,

as toxinas derivadas destas cepas apresentaram títulos ao redor de 5000

DMM, essas toxinas mesmo assim foram destoxificadas e após as provas

de inocuidade satisfatórias foram precipitadas pelo sulfato duplo de

alumínio e potássio, porém inoculadas em coelhos e cobaios para verifica¬

ção da imunogenicidade não foram satisfatórias como se esperava.

As cepas EK e EKY, que se apresentaram altamente tóxicas, ao serem

semeadas em diferentes meios de cultura a saber: Müller modificado por

Lathan, meio de Duff modificado e meio de TPGY, apresentaram compor¬

tamento muito variável, sendo que o meio de TPGY foi o que demonstrou

melhor resultado. Foi verificado também que o tempo ótimo de toxigênese

era de seis dias a 30ÍC, ocorrendo declínio a partir do 7 o dia. Após o perío¬

do de incubação a cultura era tratada com tripsina 1/250 (DIFCO) na con¬

centração final de 1 %. A elevação da toxicidade deve-se, provavelmente, à

conversão da protoxina, pela tripsina, em toxina ativa.

Ficou ainda demonstrado que o processo de filtração da toxina acarreta

perda de 90% da toxicidade, quando utilizamos a placa esterilizante 90S, a

utilização de membrana 0,45 micra e 0,22 micra (tabela 1) não altera a toxi¬

cidade do produto.

A quantidade de formaldeido a ser empregada na destoxificação varia

de acordo com o título da toxina. Levando em conta esse fato, determina¬

mos a quantidade de formaldeido necessária para completa destoxificação

sem prejuízo do poder imunogênico. (Tabela 2)

O alúmen de potássio na proporção de 1,25% como adjuvante, confir¬

mou para esta cepa os ótimos resultados verificados na obtenção de outros

soros antibotulínicos. O poder imunogênico da toxina derivada da cepa EK

foi testado em cobaios e coelhos, apresentando títulos ao redor de 16

Ul/ml e 50 Ul/ml respectivamente.

Estabelecidos os parâmetros passamos a produzir a toxina botulinica

em maior escala, e os lotes preparados e respectivos títulos constam na ta¬

bela 2. Foi utilizada a cepa EK que possuía todas as características necessá¬

rias para a produção do soro antibotulínico tipo E. A anatoxina proveniente

do filtrado tóxico e tratado pelo formaldeido e pelo sulfato duplo de

alumínio e potássio é a que foi utilizada na imunização de eqüídeos para a

produção do plasma antibotulínico, o qual concentrado e purificado pelo

método de Pope apresentou resultado satisfatório.

A tabela 3 mostra o resultado do doseamento do soro antibotulínico es¬

pecífico, onde os níveis antitóxicos atingiram os valores de cerca de 1000

Ul/ml.

Finalmente este soro purificado e concentrado era diluído conveniente¬

mente para apresentar 500 Ul/ml de antitoxina tipo E, de acordo com as re¬

comendações estabelecidas na XV Seção de Expert. Committee on Biolo-

gical Standartization da OMS.

CONCLUSÕES

Considerando os resultados obtidos na produção de soro antibotulínico

tipo E concluímos que:

a) das oito amostras de Cl. botulinum testadas somente a EK e a EKX

mostraram-se adequadas produzindo toxinas titulando cerca de 1 x 10 5 a 4

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x 10 5 DMM para camundongo

b) dos três meios de cultura testados, verificamos que o meio TPGY foi

o melhor

c) a tripsinização é importante na ativação da toxigênese do material

produzido

d) é recomendada a filtração da toxina em membrana inerte de 0,22 mi¬

cra

e) a quantidade de formaldeído necessária à destoxificação de toxina

por nós obtida foi de 0,5% a 0,6% conforme o título, ocorrendo a transfor¬

mação em anatoxina ao redor de 30 a 45 dias a 37°C

f) a mistura de plasmas resultante de diversas imunizações permitiu ob¬

ter soro purificado e concentrado cujo título atingiu níveis da ordem de 750

a 1.000 Ul/ml

g) esta primeira produção de soro antibotulínico tipo E para fins tera¬

pêuticos, no Brasil, abriu a possibilidade de obtenção do soro tipo ABE,

que já consta da lista de soros hiperimunes produzidos no Instituto Butan¬

tan.

TABELA 1

Demonstração de perdas de toxina pela utilização de

diferentes tipos de filtros: de profundidade e membrana inerte.

Lote

Título antes

da filtração

em DMM

Título após

filtração em

90 S em DMM

Título após

filtração em

membrana inerte,

em DMM

100.000

10.000

100.000

300.000

10.000

300.000

400.000

12.000

380.000

200.000

20.000

200.000

TABELA 2

Atividades destoxificante de diferentes concentrações de

formaldeído, relacionadas ao título tóxico do produto.

Destoxificação

Título da

a 37° C após 30

Lote

Toxina em DMM

Formaldeído %

ou 45 dias

1/82

200.000

5,0

2/82

100.000

5,0

3/82

100.000

5,0

4/82

300.000

6,0

5/82

150.000

5,0

6/82

300.000

6,0

1/83

500.000

6,0

2/83

600.000

6,0

3/83

400.000

6,0

4/83

600.000

6,0

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TABELA 3

Níveis de antitoxina botulinica tipo E, obtidos em

quatro cavalos, após a purificação".

Lotes dos soros

antibotulínicos

tipo E

Título em

Ul/ml

Tempo de observação em horas

24 48 72 96

Soro Dialisado

500

0/4

1-85-8

600

0/4

1/4

2/4

800

1/4

3/4

Soro Dialisado

300

0/4

1-84-54

600

0/4

1000

0/4

Soro Dialisado

500

0/4

2-83-78

600

0/4

800

0/4

4/4

—

' Dose individual de 0,5ml das misturas de toxina e antitoxina, pela via intraperitonial, em camundongos de 18g a 22g,

sendo a toxina ao nível de 0,01 L + , frente ao soro padrão internacional.

ABSTRACT: The present paper describes the method employed in the

preparation of Clostridium botulinumXype E antitoxin by horse hyperimu-

nization with mixed alum potassium adsorbed antigen, that was the

schema used in production of type A botulinum antitoxin. After Pope s

method of purification and concentration the final titres reached values

of 750 to 1.000 Ul/ml.

KEYWORDS: Botulism; Clostridium botulinum Type E food poisoning,

toxin, toxoid and antitoxin.

AGRADECIMENTOS

Ao Dr. Rosalvo Guidolin, pelas sugestões e pelo seu espírito de colabo¬

ração, que, sem medir esforços, revisou este trabalho, e ao Sr. Silvio de

Jesus pela colaboração no preparo de meios de cultura e nas inoculações

dos doseamentos.

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Mem. Inst. Butantan

51 (1): 15-24, 1989.

SOBRE A EVOLUÇÃO DE ASCARIS LUMBRICOIDES LINNAEUS,

1758, NA FASE LARVAR ENDOVULAR*

Paulo de Toledo ARTIGAS

MarleneTiduko UETA

RESUMO: Ovos de A. lumbricoides colhidos em fezes humanas foram

cultivados em solução de formol a 1 %, em temperatura ambiente (270.

Foi observado, durante o decurso do experimento, que larvas Ç apare¬

cem, em média, após 12,7 dias; larvas l _2 surgem aos 15,7 dias e a segun¬

da muda ocorre ao redor de 18,3 dias, ocasionando a formação da larva

infectante L 3 , que ainda permanece dentro do ovo. Ovos de culturas de

10 a 25 dias foram utilizados para infectar 80 camundongos albinos

Swiss, machos e fêmeas. Os camundongos foram separados em 16 gru¬

pos de 5 indivíduos; os componentes desses grupos foram infectados,

sucessivamente, dia a dia; o primeiro grupo com ovos de cultura de 10

dias, o segundo com ovos de 11 dias e, assim, sucessivamente, até o 16?

grupo que recebeu ovos com 25 dias de cultura. A partir do terceiro dia

pós-infecção, um camundongo, de cada um dos 16 grupos, foi sacrifica¬

do; isso foi feito em 5 dias subseqüentes, para cada grupo. Foi realizada,

nos animais sacrificados, a necrópsia com finalidade parasitológica, vi¬

sando a pesquisa de larvas. Larvas migrantes foram encontradas no fíga¬

do e pulmões nos camundongos dos grupos que receberam ovos com,

pelo menos 18 dias de cultura. Tal resultado comprova, cabalmente, que

somente os ovos com larvas L 3 são infectantes.

UNITERMOS: Ascaris lumbricoides, desenvolvimento do ovo, camun¬

dongo

INTRODUÇÃO

É, na verdade, muito curioso, em se tratando de um parasita extrema¬

mente freqüente e intensamente estudado, que não exista uniformidade

entre os autores, no que se refere à evolução do Ascaris lumbricoides

Linnaeus, 1758, na fase endovular.

Brumpt 5 , em seu tratado de Parasitologia, ao se referir ao desenvolvi¬

mento da larva do Ascaris lumbricoides, dentro do ovo, afirma que ela so¬

fre uma, ou talvez duas mudas.

Há um trabalho de Henner 6 , citado por Araújo 6 , em que aquele pesqui¬

sador, ao infectar camundongos com ovos de Ascaris suum, observava

que os seus roedores somente apareciam infectados quando as larvas en-

dovulares já tinham realizado duas ecdises.

UNICAMP, Instituto de Biologia, Departamento de Parasitologia, Caixa Postal 6109, 13081, Campinas, SP, Brasil.

'Auxílio FAPESP

Recebido para publicação em 12/5/1988 e aceito em 3/11 /1988.

SciELO

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ARTIGAS, P. de T & UETA, M.T. Sobre a evolução de Ascaris lumbricoides Linnaeus, 1758, na fase

larvar endovular. Mem. Inst. Butantan, 51 (1): 15-24, 1989.

Schacher 9 , com Toxocara canis, verificou, em pequeno percentual de

larvas, em cultura de ovos, a presença de uma bainha cuticular se sobre¬

pondo à cutícula da primeira ecdise. Schacher 9 , todavia, não interpretou o

fato como demonstrativo da ocorrência da segunda ecdise, mas como uma

cutícula intumescida e simulando duas camadas.

Thust 10 , utilizando microscopia eletrônica, relata a presença de uma se¬

gunda muda na larva endovular de Ascaris lumbricoides, que ocorreria em

ovos, 18 a 20 dias após o início do desenvolvimento, conservados a tempe¬

ratura de 28C.

Na década de 70, com as publicações de Araújo 1 ' 2 - 3 ' 4 e de Maung 7 , fi¬

cou bem comprovada a ocorrência da segunda ecdise intra-ovular em dife¬

rentes ascarídeos.

Outro aspecto que merece ser focalizado é o tempo necessário, no

meio exterior, para que a larva intra-ovular do A. lumbricoides se torne efe¬

tivamente infectante.

Roberts 8 , em pesquisa que se tornou clássica e em que se fundamen¬

tam autores de livros de texto de Parasitologia, observou que os ovos larva¬

dos de Ascaris lumbricoides somente se tornam infectantes depois de, pelo

menos, 20 dias de permanência no meio exterior.

Maung 7 verificou em camundongos, que a infecção somente se positi¬

va quando são utilizados ovos de cultura de 20 dias.

Ao dar início à presente pesquisa, era nosso escopo deixar bem confir¬

mado qual o período, no meio exterior, necessário para que estivesse de¬

senvolvida a larva infectante do Ascaris do homem e que, sem dúvida, a in¬

fecção do hospedeiro definitivo se processa com a ingestão da l_ 3 .

MATERIAL E MÉTODOS

7. Cultura de ovos

Fezes humanas, com ovos de A. lumbricoides, foram obtidos no Insti¬

tuto Adolfo Lutz, Laboratório Regional de Campinas, SP.

As fezes foram desmanchadas em água de torneira e processada a con¬

centração de ovos, em cálices cônicos e através de peneira com malhas de

400Mm. Uma vez concentrados, os ovos foram transferidos para uma solu¬

ção de formol a 1 % e mantidos na geladeira a aproximadamente 40.

Inicialmente, foram feitas culturas em estufa a 27C e em temperatura

ambiente (24-270; como não tivesse sido observada diferença na forma¬

ção das larvas, em um ou outro modo de agir, passou-se a utilizar somente

culturas em meio ambiente.

Foram efetuadas, diariamente, durante 25 dias consecutivos, a partir do

sexto dia de cultura, observações em microscopia direta e em contraste de

fase, para se acompanhar o processo evolutivo da larva.

Uma vez verificada a presença de ovos larvados, eram eles submetidos

à ligeira pressão, entre lâminas de vidro, para se provocar a ruptura da cas¬

ca do ovo e a exteriorização da larva.

As larvas exteriorizadas foram examinadas dia a dia, para a constatação

da presença de cutícula ou cutículas destacadas.

A verificação da sucessão de ecdises larvárias (L 1( L 2 e L 3 ), em função

do tempo, é o resultado de observação, aproximada, de 100 ovos por dia,

nos períodos citados; esta prática permitiu a informação sobre o "número

médio de dias" necessário para a evolução do nematódeo.

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ARTIGAS, P. de T & UETA, M.T. Sobre a evolução de Ascaris lumbricoides Linnaeus, 1758, na fase

larvar endovular, Mem. Inst. Butantan,51 (1): 15-24, 1989.

Larvas, em fases sucessivas da experiência, foram fotografadas e medi¬

das com auxílio da câmara clara.

2. Infecção de camundongos

Oitenta camundongos foram distribuídos em grupos de 5 e feita sua in¬

fecção, a partir do décimo dia de cultura de ovos, até o vigésimo quinto

dia. Formaram-se, portanto, 16 grupos de camundongos infectados diaria¬

mente.

Foram utilizados camundongos jovens Swiss, machos e fêmeas, com

peso aproximado de 15g. A infecção se fez com emprego de sonda fina de

borracha, introduzida pelo esôfago. Cada camundongo recebeu cerca de

200 ovos.

A partir do terceiro dia pós-infecção, foram sacrificados os camundon¬

gos dos 16 grupos, sucessivamente em 5 dias, um em cada dia. Os animais

foram colocados em ambiente saturado de éter e processada a pesquisa

parasitológica, visando o encontro de larvas em migração. Nas necropsias

fez-se tal pesquisa no sangue, nódulos linfáticos, coração, intestino, fígado

e pulmões.

Os órgãos examinados, à parte o sangue observado a fresco, entre lâ¬

mina e lamínula, eram dilacerados com estilete e pinça, em solução salina.

Positivada a presença de larvas, estas eram colhidas, procurando-se

obter o maior número delas, em cálices cônicos. A seguir, as larvas eram fi¬

xadas em líquido de Railliet-Henry, a quente e, posteriormente, examina¬

das e medidas.

Atuando dessa maneira, foi possível verificar, com segurança, o núme¬

ro de dias exigidos para que a larva endovular se torne infectante e qual,

efetivamente, é a larva infectante.

RESULTADOS

7. Cultura de ovos

O aparecimento de larvas se verificou na totalidade dos ovos. Ao fim de

uma média de 12,7 dias de cultura, já eram observadas as primeiras larvas.

A primeira larva (L-|) é muito frágil e se esfacela com facilidade. Apre¬

senta a cutícula lisa, desprovida de qualquer ectoformação; seu tubo diges¬

tivo ainda não está bem definido, sendo pouco precisa a diferenciação do

esôfago e do intestino. Nota-se que a extremidade proximal é ligeiramente

"aparada", tendendo para a condição de extremidade truncada (fig. 1 ).

Verifica-se, ainda, na extremidade oral a presença de uma formação estile-

tiforme, mais quitinisada e que acompanha a cutícula, quando esta se des¬

taca, ao aparecer a L 2 ; é ainda visível, quando a L 2 já se encontra definida;

a cauda termina em ponta e é mais curta que a cauda da L 2 ou da L3.

A L 2 aparece, em média, ao redor de 15,7 dias, na cultura mantida em

temperatura ambiente; a identificação de L 2 se comprova pela presença da

cutícula da Lt (fig. 2). A larva L 2 é mais robusta, resistindo melhor à com¬

pressão entre lâminas; é freqüente a presença, em sua extremidade proxi¬

mal, de uma disposição em forma de calota. Na microscopia direta, ainda

oferece dificuldade 0 exame da organologia interna; porém, em contraste

de fase, já se destaca bem o esôfago diferenciado.

A L 3 começa a surgir, em média, aos 18,3 dias de cultura, em tempera¬

tura ambiente e tem como caráter essencial a presença das cutículas de Li

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ARTIGAS, P. de T & UETA, M.T. Sobre a evolução de Ascaris lumbricoides Linnaeus, 1758, na fase

larvar endovular. Mem. Inst. Butantan, 51 (1): 15-24,1989.

Figura 2 — Larva L 2 , com uma cutícula descolada. Aumento 222x

Aumento 113x.

Figura 1 — Larva L-) —

2 3 4

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ARTIGAS, P. de T & UETA, M.T. Sobre a evolução de Ascaris lumbricoides Linnaeus, 1758, na fase

larvar endovular, Mem. Inst. Butantan, 51 (1): 15-24, 1989.

Figura 3 — Larva L 3 , com duas cutículas descoladas.Aumento463x.

Figura 4 — Larva L 4( com três cutículas descoladas.Aumento 445x.

ARTIGAS, P. de T & UETA, M.T. Sobre a evolução de Ascaris lumbricoides Linnaeus, 1758, na fase

larvar endovular. Mem. Inst. Butantan, 51 (1): 15-T14, 1989.

e de L 2 , descoladas e "vestindo" a L 3 (fig. 3). A organologia interna desta

larva é observada com maior facilidade na microscopia de fase, que põe em

destaque o tubo digestivo, com esôfago e intestino diferenciados. Encon-

trou-se certa dificuldade em diferenciar as larvas l _ 2 das L 3 , quando ambas

se mostravam nuas, isto é, sem as cutículas descoladas das fases prece¬

dentes. Isto se deve, às escassas modificações morfológicas, na passagem

do segundo para o terceiro estágio. Segundo Araújo? não existem caracte¬

res diferenciais entre os dois estágios, exceto a evidência das cutículas des¬

coladas.

Tivemos ensejo de observar, uma única vez, uma larva com três cutícu¬

las descoladas, portanto em L 4 (fig. 4); este achado anormal, em nosso ex¬

perimento, foi verificado em uma cultura em meio ambiente, ao fim de 21

dias.

Foram medidas larvas em cultura de 23, 28, 35 e 45 dias; os resultados

de tais medidas estão apresentados na Tabela 1. Nesta Tabela, também

aparecem dados relativos à temperatura ambiente, anotados no decorrer

do desenvolvimento dos ovos.

TABELA 1

Medidas de larvas de Ascaris lumbricoides de cultura, em solução formulada a 1 %,

mantidas em temperatura ambiente.

(Medidas médias de 30 larvas em mm; temperatura média em C).

Temperatura

ambiente

média (C)

N? de dias

de cultura

medida do comprimento

e largura (mm)

(média aritmética)

tamanho mínimo e

tamanho máximo

(comprimento e largura)

26,9

0,2357x0,0131

0,1951 a 0,2682

comprimento

0,0097 a 0,0146

largura

26,9

0,2414x0,0129

0,1951 a 0,2926

comprimento

0,0097 a 0,0146

largura

26,7

0,2446x0,0132

0,1951 a 0,3414

comprimento

0,0097 a 0,0170

largura

27,7

0,2373 x 0,0137

0,1951 a 0,2926

comprimento

0,0097 a 0,0195

largura

2. Infecção de camundongos

Esta operação visou, sobretudo, comprovar ser, realmente, a L 3 a larva

infectante.

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ARTIGAS, P. de T & UETA, M.T. Sobre a evolução de Ascaris lumbricoides Linnaeus, 1758, na fase

larvar endovular. Mem. Inst. Butantan, 51 III: 15-24, 1989.

Nos camundongos dos grupos 1 a 8, infectados com material de cultura

de menos de 18 dias, foi constantemente negativo o encontro de larvas mi¬

grantes.

A partir das infecções com material de cultivo com 18 ou mais dias, os

camundongos passaram a apresentar larvas migrantes no fígado. Na Tabe¬

la 2, estão assinaladas as larvas colhidas no fígado.

O encontro de larvas nos pulmões se verifica, e passa a ser constante a

partir do quarto dia de pós-infecção; à medida que cresce o número de lar¬

vas nos pulmões, decresce o número de larvas no fígado; esta observação

confirma, no camundongo, a passagem prévia das larvas do intestino para

o fígado e deste órgão para o pulmão.

As larvas recolhidas do fígado medem, em média, 0,35mm a 0,92mm

(Tabela 2); quanto mais tardia a colheita, maiores eram as larvas.

Nos pulmões, larvas colhidas no quarto dia pós-infecção mediam, em

média, 0,51 mm; no oitavo dia pós-infecção, atingiam a 1,29mm (Tabela 3).

Resumindo o aspecto biológico do experimento, é possível afirmar o se¬

guinte: nos quarto e quinto dias pós-infecção é maior o número de larvas

no fígado do que nos pulmões; as larvas pulmonares colhidas nos quarto e

quinto dias pós-infecção são de tamanho semelhante ao das larvas hepáti¬

cas e vão se tornando maiores nos dias subseqüentes; as Tabelas 2 e 3 ilus¬

tram estas observações. Somente as inoculações com culturas de, pelo

menos, 18 dias, em temperatura ambiente, ao redor de 24 a 27C, são positi¬

vas; culturas de menos de 18 dias, não dão ensejo à presença de larvas no

camundongo.

No nosso experimento, o encontro de larvas no sangue, nódulos linfáti¬

cos, coração e intestino foi sempre negativo em todos os camundongos

examinados.

DISCUSSÃO

São, decididamente, as tradicionais observações de Roberts 8 que vêm

servindo de suporte aos tratadistas, para as informações,em livrosde texto.

Tais informações, à luz das recentes pesquisas, destacando-se as de Araú¬

jo 2 e de Maung 7 e as apresentadas nesta publicação, devem ser atualiza¬

das, pois modificam a noção biológica de Roberts 8 , até agora consolidada,

na sua aparência, como definitiva.

Roberts 8 observou que a infecção experimental de camundongos so¬

mente se positiva quando os ovos de A. lumbricoides têm, pelo menos,

mais de 18 dias de vida no meio ambiente.

Vários pesquisadores realizaram trabalhos em que estudaram a infec¬

ção experimental de camundongos com ovos de A. lumbricoides, visando,

sobretudo, esclarecimentos sobre os estágios larvários; nem sempre foram

bem-sucedidos. Mas, ficou comprovada a necessidade de um tempo míni¬

mo de permanência dos ovos no meio exterior para que a infecção fosse

positiva; neste período, no meio externo, desenvolve-se o processo larvário

intra-ovular.

Verificou-se, neste trabalho, a seqüência biológica da larva do A. lum¬

bricoides: o ovo é eliminado do hospedeiro sem apresentar diferenciação

da futura larva; esta se corporifica ao fim de, aproximadamente, 12,7 dias

(Li); ao fim de 15,7 dias, aparece a l_ 2 ; ao redor de 18,3 dias, se positiva a

l_ 3 - caracterizada pela presença de duas cutículas, reliquat de L] e L 2 .

SciELO

ARTIGAS, P. de T & UETA, M.T. Sobre a evolução de Ascaris lumbricoides Linnaeus, 1758, na fase

larvar endovular. Mem. Inst. Butantan, 51 (1). 15-24, 1989.

TABELA 2

Medidas (comprimento x largura) em mm das Ascaris lumbricoides, colhidas no fígado de

camundongos, em dias subseqüentes de pós-infecção. Os números representam a média de 10

larvas (exceto nos assinalados).

Grupo

3 o dia

4 o dia

5 o dia

6 o dia

7 o dia

8 o

dia

0,0 x 0.0' 51

0,6015 xO.0308 13 '

0.9268 x 0,0439'"

0,0 x 0,0

0,0

x 0,0

—

0,4633 x 0,0223

0,6682 x 0,0284

0,7145x0,0397

0,7743 x 0,0353™

0,3194x0,0170

0.4389 x 0.0243 12 ’

0,6438 x 0,0289

0,7536 x 0,0358

0,7072x0,0377

0,3487x0,0190

0,4633 x 0,0238

0,6023 x 0,0304

0.7121 x 0,0341

0,8609 x 0,0441

0,3170x0,0165

0,4902 x 0,0282

0,6633 x 0,0350

0,7097x0,0336

0,7877x0,0397

0,3243 x 0,0192

0,4438 x 0,0245

0,6072 x 0,0314

0,7584 x 0,0407

—

0,9975

x 0.0499

0,3950 x 0,0207

0,5462 x 0,0277

0,7267x0,0331

—

0,8731 x 0,0387

0,9219

x 0,0392

0,3975x0,0197

0,5023 x 0,0248

0,8975 x 0,0392

0,8902 x 0,0414

0,8316

x 0,0404

0,3503 x 0,0186

0,4782 x 0,0250

0,6447 x 0.0311

0.7818 x 0.0381

0,8155 x 0,0394

0.9170

x 0.0431

(1) medida de uma única larva

(2) média de 2 larvas

(3) média de 3 larvas

(4) média de 4 larvas

(5) ausência de larvas

TABELA 3

Medidas (comprimento x largura) em mm das larvas de Ascaris lumbricóides, colhidas no pulmão

de camundongos, em dias subseqüentes de pós-infecção. Os números representam a média de 10

iarvas (exceto nos assinalados).

Grupo

3 o dia

4 o dia

5 o dia

6 o dia

7 o dia

8 o dia

0.0 x 0.0

0,0 x 0,0

1,5121 x 0,0829"’

—

0,0 x 0.0

0.0 x 0,0

0,5438x0,0199

1,0487x0.0492

1,2397 x 0.0658""

0,0 x 0.0' 51

0,0 x 0,0

0.8755 x 0,0438

0,8041 x 0,0460

0,0 x 0,0

0,2926x0,0195'"

0,7438 x 0,0304 121

0,8536 x 0,0487

0,9389 x 0,0548

—

0,0 X 0,0

0.5853 x 0,0292"’

0,7365x0,0377

0,8097x0,0431

1,0292 x 0,0565

0,0 x 0.0

0.7560 x 0.0377 12 ’

0,4999 x 0.0267' 1 2 * 4 5 * ’

0,8487 x 0,0409

1.2975 x 0,0684

n.m. <31

0,4023 x 0.0170 121

0,6829 xO.0357 131

0,9950 x 0,0514

1,4853 x 0,0709

0,0 x 0.0

n.m. m

0,9414 x 0,0428

0,9999 x 0,0526

0,9121 x 0,0477

0,5090 x 0,0258

0,6657x0,0326

0,8121 x 0,0398

0.9693 x 0,0517

1,2893x0,0671

(1) medida de uma única larva

(2) média de 2 larvas

13) média de 3 larvas

(4) média de 6 larvas

In.m.l nào medido

(5) ausência de larvas

Uma vez formada a L 3 , esta não necessita de um período de amadureci¬

mento para se tornar infectante. Não obstante, constatou-se que larvas L 3

de mais idade, por exemplo 63 dias, chegam ao fígado dos camundongos

24 horas após a ingestão do ovo. Tai verificação está de acordo com a de

Maung 7 , de que larvas de culturas mais velhas eclodem, no tubo digestivo

de camundongos, mais precocemente. A L 3 liberada do ovo no tubo diges¬

tivo do camundongo, despoja-se das cutículas e se localiza no fígado, 24 a

72 horas após a ingestão do ovo; do fígado passa para o pulmão, onde atin¬

ge dimensão avantajada (no presente experimento, até 1,29mm), de onde

se transfere, via árvore brônquica, traquéia, esôfago, estômago, para o in¬

testino delgado.

As larvas começam a aparecer no fígado poucas horas após a ingestão

oral; permanecem neste órgão de 5 a 7 dias; no sétimo dia, neste experi¬

mento, ainda eram encontradas larvas em número razoável.

SciELO

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ARTIGAS, P. de T. & UETA, M.T. Sobre a evolução de Ascaris lumbricoides ünneu, 1758, na fase lar¬

var endovular. Mem. Inst. Butantan, 51 (11:15-24, 1989.

CONCLUSÃO

1. É no meio externo, ao fim de cerca de 18,3 dias, que se processa a

segunda ecdise larvar, dando origem à larva L 3 .

2. O ovo de A. Lumbricoides torna-se infectante somente quando con¬

tém uma larva que sofreu duas mudas. Assim, à semelhança do que acon¬

tece com os nematódeos em geral, a larva infectante do A. lumbricoidesé

a L 3 .

3. A larva L 3 , após diferenciação, está imediatamente apta para infectar

o hospedeiro definitivo. Não obstante, larvas L 3 de culturas mais velhas são

encontradas, em condição experimental, no fígado de camundongos, mais

precocemente.

ABSTRACT: Eggs of A. lumbricoides obtained from human feces were

cultured in 1 % formaldehyde solution at room temperature (27C). It was

observed that during this period l_i larvae were formed inside the egg af-

ter 12,7 days in average. L 2 larvae appeared in 15,7 days and the second

molt occurred in about 18,3 days, causing the formation of infective l_ 3

larvae, which also remained within the egg. Cultured eggs, 10 to 25 days

old were then used to infect 80 young albine Swiss mice, males and fe-

males. The mice were divided in 16 groups of 5 animais, and each group

was infected once. The infection was performed daily and the first group

was infected with 10 day-old eggs. The last group (16) received 25 day-

old eggs. Since the third day after infection, one individual of the group

was killed each day consecutively for five days and larvae were searched

in a parasitologicai necropsy. Wandering larvae were found in the liver

and lungs only in those groups infected with eggs cultured for at least 18

days. These results showed that only the eggs which have l_ 3 larvae are

infective to the host.

KEYWORDS: Ascarislumbricoides, egg development, mice.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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2 3 4

SciELO

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Mem. Inst. Butantan

51 (11:25-32, 1989.

ESTUDO COMPARATIVO ENTRE OS VENENOS DE SERPENTES

DO GÊNERO BOTHROPS, PROCEDENTES DO ESTADO DE SÁO

PAULO E DO ESTADO DO PARANÁ COM ALGUMAS ESPECIES

MORFOLOGICAMENTE DUVIDOSAS

Maria Amélia Lopes PERRONE*

Medardo SILES VILLARROEL*’

Maria de Fátima Domingues FURTADO*’

RESUMO: Os venenos de serpentes Bothrops moojeni, Bothrops neu-

wiedie Bothrops jararacussu procedentes do Estado de São Paulo, fo¬

ram comparados com os venenos das mesmas espécies procedentes da

região de Itaipu, Estado do Paraná e de alguns exemplares de serpentes

de Itaipu com características morfológicas entre B.moojenie B.neuwie-

die entre B.moojeni e B.jararacussu. Os parâmetros analisados foram:

letalidade, eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS, imunodifu-

são e imunoeletroforese. Os valores da DLçq dos venenos das espécies

B.moojeni e B.neuwiedi, não apresentam diferenças significativas

quanto à letalidade; contudo, os venenos de B. jararacussu apresentam

diferenças, sendo que os espécimes de São Paulo possuem letalidade

mais elevada em relação aos de Itaipu. Os venenos de B.moojeni e B.

neuwiedi procedentes das duas regiões não apresentaram variações em

seus padrões eletroforéticos, já os venenos de B.jararacussu

apresentaram algumas diferenças nos eletroferogramas. Os exemplares

de serpentes de Itaipu com características morfológicas entre B.mooje¬

ni e B.neuwiedi (Bothrops sp 1) e entre B.moojeni e B.jararacussu

(Bothrops sp 2), quanto ao perfil eletroforético, assemelham-se ao ve¬

neno da espécie B.moojeni. A análise dos componentes imunogênicos

dos venenos das três espécies, através das técnicas de imunodifusão e

imunoeletroforese, não apresentam variações apreciáveis.

UNITERMOS: — Letalidade, imunoquímica, venenos botrópicos.

INTRODUÇÃO

Trabalhos anteriores demonstraram que ocorrem variações intraes-

pecíficas na composição dos venenos, em função da distribuição geográfi¬

ca (Jiménez-Porras, 1964, 1967; Aragon & Gubensek, 1981; Glenn et al,

1983; Rael etal, 1984).

* Bolsista da FUNDAP - Seção de Venenos do Instituto Butantan.

•• Professor Adjunto do Departamento de Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São

Paulo.

* * * Pesquisador Científico da Seção de Venenos do Instituto Butantan.

Endereço para correspondência: Departamento de Imunologia - Edifício Biomédicas III - Cidade Universitária -

CEP05508 - São Paulo - Brasil.

Instituto Butantan — CP 65-01051 — São Paulo — Brasil.

Recebido para publicação em 29-3-1988 e aceito em 3-11-1988.

SciELO

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PERRONE, M.A.L.; SILES VILLARROEL, M.; FURTADO, M. de F.D. Estudo comparativo entre os ve¬

nenos de serpentes do gênero Bothrops, procedentes do Estado de São Paulo e do Estado do Para¬

ná com algumas espécies morfologicamente duvidosas. Mem. Inst. Butantan, 51 :(1):25-32, 1989.

Estas variações bioquímicas e farmacológicas mostram diferenças sig¬

nificativas em algumas propriedades tais como a letalidade, atividade enzi-

mática, padrões eletroforéticos, efeitos locais, reações imunológicas e ou¬

tras (Minton, 1967, 1975; Fiero et al, 1972; Bonilla et al, 1973; Gutiérrez &

Chaves, 1980).

O gênero Bothrops, com ampla distribuição pelas Américas Central e

do Sul, é o grupo de serpentes peçonhentas mais importante em número

de espécies e densidade populacional, sendo responsável por aproximada¬

mente 90% dos acidentes ofídicos na casuística do Hospital Vital Brasil

(Instituto Butantan, Hospital Vital Brazil, 1982).

Há poucos estudos comparativos dos venenos, relativos à distribuição

geográfica destes animais, no território nacional (Gonçalves & Vieira, 1950;

Gonçalves & Deustsch, 1956, Schenberg, 1959).

Contando com centenas de serpentes capturadas durante o represa-

mento das águas da Usina de Itaipu, no Estado do Paraná, e classificadas

no Instituto Butantan como pertencentes às espécies Bothrops moojeni,

Bothrops neuwiedie Bothrops jararacussu, e alguns exemplares que apre¬

sentavam características morfológicas entre Bothrops moojeni e Bothrops

neuwiedi e outros entre Bothrops moojeni e Bothrops jararacussu,

propusemo-nos a estudar comparativamente os venenos dos animais per¬

tencentes a esta região com os venenos das mesmas espécies procedentes

do Estado de São Paulo, quanto à:

1. Determinação da letalidade dos venenos em camundongos inocula¬

dos pela via intraperitoneal e seus resultados expressos em DL 50 ;

2. Verificação do perfil eletroforético em gel de poliacrilamida com

SDS, dos venenos;

3. Verificação dos componentes imunológicos, através das reações de

imunodifusão e imunoeletroforese.

MATERIAIS E MÉTODOS

1. Venenos utilizados

Foram utilizados os venenos das espécies de serpentes B.moojeni

(Hoge, 1965); B.neuwiedi (Wagler in Spix, 1924) e B.jararacussu (Lacerda,

1884) procedentes do Estado de São Paulo e de Itaipu (Noroeste do Estado

do Paraná); e desta mesma procedência os venenos dos espécimes que

apresentam características morfológicas entre B.moojeni e B.neuwiedi

denominados por nós Bothrops sp 1 e os venenos de espécimes com ca¬

racterísticas do B. moojeni e B. jararacussu denominados de Bothrops sp2.

Estes venenos foram obtidos de vários exemplares adultos, por extração

manual, secos à vácuo e mantidos na geladeira a ± 4°C, fornecidos pela

Seção de Venenos do Instituto Butantan.

Os venenos foram preparados a 1 % em solução salina estéril a 0,85% e

centrifugados a 5000 rpm durante 20 minutos a 15°C, para eliminar even¬

tuais impurezas em suspensão. Os sobrenadantes foram distribuídos em

tubos de ensaio, em volumes de Iml cada e mantidos, no congelador, a —

25° C.

No momento do uso, procedia-se ao descongelamento.

2. Determinação da letalidade dos venenos

2.1. Animais utilizados, via de inoculação e volume inoculado

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PERRONE, M. A.L.; SILESVILLARROEL, M.; FURTADO, M. de F.D. Estudo comparativo entre os ve¬

nenos de serpentes do gênero Bothrops, procedentes do Estado de São Paulo e do Estado do Para

ná com algumas espécies morfologicamente duvidosas. Mem. Inst. Butantan, 51:111:25-32, 1989.

Empregamos camundongos brancos (Mus musculus Linnaeus, 1758),

Swiss Webster, de ambos os sexos, adultos jovens pesando 20 ± 2 gra¬

mas, procedentes do Biotério Central do Instituto de Ciências Biomédicas

da USP, considerados animais convencionais, nos quais inoculamos 0,5ml

de cada dose, pela via intraperitoneal. Os lotes de camundongos foram em

número de cinco por dose.

2.2 — Período de observação

Os camundongos foram observados nos períodos de 24 horas e 48 ho¬

ras após as respectivas inoculações.

2.3 — Cálculo da DL50

A determinação da toxidade dos venenos estudados foi calculada atra¬

vés do método de Spearman-Karber, descrito e recomendado pela OMS

(1981).

3. Eletroforese, imunodifusão e imunoeletroforese

3.1 - Para a eletroforese em gel de poliacrilamida em placa, utilizou-se

basicamente o método preconizado por Laemmli (1970), que consiste, em

linhas gerais, de um gradiente em acrilamida de 8-16%, com SDS, aplican¬

do-se 20 microlitros (200 ug) de solução de veneno em cada canaleta. Sub¬

meteu-se a 200V, corrente de 7,5mA inicial, seguida de 15mA durante 6

horas. O gel foi corado com Coomassie Brilhant Blue-R250 durante 24 ho¬

ras, descorado com solução de etanol, ácido acético e água (1:2:20), e

conservado em solução de ácido acético a 7%.

Para a densitometria, a placa de gel foi fotografada em Kodalit, proce¬

dendo-se a leitura no densitômetro Ata 60, filtro 500mV, abertura 7 e velo¬

cidade de lOOmm por minuto.

3.2 — Para a imunodifusão e imunoeletroforese foi utilizado 0 método

descrito por Siles Villarroel (1972); Siles Villarroel etal. (1974).

RESULTADOS

Os resultados da letalidade dos oito venenos estudados, provenientes

do Estado de São Paulo e Itaipu (Paraná), constam na Tabela I.

TABELA I

Resultados da DL 50 obtidos pelo método de Spearman-Karber

dos venenos estudados.

Veneno das

Espécies

Procedência

DL50 -

ug/camundongo

Spearman-Karber

Variação

95% de confiança

B. moojeni

São Paulo

115,81

99,69 -

134,54

B. moojeni

Itaipu

110,07

98,66 -

112,80

B. neuwiedi

São Paulo

46,64

41,34 -

52,62

B. neuwiedi

Itaipu

58,33

52,03 -

65,40

B.jararacussu

São Paulo

78,25

72,84 -

84,06

B.jararacussu

Itaipu

116,68

105,68 -

128,82

Bothrops sp 1

Itaipu

137,40

123,34 -

153,07

Bothrops sp 2

Itaipu

123,38

118,05 -

128,96

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PERRONE, M.A.L.; SILES VILLARROEL, M.; FURTADO, M. de F.D. Estudo comparativo entre os ve¬

nenos de serpentes do gênero Bothrops, procedentes do Estado de São Paulo e do Estado do Para¬

ná com algumas espécies morfologicamente duvidosas. Mem. Inst. Butantan, 51:111:25-32, 1989.

A Tabela 1 resume os valores das DL 50 , quanto à letalidade dos vene¬

nos. Segundo o método de Spearman-Karber, os valores expressos com

os intervalos de confiança de 95% demonstram que não encontramos dife¬

renças significativas quando comparamos os venenos de Bothrops moojeni

de São Paulo e Itaipu; 0 mesmo ocorreu com os venenos de Bothrops neu-

wiedi.

Encontramos diferenças bastante significativas, quando comparamos

os valores da DL 50 dos venenos de Bothrops jararacussu de São Paulo e

Itaipu.

A letalidade dos venenos dos exemplares com características morfoló¬

gicas entre B. moojeni e B.neuwiedi (denominado por nós de Bothrops sp

1) está mais próxima da DL 50 do veneno de B. moojeni do que a DL 50 do ve¬

neno de B.neuwiedi procedentes de Itaipu.

A letalidade dos venenos com características morfológicas entre

B. moojeni e B. jararacussu (denominado de Bothrops sp 2) está próxima da

DL 50 dos venenos de B. jararacussu e B. moojeni procedentes de Itaipu.

Os resultados da eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS para os

oito venenos estudados estão expressos na Fig. 1.

yV/V

ti;

O b

• MBI #ii

ti «mu

tu m

VrJ v \ J

1 m fl

FIGURAI — Curvas densitométricas e eletroferogramas dos venenos de: a - B. moojeni —

São Paulo, b — B. moojeni — Itaipu, c — Botrops sp 1 — Itaipu, d — Bothrops sp 2 — Itai-

pu, e — B.neuwiedi — São Paulo, f — B.neuwiedi — Itaipu, g — B.jararacussu — São Pau¬

lo, h — B. jararacussu — Itaipu.

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PERR0NE, M.A.L.; SILES VILLARROEL, M.; FURTADO, M. de F.D. Estudo comparativo entre os ve¬

nenos de serpentes do gênero Bothrops, procedentes do Estado de São Paulo e do Estado do Para¬

ná com algumas espécies morfologicamente duvidosas. Mem. Inst. Butantan, 51 (1 ):25-32, 1989.

Os resultados da eletroforese dos venenos de B.moojeni procedentes

do Estado de São Paulo e de Itaipu (Paraná) apresentam o mesmo número

e localização das bandas, demonstrando que não há diferenças apreciáveis

entre os venenos comparados (Fig. Ia e b). As mesmas observações foram

verificadas com os venenos de B.neuwiedi (Fig. leef).

Os venenos de B.jararacussu procedentes das diferentes localidades

apresentam pequenas variações, principalmente relacionadas à concentra¬

ção, isto se observa no penúltimo componente dos padrões eletroforéticos

(Fig. 1 g e h).

O perfil eletroforético (c) do veneno de serpentes com características

morfológicas de B.moojeni e B.neuwiedi, denominado por nós Bothrops

sp 1, assemelha-se aos padrões eletroforéticos de B.moojeni de São Paulo

e Itaipu (a e b) e difere bastante dos venenos de B.neuwiedi (e e f).

O perfil eletroforético (d) do veneno de serpentes com características

morfológicas de B.moojeni e B.jararacussu, denominado por nós Bothrops

sp 2, assemelha-se aos padrões eletroforéticos de B.moojeni de São Paulo

e Itaipu (a e b), apresentando concentrações menores para os dois primei¬

ros componentes e diferindo bastante dos venenos de B.jararacussu (g e

h).

Os resultados do estudo comparativo entre os oito venenos, através

das técnicas de imunodifusão e imunoeletroforese, não incluídos, não

apresentam variações ponderáveis.

DISCUSSÃO

A despeito da comprovação da extensa variabilidade dos venenos em

serpentes (Gloyd, 1940; Gonçalves & Vieira, 1950; Gonçalves Et Deustsch,

1956; Schenberg, 1959; Aragon e Gubensek, 1981; Rael et al., 1984), vá¬

rios autores como Jiménez-Porras (1964, 1967) concluem que as variações

nos venenos são de origem genética. E Saint-Girons Et Detrait (1978), estu¬

dando a antigenicidade dos venenos das serpentes européias, coloca-os

como caracteres válidos para fins sistemáticos.

Furlaneto et al. (1973) e Siles Villarroel (1977), estudando a DL 50 dos ve¬

nenos botrópicos, demonstraram que 0 veneno de cada espécie de serpen¬

te possui uma determinada letalidade conforme a via de inoculação e ani¬

mal experimentado.

Siles Villarroel (1977) e Siles Villarroel et al. (1978/79), trabalhando com

venenos procedentes de várias regiões, encontraram para B.moojeni a

DL50 de 105,50 ug, enquanto que os valores da DL50 por nós obtidos para a

mesma espécie procedente de São Paulo foram de 112,00 ug e de 99,71 ug

para Itaipu. Os mesmos autores determinaram a DL 50 para B.neuwiedi de

54,17 ug, sendo os nossos valores 46,0 ug e 62,08 ug, respectivamente. O

veneno de B.jararacussu apresentou, para os autores loc. cit., 0 valor de

103,79 ug e os nossos resultados foram de 76,38 ug e 121,89 ug, demons¬

trando que nos venenos desta espécie ocorre variação mais ampla de letali¬

dade e os espécimes de São Paulo possuem ação mais elevada.

Quanto aos venenos dos espécimes com características morfológicas

entre B. moojenie B. neuwiedi denominado de Bothrops sp 1 com DLso de

137,40 ug está mais próximo à letalidade dos venenos de B. moojeni de São

Paulo e Itaipu (DL 50 = 115,81 ug e 110,07 ug, respectivamente) e muito

distante da DL50 dos venenos de B. neuwiedi das duas localidades (DL50 =

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PERRONE, M.A.L.i SILES VILLARROEL, M.; FURTADO, M. de F.D. Estudo comparativo entre os ve¬

nenos de serpentes do gênero Bothrops, proced ;ntes do Estado de São Paulo e do Estado do Para¬

ná com algumas espécies morfologicamente duvidosas. Mem. Inst. Butantan, 51 : (11:25-32, 1989.

46,64 ug e 58,33 ug), sugerindo tratar-se da espécie de B.moojeni quando

analisado conjuntamente com os resultados da eletroforese.

Quanto aos venenos dos espécimes com características morfológicas

entre B.moojeni e B.jararacussu denominado de Bothrops sp 2 com DL 50

de 123,38 ug está próximo tanto da letalidade dos venenos de B.moojeni de

São Paulo e Itaipu (DL50 = 115,81 ug e 110,07 ug) quanto da letalidade do

veneno de B.jararacussu procedente de Itaipu (DL50 = 116,68 ug). Tam¬

bém neste caso a letalidade por si só é insuficiente para definir a espécie,

porém quando analisada conjuntamente com os resultados da eletroforese

sugere tratar-se da espécie B.moojeni.

Com relação à eletroforese, Gonçalves & Vieira (1950), analisando os

venenos de serpentes brasileiras, verificaram váriações geográficas nos de

Crotalus durissus terrificus, demonstrando que os venenos procedentes do

Sul do Brasil e da Argentina apresentam crotamina, enquanto que os de

outras regiões não apresentam. Aragon & Gubensek (1981) observaram

que 0 veneno de Bothrops asper diferia em função de sua zona de ocorrên¬

cia.

Os venenos de B. moojeni procedentes de São Paulo e Itaipu não de¬

monstraram diferenças quanto aos perfis eletroforéticos, 0 mesmo ocor¬

rendo com os venenos de B.neuwiedi; já a espécie B.jararacussu de São

Paulo e Itaipu apresenta pequenas variações nos padrões eletroforéticos.

E os venenos de Bothrops sp 1 e Bothrops sp 2 assemelham-se ao perfil

eletroforético de B.moojeni.

Schenberg (1963), em estudo comparativo entre os venenos de subes¬

pécies de B.neuwiedi brasileiras, utilizou a técnica de imunodifusão, en¬

contrando diferenças imunológicas nestes venenos. Tu & Ganthavorn

(1968), comparando os venenos de Naja naja siamensis e Naja naja atra,

encontraram padrões idênticos de imunodifusão e ligeiras diferenças nos

padrões imunoeletroforéticos, indicando que estas subespécies são simila¬

res mas não idênticas.

Com os venenos das três espécies procedentes de regiões diferentes,

utilizando as técnicas de imunodifusão e imunoeletroforese, obtivemos re¬

sultados semelhantes entre as espécies, não ocorrendo variação significati¬

va quanto ao número de linhas de precipitação.

CONCLUSÕES

1. Os venenos de B.moojeni e B.neuwiedi procedentes da região de

Itaipu e do Estado de São Paulo não apresentam diferenças significativas

dentro de cada espécie, quanto à letalidade e aos padrões eletroforéticos.

2. Os venenos de B.jararacussu procedentes das duas regiões apresen¬

tam diferenças significativas quanto à letalidade, sendo mais ativos os ve¬

nenos de São Paulo em relação aos venenos de Itaipu, quanto aos padrões

eletroforéticos não apresentam diferenças significativcis.

3. Os exemplares de serpentes de Itaipu com características morfológi¬

cas entre B.moojeni e B.neuwiedi (Bothops sp 1) e entm B.moojeni e B.ja¬

raracussu (Bothrops sp 2), quanto ao perfil eletroforético, assemelham-se

ao veneno da espécie B. moojeni.

4. A análise dos componentes imunogênicos dos venenos das três es¬

pécies através das técnicas de imunodifusão e imunoeletroforese não apre¬

senta variações apreciáveis.

SciELO

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PERRONE, M.A.L.; SILES VILLARROEL, M.; FURTADO, M. de F.D. Estudo comparativo entre os ve¬

nenos de serpentes do gênero Bothrops, procedentes do Estado de São Paulo e do Estado do Para¬

ná com algumas espécies morfologicamente duvidosas. Mem. Inst. Butantan, 51:01:25-32, 1989.

ABSTRACT: The venoms of Bothrops moojeni, Bothrops neuwiedi and

Bothrops jararacussu from the State of São Paulo, were compared to

samples from the Itaipu region, State of Paraná as a whole. Some of the

specimens from Itaipu present morphological aspects of both B.moojeni

and B. neuwiedi and some others of both B. moojeni and B. jararacussu.

Their toxic activity (DL50), SDS polyacrylamide gel electrophoresis, im-

munodiffusion and imunoelectrophoresis patterns were assayed. The

DL 50 values of B. moojeni and B. neuwiedi venoms showed no difference

in toxicity. However, the venoms of B.jararacussu of the Itaipu region

differed from those of São Paulo specimens, which showed higher toxi¬

city. The electrophoretic patterns of the venoms of B.moojeni and

B.neuwiedi from both regions showed no significant variation in the elec-

tropherograms. Possible intergrade specimens of B.neuwiedi/B.moojeni

(B.sp 1) and B.jararacussu/B.moojeni (B.sp 2) venom samples had

B.moojeni characteristics. The immunogenic components of the three

venoms showed no apparent variation.

KEYWORDS: toxicity, imunochemistry, botropic venoms.

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2 3

5 6

11 12 13 14 15 16

Mem. Inst. Butantan

51(11:33-38, 1989

SOBREVIVÊNCIA DE BOTHROPS JARARACUSSU

(SERPENTES, VIPERIDAE, CROTALINAE) MANTIDAS

EM CATIVEIRO.

Frederico Fontoura LEINZ*

Thélia R. F. JANEIRO-CINQUINI*

Masaio Mizuno ISHIZUKA**

Luiza Vasconcelos LANG***

RESUMO: Serpentes Bothrops jararacussu ocorrem desde o sul do Esta¬

do de Minas Gerais até o nordeste da Argentina. O plantei destas serpen¬

tes mantidas em cativeiro no Instituto Butantan no período compreendi¬

do entre setembro de 1979 e julho de 1981, constituído de42 fêmeas e 64

machos, foi analisado em função da taxa de mortalidade, freqüência sa¬

zonal de óbitos e tempo de sobrevivência também em função da estação

do ano em que ocorreu a captura. Os autores verificaram que 50% dos

animais vieram a óbito nos primeiros seis meses de cativeiro, não tendo

havido diferença significante na mortalidade entre os sexos. Por outro la¬

do, ocorreu uma incidência significante de óbitos de machos na primave¬

ra, quando se comparou a mortalidade de ambos os sexos em função das

demais estações do ano. Em relação à época em que ocorreu a captura,

verificou-se que os animais capturados na primavera e verão tiveram uma

sobrevivência mais prolongada em relação às outras estações, fato este

atribuído à provável reserva de energia acumulada naquelas estações.

UNITERMOS: Serpentes, sobrevivência, cativeiro.

INTRODUÇÃO

Serpentes peçonhentas têm sido mantidas em cativeiro visando o apro¬

veitamento do veneno, largamente utilizado na produção de imunobiológi-

cos e pesquisa.

Leloup 10 cita três sistemas de manutenção de serpentes: o intensivo, o

semi-extensivo e o extensivo. Segundo o mesmo autor, apesar do primeiro

ser o menos indicado, tal modalidade se impõe quando há necessidade em

manter-se animais oriundos de climas diversos do local de cativeiro, por

poder propiciar climatização do ambiente e controle individual dos animais,

vindo assim ao encontro das necessidades do Instituto Butantan.

O presente trabalho tem como objetivos a avaliação do tempo de sobre-

vida, cálculo da mortalidade de machos e fêmeas em .relação à estação do

ano e taxa de sobrevivência relativa à estação em que ocorreu a captura

' Pesquisador Científico, Seção de Venenos, Instituto Butantan

" Professora Titular da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP.

■" Bolsista da FUNDAP, Seção de Venenos, Instituto Butantan.

Recebido para publicação em 28-10-1988 e aceito em 10-2-1989.

SciELO

_0 11 12 13 14 15 16

LEINZ, F.F.; JANEIRO-CINQUINI, T.R.F.; ISHIZUKA, M.M.; LANG, L.V. Sobrevivência de Bothrops

jararacussu (Serpentes, Viperidae, Crotalinae) ma itidas em cativeiro. Mem. Inst. Butantan, 51(11:

33-38, 1989.

das serpentes Bothrops jararacussu do plantei do Instituto Butantan, no

período compreendido entre setembro de 1979 e julho 1981. Estas serpen¬

tes ocorrem desde o sul do Estado de Minas Gerais até o nordeste da Ar¬

gentina (Peters 13 ). Segundo Amaral 1 , estão disseminadas pelos lugares

baixos e alagadiços das zonas orientai, centro-ocidental e meridional, des¬

de o litoral até o limite sul ocidental, onde continua nos países vizinhos. Vi¬

vem em campo coberto e à beira d'água ou em rios e lagoas, alimentando-

se de rãs e roedores. É espécie ovovivípara.

MATERIAIS E MÉTODOS

a — SERPENTES : Observou-se o plantei de Bothrops jararacussu da

Seção de Venenos do Instituto Butantan de setembro de 1979 a julho de

1981, constituído de 106 serpentes, sendo 42 fêmeas e 64 machos de dife¬

rentes tamanhos e idades, recebidas regularmente e encaminhadas à pro¬

dução de venenos sem passarem por um período prévio de adaptação. Não

houve atendimento Médico Veterinário em nenhuma fase do cativeiro.

b — MANUTENÇÃO'. Os animais eram mantidos individualmente em

caixas de madeira medindo 50cm de comprimento, 40cm de largura e 25cm

de altura, acomodadas em salas à temperatura de 21 °C ± 3°C, sem contro¬

le de umidade. Nos dias mais frios de inverno aquecia-se o ambiente com

auxílio de aquecedor elétrico. As salas eram iluminadas com luz artificial.

c — ALIMENTAÇÃO: Constituiu-se de camundongos albinos adultos

fornecidos 7 dias após a extração de veneno, sendo variável a aceitação ou

não do alimento por parte da serpente. A água era mantida em potes de

barro à disposição do animal.

d — EXTRAÇÃO: As extrações eram realizadas a cada 28 dias, confor¬

me rotina estabelecida pela Seção de Venenos.

e — ANÁLISE ESTATÍSTICA: Constituiu-se no cálculo do Coeficiente

de Mortalidde Específico segundo sexo e estação do ano (Laurenti 9 ), na

aplicação do teste do Oui-Ouadrado e "t de Student'' (Vieira 17 ). Fixou-se

em 0,05 o nível de rejeição da hipótese de nulidade.

RESULTADOS

Os valores dos tempos de sobreviência de Bothrops jararacussu em ca¬

tiveiro, expressos em dias e em função do sexo, encontram-se reunidos na

Tabela 1 que permitiu o cálculo das medianas. Assim, as medianas da so-

brevida foram iguais a 167,4 dias (5,6 meses) e 159,8 dias (5,3 meses), res¬

pectivamente para machos e fêmeas, dispensando-se qualquer elaboração

estatística, pois as medianas afastaram-se muito pouco.

A Tabela 2 mostra a análise das taxas de mortalidade em função do se¬

xo e a estação do ano em que ocorreu o óbito. Com base nesta tabela pro-

cedeu-se à análise do Oui-Ouadrado que forneceu os valores 21,63 para

machos e 1,62 para fêmeas, tendo sido significante somente para machos.

A partir da mesma análise estatística procurou-se estabelecer qual a esta¬

ção do ano responsável pela significância, considerando-se primavera e

não primavera (verão + outono + inverno), visto que a maior mortalidade

de machos ocorreu naquela estação. O teste do Qui-Quadrado forneceu o

valor 15,5, que foi significante ao nível de rejeição adotado.

Os tempos de sobrevida de machos e fêmeas e respectivas médias dos

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LEINZ, F.F.; JANEIRO-CINQUINI, T.R.F.; ISFIIZUKA, M.M.; LANG, L.V. Sobrevivência de Bothrops

jararacussu (Serpentes, Viperidae, Crotalinae) mantidas em cativeiro. Mem. Inst. Butantan, 51(1):

33-38, 1989.

TABELA 1

Serpente Bothrops jararacussu em cativeiro segundo o tempo

desobrevida (dias) esexo, S.P. 1979-1981.

sobrevida'

(dias)

SEXO

MACHOS

FÊMEAS

TOTAL

0 i-

h 60

10,9

11,9

1 1,3

61 i -

-i 120

1 2

18,8

1 0

23,9

20,8

121 i-

h 180

26,6

21,4

24,5

181 i-

-i 240

1 2,5

21,4

1 6,0

241 i -

h 300

7,8

9,5

8,5

301 i-

-i 360

9.4

4,8

7,5

361 i-

h 570

9,4

7,1

8,6

571 i-

h 732

4,6

2,8

TOTAL

100,0

100.0

106

100,0

MEDIANA

( Mi )

167,4 dios

( 5,6 meses)

159,8 dias

( 5,3 meses)

TABELA 2

Frequência de óbitos em cativeiro de Bothrops jararacussu no

Instituto Butantan, segundo a estação do ano esexo, SP, 1979-1981

SEXO

ESTAÇÃO

MACHOS

FÊMEAS

TOTAL

PRIMAVERA

46,2

1 1

26,2

4 1

38,7

VERÃO

1 1

1 7,2

16,6

1 8

16,9

OUTONO

7.8

28,6

16,0

INVERNO

28, 1

28,6

28,4

TOTAL

100,0

106

100,0

valores individuais, em função da estação do ano em que ocorreu a captu¬

ra, são apresentados na Tabela 3.

Com base nesta tabela aplicou-se o teste "t de Student” para a diferen¬

ça entre duas médias, tendo sido conduzido para cada estação do ano e

entre os sexos. Este cálculo indicou que não houve diferença estatistica¬

mente significante entre os sexos nas estações consideradas, o que permi¬

tiu selecionar para fins de cálculo apenas um dos sexos (machos). Esses

valores encontram-se reunidos na Tabela 4 e mostram as médias dos tem¬

pos de sobrevida em relação às estações, tendo ocorrido maior sobrevivên¬

cia quando a captura foi realizada na primavera e verão (Tabela 4).

SciELO

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LEINZ, F.F.; JANEIRO-CINQUINI, T.R.F.; ISHIZUKA, M.M.; LANG, L.V. Sobrevivência de Bothrops

jararacussu (Serpentes, Viperidae, Crotalinae) mantidas em cativeiro. Mem. Inst. Butantan, 51(1):

33-38, 1989.

TABELA 3

Sobrevida (dias) em cativeiro de Bothrops jararacussu no Instituto Butantan

segundo a estação do ano de captura e sexo, SP, 1979-1981

ESTAÇÃO DO ANO

PRIMAVERA

VERÃO

OUTONO

INVERNO

^"\SEXO

N? 0RDEM^\^

Machos

Fêmeas

Machos

Fêmeas

Machos

Fêmeas

Machos

Fêmeas

103

186

189

145

105

198

146

1 1 8

11 7

1 1 1

101

228

16 1

141

103

137

113

11 7

165

243

1 77

143

1 1 3

165

121

125

171

282

2 1 9

143

137

190

122

127

184

300

246

153

1 37

120

190

189

331

248

171

145

130

261

232

268

189

147

148

1 1

308

289

224

162

148

308

381

228

172

151

323

386

267

2 20

190

330

555

358

234

236

337

594

401

253

442

615

458

355

497

500

731

x (dias)

250,7

228,9

284,3

21 7.4

131.6

1 1 1.7

148,6

124,3

s (dias)

181,7

69,6

17 7,4

136,2

55,0

6 2,0

7 9,0

65,4

TABELA 4

Valores de análise estatística de "t" para diferença entre

duas medidas do tempo de sobrevida de B. jararacussu em

relação à estação do ano em que ocorreu a captura.

CONTRASTE

t CALCULADO

G.L.

PRIMAVERA x VERÃO

0,48

1,645

PRIMAVERA x OUTONO

2,36*

1,679

PRIMAVERA x INVERNO

2,07 *

1,645

VERÃO x OUTONO

2,77 *

1,701

VERÃO x INVERNO

1,92*

1,645

OUTONO x INVERNO

0,67

1,701

Teste significante a nivel de o L = 0,05

DISCUSSÃO

0 tempo de sobrevida de machos e fêmeas de serpentes Bothrops jara¬

racussu, mantidas em sistema intensivo e destinadas à extração periódica

de veneno, não apresentou diferença significante entre os sexos.

Observou-se que 50% da mortalidade de machos e fêmeas ocorreram

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LEINZ, F.F.; JANEIRO-CINQUINI, T.R.F.; ISHIZUKA, M.M.; LANG, L.V. Sobrevivência de Bothrops

jaráracussu (Serpentes, Viperidae, Croialinae) mantidas em cativeiro. Mem. Inst. Butantan, 51(1):

33-38, 1989.

respectivamente nos primeiros 5,6 meses e 5,3 meses de cativeiro, valores

estes considerados elevados quando comparados com os citados por Co-

wan 7 . Este autor afirma que a principal causa da mortalidade de serpentes

em biotério é a "síndrome da má adaptação”, responsável pela morte de

80% dos animais durante os dois primeiros anos de cativeiro. Esta síndro¬

me leva o animal à inapetência, emagrecimento (embora o animal possa ali¬

mentar-se normalmente), fragilidade dos tecidos (resultando em ulceração

da pele em pontos de fricção), aumento na susceptibilidade a infecções por

microorganismos patogênicos e pelos normalmente inócuos.

A necessidade em extrair-se o veneno a cada 28 dias, operação traumá¬

tica realizada pela compressão vigorosa e repetida da glândula venenífera,

pode ter sido a principal causa do aumento na mortalidade do plantei anali¬

sado.

A taxa de mortalidade, em relação à estação do ano em que ocorreu a

captura, indicou uma maior sobrevida de machos e fêmeas quando captu¬

rados na primavera e verão. Segundo Calow 5 , a adaptação pode ser consi¬

derada um assunto de administração de energia. A adaptação a um am¬

biente que não o natural requer um aumento no consumo desta energia.

Para Snyder 16 , a resposta a esta demanda constitui-se em "stress", poden¬

do em certos casos haver o consumo total de gordura para manter o

equilíbrio interno do animal, com prejuízos imediatos às funções vitais co¬

mo crescimento, reprodução e resistência à infecções. Sendo assim, uma

sobrevivência mais prolongada das serpentes capturadas na primavera e

verão, estaria relacionada com a maior oferta de alimentos na natureza du¬

rante as citadas estações, o que as levariam a suportar melhor e por mais

tempo as conseqüências adversas do cativeiro, por disporem de maior re¬

serva de energia.

CONCLUSÕES

1 — Não existe diferença significante na taxa de mortalidade entre os

sexos.

2 — No plantei observado, 50% dos animais morreram nos primeiros

5,6 meses de cativeiro.

3 — Houve uma freqüência de óbitos mais significante de machos na

primavera.

4 _ Animais capturados na primavera e verão sobreviveram por tempo

mais prolongado em cativeiro quando comparados com os capturados no

outono e inverno.

ABSTRACT: The group of snakes Bothrops jararacussu maintained in

captivity in the Butantan Institute from September 1979 to July 1981,

consisting of 42 females and 64 males, was analysed regarding the mor-

tality rate, the seasonal frequency and the survival rate related to the sea-

son of the year when the snakes were captured. The authors observed

that 50% of the animais died during the first six months following the

capture, and there was no significant difference in the mortality. On the

other hand, a significant incidence of male mortality was observed in

Spring when compared in both sexes focusing the season of the year.

Animais captured during Spring and Summer have prolonged survival ra¬

tes when compared to those taken during Fali and Winter. This fact may

be atributed to the greater amount of energy accumulated during those

seasons.

KEYWORDS: Snakes, survival, captivity.

SciELO

_0 11 12 13 14 15 16

LEINZ, F.F.; JANEIRO-CINQUINI, T.R.F.; ISHIZUKA, M.M.; LANG, L.V. Sobrevivência de Bothrops

jararacussui Serpentes, Vipendae, Crotalinae) mantidas em cativeiro. Mem. Inst. Butantan, 51(1):

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14. RATALIFFE, H.L. Diets for zoological gardens: disease control. Int. Zoo. Yearb., 6: 4-

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15. REGAL, P.J. Thermophilic response following feeding in certain reptiles. Copeia,: 588-

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16. SNYDER, R.L. The biology of population growth.

New York, St. Martin's Press, 1976.

17. VIEIRA, S. Introdução à bioestatística. São Paulo, Campus, 1988. 294 p.

18. WALLACH, J.D. Medicai care of reptiles. J.Am. Vet. Med. Assoe., 155: 1017-1034,

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19. WALLACFI, J.D. Diseases of reptiles and their clinicai management. In: Current Veteri-

naryTherapy. Philadelphia, W.B. Saunders Co., 1971. v. 6.

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1. Soracmc serão aceitos trabalhos inéditos c que se destinem exclusivamcnte à revista. É proibida a reprodução

com fins lucrativos. Os artigos de revisão serão publicados a convite da Comissão Editorial.

2. Os trabalhos deverão ser redigidos em português, inglês ou francês, datilografados prefercncialmente em má¬

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3 No preparo do original será observada, sempre que possível, a seguinte estrutura: Página de rosto: título do arti¬

go, nornc(s) do(s) autor(es) e filiação científica. Texto: introdução, material c métodos, resultados, discussão,

conclusões, agradecimentos c referência bibliográfica. Material de referência: resumos (em português c inglês);

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mo de três, em português c inglês).

4. As referências bibliográficas deverão ser ordenadas alfabeticamente e numeradas.

Exemplos:

Para livros: autor, titulo, edição, local de publicação, editor, ano, páginas.

7. B1ER, O. Microbiologia e imunologia. 24.ed. São Paulo, Melhoramentos, 1985. 1234p.

Para artigos: autor, título do artigo, título do periódico, volume, página inicial e final. ano.

8. MACHADO, J.C. & SILVEIRA F.°, J.F. Obtenção experimental da pancreatite hemorrágica aguda no cão

por veneno escorpiônico. Mem. Inst. Butantan, 40/41: 1-9, 1976/77.

As citações no texto devem ser por números-índices correspondentes às respectivas referências bibliográficas

Exemplos:

... método derivado de simplificação de armadilha de Disney 1

... segundo vários autores 2 *' 4

5. As ilustrações (fotos, tabelas, gráficos etc.) deverão ser originais e acompanhadas de legendas explicativas. As le¬

gendas serão numeradas e reunidas cm folha ã parte. Os desenhos deverão ser a nanquim e as fotografias bem

nítidas, trazendo no verso o nome do autor e a indicação numérica da ordem a ser obedecida no texto. As ilustra¬

ções deverão ser organizadas de modo a permitir sua reprodução dentro da mancha da revista (22 x 12,5cm).

(22 x 12,5cm).

6. Os artigos deverão conter no máximo 6 (seis) ilustrações (branco c preto). De cada trabalho serão impressas 50

(cinquenta) separatas, sendo 10 para a Biblioteca do Instituto e 40 para os autores.

7. Os textos originais não serão devolvidos c os originais das ilustrações estarão à disposição dos autores.

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Manuscripts submitted to the Editorial Board should bc unpublished texts and should not be under constdera-

tion for publication elscwhere. Rcproduction for commercial purposes is not allowed. The Editorial Board will

plan the publication of revision articles.

The original and two copies of papers should bc typewrittcn in Portuguese, English or French, double spaced,

on typing paper (31 x 21cm). Pages should be numbered consecutively at the úpper right corner.

The following strueture should be considcred in the preparation of the manuscript: Title page: with articlc ti-

tle, name of author(s), professiona! address. Text: with introduction, material and methods, results, discus-

sion, conclusions, acknowlcdgments, rcferences, summary (in Portuguese and English), and kcy-words. A ma-

ximal numberof 03 key-words should be included in Portuguese and English.

Rcferences in alphabetical order should bc numbered consecutively.

Examples:

Books

7. B1ER, O. Microbiologia e imunologia. 24.ed. São Paulo, Melhoramentos, 1985. 1234p.

Articles

8. MACHADO. J.C. & SILVEIRA F.°, J.F. Obtenção experimental da pancreatite hemorrágica aguda no cão

por veneno escorpiônico. Mem. Inst. Butantan, 40/41: 1-9, 1976/77.

Citations in the text should be identified by the rcfcrcnce number.

Examples:

... método derivado de simplificação de armadilha de Disney 1

... segundo vários autores 2 '*' 4

lllustrations (photographs, rabies, figures etc.) should bc the originais and legends should bc submitted typew¬

rittcn on a separate sheet. Line-drawings should be with China ink and photographs must be of top quality. On

the back of each figure or photograph the name of the author(s) should bc lighly written and the number indi-

cating the sequencc in the text. lllustrations should fit in a page measuring 22 x 12,5cm.

No more than 6 illustrations will bc accepted and photographs should be black and white. Fifty reprints of each

article are provided without charge, and 10 will be kept at the library.

Submitted manuscripts will not bc returned to the author(s) but the original illustrations are availablc to au-

thor(s) by request.

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