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sentação de trabalhos originais que contribuam para o progresso nos campos das

Ciências Biológicas, Médicas e Químicas, elaborados por especialistas nacionais

e estrangeiros.

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ceitos emitidos são de inteira responsabilidade dos autores.

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MEMÓRIAS

INSTITUTO BUTANTAN

Volume 52, número 1, 1990

São Paulo, SP — Brasil

1990

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MEMÓRIAS do INSTITUTO BUTANTAN. (Secretaria de Estado da Saúde)

São Paulo, SP — Brasil, 1918 —

1918 — 1983/84, 7 - 47/48

Publicação interrompida de 1985 a 1986,

1987, 49 (1-3)

1988, 50(1-3, supl.)

1989, 57(1-4)

1990, 52(1

ISSN0073-9901

MIBUAH CDD 614.07205

Solicita-se permuta/Exchange desired

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Mem. Inst. Butantan

52 (1), 1990

SUMARIO/CONTENTS

Esterilização de materiais de biotério pelo calor úmido.

Steam sterilization of material used in laboratory animal house.

Sueli Blanes DAMY, Ubimara Pereira RODRIGUES, Luziane do

C.A.G. CHAGURI, Glauco Bueno MACHADO, Carlos RIGHETTI NE¬

TO, Fernando SOGORB SANCHIS .

Ochetosoma heterocoelium (Travassos, 1921

Ochetosomatidae) em novo hospedeiro.

Ochetosoma heterocoelium (Travassos, 1921

Ochetosomatidae) in a new host.

Fernando M.A. CORRÊA; Rosangela Clara PAULINO, Marcus A.

BUONONATO; Pedro A. FEDERSONI JR. 11

(Trematoda: Digenea:

Carbon dioxide as an auxiliary in the venom extraction of Bothrops ja¬

raraca snakes (Viperidae, Crotalinae)

Dióxido de carbono como auxiliar na extração de venenos de serpen¬

tes Bothrops jararaca (Viperidae, Crotalinae)

Frederico Fontoura LEINZ, Thélia R.F. JANEIRO-CINQUINI;

ISHIZUKA, M.M.

Método para la identificación individual de Bothrops alternatus Duméril,

Bibron & Duméril, 1854 (Ophidia, Viperidae) en laboratorio.

Method for the individual identification of Bothrops jararaca Duméril,

Bibron & Duméril, 1854 (Ophidia, Viperidae) in the laboratory.

Flávio FRANCINI, Fabio A. PELUSO, Carlos S. GRISOLIA . 25

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ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS DE BIOTERIO PELO

CALOR ÚMIDO*

Sueli Blanes DAMY

Ubimara Pereira RODRIGUES

Luziane do C.A.G. CHAGURI

Glauco Bueno MACHADO

Carlos RIGHETTI NETO

Fernando SOGORB SANCHIS

RESUMO: Foram comprovados através de indicadores químicos e bioló¬

gicos os melhores parâmetros de eficiência na esterilização de materiais

usados em biotérios de condições sanitárias definidas. Obtiveram-se re¬

sultados satisfatórios em 20 minutos a 121 °C para os seguintes mate¬

riais: gaiolas de polipropileno; maravalha de madeira em sacos de 5 quilos;

ração em camadas de até lOcm; tampas de arame galvanizado; unifor¬

mes em pacotes de 15 x 25 x 38cm e em 60 minutos a 121 °C para

água em garrafas de vidro com 350ml de capacidade. Materiais para

isoladores: 30 minutos a 121 °C para ração em sacos de 1 quilo e mara¬

valha de madeira em sacos de 1 quilo: 60 minutos a 121 °C para água

em garrafas de 350ml de capacidade. Houve coincidência (100%) en¬

tre indicadores químicos e biológicos o que permite a utilização imedia¬

ta dos materiais orientando-se pelo controle químico (fusão do enxofre).

Não foram avaliadas as variações dos valores nutricionais e organolépti-

cos da ração.

UNITERMOS: Autoctavagem, biotério, isoladores, indicadores biológicos

e químicos

INTRODUÇÃO

A esterilização pelo calor úmido, apesar de representar um dos méto¬

dos mais econômicos, deve ser utilizada com racionalidade em biotérios,

devido à quantidade e diversidade de materiais a serem submetidos ao pro¬

cesso. Sua aplicação é fundamental em colônias de animais gnotobióti-

* Trabalho apresentado no 1 0 Congresso Brasileiro de Animais de Laboratório 29/08 a 2/9/1988, Salvador, Bahia.

Seção de Biotério - Instituto Butantan - C.P. 65 - 01051 - São Paulo - SP - Brasil.

Recebido para publicação em 02/8/1989 e aceito em 27/11/1989.

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cos, sendo, mesmo em criações convencionais, indispensável para a qua¬

lidade do modelo biológico produzido.

Para Ardouin & Morizet 2 , os materiais utilizados podem ser divididos

em três grupos: sólidos, líquidos e alimentos, sendo necessário prever pa¬

ra cada grupo processos adequados, compreendendo: eliminação do ar

na câmara, entrada de vapor, esterilização, secagem e entrada de ar estéril.

A remoção do ar é o principal fator de sucesso do processo, uma vez

que sua presença acarretará pontos frios no interior da massa a ser esteri¬

lizada. Para Joslyn 5 , das técnicas básicas utilizadas atualmente, a elimi¬

nação do ar por pulsos repetidos de vapor intercalados com vácuo,

representa a mais eficiente, uma vez que elimina o intervalo de aqueci¬

mento entre a massa e a temperatura da câmara.

Na técnica de remoção por alto vácuo, a pressão absoluta do ar na câ¬

mara deve ser reduzida a valores de poucos milímetros de mercúrio, antes

da admissão do vapor. Um perfeito vácuo é obtido quando atinge uma eli¬

minação de 98%, porém, na prática, alguns autores reportaram resulta¬

dos satisfatórios com pressão absoluta de 20mm Hg (Knox & Penikett 6

e 50mm Hg Howie et al 4 ).

Joslyn 5 apresenta como incoveniente desta última técnica, a desidra¬

tação de materiais e o processo de oxidação que sofre o equipamento,

provavelmente devido ao vapor superaquecido, provocado pelo ar residual

que permanece na câmara, que além de promover o aparecimento de mas¬

sas superaquecidas, atua como catalisador da reação de oxidação.

Nas etapas seguintes do processo, admissão de vapor e esterilização

propriamente dita, para Cristovão & Gotillo 3 , é essencial que o vapor se

encontre entre duas fases de agregação, a líquida e a gasosa. A mudança de

uma fase para outra se faz à custa de grande troca de energia, fornecendo

assim requisitos necessários à destruição térmica dos microrganismos.

A qualidade do vapor é fundamental, representando o peso do vapor

seco na mistura e a quantidade de água presente. Se a qualidade do vapor

for de 97%, significa que a mistura contém 97 partes de água no estado

limiar e três no estado líquido. Vapor ideal contém 100% de saturação.

A qualidade afeta o grau de esterilização e secagem do material (Joslyn 5 ).

Quanto à secagem, o vácuo após esterilização provoca reevaporação

de condensados. Segundo Howie et al 4 , vácuo de 50mm de Hg garante

secagem satisfatória, se houver suplementação de vapor de boa qualida¬

de. A admissão do ar deve ser através de filtros, evitando recontaminação.

Efeitos deletérios provocados pelo calor devem ser considerados, prin¬

cipalmente no que se relaciona a alimentos, desidratação de fibras no ca¬

so de uniformes; deformação de gaiolas de polipropileno e oxidação das

tampas de metal utilizadas nas gaiolas.

Finalmente, a eficiência do processo poderá ser comprovada por méto¬

dos químicos, físicos e biológicos. Para Acker & Anderson 1 , três princí¬

pios básicos envolvem o processo de validação de esterilidade: demons¬

tração em nível máximo de probabilidade que o processamento e o méto¬

do estabeleceram esterilidade em todas as unidades do lote; esterilidade

no interior do produto; fornecimento de máxima segurança e suporte dos

resultados dos testes do produto final esterilizado.

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O sucesso da validação está na sistematização dos conhecimentos teóri¬

cos na execução do experimento validado e na análise da documentação. O

emprego de bioindicadores tem como propósito assegurar que uma redu¬

ção de sua população será suficiente para destruir toda contaminação viá¬

vel da massa. (Acker & Anderson 1 ).

OBJETIVO

0 presente trabalho teve como objetivo estabelecer para cada grupo

de material os melhores parâmetros de eficiência, comprovados através

de indicadores biológicos e químicos.

MATERIAL E MÉTODOS

Autoclave: de dupla porta, forma de paralelepípedo, capacidade 2m 3 ,

dupla parede, alimentada por vapor de água.

Gaiolas: de polipropileno (homopolímero KM 6.100), medindo 29 x 17,5

x 1 3cm, com oito extratores laterais e na parte superior da caixa dispositi¬

vo para drenagem de água. Colocadas em fileiras horizontais de 28 cai¬

xas, totalizando 224 por processo.

Tampas de gaiolas: em arame galvanizado, medindo 30 x 20cm, dis¬

postas em pilhas contendo 10 cada, totalizando 500 tampas por processo.

Maravalha: em sacos multifolhados de papel kraft, grampeados, pesando

5 quilos cada, dispostos nas bandejas superior e inferior, totalizando 20

sacos ou 100 quilos por processo.

Ração: peletizada, na formulação industrial, disposta horizontalmente

sobre as bandejas de maneira a formar camadas uniformes de lOcm de

espessura no máximo, totalizando 300 quilos por processo.

Água: bebedouros de vidro com capacidade de 350ml, colocados em

caixas de polipropileno, 24 por caixa, totalizando 336 bebedouros por

processo.

Uniformes: pacotes medindo 1 5 x 38 x 25cm, envoltos em papel kraft.

Material para isoladores: ração e maravalha embalados em saco de al¬

godão, com 1 quilo de capacidade, totalizando 2 quilos por cilindro. Água

em bebedouros de 350ml, totalizando 8 por cilindro. Os cilindros são em

aço inoxidável, contendo a porção média de seu corpo perfurações, en¬

volvida com 4 camadas de lã de vidro, funcionando como filtro absoluto.

A extremidade do cilindro foi fechada com papel celofane duplo.

Indicador químico: ampolas contendo 0,01g de enxofre (Ponto de fu¬

são 119-120°C).

Indicador biológico: ampolas contendo 2 ml de uma suspensão de es¬

poros de Bacillus stearothermophillus (MERCK ATCC 7953), com as se¬

guintes características: n = 1.000 esporos por ml; D 120 = 8±1 minuto;

Di 21 = 3±1 minuto; D 122 = 1,5±1 minuto; Fi 21 = 14 a 15 minutos;

z = 4°C.

n = número de microrganismo por unidade de medida, antes do pro¬

cesso de esterilização.

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D = tempo de redução (tempo em minutos para que uma determinada

temperatura reduza em um décimo o número de esporos capazes de so¬

breviver).

F = tempo de destruição a 121 °C (sob pressão de vapor).

z = inclinação da curva de destruição (diferença de temperatura em

graus centígrados, em 1/10 do tempo de ação do calor para alcançar uma

destruição de 90%).

Disposição dos indicadores na carga: maravalha, no centro de cada saco;

gaiolas, nas extremidades e nas posições medianas de cada fileira; ração,

no centro de cada saco; tampas, nas extremidades inferiores, superiores

e medianas; água, no centro de cada caixa; uniformes e cilindros, no cen¬

tro de cada pacote.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para cada grupo de material se estabeleceu inicialmente a carga máxi¬

ma para a câmara da autoclave. Iniciou-se a validação de cada processo,

com a temperatura de 1 21 °C por 20 minutos. Os resultados das leituras

dos indicadores químicos e biológicos foram confrontados e não ocorren¬

do correlação positiva entre eles, o tempo de esterilização foi aumentado

gradualmente, até haver coincidência de resultados. A partir do estabele¬

cimento deste parâmetro, o processo foi repetido 10 vezes para cada gru¬

po. Os resultados estão representados na tabela 1.

Os tempos necessários à esterilização de cadagrupo estão na depen¬

dência das características específicas do material, que provoca uma maior

ou menor variação entre o tempo do início do patamar de esterilização e

o aquecimento do centro da carga.

A água representou o grupo mais difícil no estabelecimento do tempo.

Segundo Ardouin & Morizet 2 , a variação deste item é grande, ocorrendo

principalmente em função do volume dos bebedouros e em menor grau

em função do número. O resfriamento requer 50 minutos para diminuir

a temperatura de 160 litros, para 100°C e 11 horas para atingir 50°C.

Os resultados indicam que apesar do grau de vácuo registrado pelo ma¬

nómetro externo de 600 mm Hg, correspondendo à pressão absoluta de

118 mm Hg, ter sido superior à preconizada por Knox & Penikett 6 e Ho-

wie et al 4 , os dados fornecidos pelos indicadores orientam quanto às con¬

dições aproximadas do histórico do processo.

Se por um lado o indicador químico forneceu somente a informação

que a temperatrura atingida foi suficiente para provocar sua fusão, o indi¬

cador biológico, após 48 horas de incubação a 60°C, forneceu a informa¬

ção do tempo mínimo que a temperatura se manteve. Na prática a

coincidência de 100% verificada, demonstrou ser de valiosa importância,

uma vez que permite a introdução de materiais na área protegida com bar¬

reira sanitárias, imediatamente após o término de cada processo de este¬

rilização, orientando-se pela fusão do enxofre.

CONCLUSÃO

1. Os indicadores químico (enxofre) e biológico (esporos de Bacillus stea-

rothermophillus, utilizados em conjunto, são eficazes na validação e mo¬

nitoração de processos de esterilização por calor úmido.

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2. Os melhores parâmetros de eficiência são:

MATERIAL UTILIZADO EM ÁREA PROTEGIDA

COM BARREIRAS SANITÁRIAS

ÁGUA-bebedouros de 350 ml

GAIOLAS — polipropileno

MARAVALHA — sacos de 5 quilos

RAÇÃO — camadas de até 10 cm

TAMPAS

UNIFORMES — pacotes de 15 x 25 x 38cm 20 minutos

TEMPO

60 minutos

20 minutos

TEMPERATURA

121 °C

MATERIAL UTILIZADO EM ISOLADORES

ÁGUA — bebedouros de 350ml

RAÇÃO — sacos de 1 quilo

MARAVALHA — sacos de 1 quilo

60 minutos

30 minutos

121 °C

1 21 °C

121 °C

ABSTRACT: By means of Chemical and biologivcal indicators, the best

efficiency parameters for the sterilization of material used in laboratory

animal house with definite sanitaryconditions were confirmed. Satisfac-

tory results were obtained within 20 min at 121 °C for the following materi¬

ais: polypropylene cages; wood shavings in 5 kg sacks; diet in layers of

up to 10 cm; galvanized wire lids; uniforms in 10 x 25 x 38 cm parcels

and within 60 min at 121 °C for water in glass bottles of 350 ml content.

Materials for isolators: 30 min at 121 °C for water in bottles of 350 ml

capacity. There was a coincidence (100%) between Chemical and bio-

logical indicators thus allowing the immediate utilization of the material

under the orientation of Chemical control (fusion of the suylphur). The

variations of the nutritional and organoleptic values of the diet were not

evaluated.

KEYWORDS: autoclave, laboratory animal houve, isolators, Chemical and

biological indicators.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. ACKER, M.J. & ANDERSON, N.R. Validation of sterile products. In: LOFTUS, B.T. &

NASCH, R.A. ed.Pharmaceuticalprocess validation. New York, Marcei Dekker, 1984.

p. 29-98.

2. ARDOUIN, P. & MORIZET, J. Du bon usage de 1'autoclave dans les unités animales.

Sei. Tech. Anim. Lab., 9{ 21:95-104, 1984.

3. CRISTOVÃO, D. A. & GOTILLO, L. Esterilização e desinfecção. São Paulo, Faculdade

de Higiene e Saúde Pública — USP, 1968. 48p.

4. HOWIE, J. W. et al. Sterilization by steam under increased pressure.The Lancet,

7(70701:425-435, 1959.

5. JOSLYN, L. J. Sterilization by heat. In: BLOCK, S. A. ed. Disinfection, sterilization and

preservation. Philadelphia, Lea & Febigèr, 1983. p. 3-46.

6. KNOX, R. & PENIKETT, E. J. K. Influence of initial vacuum on steam sterilization of dress-

ings. Brit. med. J., 7:680-682, 1958.

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OCHETOSOMA HETEROCOELIUM

(TRAVASSOS, 1921) (TREMATODA: DIGENEA:

OCHETOSOMATIDAE) EM NOVO HOSPEDEIRO.

Fernando M. A. CORRÊA

Rosangela Clara PAULINO

Marcus A. BUONONATO +

Pedro A. FEDERSONI JR.+

RESUMO: Os autores relatam o primeiro encontro de Ochetosoma hete-

rocoelium (Travassos, 1921) em Bothrops insularis Amaral, 1921. Além

dos aspectos morfológicos do parasita, sua baixa especificidade, o fato

do hospedeiro ser nascido em cativeiro, condição em que foi mantido

durante toda a sua existência, suas condições naturais de vida e a pos¬

sível forma de infestação são discutidos.

UNITERMOS: Trematoda: Digenea, Ochetosoma heterocoelium, Both¬

rops insularis.

INTRODUÇÃO

Numerosas espécies de trematóides digenéticos são encontradas em

ofídios do Brasil, ressaltando Corrêa 2 serem as do gênero Ochetosoma as

mais frequentes.

Durante necropsia de um ofídio Bothrops insularis Amaral, 1921, nas¬

cido no biotério do Museu do Instituto Butantan em 1985 e morto em 1989,

1 9 exemplares de Digenea foram encontrados na cavidade bucal e esôfa¬

go. Relatamos os resultados desse achado.

MATERIAL E MÉTODOS

Os parasitos colhidos foram fixados em formol de Railliet & Henry, li¬

geiramente comprimidos entre duas lâminas de vidro, seguras por um elás-

* Serviço de Parasitologia

+ Museu do Instituto Butantan

Instituto Butantan - C.P. 65 - 01051 - São Paulo - SP - Brasil

Recebido para publicação em 28/12/1989 e aceito em 08/2/1990.

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CORRÊA, F.M.A.; PAULINO, R.C.; BUONONATO, M.A.; FEDERSONI JR„ P.A. Ochetosoma hetero-

coelium (Travassos, 1921) (Trematoda: Digenea: Ochetosomatidae) em novo hospedeiro. Mem.

Inst. Butantan, 52 (1): 11-16, 1990

tico delgado; posteriormente, foram corados pelo carmim clorídrico e mon¬

tados em Eugenol.

O desenho apresentado foi feito com auxílio de câmara clara.

RESULTADOS

As características morfológicas levaram à diagnose genérica de Oche¬

tosoma Braun 1911 e suas peculiaridades à identificação com O. hetero-

coelium (Travassos, 1921) conforme pode ser verificado pela comparação

entre as figs. 1 e 2.

São digenéticos de tamanho variável, alongados, com ou sem espinhos

no tegumento. Acetábulo equatorial e maior que a ventosa oral. Faringe

presente. Esôfago curto. Cecos intestinais amplos e curtos, terminando

na zona acetabular. Poro genital lateral. Bolsa do cirro enorme e oblíqua.

Testículos pós-equatoriais logo atrás do acetábulo; têm zonas coinciden¬

tes e campos afastados. Ovário pequeno, redondo, abaixo ou na zona ace¬

tabular, no campo dessa ventosa e com zona em contato com a zona dos

testículos. Vitelinos constituídos por folículos grossos, laterais, em parte

nos campos cecais e testiculares, utrapassandq anteriormente a zona ace¬

tabular e, posteriormente, a zona testicular. Útero intertesticular e pós-

-acetabular. Ovos com 0,037 a 0,042 x 0,017 a 0,023 mm.

DISCUSSÃO E COMENTÁRIOS

A única espécie do gênero Ochetosoma reconhecida até agora em ser¬

pentes brasileiras é Ochetosoma heterocoelium (Travassos, 1921), assi¬

nalada no intestino de um exemplar de Bothrops neuwiedi (Wagler, 1824).

Em sua descrição original de Ochetosoma heterocoelium, confirmada

por Travassos, Freitas & Kohn 4 , Travassos 3 menciona o intestino como

habitat do parasita. Corrêa 2 , por sua vez, relata o encontro frequente desse

digenético na boca e no esôfago e, só excepcionalmente, no intestino das

seguintes espécies de ofídios:

Bothrops cotiara (Gomes, 1913)

Bothrops jararaca (Wied, 1824)

Bothrops moojeni Hoge, 1966

Bothrops neuwiedi mattogrossensis Amaral, 1925

Chironius bicarinatus (Wied, 1820)

Chironius fuscus (Linnaeus, 1758)

Clelia occipitolutea (Dum., Bibr. & Dum., 1854)

Drymarchon corais corais (Boie, 1867)

Erythrolampus aesculapii (L., 1766)

Helicops modestus Gunther, 1861)

Liophis almadensis (Wagler, 1824)

Liophis miliaris (L., 1758)

Liophis poecilogyrus (Wied, 1823)

Liophis reginae (L., 1758)

Liophis typhlus (L., 1758)

Mastigodryas bifossatus (Raddi, 1820)

Philodryas patagoniensis (Girard, 1857)

Waglerophis merremii (Wagler, 1824)

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CORRÊA, F.M.A.; PAULINO, R.C,; BUONONATO, M.A.; FEDERSONI JR., P.A. Ochetosoma hetero-

coelium (Travassos, 1921) (Trematoda: Digenea: Ochetosomatidae) em novo hospedeiro. Mem.

Inst. Butantan, 52 (1): 11-16, 1990

Fig. 2. Ochetosoma heterocoelium (original)

1, | SciELO

CORRÊA, F.M.A.; PAULINO, R.C.; BUONONATO, M.A.; FEDERSONI JR., P.A. Ochetosoma hetero-

coelium (Travassos, 1921) (Trematoda: Digenea: Ochetosomatidae) em novo hospedeiro. Mem.

Inst. Butantan, 52 (1): 11-16, 1990

Em nossa verificação, os exemplares foram colhidos da boca e do esôfa¬

go coincidindo, portanto, com as localizações mencionadas por Corrêa 2 .

Nosso achado, todavia, se deu em hospedeiro ainda não catalogado —

Bothrops insularis Amaral, 1921 e em condições que se destacam por sua

peculiaridade.

Tal espécie de ofídio, como é sabido, provém de área geográfica restrita,

a Ilha da Queimada Grande, localizada no litoral Sul do Estado de São Paulo

conforme as seguintes coordenadas: 24° 28' S e 46° 42' W. Nesse am¬

biente, totalmente isolado do continente, encontram-se dois tipos de serpen¬

tes: Bothrops insularis (Viperidae: Crotalinae), conhecida como Jararaca

Ilhoa e Dipsas albifrons cavalheiroi Hoge, 1950 (Colubridae: Disapinae),

conhecida como Dormideira.

Os hábitos da Jararaca Ilhoa são muitos diferentes das Bothrops conti¬

nentais. Não são agressivas, sobem em árvores com extrema facilidade e

têm hábitos crepusculares. Apresentam hábitos alimentares dos mais varia¬

dos, como se pôde comprovar pelo estudo do conteúdo estomacal e por

observações no campo, no momento da ingestão. Até o presente foram ca¬

talogados como tendo sido ingerido pelas Ilhoas: invertebrados (asas e patas

de insetos; diplópodos e lacraias); vertebrados: (anfíbios: Eleutherodactilus

binotatus (Spix, 1824), répteis: Dipsas albifrons cavalheiroi (serpente co¬

medora de moluscos), lagartos do gênero Mabuya; e aves: Passeriformes).

O exemplar por nós estudado era um macho, nascido em cativeiro em

07/03/85 e morto em 27/07/89. Durante toda a sua existência foi ele man¬

tido no biotério do Museu do Instituto Butantan, recebendo alimentação

o mais semelhante possível àquela encontrada na natureza, sendo certo

que em uma ocasião ingeriu uma perereca, Hyla sp.

É provável que o ofídio em questão tenha se infestado através da in¬

gestão do anfíbio. Corrobora nossa hipótese o trabalho de Byrd 1 sobre ci¬

clo evolutivo de O. aniarum, parasita de serpentes da America do Norte

e que, como a maioria dos trematóides digenéticos, faz uso de 2 hospe¬

deiros intermediários, no caso, um molusco e um girino de anuro.

Infelizmente não tivemos ainda oportunidade de necropsiar exemplares

de Bothrops insularis recém-chegados da Ilha da Queimada Grande, portan¬

to, nada podemos avançar sobre a fauna parasitológica natural do ofídio.

Por outro lado, é interessante notar que várias espécies de diferentes gê¬

neros de ofídios já foram assinaladas como hospedeiras de Ochetosoma

heterocoelium o que, sem dúvida, indica baixo grau de especificidade pa¬

rasitária.

ABSTRACT: The finding of Ochetosoma heterocoelium (Travassos, 1921)

in Bothrops insularis Amaral, 1921 is related. Besides morphological

aspects of the parasite, its iow specificity, the fact that the host was bom

and kept in captivity during its entire existence, the natural life condi-

tions of the host and possible mechanisms of infestation are discussed.

KEYWORDS: Trematoda: Digenea. Ochetosoma heterocoelium. Bothrops

insularis.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. BYRD, E. E. Life history of Reniferinae parasitic in reptilia of the New Orleans area. Trans.

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Mem. Inst. Butantan

52 (1): 17-23, 1990

CARBON DIOXIDE AS AN AUXILIARY IN THE VENOM

EXTRACTION OF BOTHROPS JARARACA SNAKES

(Viperidae, Crotalinae)

Frederico Fontoura LEINZ* *

Thélia R. F. JANEIRO — CINQUINI*

Masaio Mizuno ISHIZUKA**

ABSTRACT: Snakes of the species Bothrops jararaca, destined for peri-

odical venom extraction, maintained in captivity during the period from

November 1988 to April 1989 in the "Seção de Venenos" of the "In¬

stituto Butantan", were separated in two lots: Lot I, composed by 24

snakes extracted under carbon dioxide anaesthesia, and Lot II, composed

also by 24 snakes, extracted however without the aid of this gas. The

death rate, weight of dry venom individually produced in relation to the

weight of snake, dry venom rate in relation to sex, dried venom yield in

relation to the length of captivity of both snake lots, was analized. The

observations proved that carbon dioxide was efficient and practical as

an aid in the venom extraction of Bothrops jararaca reducing noticeably

the risk of accidents without affecting survival of the snakes and venom

production. The rate of dry venom obtained from the females was higher

than from the males and the yield of dry venom in relation to the liquid

was of 22%. There occurred a small drop of the production in the 2 nc ^

month of captivity followed by a gradative increase up to the 6^ month.

KEYWORDS: Snakes, venom extraction, carbon dioxide, captivity.

INTRODUCTION

The safe handling of venomous snakes is preoccuping researchers along

the last years on account of the high risk of accidents that this operation

includes. De Biasi 12 estimates that at the "Instituto Butantan" one acci-

dent occurs every 10.000 venom extractions, a number easily reached,

since this process is repeated more or less 7.200 times during the year.

* Seção Venenos

* • Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia-USP

Instituto Butantan - C.P. 65 - 01051 - São Paulo - SP - Brasil

Recebido para publicação em 14.12.1989 e aceito em 13.2.1990

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LEINZ, F.F.; JANEIRO-CINQUINI, T.R.F.; ISHIZUKA, M.M. Carbon dioxide as an auxiliary in the venom

extraction of Bothrops jararaca snakes (Viperidae, Crotalinae). Mem. Inst. Butantan,

52 (1): 17-23, 1990

With the aim to reduce the accident rate, is was verified that the most

used method for snake contention has been the general anaesthesia, us-

ing for this purpose injectables and inhalants substances. The injectable

anaesthesics were tested by various authors (Calderwood 9 , Brazenor 7 ,

Hinsch and Gandal 17 , Karlstrom 21 ), the barbiturics being the drug of selec-

tion in these cases. When however a great number of venomous snakes

is to be handled within a short space of time, this method becomes im-

practicable, not only by the indispensable handling, but also by the prolonged

induction and recuperation. According to Calderwood 9 , the induction peri-

od due to the low metabolism of these animais, may vary from 5 to 60

min and recuperation from 2 to 48 hs.

The use of inhalants involves less risk for the handler. Depending on

the System used for the induction, the animal is introduced into the Con¬

tainer with the aid of an appropriate hook, thus restraining the direct han¬

dling, practiced only when the snake is anaesthetized.

Ether and chloroform, although already having been employed, are not

recommended on account of the delay in induction, prolonged recupera¬

tion time, small margin of safety between the anaesthetic and toxic doses,

and also by risk of explosion (Brazenor and Kaye 7 , Kaplan and Taylor 19 ,

Stecher 26 .

Volatile liquids as Halothane and its by products are the substances cur-

rently more used as inhalant anaesthesics. Depending on the species, in¬

duction and recuperation are prompt and only a few deaths are mentioned

in consequence of their use. However, when many animais are to be han¬

dled, its use is limited by the necessity to supplement oxygen during the

induction and by eventual post-anaesthesic care, that would complicate

the process(Kaplan 20 , Calderwood 9 .

Ishii and Noburu 18 used carbon dioxide as anaesthesic in carrying out

surgery in Trimeresurus flavoviridis. Based on this rmethodology, De Biasi 12

observed a lot of 28 snakes Bothrops moojeni, extracted with the help of

this gas, and concluded that the method besides propiciating a higher pro-

tection to the extractor, prevents loss of venom when aggressive animais

are handled.

At the moment, the venom extraction of all the snake species maintained

at the "Seção de Venenos" are done with the aid of carbon dioxide, with

the purpose to diminish the risk of accidents.

Since there exists a marked variation in sensibility of the species to

anaesthesic drugs (Gans, in Burke and Wall 8 ), it is attempted to determine

the mortality rate, weight of dry venom individually produced in relation

to the weight of the snake, dry venom rate in relation to sex, dried venom

yield in relation to the liquid venom, and dried venom weight obtained in

relation to the lenght of captivity, when two groups of Bothrops jararaca

were extracted with and without the use of carbon dioxide as anaesthesic.

MATERIAL AND METHODS

Snakes: A total of 48 snakes Bothrops jararaca, were extracted at the

"Seção de Venenos" of the "Instituto Butantan" during the period of

November 1 988 to April 1 989. On receiving them from nature, they were

treated against ecto and endo-parasites, maintained in quarantine for 21

days, then placed into rooms destined for maintenance. Veterinary medi-

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LEINZ, F.F.; JANEIRO-CINQUINI, T.R.F.;

extraction of Bothrops jararaca

52 (1): 17-23, 1990

ISHIZUKA, M.M. Carbon dioxide as an auxiliary in the venom

snakes (Viperidae, Crotalinae). Mem. Inst. Butantan,

cal care was available from the admission up to the conclusion of the ex-

periment. The snakes that died were submitted to necropsy.

Maintenance: The snakes were individually maintained in wooden box¬

es, lined with corrugated cardboard, 50cm in lenght, 40cm in width and

25cm in height, within rooms with the enviromental temperature varying

from a minimum of 19°C to a maximum of 30°C. No control of humidity

was done, and the enviroment was kept under artificial light of fluorescent

type for 8 hs per day. The cleaning of the boxes was done always as soon

as the animal defecated, and once a month, all boxes were substituted

by clean and desinfected boxes. The substitution of boxes was accom-

pained by a general desinfection of the rooms.

Alimentation: Adult albinic mice Mus musculus were given 7 days after

venom extraction, with variable acceptance of the food. Water was daily

exchanged and maintained at disposal of the animais in earthen jugs,

washed and desinfected every second day.

Venom extraction: At first, two lots were set up: Lot I, composed by

24 snakes, i.e., 18 females and 6 males, extracted with the aid of carbon

dioxide anaesthesic. The induction followed the process described by De

Biasi 12 , however individually applied and not in groups. The anaesthetized

animal was considered ready for extraction when it showed itself immobi-

lized, thus impeded to make aggressive movements. Lot II, constituted also

by 24 snakes, 3 males and 21 females, extracted without the help of car¬

bon dioxide. The interval between the extractions was 28 days for both

lots. The manual extraction method described by Belluomini 5 was habi-

tally used in the "Seção de Venenos".

Attainment, weighing and drying of the venom: The venom was col-

lected on individual plates weighed on an analytical precision balance, and

then vaccum dessicated in a Container with calcium chloride for 24 hs,

then again wheighed to determine the dry weight.

Statistical analysis: The test of the difference between two ratios with

normal approach (Z) and the test "t-Student" wete done. The rejection

levei of the nullity hypothesis was established as 0,05.

RESULTS

During the realization of the experiment, 4 deaths were verified in Lot

I, submitted to anaesthesia with carbon dioxide and 2 deaths in Lot II, not

submitted to the action of the gas. Based on these results, the test of Two

Proportions with normal approximation was applied, obtaining the value

of Z = 0,88. This value showed that there was no significance in the number

of deaths in both lots the adopted 5% levei of rejection, during the the 6

months of observation. The results of the necropsies of the snakes that

died, are found in Table 1.

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LEINZ, F.F.; JANEIRO-CINQUINI, T.R.F.; ISHIZUKA, M.M. Carbon dioxide as an auxiliary in the venom

extraction of Bothrops jararaca snakes (Viperidae, Crotalinae). Mem. Inst. Butantan,

52 (1): 17-23, 1990

Table 1

Bothrops jararaca maintained in captivity, causa mortis and treatment.

Treatment

Causa mortis

With gas

Without gas

PNEUMOENTERITIS

GASTROENTERITIS

—

NDN*

—

* NDN = nothing to note

For calculation, the dried venom production was standardized on ac-

count of the very great variation of the snakes' weight. Thus there was

obtained, during the 6 months duration of the experiment, a mean produc¬

tion of 0,3 mg dried venom per weight (g) of the snake that produced the

venom. Table 2

Table 2

Mean values of the dry venom rate (*) according to treatment and venom

extraction of Bothrops jararaca in captivity

Extraction

Treatment

1 °

2 o

3 o

4 o

5 o

6 o

WITH GAS

0,330

0,296

0,300

0,311

0,322

0,367

±_

0,152

0,081

0,121

0,124

0,111

0,159

WITHOUT

0,350

0,283

0,300

0,343

0,357

0,371

GAS

0,147

0,105

0,110

0,147

0,116

0,115

* Weight of dry venom (mg) per weight of the snake (g)

When the dried venom rate produced in relation to sex was compared,

a significant difference was observed between both, the production of fe-

males being larger than that of the males (t = 10,0) for the two lots.

The mean yield of dry venom in relation to the liquid venom in both groups

was 22,8%.

An analysis of successive extractions disclosed a drop in the venom

production during the 2 nd month of extraction, when compared with the

1 st month. Afterwards, there was a gradative increase up to 6 th month,

when the dry venom production became larger than that of the 1 st month

of extraction. Table 2

The mean period of induction was 3 min and that of recuperation, 8 min.

DISCUSSION

The observation showed that the carbon dioxide was efficient as

anaesthetics when a rapid induction and recuperation is desired. It is a prac-

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LEINZ, F.F.; JANEIRO-CINQUINI, T.R.F.; ISHIZUKA, M.M. Carbon dioxide as an auxiliary in the venom

extraction of Bothrops jararaca snakes (Viperidae, Crotalinae). Mem. Inst. Butantan,

52 (1): 17-23, 1990

tical method to eliminate aggressive movements of the snakes, diminish-

ing radically the risk of accidents. Therefore it is well qualified for the neces-

sities of the "Seção de Venenos", where many snakes are handled within

a short time interval.

In relation to the mortality, althought the death rate occurring in both

groups is not significant, an index of 1 6,7% of deaths was verified in the

lot submitted to CO 2 , and 8,3% in the lot not submitted to the gas. This

index may be considered low, since the animais were monthly submitted

to the trauma provoked by venom extraction (Cowan) 11 . Belluomini 4 , cites

a death rate of 81,7% for Bothrops jararaca maintained in captivity at the

"Instituto Butantan" during 1963. For the 5 months duration of the ex-

periment developed by De Biasi 12 , the death rate of Bothrops moojeni

reached and index of 50%. This difference may be atributed to a higher

sensibility of the species, to the changes recently introduced in the manage-

ment and mainly to the methodology adopted by the author, where the

animais were anaesthetized in groups, thus difficulting the observation.

The two method used for the contention of the snakes, led us to analize

the individual production of venom in both groups. The mean weight of

the obtained dry substance maintained itself constant for both groups, cor-

roborating the observations of several authors (Amaral 1 , Klauber 22 ) who

affirmed that there exists a direct connection between the size of the snake

and the production of venom. In Bothrops jararaca, the females produced

more dry matter, not only because they are naturally larger and heavier,

but also because the show proportionally to their weight, a higher rate of

dry matter, when compared with the males, corroborating the observa¬

tion of Deoras 13 .

Snakes maintained in captivity, according to Klauber 22 and Belluomini 3 ,

present a drop in the venom production in the succeeding extractions. Other

authors (Wolf 28 , Kochva 23 , do not admitthis phenomenon, continuing sta-

ble the production. The analysis of the successive extractions of Bothrops

jararaca, either submitted or not to carbon dioxide, disclosed an abrupt

drop in the 2 nd extraction, when compared to the 1 st , and soon after an

increase of the produced dried venom rate. According to Snyder 24 , adap-

tation to an enviroment other than the natural constitues itself in stress,

when there may occur fat consumption in order to maintain the inner

equilibrium of the animal, to an immediate detriment to the vital functions.

The variation in the dry venom weight obtained in this phase, perhaps oc-

curred in consequence of an adaptation period of the animal to captivity.

CONCLUSIONS

1 — The carbon dioxide proved to be practical and efficient for the ven¬

om extraction of Bothrops jararaca diminishing noticeably the risk of acci¬

dents without affecting the survival of the animais and the venom

production.

2 — Females produced more dried venom proportionally to their body

weight then the males.

3 — During the adaptation period to captivity, a drop in venom produc¬

tion was observed.

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LEINZ, F.F.; JANEIRO-CINQUINI, T.R.F.; ISHIZUKA, M.M. Carbon dioxide as an auxiliary in the venom

extraction of Bothrops jararaca snakes (Viperidae, Crotalinae). Mem. Inst. Butantan,

52 (1): 17-23, 1990

RESUMO: Serpentes Bothrops jararaca destinadas à extração periódica

de veneno e mantidas em cativeiro no período de novembro de 1988

a abril de 1989, na Seção de Venenos do Instituto Butantan, foram divi¬

didas em dois lotes: Lote I, composto de 24 serpentes extraídas com

o auxílio do dióxido de carbono como anestésico, e Lote II, constituído

também de 24 serpentes extraídas porém sem o auxílio deste gás. Fo¬

ram analisados os índices de mortalidade, o pêso de veneno sêco pro¬

duzido individualmente, a taxa de veneno sêco em relação ao líquido e

o pêso do veneno sêco obtido em relação ao tempo de cativeiro das ser¬

pentes de ambos os lotes. As observações demonstraram que o dióxido

de carbono foi eficiente como auxiliar na extração de veneno de Both¬

rops jararaca, diminuindo sensivelmente o risco de acidentes sem afetar

a sobrevida dos animais e a produção. A taxa de veneno sêco obtido

das fêmeas foi maior que a dos machos, e o rendimento de matéria se¬

ca em relação à líquida foi de 22,8%. Ocorreu uma pequena queda na

produção rio 2 o mês de cativeiro e em seguida houve um gradativo au¬

mento até o 6? mês.

UNITERMOS: Serpentes, extração de veneno, dióxido de carbono, ca¬

tiveiro.

ACKNOWLEDGMENTS

The authors wish to thank the technicians Zilma L. da Silva e Pedro N.M.

Cerveira for the meticulous weighing and extraction of the venom.

REFERENCES

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Mem. Inst. Butantan

52 ( 1 ): 25 - 31 , 1990

MÉTODO PARA LA IDENTIFICACIÓN INDIVIDUAL

DE BOTHROPS ALTERNATUS DUMÉRIL, BIBRON &

DUMÉRIL, 1854, (OPHIDIA, VIPERIDAE)

EN LABORATORIO

Flavio FRANCINI

Fabio O. PELUSO

Carlos S. GRISOLIA*

RESUMEN: El presente trabajo tiene por objeto dar a conocer un méto¬

do para la identificación individual de Bothrops alternatus en laborato-

rio, basado en el diseno de la región cefálica. Este método permite la

fácil individualización dei ofidio sin necesidad de manipuleo, evitando el

riesgo dei operador y reduciendo el stress dei animal.

UNITERMOS: Ophidia. Bothrops alternatus. Identificación. Diseno ce¬

fálico.

INTRODUCCIÓN

El Laboratorio y Museo de Animales Venenosos de la Facultad de Ciên¬

cias Médicas de la Universidad Nacional de La Plata (LYMAV) cuenta con

un lote de aproximadamente 40 ejemplares vivos de Bothrops alternatus,

alojados en cajas individuales, las cuales poseen un número de registro

permitiendo de ese modo identificarlos con precisión 8 . Periodicamente, es¬

tos ejemplares son sometidos a estúdios que requieren su agrupación en

un mismo ambiente, con lo cual este sistema identificatorio basado en ca¬

racterísticas no ligadas directamente con el animal, resulta ineficaz. Dado

el interés en disponer de un método que permita el reconocimiento indivi¬

dual de los mismos una vez agrupados, surge la necesidad de contar con

alguna técnica de identificación precisa. En ese marco hemos ensayado

numerosos procedimientos tales como la inyección subcutânea de tinta

* Laboratório y Museo de Animales Venenosos

Facultad de Ciências Medicas, Universidad Nacional de La Plata.

Calles 60 y 120 — 1900 — La Plata — Argentina.

Recebido para publicação em 26/7/1989 e aceito em 19/2/1990.

SciELO

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FRANCINI, F.; PELUSO, F.O.; GRISOLIA, C.S. Método para la identificación individual de Bothrops

alternatus Duméril, Bibron & Duméril, 1854 (Ophidia, Viperidae) en laboratorio. Mem. Inst. Bu-

tantan, 52 (1): 25-31, 1990

china 7 ' 14 - 15 , cortes de escamas ventrales 4 ' 5 , aplicación de marcas tipo

ganado como ei marcado "a fuego'' o la fijación de etiqueta (tags) 9 - 1

sin haberse obtenido resultados satisfactorios.

Así aparece ei uso dei método basado en ei diseho cefálico de líneas

o bandas, como solución al problema planteado. Dicho carácter aparenta

ser de variación individual 2 y de fácil observación directa sin necesidad de

manipuleo de los ejemplares, minimizando los riesgos dei operador y los

factores de stress dei animal. Cabe destacar al respecto, el reciente traba-

jo de Sazima 13 donde utiliza las variaciones dei diseho a lo largo dei cuer-

po en Bothrops jararaca, como "marca natural que permite diferenciar a

los indivíduos entre si". Por otro lado, Carlstrom y Edelstam 6 , usando el

patrón de coloración tegumentario en Natrix natrix para su individualiza-

ción, Megan a la conclusión de que el sistema es tan seguro como el méto¬

do de las huellas dactilares usado por la policia.

MATERIAL Y MÉTODO

Se graficaron y fotografiaron 94 ejemplares vivos y formolizados, de di¬

ferentes edades y sexo, pertenecientes al serpentário y colección dei

LYMAV. En cada ejemplar se pueden reconocer tres elementos fundamen-

tales en el diseho dorsal de la región cefálica, a modo de líneas claras so¬

bre fondo oscuro:

a) Una línea transversal al eje de la cabeza y entre los ojos, a la que

denominamos "Línea Interocular";

b) Una línea paralela al eje dei cuerpo más o menos coincidente con

el plano de simetria de la cabeza, desde la Línea Interocular hacia atrás,

y que llamamos "Línea Medial";

c) "Líneas Lateromediales”, que tienen una posición más o menos coin¬

cidentes con la ubicación dei hueso cuadrado, y que van de la región pos-

terolateral de la cabeza hacia adelante y al centro de ésta, hasta converger

sobre la Línea Medial, dividiéndola en "Línea Medial Anterior" y "Línea

Medial Posterior".

A este esquema se le agregan elementos accesorios tales como las "Li-

neas Marginales", que se extienden a ambos lados de la cabeza, desde

la región postorbitaria hacia atrás sobre el borde de aquella hasta aproxi¬

madamente la comisura de la boca; y la "Línea Rostral", que va desde

el margen anterior de un ojo al otro por el borde anterior de la cabeza (Fig. 1 >.

RESULTADOS

A partir de las diferencias en las relaciones entre estos elementos, se

han podido reconocer cuatro patrones básicos que sirvieron como punto

de partida para la confección de un sistema de clave aplicable al lote (Fig. 2).

Dentro de cada uno de estos patrones se observan variaciones indivi-

duales tales como largo y ancho diferencial de las líneas, presencia secun¬

daria de expansiones, abultamientos y/o incisiones, y grado de rectitud o

curvatura de los elementos mayores, lo suficientemente amplias como para

permitir la identificación de un ejemplar problema integrante dei lote (Fig.3).

De acuerdo al material estudiado, no se constato variación en el diseho

de cada ejemplar a lo largo dei tiempo de observación (dos anos), aun des-

pués de las sucesivas mudas.

í, j SciELO

FRANCINI, F.; PELUSO, F.O.; GRISOLIA, C.S. Método para la identificación individual de Bothrops

alternatus Duméril, Bíbron & Duméríl, 1854 (Ophidia, Viperidae) en laboratorio. Mem. Inst. Bu-

tantan, 52 (1): 25-31, 1990

FIG. 1. — Esquema de la relación entre las líneas dei diseno de la región cefálica. LR, Lí-

nea Rostral; LIO Línea Interocular; LMa, Línea Marginal; LMA, Línea Medial An¬

terior; LLM, Línea Lateromedial; LMP Línea Medial Posterior.

FIG. 3. — Variaciones individuales dentro de un mismo patrón.

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SciELCVo

FRANCINI, F.; PELUSO, F.O.; GRISOLIA, C.S. Método para la identificación individual de Bothrops

alternatus Duméril, Bibron & Duméril, 1854 (Ophidia, Viperídae) en laboratorio. Mem. Inst. Bu-

tantan, 52 (1): 25-31, 1990

Por otro lado, se analizó la relación entre el patrón de diseno y el sexo

dei animal no encontrándose correlación alguna.

También se analizaron los disenos cefálicos de un lote compuesto por

20 crias procedentes de la misma madre. En éstas no se observo identi-

dad entre el patrón materno y el de la progenie; incluso se verifico en és¬

tas la presencia de patrones diferentes entre sí.

DISCUSION Y CONCLUSIONES

Según lo expresado por Lewke y Stroud 10 , un buen método de marca¬

do debe cumplir las siguientes condiciones: causar el menor dano y stress

posible al animal, no inhibir el normal movimiento o muda dei mismo, ser

perdurable en el tiempo, de fácil lectura, adaptable a distintas tallas de ani-

males, que pueda ser usado tanto a campo como en laboratorio, asi como

requerir equipo y materiales de fácil obtención o bajo costo.

El método de identificación individual de Bothrops alternatus basado en

el diseno cefálico se ajusta en gran medida a los critérios arriba menciona¬

dos; y ha resultado ser eficaz aplicado al manejo de los ejemplares dei

LYMAV, para separarlos en los casos de mezcla accidental o de agrupa-

mientos con fines científicos o de transporte.

Dada la cantidad de indivíduos examinados, no sabemos si el método

puede aplicarse con igual exactitud a lotes mayores, e incluso, siendo apli-

cable, habría que evaluar su practicidad. De resultar ésto así podría usarse

para estúdios poblacionales a campo a través de la técnica captura — iden¬

tificación — recaptura, tal como lo realizado por Sazima 13 en su trabajo.

Una metodologia similar está siendo intentada sobre un lote de 50 ejem¬

plares de Bothrops neuwiedi. Esta especie posee un diseno cefálico de man¬

chas oscuras sobre fondo castaho claro, aparentemente de variación

individual 1 ' 3 . Aún ésto, las manchas se presentan en forma muy irregu¬

lar, algunas incluso, con sus bordes esfumados, ausentes de definición.

Todo ésto hace difícil la determinación de patrones que permitan el agru-

pamiento de los ejemplares para sistematizar su identificación. Debemos

sumar a ésto el carácter particularmente agresivo de esta especie lo que

complica la visualización y discernimiento dei diseno cefálico. Por lo sena-

lado podemos decir que el método aplicado a B. neuwiedi no posee la misma

practicidad que para B. alternatus.

ABSTRACT: The aim of this paper is to show a method that allows the

individual identification of Bothrops alternatus in the laboratory, based

on the pattern of the cephalic region. The method allows an easy iden¬

tification of the snake without handling, avoiding risk for the worker and

reducing the snake's stress.

KEYWORDS: Ophidia, Bothrops alternatus , Identification, Pattern

cephalic.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Exemplos:

Para livros: autor, título, edição, local de publicação, editor, ano, páginas.

7. BIER, O. Microbiologia e imunologia. 24.ed. São Paulo, Melhoramentos, 1985. 12 3 4p.

Para artigos: autor, título do artigo, título do periódico, volume, página inicial e final, ano.

8. MACHADO, J.C. & SILVEIRA F.°, J.F. Obtenção experimental da pancreatite hemorrágica aguda no cão

por veneno escorpiônico. Mcm. Inst. Butantan, 40/41: 1-9, 1976/77.

As citações no texto devem ser por números-índices correspondentes às respectivas referências bibliográficas.

Exemplos:

... método derivado de simplificação de armadilha de Disney 1

... segundo vários autores 2 ' 3,4

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7. BIER, O. Microbiologia e imunologia. 24.ed. São Paulo, Melhoramentos, 1985. 1234p.

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por veneno escorpiônico. Mcm. Inst. Butantan, 40/41: 1-9, 1976/77.

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