International Society for the Study

and Conservation of Amphibians

(International Society of Batrachology)

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Laboratoire des Reptiles et Amphibiens, Muséum national d'Histoire naturelle, 25 rue Cuvier, 75005

Paris, France. — Tel.: (33).(0)1.40.79.34.87. — Fax: (33).(0)1.40.79.34.88. — E-mail: dubois@mnhn.fr.

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General Secretary: Alain Dusois (Paris, Fra

Deputy Secretary: Annemarie OHLER (Pari

Treasurer: Jean-Louis DENIAUD (Par

Deputy treasur

France).

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Councillors: Britta GRiLLITSCH (Wien, Austria); C. Kenneth Dopp, Jr. (Gainesville, USA); Julio Mario

Hoyos (Bogotä, Colombia): Thierry LODÉ (Angers, France): Jon LOMAN (Lund, Sweden); Alain

PAGANO (Angers, France): Stephen J. RICHARDS (Townsville, Autralia).

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f Alytes: complete set of volumes 1 to 17 (1982-2000) 3060 FF/612S

r (2000-2004, volumes 18 to 22) individual subscription to Alytes 1120 FF/224$

r (2000-2004, volumes 18 to 22) individual subscription to Alytes +

ISSCA + Circalytes 1500 FF / 300 $

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Circalytes, with complete set of back issues of A/vres (1982-2000, volumes 1 to 17) 3500 FF / 700 $

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Important notice: from 1996 on, any new life or patron individual subseriber to Alytes is offered a free

complete collection of back issues of Aytes from the first issue (February 1982) until the start of her/his

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ity of Richmond, Richmond, VA 23173, A (e-mail

. sent to our secretariat

Unive

(804) 289-

Department of Biol

rdesa@richmond.edu: fa

233). Source : MNHN, Paris

AINYTES

INTERNATIONAL JOURNAL OF BATRACHOLOGY

January 2001

Volume 18, N° 3-4

Alytes, 2001, 18 (3-4): 97-126.

Review paper

Quatre décennies

d’expérimentation embryologique

chez les Amphibiens Urodèles

Charles HOUILLON

179 boulevard Voltaire,

75011 Paris, France

Manipulations of embryonic stages have been realised in species of

salamanders (Amphibia, Urodela): the newts Pleurodeles waltl (Michahel-

les, 1830), Pleurodeles poireti (Gervais, 1835), Triturus alpestris (Lau-

renti, 1768), Triturus helveticus (Razoumowsky, 1789), Triturus vulgaris

(Linné, 1758) and Triturus cristatus (Laurenti, 1768), and the axolotl,

Ambystoma mexicanum (Shaw, 1789).

Tolerance or rejection of implants of embryonic tissues, such as skin

grafts, depends on the degree of histocompatibility between the seven

species. The axolotl acts as a “universal donor” for the other newts. The

tolerance of presumptive gonadal primordia results in the emission of eggs

of one species by another species.

The survival of heterospecific parabiotic pairs confirms the relative

histocompatibility observed with skin grafts. The metamorphosis of axolotl

forming a parabiosis with a Triturus species is caused by thyroïd hyperse-

cretion of the newt.

Ofthe 49 combinations forming potentially possible chimeras between

embryos of the seven species, 4 allogenic combinations (chimeras between

embryos of the same species) have actually been successfully realised (over

570 chimeras reaching from 4 months to 15 years of age), as well as

23 xenogenic combinations (chimeras of embryos of different species)

(536 chimeras reaching from 3 months to 7 years of age). The allogenic

chimeras are viable at the same level as normal animals. Chimera constructs

of double body have two pairs of gonads. In homosexual combinations, the

animals have either 4 functional ovaries or 4 functional testes (germinal

chimeras). In heterosexual combinations, the interactions between gonads

of different sexes depend on their relative position: free-martin effect

inhibition and even inversion of ovaries) is observed when the ovaries are

anterior relative to testes. This effect is weak and often even absent when

the ovaries are posterior relative to testes. In this case the development of

posterior ovaries is scarcely modified by the anterior testes.

The survival of xenogenic chimeras depends on the species combination

and on the direction of the association. À xenogenic chimera that reaches

À BIBL. DU

\MUSÉUM

PARIS

DET00

6 660

[ll

unesny 21841089

AR! Source : MNHN, Paris

< /

ALYTES 18 (3-4)

the adult stage can show the sexual behaviour of the species that forms its

anterior part and of the species that forms its posterior part.

Salamanders, showing only exceptionally spontaneous tumours, deve-

lop teratomas after implantation of embryos, allogenic or xenogenic, in the

coelomic cavity of young larvae. Some of these experimental tumours

remain benign, but others destabilise, becoming teratocar(

Ovaries taken from juvenile animals and transplanted into young

animals, either castrated males or castrated females, can be indefinitely

tolerated, even if they form xenotransplants.

The tolerance of axolotl ovaries by Pleurodeles allows the systematic

emission of axolotl eggs by Pleurodeles. After artificial fertilisation, the

egas, which have completed their entire growth in a foreign organism, show

an apparently normal development.

The relative histocompatibility of embryonic xenografts, the survival of

parabiotic pairs and xenogenic chimeras, the free-martin effect of position

in interactions between gonads, the formation and destabilisation of exper-

imental teratomas are phenomena that remain unexplained.

The anatomical specimens arising from the described experiments are

classified and stored in the collection of the Laboratoire des Reptiles et

Amphibiens of the Muséum national d'Histoire naturelle, Paris.

SOMMAIRE

Matétielét Méthodes .on 2 sente crane Dico Mure On ner 99

Grefes de téguments embryonnaires et d'ébauches présomptives …............. …. 01

ATIOBTETES enr desc danibenues annee et arr ge 101

Xénogrefl

Parabioses-as. 4, MIEL RE Me ie re mere tee Mrs eesss US

Allogéniques

Xénogéniques

GHIMÉRES te es ads E RE RES RCE EURE se 4530 108

Tératomes et tératocarcinomes expérimentaux

Allogéniques .......... étiez D tereté in RTC AES PRET ete aorgt CAO

OU UC DOM PL DERR ER ENS GR) PRE LE. CEE A nl

Allogéniques

Xénogéniques

Transplantations oVariennes. 2325.10 e dede ne cit ttes an 118

AIOBÉNIQUES rites een SAR eat tue EPS e Rasa n 119)

ÉD OÉIQUES. Bas ea dde En aan 119

Autres interventions embryonnaires ...... PT ST ANS Re hrs Sa Ne © 1207

Organogenèse de la gonade ................... AN UE LAN OR …… 120

Formation du canal de Müller ................. D AA RER PES à CAL

Inversion du phénotype sexuel femelle par la température .......... 1 21

Source : MNHN, Paris

HOUILLON 99

Clonage du pleurodèle à partir du noyau des cellules germinales .............. 121

Expérience SEERTIDE Pas HR Porn ae A nd on Mine Enr creer Bet el 122

CONClUSIONS 2 Mauaue cernes nantes berne te and eds re tite à 122

RÉSUMÉ user dsl tnnes rss ne na rene aise e ee she 123

Remerciements. 2340 HR Te Re UE re nette ER aae 124

Références DIDHOSTAPRIQUES 1 24e de eaes eur armegtecs paeesansnerensras reel 125

INTRODUCTION

L'embryologie descriptive prit son essor à la suite des idées évolutionnistes à partir du

dernier tiers du 19° siècle. Elle fut aussitôt suivie par l'embryologie expérimentale, aussi

appelée embryologie causale, dès la fin du même siècle. A ce propos, il est bon de rappeler

CHaBRY (1887), qui imagina le micromanipulateur pour détruire l’un des deux premiers

blastomères de l'oeuf d'ascidie. Peu après, DRIESCH (1891) réussit à séparer les deux premiers

blastomères de l'oeuf d'oursin. Mais, dès cette époque, l'oeuf d’amphibien s'imposa comme

matériel particulièrement favorable pour les mêmes interventions précoces grâce à Roux

(1895) et l’école allemande. Faisant preuve de beaucoup d’audace pour l'époque, BORN (1897)

tenta d’associer des hémi-embryons afin de fabriquer des germes composites qui survécurent

quelques semaines. Puis SPEMANN, par des manipulations encore plus fines sur l'oeuf de triton

à propos de l'organogenèse de l'oeil (1901) et surtout avec la greffe de la lèvre dorsale du

blastopore (1921), donna ses lettres de noblesse à l'embryologie expérimentale.

La faveur pour cette discipline ne s'est jamais démentie durant tout le 20° siècle. C'est

ainsi que BRIGGS & KING (1952) avec Rana catesbeiana furent les pionniers de la transplan-

tation nucléaire. On oublie trop souvent que les premiers vertébrés clonés furent des amphi-

biens tant anoures qu'urodèles, il y a plus de 40 ans! A partir des années 1960, l'oeuf des

mammifères trouva sa place de choix dans la discipline avec les souris tétraparentales de

TARKOWSKI (1961) et de MiNTZ (1962). Est-il besoin de rappeler la remarquable actualité de

la greffe nucléaire qui vient d'être adaptée à l'oeuf de mammifère? Le clonage avec ses

problèmes de toutes natures garantit de belles perspectives pour l'embryologie à l'aube du

21 siècle.

_Le propos de la présente revue concerne des greffes embryonnaires les plus diverses

chez les amphibiens urodèles, avec comme originalité d’être pratiquées entre espèces

différentes. De telles greffes sont encore irréalisables chez les mammifères.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

L'intérêt des amphibiens pour la microchirurgie embryonnaire tient à un ensemble

d'avantages exceptionnels chez les vertébrés: (1) oeufs pondus en abondance (quelques

dizaines pour les tritons, quelques centaines pour le pleurodèle et l'axolotl): (2) oeufs obtenus

ons par injections hormonales (hormones gonadotropes ou mieux

#À

souvent en toutes

Source : MNHN, Paris

100 ALYTES 18 (3-4)

encore, facteurs hypothalamiques); (3) oeufs relativement volumineux dont le diamètre est

compris entre un et deux millimètres alors que l’oeuf de mammifère ne dépasse guère un

dixième de millimètre; (4) possibilité de fécondation artificielle; (5) facilité d’accès à l’oeuf ou

à l'embryon après dégangage: (6) développement en milieu externe d’où commodité d’une

observation continue; (7) développement assez lent qui peut être légèrement ralenti ou

ac é en fonction de la température; (8) élevage facile une fois maîtrisés les paramètres

relatifs à la nourriture et à la qualité de l’eau: (9) élevage des animaux expérimentaux jusqu’à

l'état adulte ce qui permet d'envisager leur reproduction; toutefois, celle-ci n’est le plus

souvent réalisable que vers l’âge de deux ans.

Les interventions sur les embryons ou les animaux juvéniles rapportées dans cet article

ont été, pour la plupart, effectuées par l’auteur dans le laboratoire de Biologie Animale-

Embryologie de l'Université Pierre et Marie Curie. Elles ont concerné sept espèces d’amphi-

biens urodèles dont six pour la famille des Salamandridae Goldfuss, 1820 (Pleurodeles et

Triturus) et une pour la famille des Ambystomatidae Gray, 1850 (axolotl): Pleurodeles waltl

(Michahelles, 1830), pleurodèle de Waltl (P.w.); Pleurodeles poireti (Gervais, 1835), pleurodèle

de Poiret (Pp.); Triturus alpestris (Laurenti, 1768), triton alpestre (alp.); Triturus helveticus

(Razoumowsky, 1789), triton palmé (palm.); Triturus vulgaris (Linné, 1758), triton commun

(vulg.): Triturus cristatus (Laurenti, 1768), triton crêté (cr.); Ambystoma mexicanum (Shaw,

1789), axolotl (Ax.).

Avec l’axolotl on dispose de plusieurs souches dont la pigmentation dépend de deux

couples de gènes allélomorphes, utilisables comme marqueurs pigmentaires pour suivre

l'évolution des greffes (LESIMPLE et al., 1990):

(1) souche “sauvage” (DA/DA): oeufs, embryons, larves et adultes pigmentés;

(2) souche “blanche” (dA/dA): oeufs et embryons pigmentés, larves et adultes dépigmen-

tés par suite de l'absence de migration et du non-étalement des cellules pigmentaires, en

particulier des mélanophores:

(3) souche “albinos sauvage” (Da/Da): oeufs et embryons albinos, larves et adultes

jaunâtres par suite de la présence de xanthophores et d'iridophores mais absence de mélano-

phores (pas de synthèse de mélanine);

(4) souche “albinos blanche” (da/da): oeufs, embryons, larves et adultes dépigmentés.

La terminologie employée est celle propre aux greffes en immunologie: les allogreffes ou

greffes allogéniques sont des interventions entre individus de la même espèce et les xénogrefles

ou greffes xénogéniques sont des interventions entre individus d'espèces différentes. Par

exemple, le terme ‘allogénique a employé pour des interventions entre embryons d’axo-

lotl même s'ils sont de souches différentes et le terme “xénogénique” sera employé pour des

interventions entre embryons d’axolotl et embryons de tritons.

de pleurodèles sont élevées en

de tritons proviennent direc-

Les différentes souches d’axolotl et les deux espèce

permanence au laboratoire. En revanche, les différentes espè

tement de la nature où elles sont récoltées au printemps; ces animaux sont remis dans leurs

mares d’origine quelques mois plus tard, après avoir servi de prog

La technique opératoire sera précisée à propos de chaque type d'intervention. La

méthode générale relève de la microchirurgie embryonnaire classiquement appliquée aux

Source : MNHN, Paris

HOUILLON 101

amphibiens. Le maximum d’asepsie est requis en particulier la stérilisation des milieux

physiologiques opératoires (milieu de Holtfreter et milieu de Steinberg). Les interventions se

font dans des coupelles opératoires sur fond de gélose ou plus commodément sur fond de pâte

à modeler et en utilisant une loupe binoculaire aux grossissements 10, le plus souvent 16, mais

rarement davantage. Les instruments destinés aux interventions sur les embryons sont de

simples fils de platine (diamètre 3 ou 4 centièmes de millimètre) emmanchés sur des tubes de

verre.

Les interventions sur les embryons se pratiquent au stade du bourgeon caudal, avant la

réponse musculaire, les germes étant âgés de 4 à 5 jours selon les espèces et la température

ambiante. Seuls sont gardés les embryons parfaitement cicatrisés 24 heures après l'opération.

Ils séjournent ensuite pendant 3 à 5 jours dans le milieu d'élevage (liquide opératoire dilué au

1/10 dans l’eau ordinaire). Après quoi, ils peuvent être mis définitivement dans l’eau ordinaire

car ils atteignent pratiquement le stade de l’éclosion tout comme s'ils étaient demeurés dans

les conditions naturelles. La première alimentation intervient environ 8 jours plus tard.

Dans la plupart des cas, l'analyse ne porte que sur les animaux expérimentaux qui

survivent au moins jusqu'à l’âge de trois mois, ce qui correspond le plus souvent à l'époque de

la métamorphose. L'élevage se poursuit le plus longtemps possible, au moins jusqu'à l’état

adulte mais parfois pendant plus de dix années.

La pratique de la microchirurgie embryonnaire des amphibiens ne demande guère

d’aptitudes particulières si ce n’est une certaine dextérité, beaucoup de persévérance pour

refaire maintes fois le même type d'expérience et surtout une grande disponibilité afin de

pouvoir utiliser en temps utile des embryons appartenant à des espèces différentes et aux

stades opératoires convenables. Il est nécessaire de bien connaître les conditions de reproduc-

tion des progéniteurs lorsqu'on désire disposer d’une ponte de pleurodèle en même temps que

d’une ponte d’axolotl ou de triton, ou encore disposer simultanément de plusieurs pontes

d’axolotl provenant de souches différentes. La connaissance de la chronologie du développe-

ment de chaque espèce est indispensable. Dans l'exposé ci-dessous, le mot “pleurodèle”,

utilisé seul, se rapporte à Pleurodeles walil, espèce la plus fréquemment utilisée dans nos

expériences.

GREFFES DE TÉGUMENTS EMBRYONNAIRES ET D'ÉBAUCHES PRÉSOMPTIVES

ALLOGREFFES

L'intervention la plus banale consiste à prélever un lambeau de tégument sur un

embryon pour le greffer sur un autre embryon après avoir éliminé le territoire équivalent. 11

s’agit d’une allogreffe qui peut être réalisée entre un embryon d’axolotl de la souche albinos

(embryon donneur dépigmenté) et un embryon de la souche blanche (embryon receveur

pigmenté) (fig. 1). Par la suite, l'embryon receveur évolue en larve puis en adulte “blanc” car

les mélanophores bien que présents ne migrent pas et ne s'étalent pas. En revanche, le greffon

qui originellement ne possédait pas de mélanophores, va se pigmenter intensément

strat convenable, il attire les mélanophores de l'hôte qui peuvent s'étaler :

“albino

car, possédant un su

Source : MNHN, Paris

102 ALYTES 18 (3-4)

aa dd

Fig, 1. - Allogrefle de tégument et d'ébauche gonadique présomptive entre un embryon d'axolotl de la

souche albinos (aa) et un embryon de la souche blanche (dd) (voir Matériel et méthodes pour la

définition de ces souches).

un greffon “albinos” sur un hôte “blanc” devient très rapidement noirâtre (fig. 4). Et pourtant

le greffon garde bien sa structure albinos originelle! En effet, en même temps que le tégument,

on peut greffer la partie sous-jacente qui correspond à l'ébauche présomptive de la gonade. Si

on se trouve dans le cas particulier, réalisé une fois sur quatre, d’une ébauche présomptive

ovarienne “albinos” greffée sur un embryon femelle “blanc”, l’'ébauche greffée évolue en

ovaire tout comme la gonade de l'hôte située du côté non-opéré. Cet axolotl femelle blanc

possède un ovaire avec des ovocytes pigmentés du côté non-opéré et un ovaire avec des

ovocytes albinos du côté opéré. Finalement un tel animal peut pondre, en même temps que ses

propres oeufs pigmentés, des oeufs dépigmentés provenant de la greffe ovarienne (fig. 5)

(HOUILLON & BAGNARA, 1996).

Une sorte de contre-épreuve de l'expérience ci-dessus est apportée par l’allogreffe de

crête neurale dont sont issues les cellules pigmentaires. Un fragment de crête neurale prélevé

sur une neurula de la souche blanche peut être greflé à l'emplacement équivalent d’une

neurula de la souche albinos (fig. 2). L’embryon hôte évolue normalement en larve puis en

adulte albinos mais, peu avant le stade de l’éclosion, on observe l'apparition de mélanophores

au voisinage puis ultérieurement assez loin de la greffe. L'hôte albinos se trouve plus ou moins

localement pigmenté par les mélanophores issus du greffon blanc qui trouvent dans cet hôte

le substrat nécessaire à leur migration et à leur étalement. Ainsi, un axolotl albinos peut être

partiellement pigmenté par une allogreffe de crête neurale de la souche blanche (fig. 6). Des

phénomènes migratoires comparables s’observeront chez les chimères allogéniques entre les

axolotis de la souche blanche et les axolotis de la souche albinos.

XÉNOGREFFES

Les xénogrefles de téguments embryonnaires sont réalisables selon le même protocole

que les allogreffes entre le pleurodèle, l'axolotl et les tritons (fig. 3). L'hôte poursuit son

s son

développement normal et le greffon se différencie conformément à son origine, ma

évolution à plus long terme dépend du sens de la greffe.

Le cas le plus remarquable, encore inexpliqué, est la tolérance parfaite et indéfinie des

xénogreffes embryonnaires d’axolotl aussi bien sur le pleurodèle (fig. 7) que sur les diverses

espèces de tritons. A l'inverse, les xénogrefles embryonnaires de pleurodèle aussi bien que de

Source : MNHN, Paris

HOUILLON 103

dd aa

Fig. 2. - Allogrefe de crête neurale d'une neurula d’'axolotl de la souche blanche (dd) sur une neurula de

la souche albinos (aa).

AXOLOTL PLEURODÈLE

Fig. 3.- Xénogreffe de tégument et d'ébauche gonadique présomptive entre un embryon d’axolotl et un

embryon de pleurodèle.

tritons sont inéluctablement rejetées par l'axolotl après une tolérance de quelques mois. Le

rejet des xénogreffes embryonnaires par l’axolotl peut intervenir brutalement en quelques

jours, entraînant la mort de l'hôte. Dans les autres cas, surtout entre le pleurodèle et les tritons,

le rejet intervient plus ou moins lentement, permettant aux téguments rejetés d'être progres-

sivement remplacés par les téguments de l'hôte.

Il découle de cette étude la notion d'“histocompatibilité relative” entre les différentes

espèces d’urodèles, qui va en décroissant dans le sens axolotl, triton palmé, triton alpestre,

pleurodèle (HOUILLON, 1967; HoUILLON et al. 1969). L'axolotl peut être considéré comme

“donneur universel” pour les xénogreffes embryonnaires, mais il ne tolère que les allogreffes

embryonnaires, c'est-à-dire de sa propre espèce.

La tolérance pour les xénogrefles de téguments embryonnaires se retrouve pour les

xénogreffes d'ébauches présomptives. Ainsi, en même temps que les téguments d’axolotl, on

peut prélever l'ébauche présomptive sous-jacente de la gonade (HOUILLON, 1973). Dans le cas

particulier où il s'agit d’une ébauche ovarienne greffée sur un embryon femelle de pleurodèle

ou de triton, cette ébauche se différencie en ovaire tout comme la gonade de l'hôte située du

Source : MNHN, Paris

104 ALYTES 18 (3-4)

Greffes de téguments embryonnaires et d'ébauches gonadiques présomptives.

Barre = 20 mm

albinos” sur un axolotl “blanc”. Les

dans le greffon

Fig. 4. - Greffe allogénique de tégument embryonnaire d'axolotl

mélanophores de l'hôte “blanc”, qui ne migrent pas et ne s'étalent pas, sont “attirés

“albinos” où ils peuvent s'étaler (12 mois, 190 mm)

Source : MNHN, Paris

HOUILLON 105

côté non-opéré. On obtient un pleurodèle ou un triton femelle qui possède un ovaire normal

du côté non-opéré et un ovaire d’axolotl du côté opéré (fig. 9). Le pleurodèle pondra en même

temps ses propres oeufs et des oeufs d’axolotl (fig. 8), mais les oeufs d’axolotl sont trop gros

pour être pondus par un triton.

PARABIOSES

ALLOGÉNIQUES

La greffe en parabiose (BURNS, 1925) consiste à souder deux embryons entiers (fig. 10)

pour établir une circulation croisée entre deux animaux afin de mimer le phénomène free-

martin des Bovidés. Lorsqu'une vache donne naissance à deux veaux de sexe différent, par la

suite le mâle peut procréer normalement dans la majorité des cas alors que la femelle est le

plus souvent stérile. L'interprétation de ce phénomène (LiLLIE, 1916) est qu'à la suite d’une

fusion placentaire des anastomoses vasculaires s’établissent très précocement, permettant une

circulation croisée entre les deux foetus. Or, comme la différenciation sexuelle mâle s'effectue

la première, les facteurs responsables de cette différenciation diffusent dans le jumeau femelle,

inhibent la différenciation des ovaires et même provoquent leur masculinisation.

La soudure de deux embryons d'amphibiens peut se faire latéralement au niveau des

flancs (parabiose proprement dite) (fig. 11-13) ou par les extrémités caudales (télobiose)

Fig. 5. - Greffe allogénique de tégument et d'ébauche ovarienne présomptive d’axolotl “albinos” sur un

axolotl femelle “blanc”, L'hôte “blanc” pond des oeufs pigmentés provenant de l'ovaire situé du côté

non-opéré et des oeufs dépigmentés provenant du greffon ovarien toléré (12 mois, 190 mm,

photographie 8 jours après la ponte).

Fig. 6. - Allogreffes de crête neurale d’axolotl “blanc” sur des axolotis “albinos”. Les mélanophores

d’axolotl blanc trouvent dans les axolotis albinos le substrat nécessaire à leur migration et à leur

étalement. Le greffon “blanc”, non pigmenté, est bien visible sur l'animal de gauche, légèrement en

arrière de la tête et à gauche (2 ans, 190 mm). Un axolotl albinos peut être pigmenté par une greffe

d’axolotl blanc!

Fig. 7. - Greffe xénogénique de tégument d'axolotl blanc sur le pleurodèle. Tolérance indéfinie des

xénogreffes embryonnaires d'axolotl sur le pleurodèle (4 ans, 180 mm).

Fig. 8. - Ponte simultanée d'oeufs de pleurodèle (Pan). les plus nombreux et les plus clairs (1.4 mm) et

d'oeufs d’axolotl (Ax.). les plus gros et les plus foncés (1.8 mm), par un pleurodèle femelle qui a toléré

une ébauche ovarienne présomptive d'axolotl.

Fig. 9. - Dissection d’un triton alpestre femelle qui avait reçu une xénogreffe embryonnaire d'ébauche

ovarienne présomptive d’axolotl indéfiniment tolérée. Du côté droit non-opéré, ovaire de triton

alpestre à maturité sexuelle: du côté gauche grefé, ovaire d'axolotl (Ax.) à maturité sexuelle ainsi

qu'un élément ovarien postérieur de triton alpestre (alp.). Les ovocytes d'axolotl sont trop volumi-

neux pour pouvoir transiter dans les oviductes de triton alpestre (7 ans. 100 mm).

Source : MNHN, Paris

106 ALYTES 18 (3-4)

logete dns

PARABIOSE à oàie à modeir

ca CS

piae

oo) C

Opération

Cicatrisation

logerte dans

TÉLOBIOSE la pâte à modele”

Operation V/. Cicatrisation

“ig. 10. - Principe de la greffe en parabiose entre deux embryons de pleurodèle.

(fig. 14-15). La parabiose allogénique, plus communément appelée parabiose homospécifique,

est assez facilement réalisable chez le pleurodèle, l’axolotl et le triton alpestre. Les paires

parabiontiques ont un développement normal: certaines parabioses pleurodèle/pleurodèle

ont survécu plus de six ans. Cependant des anastomoses digestives dues à une soudure trop

intime des deux parabiontes abrègent souvent la survie.

XÉNOGÉNIQUES

La survie des parabioses xénogéniques est nettement plus brève que celle des parabioses

allogéniques et dépend des espèces associées. Le maximum observé a été de trois ans pour

Parabioses allogéniques.

Barre= 20 mm, sauf pour la fig. 11.

Fig. 11. - Parabiose entre un embryon d'axolotl de la souche albinos (aa) et un embryon de la souche

blanche (dd), 24 heures api

Fig. 12. - Parabiose entre un axolotl de la souche albinos (aa) et un axolotl de la souche blanche (dd)

Noter la migration au niveau de la soudure des mélanophores de l'axolotl blanc qui se sont étalés

localement dans le parabionte albinos (2 ans, 180 mm).

s l'opération.

Fig. 13. - Parabiose entre deux tritons alpestres (1 an, 85 mm).

Source : MNHN, Paris

HOUILLON 107

Fig. 14. - Télobiose entre un axolotl de la souche sauvage (DD) et un axolot] de la souche blanche (dd)

(5 ans).

Fig. 15.- Télobiose entre deux pleurodèles (6 ans).

Source : MNHN, Paris

108 ALYTES 18 (3-4)

des parabioses pleurodèle/triton alpestre. La métamorphose, légèrement plus tardive par

rapport aux conditions normales, est rigoureusement synchrone pour les deux parabiontes.

A cette époque ou peu après, l’un des parabiontes est souvent victime de phénomènes de

rejet de la part de son partenaire et sa nécrose entraîne la létalité de l'association. La tolé-

rance dans la parabiose xénogénique relève de la même histocompatibilité relative que celle

rencontrée pour les xénogreffes embryonnaires (HOUILLON, 1966). Par exemple, les parabioses

entre les différents tritons, assez proches du point de vue de l’histocompatibilité, ont une

longévité bien supérieure aux parabioses entre l’axolotl et le pleurodèle peu histocompatibles

(fig. 16).

L'effet free-martin se manifeste dans les parabioses xénogéniques hétérosexuées comme

dans les parabioses allogéniques hétérosexuées, mais son analyse est beaucoup plus délicate.

En plus des phénomènes d’histocompatibi nterviennent d’autres paramètres tel que le

volume des gonades quand une espèce de grande taille est mise en parabiose avec une espèce

de petite taille, de même que les différences d'ordre chronologique de la différenciation

sexuelle d’une espèce par rapport à l’autre.

L'observation la plus remarquable concerne les parabioses entre l’axolotl, habituelle-

ment néoténique, et les tritons alpestre ou palmé (fig. 17), qui se métamorphosent naturelle-

ment vers l’âge de dix semaines. Lorsque de telles associations survivent assez longtemps, la

métamorphose intervient en quelques jours et d’une manière parfaitement synchrone pour les

deux parabiontes vers l’âge de dix mois. L'étude histologique a révélé que la thyroïde du triton

était hyperactive alors que la thyroïde de l’axolotl demeurait dans le même état que celle d’un

axolotl néoténique (CHARLEMAGNE & HOUILLON, 1966). Ceci signifie que le complexe

hypophyse-thyroïde du triton est hyperfonctionnel afin d'assurer en même temps la métamor-

phose des deux parabiontes, cependant que le complexe hypophyse-thyroïde de l’axolotl

demeure au repos. La sécrétion thyroïdienne du triton doit être particulièrement abondante

pour provoquer d’une part sa propre métamorphose et d’autre part celle de l’axolotl souvent

six à dix fois plus volumineux (fig. 18).

CHIMÈRES

Entre la greffe d’une ébauche embryonnaire et la soudure de deux embryons complets, il

existe un moyen terme qui consiste à prendre deux hémi-embryons pour reconstituer un

embryon composite. L'animal ainsi obtenu est une “chimère” au vrai sens étymologique.

Chez un tel animal on ne peut pas définir quelle est la partie “donneur” par rapport à la partie

“receveur”, on ne discerne pas le greffon de l'hôte. La greffe embryonnaire en chimère consiste

à sectionner transversalement deux embryons au stade du bourgeon caudal pui ocier la

partie antérieure de l’un avec la partie postérieure de l'autre (fig. 19). Selon l'importance de

chaque hémi-embryon on réalise une chimère à corps simple lorsque les parties antérieure et

postérieure sont complémentaires mais, à la limite, on réalise des chimères à corps double

quand on associe un embryon dont on a éliminé le bourgeon de queue avec un embryon dont

on a éliminé la tête. Toutes les associations entre ces deux extrêmes sont concevables (CHAR-

LEMAGNE & HOUILLON, 1974).

Source : MNHN, Paris

HOUILLON 109

€

17 18

Parabioses xénogéniques.

Barre= 20 mm.

Fig. 16. - Télobiose entre un axolotl et un pleurodèle (P:w.). Le pleurodèle (à droite) est en cours de rejet

(5 mois, axolotl: 60 mm).

Fig. 17.- Parabiose xénogénique, non métamorphosée, entre un axolotl blanc et un triton palmé (palm)

(7 mois, axolotl: 70 mm).

Fig. 18. - Axolotl métamorphosé de la souche blanche en parabiose avec un triton alpestre (alp.) (12 mois,

axolotl: 70 mm).

Source : MNHN, Paris

110 ALYTES 18 (3-4)

CHIMÈRES ALLO GÉNIQUES

Éoins-simple tiéciproqus | corps double {longue

CHIMÈRES XÉNOGÉNIQUES

corps double {longue

corps simple (réciproque

Fig. 19. - Principe de la greffe en chimère à corps simple et à corps double entre embryons de la même

espèce (chimères allogéniques) et entre embryons d'espèces différentes (chimères xénogéniques).

Depuis les premières chimères obtenues au cours des années 1960 (HOUILLON, 1964a-b,

1965) jusqu'aux dernières réalisées avec trois tronçons d'embryons différents (fig. 20) (trichi-

mères; HOUILLON, 1984), les associations les plus diverses ont été réalisées. A partir de sept

espèces différentes d’urodèles, on peut concevoir 49 associations chimères à corps simple

comme à corps double. Il y a théoriquement sept associations allogéniques dont quatre ont

effectivement été réalisées avec P waltl, P. poireti, T. alpestris et A. mexicanum. Sur 42

associations xénogéniques théoriquement concevables, 23 ont effectivement été réalisées

(HOUILLON, 1999).

Une chimère est désignée par l'abréviation de sa partie antérieure et l’abréviation de sa

par exemple, “P.w.- Pw.” est une chimère oRAqse partie & antér ieure té

ialtl-partie pos

waltl-partie postérieure T: alpest

précédente.

Dès que la prise de nourriture est assurée, soit une quinzaine de jours après l'opération,

les chimères allogéniques à corps simple et à corps double ont une viabilité comparable à celle

des animaux témoins, et 50 % d'entre elles atteignent l'âge d'un an. De nombreuses chimères

allogéniques ont vécu plus de quatre mois: plus de 300 P.w.-P.w. (fig. 22), plus de 150 Ax.-Ax.

(fig. 23-25), 90 alp.-alp. et 30 P.p.-Pp. L'âge maximum atteint par ces chimères a été respecti-

vement de 15, 10,6 et 5 ans.

Les chimères allogéniques ont été surtout réalisées en vue d'analyser les interactions

entre glandes génitales, plus particulièrement chez les animaux à corps double (HOUILLON &

CHARLEMAGNE, 1971: HOUILLON et al., 1973; HOUILLON, 1977, 2000; HOUILLON & DOURNON,

Source : MNHN, Paris

HOUILLON 111

Fig. 20. - Trichimères entre embryons d’axolotl de la souche albinos (a) et embryons de la souche sauvage

(D).

1986) (fig. 21). Dans la combinaison homosexuée femelle antérieur-femelle postérieur (9-2),

les chimères sont pourvues de quatre ovaires, et dans la combinaison homosexuée mâle

antérieur-mâle postérieur (4 -d ), les chimères ont en général quatre testicules. Le point le plus

intéressant concerne les combinaisons hétérosexuées car il s’agit d'animaux bien viables chez

lesquels des laparotomies successives au cours de leur existence permettent de suivre l’évolu-

tion du tractus uro-génital. Le résultat essentiel, mais imprévu et encore inexpliqué, est que

l'effet free-martin dépend de la position des ovaires par rapport aux testicules ainsi qu'il est

résumé dans le tableau 1 (HOUILLON, 2000).

Dans la combinaison hétérosexuée femelle antérieur-mâle postérieur (9-8), les ovaires

antérieurs sont totalement inhibés (fig. 28) et peuvent même être inversés en testicules sous

l'effet des testicules postérieurs normaux. Dans la combinaison hétérosexuée mâle antérieur-

femelle postérieur (4-2 ), les testicules antérieurs normaux inhibent peu l'évolution ovarienne

postérieure, à un tel point que l'on observe des animaux hermaphrodites avec des testicules

antérieurs et des ovaires postérieurs à maturité sexuelle (fig. 29).

Certaines associations allogéniques pour les combinaisons homosexuées sont des “chi-

mères germinales”, c'est-à-dire qu'elles peuvent émettre à la fois les gamètes en provenance de

la partie antérieure et les gamètes en provenance de la partie postérieure. Ceci a été observé

pour des chimères femelles Ax.-Ax. (®-®), qui pondaient en même temps des oeufs albinos

sus des ovaires antérieurs et des oeufs pigmentés issus des ovaires postérieurs. De même, à

partir de croisements appropriés en utilisant les marqueurs de la pigmentation, il a été

démontré que leschimères mâles Ax.-Ax. (4-8 )émettaient en même tempsles spermatozoïdes

issus des testicules antérieurs et les spermatozoïdes issus des testicules pi il

XÉNC

iÉNIQUES

Plus délicates à réaliser par suite de la différence de taille des embryons et surtout à cause

des degrés d’histocompatibilité, les chimères xénogéniques ont une longévité bien moindre

que les chimères allogéniques. Ainsi, s’il est relativement commode de réaliser des chimères

entre pleurodèles et tritons (fig. 24), la plupart des chimères entre pleurodèles et axolotis,

comme pour les parabioses, sont difficilement viables. D'une manière générale, seulement

20% des animaux bien cicatrisés le lendemain de l'opération atteignent l'époque de la

métamorphose vers 3 mois et cet âge également pour les chimères avec une partie antérieure

axoloti qui ne se métamorphosent jamais (fig. 26). Sur les 536 chimères xénogéniques prises en

Source : MNHN, Paris

112

corps double

ALYTES 18 (3-4)

combinaisons

homose xuées

combinaisons

hétérosexuées

corps simple

Fig. 21. - Combinaisons sexuelles chez les chimères allogéniques à corps double et à corps simple.

Tableau 1. - Interaction entre glandes génitales de sexe différent chez les Urodèles chimères.

Combinaison sexuelle | Type de chimère Partie antérieure Partie postérieure

Forte inhibiti ie :

Corps double orte inhibition ovarienne Testicules normaux

Ca ou inversion ovarienne

Corps simple Inversion ovarienne Testicules normaux

ee Re

Corps double Testicules normaux Inhibition oyARenne: <rne

ou rare inversion

Corps simple Ft HOrHAIRE Inhibition ovarienne + faible

ou légère réduction ou fréquente inversion

Source : MNHN, Paris

HOUILLON 113

compte à partir de trois mois, ilen restait 181 à un an (34 %) mais seulement 23 (4,3 %) à l’âge

de quatre ans (HOUILLON, 1999).

L'analyse des interactions dans la sphère uro-génitale est aussi délicate que pour les

parabioses xénogéniques car en plus les retards de croissance sont fréquents. A ce sujet, il a été

remarqué que la taille des chimères xénogéniques demeurait harmonieuse même quand une

espèce de grande taille, par exemple le pleurodèle, était associée avec une espèce de petite taille,

par exemple le triton vulgaire. La partie à laquelle appartient l'espèce de grande taille semble

ralentir sa croissance pour s'adapter à la partie qui appartient à une espèce de petite taille

(fig. 27).

La maturité sexuelle n’a pas encore été observée chez les chimères xénogéniques à corps

double, mais elle a été souvent observée chez les chimères xénogéniques à corps simple.

Notons que par suite de la technique opératoire, le prélèvement de la partie antérieure se

faisant toujours en avant de la région génitale présomptive, ces animaux ne possèdent que les

gonades de la partie postérieure. Une fois adultes, les chimères xénogéniques à corps simple ne

seront jamais “germinales” puisque leurs gamètes ne peuvent provenir que de leur partie

postérieure. Sur 268 chimères xénogéniques à corps simple, près de 20 % ont atteint la

maturité sexuelle dont 25 mâles sur 136 et 26 femelles sur 132.

Le comportement sexuel de ces chimères est particulièrement remarquable. C’est ainsi

qu’une chimère P.w.-alp. (partie antérieure P walil-partie postérieure T: alpestris) âgée de deux

ans, mise en présence d’un pleurodèle femelle, s'est accouplée avec cette femelle selon

l'amplexus classiquement observé chez Pleurodeles dans les conditions naturelles. Ensuite,

remise en présence d’un triton alpestre femelle, il n’y a pas eu d’amplexus mais des ondula-

tions de la queue comme lors de la parade nuptiale chez les tritons. Ainsi une chimère

xénogénique adulte peut manifester successivement le comportement sexuel propre à l'espèce

de sa partie antérieure et le comportement sexuel propre à l'espèce de sa partie postérieure

(HouUILLON, 1992).

TÉRATOMES ET TÉRATOCARCINOMES EXPÉRIMENTAUX

Les tumeurs spontanées sont peu fréquentes chez les amphibiens et en particulier chez les

urodèles. Depuis un demi-siècle que le pleurodèle est d'un usage courant comme matériel

biologique, le seul cas rapporté est celui d’une tumeur maligne entretenue par des transplan-

tations successives durant près de cinq années dans notre laboratoire (PLAÇAIS, 1974). La

rareté des tumeurs naturelles tout comme la difficulté à induire des tumeurs par les substances

cancérigènes chez les urodèles ont conduit à rechercher la capacité du pleurodèle et de

‘axolotl à produire des tératomes, voire des tératocarcinomes, de la même manière que chez

la souris de telles formations sont obtenues après l'implantation d'embryons en des sites

extra-utérins.

anesthésie, à pratiquer une légère incision sur le

ix embryons dans la cavité générale (fig. 34).

ées de 7 à 8 semaines pour les plus jeunes (40 mm)

Le principe de l'opération consiste, apr

flanc de l'animal receveur, puis à inoculer troi:

Les animaux opérés sont des larv

Source : MNHN, Paris

114 ALYTES 18 (3-4)

allogénique P wall P wall (P:w-Pw), mâle à

membres intermédiaires (4 ans, 220 mm). L

s) de la partie postérieure

corps presque double avec duplication

ss membres intermédiaires sont les membres

antérieurs (quatre do

23.- Paire de chimères allogéniques à corps simple (chimères réciproques) entre axolotis de la souche

blanche (dd) et axolotis de la souche albinos (aa). Les plages pigmentaires au niveau des parties

albinos proviennent de la migration et de l'étalement des mélanophores en provenance des parties

blanches (12 mois, 155 mm).

Source : MNHN, Paris

HOUILLON 115

jusqu’à des individus âgés de 4 à 5 mois (65 à 85 mm), ce qui correspond pour le pleurodèle à

des animaux métamorphosés.

Les embryons implantés vont des stades de la segmentation aux stades proches de

l'éclosion. Une fois dégangués, les embryons sont inoculés à l’aide d’une pipette de verre

calibrée à la taille des implants. Des points de suture sont indispensables pour refermer

l'incision et éviter l'expulsion des embryons. La principale difficulté est d'éviter l'écrasement

des jeunes embryons dégangués particulièrement fragiles jusqu’au stade du jeune bourgeon

caudal. La mortalité post-opératoire est pratiquement nulle. Les animaux opérés sont sacri-

fiés entre trois mois et quatre ans après l’opération. La présence de tératomes se détecte à la

suite d’une laparotomie mais bien souvent la simple palpation permet de percevoir la présence

de nodules tumoraux.

ALLOGÉNIQUES

Sur 245 pleurodèles larvaires ou métamorphosés ayant reçu des implants embryonnaires

de pleurodèle, 97 ont présenté des tératomes ou des tératocarcinomes (fig. 31), et sur 76 axo-

lotis juvéniles ayant reçu des implants embryonnaires d’axolotl, 69 avaient développé égale-

ment des tératomes ou des tératocarcinomes (fig. 32). Ainsi 40 % des pleurodèles et jusqu'à

90 % des axolotis peuvent développer des tératomes ou des tératocarcinomes allogéniques

(HOUILLON, 1988).

XÉNOGÉNIQUES

Des embryons d’axoloti ont été implantés dans la cavité générale de pleurodèles, de

même que des embryons d’axolotl en même temps que des embryons de pleurodèle. Sur un

total de 287 opérations, 194 pleurodèles, soit 68 %, ont développé des tératomes ou des

tératocarcinomes xénogéniques (fig. 33) (HOUILLON, 1989).

Fig. 24. — Remarquable chimère xénogénique à corps double P wall — T. helveticus (Pw-palm.}:

opération le 6 juin 1961, chimère morte le 7 août 1965 (50 mois, 85 mm).

— Axolotl trichimère: partie antérieure albinos (aa) — partie moyenne sauvage (DD) - partie

postérieure albinos (aa) (9 mois, 150 mm). Métamorphose spontanée à 6 mois, mort à 13 mois. Pas

de migration des mélanophores DD dans la partie antérieure aa mais légère migration des mélano-

phores DD dans la partie postérieure aa.

Fig

Fig. 26. - Vues ventrales de chimères xénogéniques entre Z alpestris (alp.) etaxolotis de la souch

(AX.). À gauche, la chimèi 6 t métamorphosée à 3 mois:

la chimère Ax.-alp. à restée néoténique (72 mm)

. 27, — Vues ventrales de chimères xénogéniques entre 7: vulgaris (vulg.) et P waltl(Pw). À gauche.

chimère vulg.-Pw. (22 mois, 92 mm}: à droite, chimère mâle Pw.-vulg. à maturité sexuelle (22 mois.

70 mm).

Source : MNHN, Paris

116 ALYTES 18 (3-4)

Tractus uro-génital et tératomes.

Barre= 20 mm.

Chimère allogénique à corps double P walt!- P walt{(P.w-P.w.) de la combinaison hétérosexuée

femelle antérieur — mâle postérieur (2-4): inhibition totale des ovaires antérieurs (o.a.) (eflet

free-martin) et testicules postérieurs normaux (L.p.). Les corps jaunes adipeux antérieurs et posté-

enlevés (32 mois, 220 mm).

rieurs n'ont pas

Source : MNHN, Paris

HOUILLON 117

Des embryons de pleurodèle ont été implantés dans la cavité générale d’axolotis, de

même que des embryons de pleurodèle en même temps que des embryons d’axolotl. Sur un

total de 44 opérations, 9 axolotis (20 %) ont développé des tératomes xénogéniques. Un seul

cas de tératome xénogénique sur 35 opérations a été observé à la suite de l'implantation

d’embryons de triton alpestre chez le pleurodèle. Par contre, 19 cas de tératomes xénogéniques

sur 31 opérations (61 %) ont été observés à la suite de l'implantation d’embryons de triton

alpestre chez l’axolotl.

Les différents pourcentages de tératomes ou de tératocarcinomes xénogéniques obtenus

chez le pleurodèle, l’axolotl et le triton alpestre s’interprètent facilement par les différents

degrés d’histocompatibilité entre ces urodèles, au même titre que pour les greffes embryon-

naires, les parabioses et les chimères xénogéniques. Plusieurs nodules de tératome s’observent

le plus souvent chez un même animal puisque plusieurs embryons sont inoculés en même

temps mais parfois il n'existe qu’un seul nodule. Dans ce cas il s’agit d’un “tératome chimère”

surtout lorsqu'il provient de l'implantation simultanée d'embryons d'espèces différentes.

Les tératomes se classent en trois catégories selon leur importance. Une première

catégorie concerne ceux dont la croissance est à peine marquée: leur poids correspond à moins

de 1 % du poids de l'hôte. Une deuxième catégorie concerne les tératomes qui évoluent au

même rythme que l'hôte; ils peuvent atteindre au maximum 4 à 5 % du poids de l’hôte. Pour

une troisième catégorie la croissance paraît incontrôlée; ils dépassent 10 % et parfois jusqu'à

40% du poids de l'hôte (fig. 31-32). Ces tératomes sont “déstabilisés”, leur croissance

anarchique provoque la cachexie et finalement la mort de l'hôte. De telles tumeurs déstabili-

sées peuvent être considérées comme malignes: ce sont des tératocarcinomes. Elles affectent

davantage les implants d’embryons d’axolotl (30 à 40 % des tératomes) que les implants

d’embryons de pleurodèle (20 % des tératomes).

29. - Chimère allogénique à corps double 7. alpestris — T. alpestris (alp.-alp.) de la combinaison

hétérosexuée mâle antérieur — femelle postérieur (4-® ): testicules antérieurs (L.a.) et ovaires posté-

rieurs (0.p.) à maturité sexuelle (pas d'effet free-martin, animal hermaphrodite, 22 mois, 110 mm).

Fig. 30. Tolérance d'un ovaire d’axolotl (o.Ax.) transplanté chez un triton alpestre (39 mois). La

transplantation a été faite avec des ovaires d'axolotl juvénile âgé de 5 mois après l'ablation des ovaires

du triton alpestre âgé de 8 mois. Malgré la maturité sexuelle de l'ovaire transplanté, le triton alpestre

ne peut pas pondre les trop gros ovocytes d'axolotl.

Fig. 31.- Tératocarcinome allogénique chez un pleurodèle âgé de 17 mois qui avait reçu cinq gastrulas de

8 'geniq &

pleurodèle, 13 mois plus tôt au moment de la métamorphose.

Fig. 32. - Tératocarcinomes allogéniques chez un axolotl albinos âgé de 11 mois qui avait reçu sept

Strulas d'axolotl albinos, 6 mois plus tôt.

33. — Tératomes xénogéniques isolés provenant de divers pleurodèles ayant reçu des embryons

d'axolotl: (a) tératomes (poids 0.90 g et 0.45 #) provenant d'un pleurodèle âgé de 38 mois qui avait

reçu trois blastulas d'axolotl albinos, 34 mois plus tôt en fin de métamorphose: (b) tératome (poids

g) provenant d'un pleurodèle âgé de 14 mois qui avait reçu trois embryons d’axolotl sauvage au

stade bourgeon caudal jeune, 11 mois plus tôt à l'état larvaire: (c) tératomes (poids 1.10 g et 0.60 g)

provenant d'un pleurodèle âgé de 37 mois qui avait reçu trois embryons d'axolotl albinos au stade

bourgeon caudal âgé. 33 mois plus tôt en fin de métamorphose.

Source : MNHN, Paris

118 ALYTES 18 (3-4)

donneur receveur

Cd où g castré)

ovaires

PLEURODÈLE

AXOLOTL 5 mois _ 80 mm

5 mois _110 mm

Fig. 34. - Inoculation d'embryons de pleurodèle, ou d’axolotl, dans la cavité générale d’une larve de

pleurodèle pour obtenir des tératomes.

Histologiquement, on reconnaît les tissus les plus divers sans organisation et dont

l'importance varie selon les tératomes: nodules de cartilage, épithélium intestinal, formations

tubulaires comme dans une structure rénale, tissu nerveux, mince épithélium qui limite les

musculaire mais abondant tissu conjonctif dans tous les cas.

nature carcinomateuse est attestée par les nombreuses mitoses, les noyaux pycnotiqui

des noyaux polylobés avec plusieurs gros nucléoles, l’intense vascularisation et les nombreuses

hématies qui infiltrent tous les tissus. La structure histologique bénigne ou maligne varie

d’une tumeur à l’autre sans qu'il soit possible d'établir la relation entre le stade de l'implant

embryonnaire et l’âge de l'hôte.

TRANSPLANTATIONS OVARIENNES

L'histocompatibilité relative entre les divers urodèles, et plus spécialement l'étonnante

tolérance des greffes embryonnaires d’axolotl par les autres, furent mises à profit pour réaliser

des transplantations d’ovaires. Le principe de l'intervention consiste dans un premier temps à

castrer un animal juvénile, mâle ou femelle, quelques mois après la métamorphose, puis dans

Source : MNHN, Paris

HOUILLON 119

Fig. 35. - Xénotransplantation des ovaires d’axolotl dans un pleurodèle juvénile, mâle ou femelle, qui a

é préalablement castré.

un deuxième temps à prélever les ovaires d’un animal sensiblement au même âge dont les

ovocytes sont en prévitellogenèse pour ensuite implanter ces ovaires dans la cavité générale

des receveurs castrés. Les transplants ovariens sont placés dorsalement en position orthoto-

pique de façon à obtenir des adhérences au niveau des zones cicatricielles résultant de la

castration (fig. 35). La mortalité post-opératoire est pratiquement nulle. Les animaux opérés

poursuivent leur développement normal pour atteindre l’état adulte un à deux ans plus

tard.

ALLOGÉNIQUES

Les interventions ont été réalisées à partir de pleurodèles métamorphosés âgés de 4 à

5 mois (65 à 85 mm). Les receveurs castrés sont aussi bien des pleurodèles femelles que des

pleurodèles mâles. Seize animaux (8 mâles et 8 femelles) appartenant à la même souche

histocompatible furent castrés; la reprise des ovaires fut effective chez tous. Quand il s’agit de

pleurodèles standards, qui n’appartiennent pas à des souches histocompatibles, la reprise des

allotransplants ovariens intervient dans 85 % des cas aussi bien chez les femelles castrées que

chez les mâles castrés. Ces animaux peuvent pondre dès l’âge de deux ans.

La même intervention fut tentée afin de transplanter les ovaires de pleurodèles femelles

adultes qui avaient séjourné pendant 12 jours en microgravité dans le biosatellite russe

Cosmos 2229" fin 1992-début 1993 (DOURNON et al, 1997). Ces femelles devaient être

nécessairement sacrifiées dés leur retour pour être utilisées par divers expérimentateurs. Une

fois prélevés, des fragments d’ovaire furent transplantés dans des pleurodèles mâles ou

femelles castrés, juvéniles et adultes. Sur 25 animaux opérés, seulement 7 survécurent aux

conditions particulières lors de cette expérience, néanmoins la reprise des allotransplants

ovariens adultes fut effective chez 6 pleurodèles.

XÉNOGÉNIQUES

Le protocole opératoire ci-dessus fut appliqué pour transplanter des ovaires d'axolotl

chez le pleurodèle (HouILLON. 1972) et chez le triton alpestre (HOUILLON, 1975), de même que

pour des transplants ovariens entre le pleurodèle et le triton alpestre. Pour les transplantations

d'ovaires d’axolotl, les donneurs sont ägés de 5 à 6 mois (100 mm) et les pleurodèles ou les

Source : MNHN, Paris

120 ALYTES 18 (3-4)

tritons alpestres receveurs sont âgés de 7 à 9 mois. Sur 124 pleurodèles castrés et transplantés

avec des ovaires d’axolotl, 34 mâles sur 55 et 41 femelles sur 69 ont présenté plus tard des

ovaires d’axolotl. La plupart de ces ovaires ont atteint la maturité sexuelle de sorte que des

pleurodèles ont pondu systématiquement des oeufs d’axolotl.

La reprise effective des ovaires d’axolotl fut également observée chez des tritons alpestres

castrés (4 mâles sur 4 et 4 femelles sur 7). Cependant, bien que les ovaires aient atteint la

maturité sexuelle, les tritons alpestres n'ont jamais pu pondre d'oeufs d’axolotl car les

ovocytes d’axoloti sont trop volumineux pour pouvoir transiter dans les oviductes de triton

alpestre (fig. 30).

Les xénotransplants ovariens entre le pleurodèle et le triton alpestre sont tolérés

mais avec un succès très variable selon le sens de la transplantation. Le triton alpestre

tolère assez bien les xénotransplants ovariens de pleurodèle (10 cas sur 24) mais les ovocytes

de pleurodèle ne peuvent pas transiter dans les oviductes du triton alpestre. En revanche,

la tolérance du pleurodèle pour les xénotransplants ovariens de triton alpestre est très faible

(3 cas sur 26) mais il a pu être obtenu l'émission d'oeufs de triton alpestre par un pleuro-

dèle.

En plus des transplantations d’ovaires, quelques xénotransplantations de testicules

juvéniles d’axolotl ont été tentées avec succès dans des pleurodèles juvéniles castrés sans

espoir pourtant d'obtenir l'émission de spermatozoïdes hétérologues puisque le réta-

blissement des connexions anatomiques pour l’émission des gamètes mâles est inconcevable

chez les amphibiens. C’est ainsi que chez 15 pleurodèles, dont 10 mâles castrés sur 12 et

5 femelles castrées sur 5, des testicules d’axolotl furent tolérés et atteignirent la maturité

sexuelle.

Les oeufs d’axolotl pondus par le pleurodèle ont un développement en apparence normal

quand ils peuvent être fécondés artificiellement par des spermatozoïdes d’axolotl. Il en est de

même pour les oeufs de triton alpestre pondus par le pleurodèle quand ils peuvent être

fécondés artificiellement par des spermatozoïdes de triton alpestre. Cependant dans les deux

étude du développement n'a pas été envisagée d’une manière approfondie.

AUTRES INTERVENTIONS EMBRYONNAIRES

En utilisant toujours P walrl comme matériel biologique, les autres expérimentations

ci-dessous furent réalisées.

ORGANOGENÈSE DE LA GONADE

Le blocage unilatéral de l'uretère primaire (canal de Wolff) au stade du jeune bourgeon

caudal avant sa croissance provoque l'absence de mésonéphros du même côté. Les cellules

germinales primordiales se mettent en place normalement, mais en absence de la médulla

gonadique qui provient du blastème mésonéphrétique les cellules germinales non seulement

Source : MNHN, Paris

HOUILLON 121

ne prolifèrent pas, mais dégénèrent. L'absence de mésonéphros a pour conséquence l’agénésie

et même l’absence de glande génitale (HOUILLON, 1956).

FORMATION DU CANAL DE MÜLLER

L'ablation précoce du pronéphros provoque l'absence du canal de Müller. Toute absence

locale ou déviation du canal de Wolff se traduit par une absence ou une déviation comparable

du canal de Müller. La formation du canal de Müller est liée à la présence du pronéphros et au

voisinage ininterrompu de son extrémité en voie de croissance avec le canal de Wolff qui lui

sert de guide pour atteindre le cloaque (HOUILLON, 1959).

INVERSION DU PHÉNOTYPE SEXUEL FEMELLE PAR LA TEMPÉRATURE

Chez le pleurodèle, le déterminisme génétique du sexe obéit au mécanisme mâle

ZZ-femelle ZW (hétérogamétie femelle). L'élevage des larves à la température du laboratoire

(20 + 2°C) donne une sex-ratio normale: 50 % de mâles et 50 % de femelles. Des larves ZW,

élevées à la température de 32°C jusque peu avant la métamorphose, se différencient en mâles

(thermo-néo-mäâles) dans 100 % des cas. L'inversion du phénotype sexuel de ces larves a été

prouvée par diverses analyses génétiques, notamment par l'étude de la descendance issue du

croisement entre une femelle standard ZW et un “thermo-néo-mâle ZW”. Comme attendu,

de tels croisements ont donné, à la température du laboratoire, 25 % de mâles et 75 % de

femelles dont 25 % de femelles WW viables (HOUILLON & DOURNON, 1978; DOURNON &

HOUILLON, 1984, 1985: DOURNON et al., 1990).

CLONAGE DU PLEURODÈLE À PARTIR DU NOYAU DES CELLULES GERMINALES

La greffe nucléaire fut appliquée au pleurodèle au début des années 60 (SIGNORET &

PICHERAL, 1962). Cependant, seuls les noyaux prélevés au stade de la blastula permettent

d'obtenir un développement normal jusqu'à l’état adulte. Les noyaux prélevés à des stades

ultérieurs conduisent à des développements s'interrompant d'autant plus tôt que l'embryon

donneur est plus âgé; aucun développement n’est obtenu à partir du bourgeon caudal. Et

pourtant, les noyaux des cellules germinales, qui ne sont identifiables dans les crêtes génitales

que peu après l’éclosion (larves de 15 jours), conduisent à des développements complets. La

totipotence des noyaux germinaux persiste au moins jusqu'à la métamorphose. On peut

encore cloner le pleurodèle avec des noyaux issus de cellules germinales prélevées directement

dans les testicules ou les ovaires d'animaux âgés de quatre mois et obtenir des pleurodèles

adultes capables de se reproduire (LESIMPLE et al., 1987). A ce jour, pour réussir le clonage,

tant chez les amphibiens que chez les mammifères, avec des noyaux de cellules embryonnaires

âgées ou avec des noyaux de cellules somatiques différenciées, il est nécessaire que ces noyaux

aient subi au préalable un traitement particulier (reprogrammation).

Source : MNHN, Paris

122 ALYTES 18 (3-4)

EXPÉRIENCE “FERTILE”

Depuis l'apparition de la vie sur notre planète, les organismes vivants ont évolué, se sont

développés et adaptés à la gravitation terrestre (gl). Le développement d’un vertébré est-il

possible en apesanteur (g0)? Dès avril 1987, nous avons soumis au Centre National d'Etudes

Spatiales (CNES) un projet destiné à l'étude de la fécondation et du développement du

pleurodèle dans l'espace. Le laboratoire de Biologie du Développement de Toulouse (Mme

A.-M. Duprat) y fut associé fin 1987 ainsi que le laboratoire de Biologie expérimentale et

Immunologie de Nancy (Prof. C. Dournon) à partir de 1989. La mise au point du projet a

nécessité la résolution de nombreux problèmes liés aux contraintes des vols spatiaux, en

particulier l'obtention certaine d’une ponte à un moment précis et la survie d'embryons dans

le milieu aquatique nécessairement très réduit. L'expérience FERTILE (Fécondation et

Développement du Triton dans l'Espace) s’est déroulée dans la station MIR en 1996 avec la

participation de la Cosmonaute française Claudie André-Deshays. Cette expérience fut

reprise au printemps 1999 dans la même station orbitale avec la participation de Jean-Pierre

Haigneré.

Les résultats essentiels sont que la fécondation s’avère possible et que le développement

ne semble guère perturbé par l'absence de pesanteur durant une dizaine de jours. Des

pleurodèles conçus dans l'espace, et qui ont débuté leur développement en microgravité

jusqu'à un stade proche de l’éclosion, atteignent maintenant l’âge adulte et peuvent se

reproduire.

CONCLUSIONS

Les résultats des interventions embryonnaires rapportées posent autant de problèmes

qu'ils en résolvent, mais n’est-ce pas le propre de toute expérimentation biologique en raison

de la complexité des phénomènes vitaux? L'intérêt des xénogreffes embryonnaires est d'avoir

mis en évidence des degrés d’histocompatibilité entre différentes espèces, ce qui permet une

comparaison phylogénétique autre que celle basée sur les caractères anatomiques. Cette

histocompatibilité relative est corroborée par les parabioses et les chimères. L'étude de la

viabilité de ces animaux expérimentaux devrait permettre une nouvelle approche des phéno-

mènes immunitaires encore peu connus pour les xénogreffes: la reconnaissance d’un “soi

xénogénique” au cours de la période d'acquisition de la maturité immunologique. L’axolotl,

donneur universel de xénogrefes, est un cas étonnant qui pourrait s'interpréter par ses

caractères primitifs: il ne possèderait que les antigènes de transplantation communs à tous les

autres urodèles. Et si chez les mammifères il pouvait se trouver un tel donneur universel! Quel

merveilleux matériel ce pourrait être pour les xénotransplantations d'organes.

La parabiose, qui -martinisme des bovidés, trouve

avec les associations xénogéniques une nouvelle approche qui met davantage l'accent sur

l'énigmatique effet de position dans les interactions gonadiques chez les chimères hétéro-

. L'absence d'interprétation ne peut qu'inciter à poursuivre l'expérimentation.

st la réalisation expérimentale du fre

sexué

Source : MNHN, Paris

HOUILLON 123

La plus ou moins grande viabilité des chimères xénogéniques implique des mécanismes

immunologiques encore inconnus. Après une évolution apparemment normale durant plu-

sieurs mois, certaines périssent brutalement en quelques jours; d’autres s’amaigrissent lente-

ment mais inexorablement pour atteindre un état de cachexie extrême; une troisième catégorie

présente des plages de nécrose incurable au niveau de l’une des hémi-parties: il s'agit en

l'occurrence d’une véritable maladie auto-immune, où tout se passe comme si la partie saine

rejetait l’autre. Enfin pourquoi une quatrième catégorie de chimères demeurent-elles viables

sans jamais présenter de signe pathologique?

La faible antigénicité des ovaires révélée par les allo- et les xénotransplantations n'a

guère été envisagée pour les vertébrés supérieurs et l'éthique ne permet pas de songer à une

application pour remédier à la stérilité féminine! Mais pourtant, l'accroissement des ovocytes

dans un organisme étranger est-il vraiment sans influence sur le développement ultérieur?

Serait-il abusif de parler ici de tentative de transgenèse par le biais d'informations étrangères

qui s’intègreraient dans l’ovocyte au cours de son accroissement?

D'une particulière originalité, les tératocarcinomes expérimentaux ne sauraient laisser

indifférent compte tenu de leurs implications chez les mammifères. Quand, comment et

pourquoi certaines cellules deviennent-elles malignes? Ces questions font partie des préoccu-

pations les plus actuelles concernant les relations entre cellules embryonnaires et cellules

tumorales.

Enfin, pour revenir à l’organogenèse initiale des gonades, quels sont les facteurs de

croissance pour les cellules germinales primordiales qui, émanant du blastème mésonéphré-

tique, permettent leur persistance et leur prolifération? Pourquoi la prolifération rapide des

cellules germinales primordiales est-elle le premier indice de la différenciation ovarienne alors

qu'une prolifération lente conduira à une différenciation testiculaire?

Et c'est ainsi qu’à travers des manipulations, classiques pour quelques-unes, originales

pour la plupart, les amphibiens gardent tout leur intérêt comme matériel expérimental de

choix, sans oublier les aspects moléculaires envisagés ces dernières décennies, pour aborder

avec profit l'embryologie du 21° s

Des interventions aux stades embryonnaires ont été réalisées entre sept espèces d’amphi-

biens urodèles: Pleurodeles waltl, Pleurodeles poireti, Triturus alpestris, Triturus helveticu

Triturus vulgaris, Triturus cristatus et Ambystoma mexicanum.

La tolérance ou le rejet des greffes de téguments embryonnaires dépend du degré

d'histocompatibilité entre les sept espèces. L'axolotl se comporte comme un “donneur

universel” pour les autres urodèles. La tolérance des ébauches gonadiques présomptives

permet d'obtenir l'émission d'oeufs d’une espèce par une autre espèce.

La survie des parabioses xénogéniques confirme l'histocompatibilité relative observée

avec les greffes de tégument. La métamorphose de l'axolotl en parabiose avec un triton est

provoquée par l'hypersécrétion thyroïdienne du triton.

Source : MNHN, Paris

124 ALYTES 18 (3-4)

Sur 49 asssociations en chimères théoriquement concevables entre les embryons des sept

espèces, 4 associations allogéniques (chimères entre embryons de la même espèce) ont

effectivement été réalisées (plus de 570 chimères âgées de 4 mois à 15 ans) et 23 associations

xénogéniques (chimères entre embryons d'espèces différentes) ont été réalisées (536 chimères

âgées de 3 mois à 7 ans). Les chimères allogéniques sont viables au même titre que les animaux

standards. Les chimères à corps double sont pourvues de deux paires de gonades. Dans les

combinaisons homosexuées, les animaux ont soit quatre ovaires soit quatre testicules fonc-

tionnels (chimères germinales). Dans les combinaisons hétérosexuées, les interactions entre

gonades de sexes différents dépendent de leur position relative: l'effet free-martin (inhibition

et même inversion des ovaires) s'observe lorsque les ovaires sont antérieurs par rapport aux

testicules: l'effet free-martin est faible et même souvent nul lorsque les ovaires sont postérieurs

par rapport aux testicules; dans ce cas l'évolution des ovaires postérieurs est peu modifiée par

les testicules antérieurs.

La survie des chimères xénogéniques dépend des espèces associées et du sens de l’asso-

ciation. Les chimères xénogéniques qui atteignent l'état adulte peuvent manifester le compor-

tement sexuel de l’espèce qui constitue sa partie antérieure et de l'espèce qui constitue sa partie

postérieure.

Les urodèles, qui ne présentent qu'exceptionnellement des tumeurs spontanées, dévelop-

pent des tératomes après l'implantation d’embryons, allogéniques ou xénogéniques, dans la

cavité générale des jeunes larves. Certaines de ces tumeurs expérimentales restent bénignes

mais d’autres se déstabilisent pour devenir des tératocarcinomes.

Les ovaires prélevés chez des animaux juvéniles et transplantés dans des jeunes animaux,

mâles ou femelles castrés, peuvent être indéfiniment tolérés même quand il s’agit de xéno-

transplants.

La tolérance des ovaires d’axolotl par le pleurodèle permet l'émission systématique

d'oeufs d’axolotl par le pleurodèle. Après fécondation artificielle, les ovocytes, qui ont effectué

tout leur accroissement dans un organisme étranger, ont un développement en apparence

normal.

L'histocompatibilité relative des xénogreffes embryonnaires, la survie des parabioses et

des chimères xénogéniques, l'effet free-martin de position dans les interactions entre glandes

génitales, la formation et la déstabilisation des tératomes expérimentaux sont autant de

phénomènes originaux qui demeurent énigmatiques.

RCI

NTS

ance du Professeur Alain Dubois et à l’aide efficace de Mme Annemarie Ohler,

pondant aux expériences rapportées ont pu être classées

des Reptiles et Amphibiens du Muséum national d'Histoire

ous les numéros de collection MNHN 1997.6600-8200.

Grâce à la bienvei

plupart des pièces anatomiques cor

conservées en zoothèque au laboratoi

naturelle de Paris, où elles sont enregistré

Source : MNHN, Paris

HOUILLON 125

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Corresponding editor: Alain DURoIs.

Source : MNHN, Paris

s, 2001, 18 (3-4): 127-140. 127

Une nouvelle espèce de Wolterstorffina

(Amphibia, Anura, Bufonidae)

de l’étage afro-subalpin du Mont Okou

(Cameroun)

R. BoisTEL*! & J.-L. AMIET**

* Laboratoire de Biogéographie et Ecologie des Vertébrés,

Ecole Pratique des Hautes Etudes, Université de Montpellier IL,

Case postale 094, 34095 Monipellier Cedex, France

**48 rue des Souchères, 26110 Nyons, France

A new species of Wolterstorffina is described from Mount Oku (Came-

roon). It is readily distinguished from the previously known species, W

parvipalmata and W. mirei, by its medially smooth but laterally warty

dorsum, the thickened external edge of the foot and the largest size. The

new species is probably an endemic species of the Mount Oku afro-

subalpine zone.

INTRODUCTION

Un caractère remarquable de la faune bufonidienne d'Afrique est le nombre élevé de

genres mono- ou paucispécifiques orophiles. Actuellement au nombre d’une dizaine (d’après

la classification proposée par Dugois, 1987), ces genres sont endémiques de systèmes orogra-

phiques plus où moins étendus, allant de l'Afrique occidentale à l'Ethiopie et à l'Afrique

australe, et présentent pour la plupart des modes de reproduction originaux.

Cette diversification générique a été particulièrement marquée sur la Dors

naise, qui abrite à elle seule trois de ces genres: Werneria, Didynamipus et Wolterstorffina.

le c:

merou-

Ce dernier a été créé il y a soixante ans (MERTENS, 1939) pour Nectophryne parvipalmata

Werner, 1898, car il ne présente pas les lamelles plantaires et palmaires caractéristiques de

Nectophryne afra Buchholz et Peters, 1875 et Nectophryne batesii Boulenger, 1913. Une

seconde espèce, initialement attribuée au genre Nectophrynoides, s'y est ajoutée ensuite:

Wolterstorffina mirei (Perret, 1971). Entretemps, une espèce d'Afrique centrale, Wolter-

storffina parkeri Laurent, 1950, avait été transférée dans le genre Laurentophryne par TIHEN

(1960).

Grâce aux recherches de M. Laurent Chirio, qui nous

deux spécimens récoltés sur le Mont Okou, le genre s'enrichit à présent d’une troisième espèce.

avait soumis pour identification

1. Correspondance: Université Paris Sud, Centre scientifique d'Orsay, Laboratoire des Mécanismes de Communication:

Bâtiment 446, 91405 Orsay Cedex. France.

Source : MNHN, Paris

128 ALYTES 18 (3-4)

Par leur habitus, ces spécimens ressemblent en effet beaucoup plus à Wolterstorffina parvipal-

mata et W. mirei qu’à tout autre bufonide du Cameroun. Ce rapprochement est confirmé par

leurs caractères ostéologiques, qui correspondent à ceux retenus par GRANDISON (1978) pour

définir le genre Wolterstorfina (huit vertèbres indépendantes présacrales procæles, extrémité

des phalanges terminales élargie en spatule, humérus des mâles adultes avec crista medialis et

lateralis élargies, palatin présent, columelle et trompe d'Eustache absentes). Plusieurs carac-

tères montrent toutefois qu'ils ne peuvent être rapportés à aucune des deux espèces déjà

connues, et en particulier à W7 mirei, qui en est pourtant sympatrique sur le Mont Okou.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

En plus des deux spécimens déjà mentionnés, nous avons pu disposer du matériel recueilli

par M. Lamotte lors d’une mission effectuée au Cameroun en 1976.

Par ailleurs, nous avons examiné à titre comparatif des individus de W mirei et W

parvipalmata, déposés, comme ceux de la nouvelle espèce, au Laboratoire des Reptiles et des

Amphibiens du Muséum national d'Histoire naturelle de Paris (MNHN). En voici les

références.

(1) Wolterstorffina mirei: 1 femelle, MNHN 1991.4935, Mts. Bamboutos, 7.7.76, réc. M.

Lamotte; 2 femelles MNHN 1999.6393-6394, Mts. Bamboutos, prairie, 2500 m, réc. L.

Chirio; 1 mâle, MNHN 1999.6398, Mts. Bamboutos, prairie, 2700 m, 22.9.71, réc. et coll. J.-L.

Amiet (JLA 71.128); 1 femelle, MNHN 1999.6399, Mts. Bamboutos, prairie, 2400-2500 m,

26.5.75, réc. et coll. J.-L. Amiet (JLA 75.228); 1 juvénile, MNHN 1999.6400, Mts. Bambou-

, Sous une pierre en prairie, 2400-2500 m, 17.7.70, réc. et coll. J.-L. Amiet (LA 70.238).

€) Wolterstorffina parvipalmata: \ mâle, MNHN 1999.6395, Mofako, près d’un ruisseau,

1100 m, 26.11.81, réc. et coll. J.-L. Amiet (JLA 81.195); 1 femelle, MNHN 1999.6396, K:

forêt près d’une rivière, 800 m, 21.9.74, réc. et coll. J.-L. Amiet (JLA 74.275); 1 juvénile,

MNHN 1999.6397, Kala, forêt près d’une rivière, 800 m, 6.2.71, réc. et coll. J.-L. Amiet (JILA

71.100).

Des diapositives et des spécimens de la collection d’un des

été utilisés, pour comparaison avec le matériel mentionné ci-dess

uteurs (JLA) ont également

Wolterstorffina chirioi n. sp.

Holotype. - MNHN 1999.6391, femelle adulte (museau-anus: 40,1 mm), trouvée sous une

pierre au sommet du Mont Okou (6°14°N, 10°26'E), à 3000 m d'altitude, en juin 1998, par L.

Chirio. Habitus: voir fig. 1. Mensurations: voir tab. 1.

Paratypes. — (1) MNHN 1999.6392, femelle adulte (museau-anus: 44,1 mm), récoltée au

même endroit et à la même date que l'holotype: (2}) MNHN 19914928, femelle adulte

(museau-anus: 41.9 mm). MNHN 19914929, femelle adulte (museau-anus: 40,1 mm),

MNHN 1999.4930, femelle adulte (museau-anus: 36,4 mm), MNHN 1999.4931, mâle adulte

(museau-anus: 31,3 mm), MNHN 19994932, mâle adulte en mauvais état (museau-anus:

Source : MNHN, Paris

BolsTEL & AMIET 129

Tab. 1. - Mensurations de l’holotype (astérisque) et des paratypes de W chirioi, à la précision

de 0,1 mm. AB, longueur de l’avant-bras; C, longueur de la cuisse; IN, espace internasal:

TP, espace interpalpébral; J, longueur de la jambe; L, longueur museau-anus; LT, lon-

gueur de la tête; M, longueur de la main; O, diamètre de l'œil; ON, distance angle

palpébral antérieur — narine; P, longueur du pied; T, largeur de la tête.

1999.6391" | 1909.6302 | 1991.4928 | 1991.4929 | 1991.4930 | 1991.4931

L: 40,1 419 401 | 364 313

12,5 124 123 | 114 98

116 114 T0

35 E 29

36 333 29

45 44 37

25 25 24

98 9,1 87

M 11,2 103 95

G 15 13.3 129

J T3T [133 LE)

P 16.1 17.8 [158 16

31,2 mm), MNHN 1999.4933, juvénile (museau-anus: 14 mm) et MNHN 1999.4934, femelle

adulte en mauvais état (non mesurée), Mont Okou, 10.11.75, réc. M. Lamotte.

Diagnose. - Espèce appartenant au genre Wolterstorffina, distincte de ses congénères par: (1)

sa grande taille, (2) son tégument lisse sur le dos mais verruqueux-granuleux, avec des spinules

ur les flancs et sur les épaules, (3) la tranche externe de ses pieds fortement épa

(4) l'absence de sillon cutané marqué entre les régions gulaire et pectorale. Elle se sépare aussi

de W. parvipalmata par son museau moins pointu et moins saillant et ses paupi

res non tuberculées, et de W! mirei par sa fente cloacale moins nettement orientée vers le bas.

à M. Laurent Chirio, Inspecteur pédagogique de Sciences

ité de son

Etymologie. — L'espèce est dédié

naturelles actuellement en poste à Bafoussam (Cameroun), pour consacrer l’effic:

activité herpétologique et batrachologique en Afrique.

Description.

Habitus. — W. chirioi est remarquable par sa grande taille (mâles: 30-31 mm, femelles:

41-44 mm), nettement supérieure, pour les deux sexes, à celle de W! parvipalmata (mâles: 24-

27 mm, femelles: 30-35 mm, exceptionnellement 37-39 mm chez des femelles du Massif de

Yaoundé) ou, au moins pour les femelles, à celle de W mirei (mâles: 32-36 mm, femelles: 35-

39 mm). Sa stature est modérément élancée, moins svelte que chez W parvipalmata mais plus

que chez W mirei (les spécimens de Chirio, voir fig. 1, sont plus sveltes que ceux de Lamotte,

probablement en raison d’un jeûne prolongé). Les membres sont longs et relativement minces.

sauf les mains et surtout les pieds, qui contrastent avec les autres segments par leur aspect

chez les mâles, la musculature des bras et des avant-bras est hypertrophiée. Comme

Source : MNHN, Paris

130 ALYTES 18 (3-4)

Fig. L.— Wolterstorffina chirioi. Holotype, MNHN 1999.6391, en vue dorsale (dessin R. Boistel).

chez les autres espèces de Wolerstorffina, la tête, large, est séparée du corps par un rétréci

sement collaire situé en avant de la région scapulaire.

Tégument. — Un des caractères distinctifs majeurs de W chirioi réside dans la di

d'aspect du tégument de la région dorsale et des flancs. Sur la tête (paupières compris

les épaules et sur toute la région lombo-sacrée jusqu'à l’urostyle, la peau est lisse, d'aspect

soyeux. La région postorbitaire est aussi lisse mais munie de petites épines. Au-delà, depuis le

ment collaire jusqu'aux aines, les flancs sont couverts de verrucosités denses et

irrégulières, formant un ensemble grossièrement réticulé. Ces excroissances, dans la moitié

antérieure des flancs, portent des épines noires qui, fait important, sont présentes dans les

deux sexes.

Source : MNHN, Paris

BoISTEL & AMIET 131

Fig. 2. — Tête, en vue dorsale (à gauche), ventrale (au milieu) et latérale (à droite) des trois espèces de

Wolterstorfiina. À, W: parvipamalta (MNHN 1999.6396. largeur de la tête: 9,5 mm); B, HW mi

(MNHN 1999.6399, largeur de la tête: 10,5 mm): C, H chirioi (holotype, MNHN 1999.6391, largeur

de la tête: 11,3 mm). Remarquer la différence d'aspect du tégument chez les trois espèces, ainsi que la

forme caractéristique du museau chez W{ parvipalmata.

Sur la face ventrale, gorge comprise, la peau est régulièrement granulée-réticulée, le relief

cutané pouvant être plus dense et plus saillant sous la région cloacale.

Tête. La tête, aussi large que longue, est rétrécie en arrière des yeux: en avant de ceux-ci,

elle dessine, vue en plan, une courbe assez régulière, à peine interrompue par l'extrémité

obtuse-arrondie du museau.

Le museau est court, la distance œil-narine en général inférieure au diamètre de l'œil. Son

extrémité, vue de profil, est obtuse, verticalement tronquée ou légèrement saillante en avant de

la bouche. La région loréale est verticale et quelque peu concave. Les canthus sont modéré-

ment incurvés, non anguleux. Les narines, situées très près du bout du museau, s'ouvrent

latéralement: l'espace qui les sépare est inférieur à l'espace œil-narine.

La face supérieure de la tête, museau compris, est plane. L'espace interorbitaire est

large, presque double de la plus grande largeur des paupières. Il n'y a ni crêtes céphaliques,

Source : MNHN, Paris

132 ALYTES 18 (3-4)

ni glandes parotides, ni tympans, ni replis supra-tympaniques, mais, comme on l’a vu,

l'aspect du tégument de la région postorbitaire est bien différent de celui du dessus de la

tête.

Ventralement, la région gulaire ne présente pas de caractère particulier, mais il faut

relever qu’elle n’est pas séparée de région pectorale par un pli creux, contrairement à ce qui

s’observe souvent chez W mirei et toujours chez W parvipalmata.

La langue est allongée, non échancrée à son extrémité. Il n’y a pas de sacs vocaux chez les

mâles et pas d’orifices correspondants dans la bouche. Il n’y a pas non plus d’orifices des

trompes d’Eustache, ni de dents vomériennes.

Membres. Les membres antérieurs sont assez grêles chez la femelle, beaucoup plus épais

chez les mâles, en particulier les bras, dont l’humérus est muni d’une haute crête aliforme et

dont la musculature est hypertrophiée. La main est grande, la taille relative des doigts

correspondant à la formule I < II < IV < II. Les doigts sont subcylindriques, non (I et II) ou

à peine (III et IV) dilatés à leur extrémité, avec un petit sillon dorsal marquant la limite entre

l’avant-dernière et la dernière phalange. Ils paraissent largement séparés à leur base et

dépourvus de palmure; en fait, comme le montre la fig. 3A, il y a une petite palmure entre I et

IT et entre IT et III, mais celle-ci est fortement & ie (différence avec W. parvipalmata, à

palmure plus étendue et plus mince). Chez les deux mâles dont nous disposons, il n’y a pas de

callosités nuptiales. Le tégument de la face palmaire a une texture à peu près lisse, sans

granulations ni réticulation. Les tubercules sous-articulaires sont massifs, peu saillants et mal

délimités: il y en a un, basal, aux doigts I et IT, et deux aux doigts III et IV. A la base de la main,

il y a un tubercule métacarpien, ovale-arrondi et peu saillant.

Comme chez les autres Wolterstorffina, les membres postérieurs sont élancés mais

ssent relativement minces, en raison de la faible musculature des es mais aussi du

contraste résultant du grand développement du pied (fig. 1). Celui-ci, par sa largeur, son

aspect massif et le grand développement de la palmure, est nettement différent de celui des

deux autres espèces. La taille relative des orteils, du plus petit au plus grand, est donnée par la

formule I < II < V < III < IV. L'extension de la palmure ressort de la formule suivante (selon

MYERS & DUELLMAN, 1982): 10—0110-01110-31V 3-1 1/3 V. Les orteils les mieux dégagés

de la palmure, le IV et le V, ont un aspect boudiné. L’extrémité des orteils est arrondie, non

dilatée (sauf, très légèrement, pour le V) et, dorsalement, un sillon marque la dernière

articulation. Le tégument plantaire est semblable à celui de la main. En dehors des pelotes

terminales, peu saillants, il est à peu près impossible de reconnaître des dilatations corres-

pondant à des tubercules sous-articulaires. Les tubercules métatarsiens interne et externe, peu

ou à peine saillants, sont mal différenc

Une particularité remarquable du pied, non apparente sur les figures 1 et 3A, est

l'épaisissement de sa tranche externe, qui a un aspect boursouflé. Ce caractère n'est visible-

ment pas dû à un artefact de fixation et n'est pas lié au sexe. Comme on peut le constater sur

la fig. 3A, il s'accompagne d’une extension de la pigmentation foncée dorsale à la région

plantaire externe.

Ostéologie. — Les caractères du squelette ont pu être étudiés à partir d'une radiographie

aux rayons X effectuée par M. Gasc, et dont l'interprétation nous a été facilitée grâce à l'aide

de M. Hoyos (fig. 4). Les points suivants doivent être relevés.

Source : MNHN, Paris

BOISTEL & AMIET 133

Fig. 3. — Aspect de la face palmaire (en haut) et plantaire (en bas) des trois espèces de Holrerstorfina. À.

W chirioi (holotype, MNHN 1999.6391, main: 10,5 mm, pied: 16,1 mm); B, W mirei (MNHN

1999.6399, main: 10 mm, pied: 15 mm); C, W! parvipalmata (MNHN 1999.6396, main: 9,5 mm, pied:

14 mm). On notera l'extension de la pigmentation foncée dorsale sous la tranche externe du pied chez

W chirioi.

(1) Squelette céphalique: columelle absente; palatin bien développé: vomers apparem-

ment absents; quadratojugal réduit, séparé et “articulé”; complexe sphénethmoïde ossifié.

(2) Squelette axial: huit vertèbres présacrées procæles: première (cervicale) et seconde

vertèbres présacrées non fusionnées: sacrum et coccyx non fusionnés. Ce dernier caractère est

en contradiction avec PERRET (1972) et GRANDISON (1978), mais il s'agit peut-être d’un lapsus

Source : MNHN, Paris

134 ALYTES 18 (3-4)

Sphénethmoïde Palatin

Quadrato-jugal

réduit et articulé

j: Vue en détail de

Première et seconde de l'extrémité d’une

vertèbres présacrées 1 phalange dilatée

non fusionnées

Huit vertèbres

présacrées procæles

Sacrum et coccyx

non fusionnés

Cartilages sésamoïdes

Fig. 4. - Radiographie de l’holotype de W: chirioi (radiographie J.-P. Gasc).

du premier repris par la seconde, car la radiographie de W. mirei publiée par Perret semble

montrer un sacrum et un coccyx non fusionnés.

(3) Ceinture pectorale: omosternum absent: sternum entièrement cartilagineux.

(4) Membres: chez le mâle, crista medialis de lhumérus hypertrophiée, en forme de

lame: extrémité des phalanges spatulée aux mains et aux pieds: cartilages sésamoïdes pré-

sents.

Source : MNHN, Paris

BOISTEL & AMIET 135

Coloration en alcool. - Les spécimens fixés ont un aspect beaucoup plus sombre que ceux

de W mirei car la teinte foncière du dos est marron foncé, alors que la spinosité est noire. Il

peut y avoir sur les flancs et les membres des taches rondes ou oblongues d’un beige jaunâtre

clair ou des macules éclaircies diffuses sur les cuisses et les bras et la partie postérieure du dos.

La lèvre supérieure peut aussi être éclaircie. Aucun des individus examinés ne présente de

maculation transversale sur les membres (caractère au contraire très fréquent chez W.

parvipalmata: fig. 5b). La face ventrale est d’un blanc jaunâtre uniforme ou avec des macules

brunâtres sous les membres et une suffusion brune sous la gorge. Chez le juvénile, le dessous

est beige marron avec de petites taches blanches.

Dimorphisme sexuel. - Les mâles n’ont pas de sac vocal et de fentes vocales, ni de

coussinets nuptiaux (du moins chez les deux spécimens examinés). Ils peuvent cependant être

aisément distingués des femelles par leur taille plus faible, et surtout par leurs membres

antérieurs plus robustes, à humérus pourvu d’une crête aliforme (crista medialis). I] faut aussi

souligner que les testicules, non pigmentés, sont particulièrement volumineux, caractère que

PERRET (1972) signale aussi chez W mirei et W. parvipalmata, et qui pourrait être propre au

genre.

Distribution et écologie. — W chirioi n’a été trouvée que sur le Mont Okou. Compte tenu de son

écologie (voir ci-après), il est probable que l'espèce est endémique de ce massif.

Culminant à 3011 m, le Mont Okou (ou Oku) est le second sommet de la Dorsale

camerounaise après le Mont Cameroun (4095 m). La Dorsale camerounaise est un ensemble

de hauts plateaux et de montagnes, souvent volcaniques et d’altitude supérieure à 2000 m, qui

jalonnent un système de failles, orienté SSW-NNE, la “ligne du Cameroun”. Exception faite

des monts Mandara, qui en sont nettement séparés, la Dorsale s'étire sur plus de 600 km; dans

sa partie centrale, des chaînons transversaux lui confèrent une largeur maximale de l'ordre de

200 km. Malgré son altitude, le Mont Cameroun est isolé de la masse principale de la Dorsale,

dont le noyau correspond au Mont Okou. Celui-ci, bien que d’origine volcanique, n’a plus

d'activité, contrairement au Mont Cameroun.

Si l’on adopte la succession d’étages reconnue par Letouzey, dans la Notice de sa carte

phytogéographique du Cameroun (LETOUZEY, 1986), le Mont Okou est le seul sommet de la

Dorsale (Mont Cameroun excepté) qui atteigne l'étage afro-subalpin. Toutefois, la zone

correspondant à cet étage a une amplitude restreinte, puisque sa limite inférieure se situe,

d’après le même auteur, vers 2800 m.

A ce niveau, la végétation est essentiellement herbacée, avec des prairies à Sporobolus

comprenant divers orophytes, dont quelques espèces sont caractéristiques de l'étage. Cette

végétation a probablement une origine au moins en partie anthropique, car les troupeaux des

pasteurs Bororos pâturent jusqu’au sommet. LETOUZEY (1986) signale l'existence, dans la

région culminale, de taillis arbustifs, de lambeaux forestiers et même de “taches importantes”

de forêt de Podocarpus sur le versant nord: ces formations doivent représenter les vestiges

d’une végétation forestière autrefois plus étendue qu'à présent.

L'altitude à laquelle ont été capturés les spécimens de Lamotte n'est pas connue, mais

ceux de Chirio ont été trouvés à 3000 m, donc presque au sommet. En se fondant sur ce que

l'on sait de la batrachofaune d'autres massifs camerounais (MERTENS, 1938; AMIET, 1975,

1980, 1987), on peut raisonnablement avancer que la présence de W! chirioi est liée à celle de

Source : MNHN, Paris

136 ALYTES 18 (3-4)

Fig. 5. - Deux espèces de Wo/terstorflina photographiées sur le vivant: a, W! mirei, mâle des Monts

Bamboutos, juillet 1974; b, H! parvipalmata, femelle du Mont Kala, près de Yaoundé, 21 décembre

1970. Les excroissances des paupières supérieures de HW! parvipalmata et la dilatation humérale du

mâle de H! mirei sont bien visibles (photos J.-L. Amiet)

Source : MNHN, Paris

BOISTEL & AMIET 137

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pr C1] W. parvipalmata

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Fig. 6. - Carte du sud-ouest du Cameroun montrant la distribution des trois espèces de Wolterstorffinar

Trame quadrillée à 10 minutes sexagésimales: courbes de niveau de 900 et 1500 m.

Source : MNHN, Paris

138 ALYTES 18 (3-4)

l'îlot d'étage afro-subalpin, ce qui n'exclut pas qu’elle puisse en transgresser la limite infé-

rieure. Des recherches ultérieures devront préciser quelles autres espèces d’anoures lui sont

associées, et surtout quels sont ses rapports spatiaux avec W mirei: cette espèce, abondante sur

le Mont Mélétan dans le massif des Bamboutos, entre 2400 et 2700 m, a été en effet décrite sur

des spécimens récoltés par l’entomologiste P. Bruneau de Miré sur le Mont Okou vers 2500 m

d'altitude (d’après PERRET, 1971).

On remarquera que les trois espèces de Wolterstorffina se succèdent verticalement suivant

un schéma assez semblable à celui que montrent d’autres anoures orophiles du Cameroun

(AMEET, 1980):

(1) W parvipalmata est répandue dans l'étage submontagnard sur les flancs sud et ouest

de la Dorsale mais descend assez nettement en-dessous de la limite inférieure de cet étage et

atteint le massif de Yaoundé (espèce “paramontagnarde”), où elle subsiste, comme relicte

paléoclimatique, dans la frange supérieure de l'étage collinéen (AMIET, 1987);

(2) W mirei peuple la partie supérieure de l'étage afro-montagnard (environ 1800-

2800 m) des massifs centraux de la Dorsale;

(3)W chirioin’est connue que de la partie inférieure de l'étage afro-subalpin du Mt Okou.

CLÉ D'IDENTIFICATION DES GENRES DE BUFONIDAE DU CAMEROUN

ET DES ESPÈCES DU GENRE WOLTERSTORFFINA

1. Glandes parotides et tympans présents; tégument dorsal fortement verruqueux (sauf chez

B. superciliaris) 4 Bufo

1°. Ni glandes parotides ni tympan:

2. Tégument dorsal lisse; pieds normaux, à palmure peu développée (sauf chez les mâles en

livrée nuptiale de Werneria bambutensis) .… Werneria

2’. Un relief tégumentaire plus ou moins accusé, au moins sur certaines parties du corps et des

membres; pied présentant des caractères particuliers ou, au moins, largement palmés ..…. 3

ulement 4 orteils, les doigts et orteils I et IV

Didynamipus

3. Pieds et mains étroits, d'aspect atrophié: s

réduits; taille faible (18-24 mm)

3°. Cinq orteils et quatre doigts, pieds largement palmés .............................. 4

4. Des lamelles transversales sous les orteils et les doigts, pieds et mains largement palmés:

taille petite (18-25 mm) ..... Nectophryne

4. Pas de lamelles sous les doigts et les orteils, seuls les pieds sont largement palmés

(25-40 mm) Wolterstorffina (5)

5. Extrémité du museau saillante, dépassant nettement la bouche; paupières supérieures

fortement verruqueuses: main avec une palmure interdigitale ... W parvipalmata

5’. Extrémité du museau non ou à peine saillante;

verruqueuses: palmure interdigitale petite ou absente

upérieures non ou à peine

paupièr

avec des excroissances spinuleuses:

W chirioi

6. Tégument dorsal lisse, la région scapulaire et les flancs

tranche externe des pieds épaissie, d'aspect boursouflé

6°. Tégument dorsal verruqueux: tranche externe des pieds non épaissie ........ W mirei

Source : MNHN, Paris

BoISTEL & AMIET 139

RÉSUMÉ

Une nouvelle espèce de Wolterstorflina, W. chirioï, est décrite du Mont Okou (Came-

roun). Elle se distingue des deux autres espèces déjà connues, W parvipalmata et W! mirei, par

plusieurs caractères (par exemple, son tégument lisse sur le dos mais verruqueux-spinuleux sur

les flancs et les épaules, la tranche externe de ses pieds fortement épaissie, sa taille plus grande,

etc.). W chirioi est probablement une espèce endémique de l'étage afro-subalpin du Mont

Okou.

REMERCIEMENTS

Nous exprimons notre gratitude d’abord à M. Laurent Chirio, dont les captures ont été à l’origine de

ce travail, ainsi qu'à Madame Annemarie Ohler et MM. Alain Dubois, Jean-Pierre Gase, Stéphane

Sjean, Julio Mario Hoyos, Maxime Lamotte, Olivier Pauwels et Jean-Luc Perret qui, à des titres

divers, nous ont apporté leur aide et ont ainsi contribué à sa réalisation.

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Source : MNHN, Paris

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À new species of tree frog

(Anura, Hylidae, Litoria)

from the mountains of Irian Jaya, Indonesia

Stephen J. RicHarDs* ! & Djoko T. ISKANDAR**

* School of Tropical Biology, James Cook University,

Townsville, Queensland 4811, Australia

** Laboratory of Biosystematies and Genetics, Jurusan Biology,

Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Institute of Technology,

Bandung 10, Jalan Ganesa, Bandung 40132, Indonesia

fiskandar@bi.itb.ac.id]

A new species of hylid frog is described from lower montane rainforest

(1070 m elevation) in the headwaters of the Wapoga River, Irian Jaya. The

new species shows affinities to some members of the Litoria nigropunctata

species-group but can be distinguished from all described species in that

group by a combination of dark brown colouration on the hidden surfaces of

the thighs, groin and axilla, and dorsal colouration which consists (in life) of

small yellow spots on a uniform green background. The advertisement call

is a short, distinctly pulsed note lasting about 0.2 second, with a dominant

frequency of about 2.5 kHz.

INTRODUCTION

The Australopapuan hylid frog genus Litoria reaches its greatest diversity in Australia

and mainland New Guinea (FRosT, 1985). Although the genus is relatively well documented

in Australia (BARKER et al., 1995), the New Guinea fauna remains poorly known. This is

particularly true for the Indonesian province of Irian Jaya where fauna surveys have lagged

behind those in neighbouring Papua New Guinea (ALLISON & DWIYAHRENI, 1997)

Ten small green Litoria species have been reported from the mountains of New Guinea.

MENZIES (1993) included six of these (Litoria chloronota, L. iris, L. havina, L. leucova, L

mucro and L. ollauro) in the Litoria nigropunctata Species-group, which was defined (in part)

by TyLer & DAVIES (1978) as “small to medium species with short, 1/3-webbed fingers and

almost fully webbed toes. Predominantly green in life and may be marked with gold and

black.” JOHNSTON & RICHARDS (1994) subsequently redefined L. leucova and suggested that it

may be related to torrent-dwelling frogs of the L. becki species-group of TYLER & DAVIES

(1978). They described an additional member of the L. nigropunctata group, Litoria maÿik-

thise, from the foothills of the Star Mountains.

ate Department, South Australian Museum, North Terrace, Adelaide, S.A. 5000, Australia:

1. Current address: Vertel

Richards Stevetsaugov.s:

Source : MNHN, Paris

142 ALYTES 18 (3-4)

Litoria contrastens is a montane representative of the predominantly lowland Litoria

bicolor species-group, and two other small green Litoria, L. bulmeri and L. longicrus, are

torrent-dwelling frogs that live along steep mountain streams (S. J. Richards, personal

observations). TYLER & DAVIES (1978) placed L. bulmeri in a monotypic species group and,

based solely on morphological characters, erroneously included L. longicrus in the L. bicolor

species-group. Two of these species have been reported from Irian Jaya. Litoria iris à

widespread along the central mountainous spine of New Guinea, reaching its western limi

the Star Mountains in Irian Jaya (TYLER, 1968). Litoria chloronota is endemic to Irian Jaya,

being known only from the Arfak Mountains on the Vogelkop Peninsula (TYLER, 1968:

MEXNZIES, 1993).

During a biodiversity survey in the mountainous headwaters region of the Wapoga

River, Irian Jaya (MACK & ALONSO, 2000), we collected eight specimens of an undescribed,

small green treefrog showing some affinities with the Liroria nigropunctata species-group

(TYLER & DAVIES, 1978). Here we describe the new species and provide information on its

advertisement call and natural history.

MATERIAL AND METHODS

Specimens are deposited in the Museum Zoologie Bogoriense (MZB), Indonesia,

and the South Australian Museum (SAMA), Australia. Additional specimens examined

for comparisons (see list in app. 1) are in the British Museum (BM) and the Natural

Sciences collection of the University of Papua New Guinea (UP). Measurements (to the

nearest 0.1 mm) were taken with dial callipers and a stereomicroscope fitted with an ocular

micrometer, and follow MENZIES (1993). They are: SVL (snout-vent length), TL (tibia length),

HW (head width at tympanum), HL (head length from tip of snout to posterior edge of

tympanum), EYE (horizontal eye diameter), TYM (horizontal tympanum diameter), IN

(inter-narial distance), EN (distance between anterior edge of eye and posterior edge of

naris), 3FD (horizontal diameter of 3" finger disc) and 3FP (narrowest horizontal width of

3% finger penultimate phalanx), 4TD and 4TP (4 toe disc and penultimate phalanx, as for 3"

finger). For measurements and proportions, the mean (x) is given below followed by the

standard deviation (s) and the range.

Calls were recorded with a Sony Professional Walkman tape recorder and SMZ-200

microphone, and were analysed with the sound analysis program Avisoft SAS-Lab Pro.

RESULTS

Litoria wapogaensis sp. nov.

(ig. 1-6)

Holotype. - MZB Amp.3873, adult male, collected at Wapoga Alpha exploration camp

(1364 ’E, 3°08.687S, 1070 m elevation) in the headwaters of the Wapoga River, Irian

Jaya Province, Indonesia, on 12 April 1998. by S. Richards & D. Iskandar.

Source : MNHN, Paris

RICHARDS & ISKANDAR 143

Paratypes.- MZB Amp.3874-3875, SAMA R54595-54598, adult males collected at the same

locality as the holotype on 9 April 1998; MZB Amp.3876, adult male collected at the same

locality as the holotype on 15 April 1998.

Diagnosis. — À small Litoria (males 30.5-32.9 mm SVL) characterised by: (1) snout broadly

rounded in dorsal view and bluntly rounded in lateral view: (2) canthus rostralis poorly

defined, gently rounded and straight or slightly curved: (3) vomerine teeth present: (4) fingers

one half webbed: (5) dorsum (in life) green with small yellow spots: (6) axilla, groin and

hidden surfaces of thighs deep purplish brown; and (7) advertisement call a single, distinctly

pulsed note.

Description of holotype. - Head moderately slender (HW/SVL 0.35); head about as wide as

long (HL/HW 1.02), slightly more than one-third body length (HL/SVL 0.35). Snout broadly

rounded in dorsal view, bluntly rounded in lateral view (fig. 1, 3). Dorsal one-fifth of

tympanum obscured by gently curving supratympanic fold that extends from posterior edge

of eye half-way to point of arm insertion. Eye relatively large, prominent (EYE/SV 0.123).

Canthus rostralis poorly defined, gently rounded, slightly curved; loreal region slightly

concave. Vomerine teeth in two raised patches between choanae, vocal slits present. Tongue

broadly cordiform.

Limbs slender. Fingers short, outer fingers one-half webbed: relative lengths of fingers

I > IV > I > I; terminal discs large, prominent (3FP/3FD 0.64). Subarticular tubercles

distinctly bi-lobed. Brown nuptial pad on each thumb. Legs moderately long (TL/SVL 0.59).

Toes nearly fully webbed; web reaching base of disc except on 4‘ toe where webbing reaches

penultimate tubercle and continues as fringe along toe to base of disc. Toe discs large,

prominent (4FP/4FD 0.69). Relative lengths of toes IV > II = V > IT > I. Subarticular

tubercles on toes 3-5 bi-lobed.

Dorsum very finely striated (nearly smooth), without tubercles on head or body. Ventral

surface finely granular on throat, coarsely granular on belly. Large white tubercles on ventral

surface of thighs.

Colour in life. - Dorsally uniform green with scattered, small yellow spots; narrow, pale

yellow stripe around upper jaw. Ventral surfaces white. Axilla, groin and posterior of thigh

deep purplish brown.

Colour in preservative. — Dorsally pale blue with small white spots; a faint white stripe

around upper jaw. Pigmentation in axilla, groin and posterior of thigh dark brown. Brown

pigment on legs sharply delineated from blue dorsal colouration of limbs by two narrow strips

of black and brown pigmentation. Blue pigmentation on arms terminating abruptly in clearly

demarcated line at wrist. Pigment on hands restricted to fine brown stippling on dorsal

surfaces of 3"! and 4!” fingers, extremely sparse on 2" finger. Plantar surfaces with scattered

brown pigmentation.

Measurements (mm) of holotype. - SVL 30.7: TL 18.2: HW 104

IN 3.8: TYM 1.6; 3FD 1.7: 3FP 1.1; 4FD 1.6: 4FP 1.1.

Variation. — There are seven paratypes. all adult males (SVL 30.5-32.9 mm). Dorsal coloura-

tion of all specimens is pale to dark blue (green in life) with scattered small white (yellow in

life) spots. In some specimens a few spots are very pale blue (pale. yellowish greenin life)

EYE 38; EN 3.0:

Source : MNHN, Paris

144 ALYTES 18 (3-4)

Fig. 1. - Lateral view of the head of Litoria wapogaensis, paratype (SAMA R54595). Scale bar: 2 mm.

and several specimens have very small, intensely dark blue (dark green in life) spots concen-

trated laterally. The dark brown colouration of the concealed surfaces of the thighs and axilla

is a conspicuous feature of all specimens and is ined in preservative. AI paratypes have a

prominent short, raised white ridge below the vent, a feature that is poorly developed in the

holotype. In two of the paratypes (SAMA R54596 and 54598), the vomerine teeth are poorly

developed.

Measurements (mm) and proportions of the six paratypes (x + 5, range ).— SVL 31.85 +

0.91, 30.5-32.9; TL 18.1 + 0.51, 17.4-19.0; HW 10.97 + 0.25, 10.5-11.1; EYE 3.81 + 0.21,

3.5-4.1; EN 2.95 + O.1 3.2: IN 3.81 + 0.16, 3.6-4.0; TYM 1.53 + 0.05, 1.5-1.6; 3FP 1.05

+ 0.12,0.9-1.3: 3FD 1.71 + 0.21, 1.4-2.0; 4TP 1.0 + 0.15, 0.8-1 TD 1.52 + 0.18, 1.3-1

TL/SVL 0.56 + 0.02, 0.53-0.59; EYE/SVL 0.12 + 0.008, 0.1-0.13; EN/IN 0.77 + 0.

0.71-0.88; 3FP/3FD 0.62 + 0.06, 0.55-0.71; 4FP/4FD 0.65 + 0.06, 0.58-0.75.

Advertisement calls. — We recorded 28 calls from three specimens. Two different calls were

produced. The most frequently produced call (78.6 % of total), and the one that we presume

to be the advertisement call, was a single distinctly pulsed note emitted at irregular intervals

(fig. 5: tab. 1). The mean length of 22 calls was 0.20 s (s 0.03, range 0.16-0.30). Mean pulse rate

was 41.39/s (4.07, 34.0-47.8) and the mean dominant frequency wi 7 Hz (2177, 1733-

2659). The second call type was emitted infrequently, and was possibly produced during

Source : MNHN, Paris

RICHARDS & ISKANDAR 145

Fig. 2. - Palmar and plantar views of the hand and foot of Litoria wapogaensis, paratype (SAMA

R54595). Scale bar: 2 mm.

Source : MNHN, Paris

146 ALYTES 18 (3-4)

Fig. 3. Litoria wapogaensis male in calling position, Wapoga, Irian Jaya.

although further observations are required to confirm this. These calls

5.97/s; fig.

inter-male interactions

were shorter (mean length 0.15 s), and had a much higher pulse rate (mean

Detailed analyses are presented in tab. 1.

. One

specimen was collected at night from a Pandanus leaf at a height of about 1.0 m in a small

Natural history. - The collection locality is in closed-canopy lower-montane rainfores

Pandanus swamp. The remaining specimens were calling at night from fern fronds and other

low vegetation along a slow-flowing, shallow and swampy stream (fig. 4). These were the only

erbodies in the area. Despite the abundance of swiftly flowing streams in the region,

s was never collected or observed in lotic habitats.

Comparison with other species. — In its general size, dorsal colouration and extent of finger

webbing, Litoria wapogaensis shows some affinities with L. iris and its allies (as defined by

MENZIES, 1993) within the L. nigropunctata species-group. À comparison of morphological

characters among montane green Litoria is presented in tab. 2. Most species can be readily

he concealed surfaces of the thighs are

distinguished in life on the basis of thigh colouration

brightly coloured (purple, orange, red or blue) in Litoria chloronota, L. iris, L. majikthise and

L. ollauro (versus dark brown in L. wapogaensis). The latter three species also difler in

possessing a violet patch in the groin and axilla (versus dark brown). Litoria havina has bright

red thighs, and males are further distinguished from L. wapogaensis by the presence of a

rostral spike (absent in L. wapogaensis). Litoria wapogaensis can also be distinguished from all

of these species by its advertisement call, which is a single distinctly pulsed note. MENZIES

Source : MNHN, Paris

RICHARDS & ISKANDAR 147

Table 1. - Advertisement call characteristics of Litoria wapogaensis sp. nov. Measurements are

given as mean (standard deviation) range. See text for description of call types.

Specimen SAMA R54595 SAMA R54596 MZB Amp.3876

Call Type slow fast slow fast slow Fast

Air temperature (°C) 226 26 204

n 5 1 5 1 12 4

0.182 (0.019) 0.224 (0.047) 0214(0.027) 0.115 (0.071),

Length (s) 0.359 0.095

0.16-0.20 0.176-0.301 0.16-0.252 0.07-0.22

Pulses 8-10 50 8-12 32 7-12 21-36

41.71 (1.89) 35.59 (0.9) 43.67(3.0) 238.26 (58.56)

Pulse rate (pulses/s) 136.5 3263

38.46-43.06 34.09-36.54 375-4782 1576-2857

2400 (141.83) 2354 (35.68) 2341 (285) 2142.3 (445)

Dominant frequency (Hz) 2834 2326

2204-2573 2315-2404 1733-2659 1707-2708

(1993) and JOHNSTON & RICHARDS (1994) provided detailed descriptions of the calls of L. iris

and other members of this group.

Litoria contrastens (male SVL 25-30 mm) is smaller than L. wapogaensis (male SVL

30.5-33 mm), with an immaculate dorsum (versus yellow-spotted), relatively shorter legs, a

relatively longer snout, and without vomerine teeth (tab. 2). The shape of the snout (distinctly

projecting in profile) is also quite different from L. wapogaensis (bluntly rounded in profile).

Litoria bulmeri is a torrent-dwelling species (S. JL Richards, unpublished) that is readily

distinguished from L. wapogaensis by having fingers free of webbing and a broad black lateral

band, and is not considered further here. Litoria longicrus is a small species (SVL < 30 mm)

with a broad white bar beneath the eye and has much longer legs than L. wapogaensis

(TL/SVL 0.62-0.63 versus 0.53-0.59)

Four lowland species that are partly or entirely green in life are compared with L.

wapogaensis. Litoria mystax is a small species (29.5 mm SVL) known only from the holotype.

It can be distinguished from L. wapogaensis by its prominent and strongly curved canthus

rostralis (versus poorly defined, slightly curved or straight), a broad white bar beneath the eye

(absent in L. wapogaensis) and yellowish-brown (versus white) venter (TYLER, 1968). Litoria

gracilenta was described from northeastern Australia and the status of New Guinea popula-

tions is unclear (GÜNTHER & RICHARDS, 2000). New Guinea specimens currently referred to

L. gracilenta, and the recently described Litoria elkeae, are small green frogs (male SVL

approximately 30 mm) in which the dorsum is frequently spotted with white, and there is a

pale cantho-rostral stripe. The concealed surfaces of the thighs are cream or pale yellow in L.

elkeae (versus dark brown in L. wapogaensis) (GÜNTHER & RICHARDS, 2000).

Litoria nigropunctata is a small lowland frog that is predominantly brown or green-

brown in life, and frequently exhibits small black spots on the dorsum. It further differs from

Source : MNHN, Paris

Table 2. - Comparisons among Litoria wapogaensis sp. nov

text).

. and small green Litoria occurring in the mountains of New Guinea (excluding L. bulmeri: see

SVL (mm)

Violet in groin

Rostral spike

sois manon [Mango nus | sm | asennenenean Retaes

(as) ail Gas on) |_ sh

orge a msn | obus | - [asos [once] | + Fa

Series of short

Litoria chloronota (Boulenger, 1911) 27-32 Orange +“ 0.52-0.58 | 0.63-0.71 F5 L æ MENZIES, 1993

amàngnots

Clicks followed b} TYLER, 1968;

Litoria contrastens (Tyler, 1968) 25-30 Orange-red - 0450.54 | 0.89-1.17 di à -

morbez as 176

Litoria havina Menzies, 1993 30-36.5 Cherry-red F 0.54-0.61 | 0.63-0.79 | Series of whistles + - MENZIES, 1993

Series of clicks

Biaiairs ,1962 mas [norton] + ous Jomes [ou | mous 198

and buzzes

Transh it pink Short and k ls

Lire men | ansass [rates] asoss Faraggg |Sherméieal | 1 Loerona monane, 194

with yellow spots in long series

Litoria longicrus (Boulenger, 1911) 274 Unpigmented 5 0.623-0.628 | 0.58-0.61 ? - + TYLER, 1968

ru. | Shop

cor harsh “raagh”

mie

Litoria mucro Menzies, 1993 <31mm Gr peik * 0.51-0.56 | 0.8-1.1 ? + “ MENZIES, 1993

peppered black

Litoria ollauro Menzies, 1993 <34mm Blue p 0.54-0.59 | 0.75-0.95 | Quiet ereaking noise - + MENzIES, 1993

8pl

(p-€) 81 SALATV

Source : MNHN, Paris

RICHARDS & ISKANDAR 149

Fig. 4. — Habitat of Litoria wapogaensis in lower montane rainforest, Wapoga River headwaters, Irian

Jaya.

;

4 2| LU MT OT

T T T T T T T

0.05 0.1 0.15 02 0.25 0.3 0.35 s

Fig. 5. — Wave form (top) and audiospectrogram and frequency spectrum (bottom) of two types of

vocalisations of Liroria wapogaensis. Left, slow call: right, fast call. Ta = 22.6°C.

Source : MNHN, Paris

150 ALYTES 18 (3-4)

130° 135 140

ï ; ï :

Jayapural

ER, ù

Arafura Sea

Fig. 6.— Type (and only known) locality of Litoria wapogaensis, Irian Jaya, Indonesia.

Merauke

L. wapogaensis in having yellow (erroneously reported as black by JOHNSTON & RICHARDS,

1994) in the concealed parts of the thighs, in having a truncate (versus rounded) snout, and in

its different advertisement call, which is an “irregular succession of clicks and buzzes”

(MENZIES, 1972). Through the courtesy of Mr. David Price, we have examined several

specimens and advertisement calls of Litoria nigropunctata from the vicinity of the type

locality (Yapen Island, Irian Jaya). Morphologically and acoustically these animals agree

closely with populations from mainland New Guinea (MENZIES, 1972; $. J. Richards, unpu-

blished) and differ consistently from L. wapogaensis in the characters described above.

Etymology. - Named for the headwaters of the Wapoga River, the major drainage system for

the spectacular rainforest-clad mountains where the new species was collected.

APPENDIX I

ADDITIONAL SPECIMENS EXAMINED

Liroria elkeae Günther & Richards, 2000. - INDONESIA. Irian Jaya Province, Siewa: paratypes MZB

Amp.3866-9.

Litoria havina Menzies, 1993. - PAPUA NEW GUINEA. Western Province, Ok Ma: paratypes UP

8406-7.

Source : MNHN, Paris

RICHARDS & ISKANDAR 151

Litoria iris (Tyler, 1962). - PAPUA NEW GUINEA. Southern Highlands Province, Tari: UP3115-35;

Eastern Highlands Province, Ubaigubi: UP8289-90; Enga Province, Porgera: UP7148-67; Sandaun

Province, Telefomin: SAMA R5423, 5874.

Litoria leucova (Tyler, 1968). - PAPUA NEW GUINEA. Sandaun Province, Mount Stolle: SAMA

R44091-44092, UP 86046.

Litoria longicrus (Boulenger, 1911). - INDONESIA. Irian Jaya Province, Wendessi: syntype BM

1947.2.22.61.

Litoria majikthise Johnston & Richards, 1994. - PAPUA NEW GUINEA. Western Province, all in

general vicinity of Tabubil: holotype SAMA R44093; paratypes UP 6734, UP 7305-9, UP 8501-8,

UP 8602-3, SAMA R44094-44101.

Litoria mucro Menzies, 1993. - PAPUA NEW GUINEA. East Sepik Province, near Rauit Village:

paratypes UP 2741-2743, UP 2745-2756.

Litoria nigropunctata (Meyer, 1875).- PAPUA NEW GUINEA. Morobe Province, Lac: SAMA R09296;

Madang Province, Binek near Madang: SAMA R11794.

ACKNOWLEDGMENTS

We are extremely grateful to Dr Arie Budiman of Puslitbang Zoology, and the head of Museum

Zoologicum Bogoriense — LIPI, Ibu Liliek Prijono, for their assistance in Jakarta and Bogor. This

research was part of Conservation International’ Rapid Assessment Program, and we greatly appreciate

their assistance, Funding support was provided by the CI-USAID Cooperative Agreement N°PCE-5554-

A-00-4028-00. We are especially grateful to Dr Andy Mack, Dr Jatna Supriatna, and Mr Burke Burnett

of CI for their support and assistance during the survey. PTFreeport Indonesia provided invaluable

logistical support for which we are most grateful. Mr David Price kindly allowed the senior author to

examine his valuable collection of frog specimens from Yapen Island, and the Price family provided

generous hospitality to the senior author in Jayapura. Bronwen Scott produced fig. 1-2 and Warwick

Browne helped produce the map. Mike Tyler kindly provided useful comments on the manuscrit.

LITERATURE CITED

ALLISON, À. & DWWIYAHRENI, A. À. 1997. — The amphibians and reptiles of the Freeport Contract of Work

Region, Irian Jaya: results from the survey of 4-26 March 1997. Unpublished Report, PT Freeport,

Jakarta.

BARKER, J., GRIGG, G. C. & TYLER, M. J., 1995. — 4 field guide to Australian frogs. NSW, Surrey Beatty

& Sons: i-x + 1-407.

FRosr, D. R., (ed.), 1985. - Amphibian species of the world. Lawrence, Allen Press & Assoc. Syst. Coll.:

Liv] + iev + 12732.

GÜNTHER, R. & RICHARDS, S. J., 2000. - A new species of the Litoria gracilenta group from Irian Jaya

(Anura: Hylidae). Herpetozoa, 13: 27-43.

JOHNSTON, G. R. & RICHARDS, S. J., 1994. — A new species of Liroria (Anura: Hylidae) from New Guinea

and a redefinition of Litoria leucova (Tyler 1968). Mem. Qld. Mus., 37: 273-279.

Mack, A. & ALONSo, L., (ed), 2000. - A biological assessment of the Wapoga River area of northwestern

Irian Jaya, Indonesia. RAP Bulletin of Biological Assessment, Washington, Conservation Interna-

tional, 14: 1-129.

MENZIES, JL L., 1972. - Papuan tree-frogs of the Litoria nigropunctata group. Herpetologica, 28: 291-300.

1976. — Handbook of common New Guinea frogs. Wau, Papua New Guinea, Wau Ecology Institute

Handbook N°1: i-viii + 1-75.

993. - Systematics of Liroria iris (Anura: Hylidae) and its allies in New Guinea and a note on sexual

dimorphism in the group. Aust. J. Zool., 41: 225-255.

Source : MNHN, Paris

152 ALYTES 18 (3-4)

Tvuer, M. J., 1968. - Papuan hylid frogs of the genus Hyla. Zool. Verhandel., 96: 1-203.

TYLER, M. J. & Davirs, M., 1978. - Species-groups within the Australopapuan hylid frog genus Litoria

Tschudi. Aus. J. Zool., suppl. 63: 1-47.

Corresponding editor: Alain DuBoIs.

Source : MNHN, Paris

Alytes, 2001, 18 (3-4): 153-177. 153

Frog morphometrics: a cautionary tale

Lee-Ann C. HAYEK*, W Ronald HEYER**! & Claude GASCON***

* Mathematics & Statistics, MRC 136, National Museum of Natural History,

Smithsonian Institution, Washington, DC 20560-0136, USA

Ihayek.lee-ann@nmnh.si.edu]

** Amphibians & Reptiles, MRC 162, National Museum of Natural History,

Smithsonian Institution, Washington, DC 20560-0162, USA

[heyer.ron@nmnh.si.edu]

**+ Field Support Program, Conservation International,

2501 M Street, N' uite 200, Washington, DC 20037, USA

[c.gascon@conservation.org]

Scant attention has been paid to measurement error in frog morpho-

metric studies. We study both interobserver effects of measurement on the

same specimens of Vanzolinius discodactylus (Anura, Leptodactylidae)

and intraobserver effect of repeated measurements on a single V discodac-

tylus specimen. Interobserver measurements differ statistically and result

in different biological interpretations in some cases. Evidence is provided

that log transformation of raw data is often unnecessary. Allometric trans-

formation of measurement variables to remove size effect requires parallel

regression slopes of variable against size. This requirement is not met with

the V. discodactylus data, nor is it likely to be met when several variables

are used in a morphometric study. We recommend: assume measurement

differences between sexes in frogs and analyze data separately by sex;

consider and select the most appropriate statistical model options for data

analyses; avoid pseudoprecise measurements; do not rush to logarithmic

transformation; remeasure at least one individual frog 20 times to provide

an assessment of measurement error in data interpretation; be conservative

in drawing biological inferences from morphometric analyses, basing inter-

pretations and conclusions only on very robust effect size estimates and

differences.

INTRODUCTION

Frogs are relatively soft-bodied organisms and their preservation requires considerable

care. Limbs and body must be correctly positioned to achieve standardized preparation.

Unfortunately, different preservatives and different individual techniques result in very diffe-

rent museum preparations for the same species (fig. 1). Therefore, precise, comparable

measurements of preserved frogs are difficult. For example, one of the standard measure-

ments taken on fro, nout-vent length (SVL), is somewhat problematic in larger preserved

frogs, because the sacral-urostyle portion of the body usually is fixed at an obtuse angle to the

vertebral column. How much one “straightens out” the preserved animal has an effect on the

1. Corresponding author

Source : MNHN, Paris

154 ALYTES 18 (3-4)

Fig. 1. — Thoropa miliaris (USNM 38936 on left, USNM 229848 on right) showing preservation/

positioning differences that make accurate, comparable measurements difficult

resultant measurement. In spite of (or, perhaps oblivious to) these difficulties,

have used frog measurement data to address a ty of scientific questions. There has been

little attention paid to precision and repeatability of frog measurement data and how this

variation might affect the scientific questions being addressed.

We know of only one study (LEE, 1982) that demonstrated important measurement

differences between fresh and preserved frogs and differences in measurements taken on the

same individuals at the same state of preservation. In that study, Lee took all the measure-

ments himself using the same measuring equipment and methodology throughout. Although

LEE (1982) presented extensive literature on the effects of preservation technique on fish

morphology and discussed its relevance to frog morphometries, herpetologists have generally

ignored his warnings.

Source : MNHN, Paris

HAYEK, HEYER & GASCON 155

We are not aware of any published studies of the effect of different individual researchers

taking the same set of measurements on the same frogs to measure inter-observer variability

(although A. Dubois and A. Ohler have unpublished data on this topic, personal communi-

cation). Studies on other groups of organisms demonstrate that such differences are not

trivial. LEE (1990) found differences in precision between two observers on scale count data

taken from the same lizards. YEZERINAC et al. (1992) found that measurement error varied

considerably, depending on the variable, for bird skeleton measurement data. In these studies,

a constant value was being measured. That is, the number of scales did not change on any

individual lizard, nor did the individual bird bones change size or shape. As indicated above,

this is not true for whole frog specimens: how the specimen is positioned will determine what

the value of the measurement will be for several of the measurements (variables) commonly

taken for frog morphometric studies.

PAGANO & JoLY (1999) compared a select group of morphological measures on water

frogs with an analysis of allozymic markers. These authors concluded that frog morphology

was of limited use for their identification purposes. They determined frog body landmarks for

measurement points from digitized photographs of specimens. Data were input and analyzed

on a computer. Similar methodology has proved acceptable for characterization of strati-

graphic sections (see e. ENSON et al., 1995), in which the surfaces are approximately

linear and two-dimensional. However, for examination of three-dimensional, soft-bodied

organisms, the use of such methods further complicates the measurement process. Despite the

stated advantage of magnification of digitized figures for measurement purposes, statistical

error minimization has not been proved to be achievable for measurements taken from frog

photographs. Based on our experience, we do not recommend using photographs of frogs

from which to take morphometric data.

One of us (CG) took a series of measurements on specimens of the frog species

Vanzolinius discodactylus (Anura, Leptodactylidae) from the Rio Juruä in Brazil to test the

riverine hypothesis of speciation (GAsCoN et. al., 1996). Another of us (WRH) used the same

specimens in a study examining differentiation throughout the entire species range of W

discodactylus (HEYER, 1997). WRH took the same set of measurements on the same frogs that

CG measured. The two data sets were given to LCH to analyze and evaluate. During the

course of this study, LCH reevaluated the statistical procedures and assumptions used in the

Gascon et al. (1996) study.

The objectives of this study are: (1) to evaluate inter- and intra-observer statistical

differences of measurement sets; (2) to understand the kinds of differences investigators create

when measuring frogs; (3) to evaluate the effect of measurement differences on certain

statistical procedures that are generally applied in frog morphometric studies: and (4) to judge

whether measurement differences yield different biological interpretations.

METHODS AND MATERIALS

Fourteen measurements were made on each frog, following the methodology in GASCON

et al. (1996). The fourteen variables are: snout-vent length (SVL), nostril separation, eye

Source : MNHN, Paris

156 ALYTES 18 (3-4)

width anterior, eye width posterior, head width, head length, eye to nostril distance, tympa-

num diameter (tympanum height of GascoN et al., 1996), eye length, thigh length (femur

length of GASCON et al., 1996), shank length (tibia length of GascoN et al., 1996), foot length,

maximum width of disk on third finger, and maximum width of disk on fourth toe.

Prior to WRH's taking of these data, he confirmed landmarks with CG for a subset of

the variables in an attempt to make certain that the measurements would be comparable.

CG and WRH measured each individual one time.

CG used digital calipers linked to an IBM-PC; measurements were made to the closest

0.01 mm and the data were recorded with three decimal places. WRH used Helios dial

calipers; measurements were made to the closest 0.1 mm and the data were recorded with one

decimal place.

To assess individual measurement error, WRH measured one male, USNM 348976, 20

times over a 12 day period. The eye region on one side of the head is slightly squashed, other-

wise this specimen is in reasonable shape. The specimen is about average in overall state of pres-

ervation and positioning in terms of ease of measurements. Measurements were taken at

various times of the day and measurements were never taken one immediately after the other to

eliminate or minimize carry-over effects of learning or memory. For SVL, efforts were made to

focus visually on the caliper jaws when measuring the specimen and not to look at the readout

dial until after the jaws had been set. AI other measurements were taken under a dissecting

microscope with the calipers while the measurement readout dial was not visible in the field of

observation. Measurements were recorded on dated and timed separate, individual data sheets.

CG and WRH used different criteria to categorize sex of the individuals. CG used three

categories: F, M and 0. In cases where CG opened the frog to take tissues, sex and whether the

individual was adult or not were determined by the state of its gonads. Individuals recorded

as 0 were not opened. These data were recorded under field conditions. For the morphological

analyses reported by GAsCON et al. (1996), data for adult and non-adult males were combined

as were the data for adult and non-adult females. WRH used five categories: M, F, B, G and

J. The M (adult male) category was determined by presence of vocal slits in males. The F

(adult female) category was determined by presence of developed ova or some curliness of the

oviduct in females. The B (juvenile male) category was determined by presence of testes. The

G (juvenile female) category was determined by presence of ovaries. The J (juvenile) category

was used when sex could not be determined, either because the gonads were indeterminate in

very small specimens or the gonads had been removed from the specimens when tissues had

been taken. These data were taken in the laboratory with the aid of a Wild stereoscopic

dissecting microscope.

Male and female immature gonads of Vanzolinius discodactylus are quite similar in

appearance and difficult to differentiate without detailed examination under magnification.

Both ovaries and testes have a mosaic-like pattern externally. The only consistent difference

between immature gonads is that the testes have a smooth external surf whereas ovaries

have an irregular external surface. Not surprisingly, the difficulty of differentiating gonads

using the unaided eye resulted in several different interpretations of sex by CG and WRH. The

differences are (CG determination, followed by WRH determination): INPA 2410 (F, B);

INPA 2371,2433, 3397, 5605, 5671, 5728, 5735, 5736, 5799, 5801 (M, G); INPA 3572, 5571 (F,

Source : MNHN, Paris

HAYEK, HEYER & GASCON 157

J, gonads now removed in both); INPA 3177, 3573, 5524, 5592, 5670, 5697, 5730 (M, J, gonads

now removed in all).

WRH'Ss categories of adult male (M) and adult female (F) are used in the analysis section

for both the CG and WRH measurement data sets unless otherwise noted. Using this

categorization, 88 adult individuals are available for analysis. Each variable was examined and

summarized separately for male and female adults. Graphs and descriptive statistics were

calculated and assumptions tested prior to means tests or predictive analyses. Logarithmic

transformations were performed and descriptive statistics calculated on the transformed

values as well. Tests of normality were performed and discussed below.

In this study, we cannot calculate residual measurement error because we do not have the

“true” value of the variable for any individual specimen. Similarly, we are unable to assess a

statistical variability estimate for the factors involved in the overall measuring error. That is,

we cannot remove intra-observer variability from inter-observer measurement error. We

therefore evaluate the two factors separately.

We distinguish “precision” from “accuracy”. Accuracy is the closeness of an observer’s

measurement to the quantity intended to be measured. In our case, this is unknown for the

true value of the frog's morphological measurement but can be evaluated by considering the

closeness of the results of the two observer’s values. Precision refers to the entire class of

measurements and how well repeated measurements self-conform. In this case, the mean

value does not have to be the “true” value of the variable. To examine these characteristics we

calculated both inter- and intra-observer variability estimates and also descriptive measures

for qualitative evaluation of the frog data.

Data were analysed either using direct mathematical formulae or using the software

package SPSS 8.0 (ANONYMOUS, 1998). Although the discriminant function analyses were

done using SPSS 8.0 (ANONYMOUS, 1998), the figures were produced using either SYSTAT

versions 7 (ANONYMOUS, 1997, for fig. 7) or 9 (ANONYMOUS, 1999, for fig. 5-6).

THE APPROPRIATENESS OF RAW DATA TRANSFORMATION PROCEDURES

IN FROG MORPHOMETRIC STUDIES

Gascon et al. (1996) used an allometric transformation procedure described by THORPE

(1976) in an effort to remove size effects from the data. The Thorpe procedure (presented in

detail in THORPE, 1975) involves two steps: (1) log-transforming the original measurement

data; and (2) transforming the log values using a common slope based on the entire data set.

The topic of transforming raw data is discussed first, followed by demonstration that the

statistical assumptions of the Thorpe procedure are not met by the Vanzolinius data as used by

GascoN et al. (1996).

Although not specifically mentioned by Gascon et al. (1996), the raw measurement data

were log-transformed as part of THORPE’s (1976) transformation procedure. Raw data are

transformed as a matter of course in many multivariate analyses of frog morphometric data

(for a recent example see GREEN et al., 1997). SOKAL & ROHLF (1969) state that log transfor-

mation is the most common transformation for biological data and they provide a cogent

Source : MNHN, Paris

158 ALYTES 18 (3-4)

35 40

Eye Length

Fig. 2. - Histogram of eye length values measured by CG on total sample of 131 frogs with normal

distribution best fit.

discussion on the topic of log-transforming variables as a way to meet some statistical test

assumptions that are not met by raw variable data. However, this transformation is often

applied routinely, when, in fact, it may be either unnecessary or incorrect to do so.

Replacing each measurement by its logarithm may result in more approximate variance

equality. Also, for many biological applications the data can be normalized by this change.

The assumption of concern for our purposes is whether the variables are normally distribut-

ed. Using BESTFIT (ANONYMOUS, 1995) on the data as analyzed by GASCON et al. (1996),

untransformed variables for the entire sample size of 131 individuals were fit with a normal

distribution (see fig. 2 for an example). We used the Anderson-Darling test criterion as well as

a chi-square test of fit. The Anderson-Darling criterion is more tail-sensitive than the

ordinary chi-square goodness-of-fit test.

SokaL & RoHLF (1969) state that the log transformation may be appropriate and useful

when the means of the samples are proportional to the range or standard deviation of the

respective samples. The biological questions we are asking of the Vanzolinius data require

grouping of the data by locality. None of the variables, for the total sample or when organized

by locality, show a relationship of mean with either standard deviation (r = 0.06 ns) or range

(= 0.19 ns). In addition, each raw variable plot shows approximate symmetry, lack of

prominent skewness and unimodality (for example, snout-vent length as ).

Thus, the data as analyzed by GASCON et al. (1996) can be appropriately analyzed as raw

variable measurements, rather than log-transformed variables. It is not incorrect statis

to apply and use the logarithmic sample data for this problem. It is, however, unnec

shown in fig.

the morphological variables being measured here.

The reason GAsCoN et al. (1996) used logarithmic transformation was to attack the

problem of allometry effects in their data, which included both adults and juveniles. THORPH

(1976) presented a procedure that uses a log transformation as an initial step toward

eliminating the influence of allometry. We examined the application of this approach and

found it inappropriate for the Vanzolinius data for the following reason.

Source : MNHN, Paris

HAYEK, HEYER & GASCON 159

SVL - Untransformed Data SVL - Log Transformed Data

16 20

200 240 280 320 360 40.0 30 32 34 36

Fig. 3. Histogram of SVL values measured by WRH with a normal distribution curve superimposed

on both raw and log transformed data for 131 specimens.

Following THORPE (1975), GascoN et. al. (1996) used the allometric transformation for

all variables to “remove size effects for the data”. Raw measurements were adjusted using a

common slope for all locality data sets and sexes combined. This procedure adjusts the

allometric character or variable by using the slope of its regression against size. When there

are multiple localities, as in the case of the present work, the pooled within-locality slope is

used to make the adjustment.

This procedure can be applied appropriately only when the locality slopes are approxi-

mately parallel. That is, when a test of slope homogeneity (the first step in most packaged

ANCOVA programs) shows no significance, the slopes from the separate localities can be

pooled. For the 11 localities of this study, that is not the case. When there is heterogeneity, one

can do the calculations to obtain a common within-locality slope, but the resultant number

meaningless. When the slope test indicates heterogeneity, as is the case for this data set (P

0.001), there can be no one slope to describe the data (fig. 4). Therefore, the problem of size

effects in the GASCON et al. (1996) data would remain.

We can eliminate the need to consider allometry by using only adults but we still need to

consider sexual size effects. If size effects are not present or if they can be removed statistically,

then male and female specimens can be pooled for analyses that can be more statistically

powerful. As stated by GASCON et al. (1996), the transformation manipulations they (inap-

propriately) applied did remove size effects between males and females (which included both

immature and mature individuals) for all variables except head length. They deleted this

variable from their analyses and combined male and female data in their analyses. In our

analyses, we examine the sex differences on both raw and transformed variables using adults

only

When the raw variables are examined using CG's classification of males and females (124

total) and his measurements: (1) all fourteen variables have non-significant univariate homo-

geneity of variance tests (an assumption for means tests); (2) all univariate F tests (F; ,;) on

means are significant (P = 0.000); (3) the multivariate F,4. 359 is significant (P = 0.000;

Source : MNHN, Paris

160 ALYTES 18 (3-4)

Variable Values - Log Transformed

29) 1 1

0 1 2 3 4

SVL - Log Transformed Values

Fig. 4. - Fourteen regression slopes for morphometric variables, log transformed, CG measurements,

for 131 specimens per variable.

Hotellings T? = 1.075); and, (4) homogeneity of slope is rejected (P = 0.000). No regression

effect could be determined and removed. Similar results hold for the logarithmic-transformed

data. Thus, it is inappropriate to assume that we can combine Gascon’s raw male and female

data in univariate or multivariate analyses. We know of no valid procedure to remove the

sexual size differences under the conditions involved with this data set.

When WRH's raw data of 88 (57 female; 31 male) known adults are used: (1) all 14

variables have non-significant univariate homogeneity of variance test results; (2) all univa-

riate F, 46 -tests (1-tests, df 86) are significant (P = 0.000); and, (3) multivariate F,4 4 is

significant (P = 0.000). Similar results held for the log-transformed variables. In practice then,

because of equivalent results with this sample data, either the log-transformed or the raw data

could be used for further testing. However, it is an unnecessary complication for both

application and interpretation to transform a variable when the raw data can be used. We

continue with the raw data results for the 88 adult specimens, for which males and females test

significantly different on each of the measurements considered.

Source : MNHN, Paris

HAYEK, HEYER & GASCON 161

ANALYSIS OF MEASUREMENT DATA

EFFECT OF ROUNDING

There are two components to consider when rounding a raw measurement value that

could impact amphibian data sets: (1) pseudo-precision, and (2) the number of decimal places

used by computers in calculating statistical algorithms.

Pseudo-precision is using greater precision in calculations for measurements than can be

justified in terms of the originally recorded accuracy of those measurements. For example, if

multiple measures of the tympanum diameter of the same individual frog specimen are 2.165,

2.224, 2.187, 2.240, 2.193, the tympanum cannot be measured accurately beyond one decimal

place. Using values with two or three decimal places for these values is pseudo-precision.

Statisticians advise using precise measurements only (e.g., SokaL & ROHLF, 1969: 13-16).

Biological practitioners routinely ignore this advice. For example, although WRH uses

mechanical dial calipers that record measurements to the nearest tenth of a millimeter, in the

size range of Vanzolinius discodactylus, snout-vent length can be measured only to a precision

of 0.6 (see tab. 4). Thus, this variable should be recorded to the whole number, not with one

decimal place.

A second potential biological consequence results from the number of decimal places

computers use in calculations. This is less of a problem now with recent computer advances

in calculation. However, using pseudo-precise measurement data certainly can result in

different numerical values for test statistics, which are summarizations. To test whether any

biologically meaningful interpretations would be drawn from our data due solely to rounding

errors, paired 1-tests were computed on two sets of the data. We compared the CG and WRH

measurements as recorded (WRH with one decimal place, CG with three) with both data sets

recorded to one decimal place. The CG data set was rounded by the usual method of rounding

up the i‘" place when the (1+i)"" place is 5 or more.

As expected, when different numbers of decimal places are used (rounded vs. not) for the

data set, several of the resultant test values vary slightly. However, in no case are the decisions

different for the selected test level (0.05, 0.01, 0.001), nor would any different biological

inferences likely be drawn from the observed probability levels (tab. 1) from corresponding

tests.

While pseudo-precision, as a consequence of computer generated or digital caliper

induced values, is biologically and statistically offensive, it does not impact seriously the

univariate descriptive or inferential results of real data sets such as ours for Van=olinius

discodacty

INTER-OBSERVER DIFFERENCES

A battery of descriptive statistics was run on the raw measures of WRH-defined adults to

evaluate the nature of differences between the CG and WRH measurements (tab. 2). The

mean for each observer was calculated for each measurement. The usual assumption for a

Source : MNHN, Paris

Table 1. - Comparison using CG measurements at three decimal places and rounded off to one decimal place to WRH measurements at one decimal place. Mean values

reported at statistically inappropriate 4 decimal place level to demonstrate effect of computation results.

(p-£) SI SALATV

Ve AE Means Coefficient of variation T - statistic T - significance

0.000 0.0 0.000 0.0 0.000 0.0 0.000 0.0

Snout-vent length cs 20-1270, 301282 ss 3:85 -2.85 -2.82 0.005 0.005

WRH 30.2260 5.77

CG 2.7058 2.7053 6.87 6.78

Nostril ti à ë À 0.000

ostril separation Non re 5.98 5.92 0.000

CG 5.8029 5.8000 7.06 7.12

E; idth ie -7.67 -7.52 À 0.000

ye width anterior rar ET a 76 5 0.000

Eye width posterior ss 2160, 31739 CE si -9.79 -9.79 0.000 0.000

WRH 84771 7.14

RP CG 10.5286 10.5321 5.76 5.76 ve 2% " =

WRH 10.5496 6.17

Head length CG LL OSOL 1150420 25e 5 - 14,57 - 14.66 0.000 0.000

WRH 11.9618 6.80

Eye-nostril distance es 25526 25220 550 629, -3.21 -3.36 0.002 0.001

WRH 3.5901 6.34

CG 3.7019 3.7046 7.11 7.15

Eye length 8.70 8.80 0.000 0.000

RE WRH 34917 5.02

Tympanum diameter ce 147, H2450 340 552, = 16.67 = 16.09 0.000 0.000

WRH 2.1962 5.53

Thigh length cm 128507 17 559 200 -3.99 -4.02 0.000 0.000

WRH 13.0870 5.60

Shank length es 188533, Mr 5:15 Gé 10.94 10.81 0.000 0.000

WRH 14.1160 6.00

Foot length es 154500 154550 597 ss - 12.87 - 12.86 0.000 0.000

WRH 16.0511 5.86

Third finger disk width SG vs413 CRE 5; pas -4.83 -4.39 0.000 0.000

WRH 0.6710 6.10

Fourth toe disk width cG CEE 05260 Ar D - 10.44 -948 0.000 0.000

WRH 0.8962 5.46

Source : MNHN, Paris

Table 2. - Descriptive statistical differences between CG and WRH measurement data on the same specimens of adult Vanzolinius discodactylus (n = 88).

Variable Data set || Mean” | Sindard | ce L'Stendénl |" Coeft | ‘Hartley ra Obeved | ne ce Copt

deviation error variation test P (2 tail) (2tail) | determin.

LG 32.54 3.90 à 42 X

Snout-vent length Nes 32. 3.95 ie ee . _ 1.03 -3.15 0.002 100 0.000 0.99

Nostril separation _ En ne de es se 0.81 5.24 0.000 0.75 0.000 0.57

Eye width anterior Non ne de Fr mn se 0.99 - 6.47 0.000 0.87 0.000 0.76

Eye width posterior Las — 2 ee ie es 0.97 -7.30 0.000 0.92 0.000 0.84

CG 11 L + 14 2

Head width tn à 1 re a 088 | o66 | 0.508 | os | 0000 | 00

Head length ae _ à — Le ee 0.94 - 12.42 0.000 0.89 0.000 0.80

Eye - nostril distance SE —. De ee Te se 102 | -366 | 0000 | os | 0000 | 077

Eye length en 2 ie me re _. 0.50 7.120 0.000 0.73 0.000 0.54

” CG 2.08 0.30 0.09 0.03 6.6

Tympanum diameter WRH 235 033 il 0:04 718 120 - 14.12 0.000 0.89 0.000 0.79

Thigh length LE ce _ En a ee LOI -3.14 0.002 0.94 0.000 0.89

Shank length ne ss LE en à Le 2 1.05 8.74 0.000 0.99 0.000. 0.98

Foot length ee LES El 2 ee = 1.05 |-11.86 | 0.000 0.96 0.000 0.93

Third finger disk width nd na en _ a ee se 0.79 -2.83 0.006 0.73 0.000 0.53

" " cG 0.89 0.12 0.02 0.01 E*

Fourth toe disk width TON MEN RE Te UE et 108 | -s11 | 0000 | 077 | 0000 | 0.59

NODSVO @ WAAI NIAVH

£9T

Source : MNHN, Paris

164 ALYTES 18 (3-4)

Table 3. - Performance rankings of measurement variables.

Variable Mes SON De cesse 96 cuits of Hartley test

variation

Snout-vent length Good Best Good Good

Nostril separation Moderate Moderate Good Moderate

Eye width anterior Moderate Worst Good Good

Eye width posterior Moderate Moderate Moderate Good

Head width Good Best Moderate Moderate

Head length Poor Moderate Poor Moderate

Eye-nostril distance Moderate Moderate Good Good

Eye length Poor Worst Poor Poor

Tympanum diameter Poor Best Good Moderate

Thigh length Moderate Best Good Good

Shank length Moderate Moderate Good Good

Foot length Moderate Best Good Good

Third finger disk width Moderate Best Poor Moderate

Fourth toe disk width Poor Best Moderate Good

Students 1-test are not met because the observers measured the same sample and not samples

independently chosen at random. Because these are repeated measurements, the test statistic

denominator we use to test for a difference between each observer pair of measures is the

formula for the standard error of a difference when samples are not independent. That

formula is: 5,61)mç2) = Sa = SE'U(S nt) + Sn) — ZSm(t) Se) 12), Where m(i), i= 1,2, are the two

observers means for the particular measurement, sis the standard deviation for each, and ris

the correlation between the two sets of paired measures. Alternatively, for » pairs, the

standard deviation of the d differences can be written, s, = sqrt((n Xd?(Ed)/(n-1))), and the

test statistic is 1 = Yd/ss.

The paired #-test results indicate that all variables differ significantly except for one (head

width). The correlation coefficients are all statistically significant and most coefficients of

determination are high. The correlation statistics, considered with corresponding coefficient

of variation values, indicate that the two sets of observer measurements are consistent and

generally comparable. The /-test results leave no doubt, however, that overall, our two sets of

measurements differ statistically.

Given that our measurements are statistically different, we wish to explore our measure-

ment performance on a variable by variable basis. To do this, various ways of describing

performance are ranked and compared.

(1) Mean inter-observer difference of measures adjusted by magnitude of variable. The

intent of this comparison is to evaluate how well the two sets of measurements agree with each

other, specifically to see if the observers performed better on larger measurements than

smaller (e.g., snout-vent length (SVL) vs. width of third finger disk). The smaller mean value

Source : MNHN, Paris

HAYEK, HEYER & GASCON 165

for the same individuals and for each variable was subtracted from the larger. That number

was divided by the average value of the two means. The resultant values range from 0.002 to

0.126. For comparative ranking purposes, good is considered to be 0.000-0.005, moderate

0.005-0.050, and poor 0.050-0.150 (tab. 3).

(2) Coefficients of variation. Values of the coefficient of variation (CV) for each measure

are often used to compare the variability of the variables. Adjustments for sample size and

other factors have been suggested (e.g. DELAUGERRE & DUBOIS, 1985). We chose to use the

original formula and to categorize the CV values because, regardless of adjustment, the CV

remains extremely sensitive to errors in sample means. For evaluation and ranking purposes,

the best category, 5.0-6.0, has the lowest variability in the attribute measured; moderate is

6.0-7.0, and the worst category is 7.0-8.0 (tab. 3). Most of the coefficient of variation values

for each observer pair fall into the same categories (see tab. 2); in the few cases where our

values fell in different categories, the average of our values was used for category placement.

(3) Difference in coefficients of variation. The intent of this comparison is to evaluate

repeatability of our measurements. If each of us has the same degree of measurement

repeatability, our coefficient of variation values should be identical. Therefore, how different

these values are indicates degree of deviation from consistency of measurement for the

variable involved. For ranking purposes, good is a difference of 0.0-0.2; moderate is 0.3-0.5;

and poor is 0.6-1.5 (tab. 3).

(4) Hartley F-max test. The Hartley test statistic, which is the quotient of the larger and

the smaller variance, provides another way to evaluate repeatability of measurements. A

Hartley test value of 1 is not significant; values both larger and smaller indicate differences.

For ranking purposes, good is 0.9-1.1, moderate 0.8-0.9 or 1.1-1.2, and poor < 0.8. (tab. 3).

From the above (tab. 3), it is apparent that CG and WRH measured one variable

consistently and with the greatest precision: snout-vent length. There are five variables that we

measured with reasonable consistency and precision: head width, eye-nostril distance, thigh

length, shank length, and foot length. There are four variables that we apparently measured

differently, but each of us with reasonable to good precision: head length, tympanum

diameter, foot length, and width of fourth toe disk. Apparently we are using slightly different

landmarks for these measurements. For the tympanum, it would seem that CGs description

of tympanum height (GasCoN et al., 1996) does in fact describe something different from

WRH'Ss definition of tympanum diameter. Once these results became known, CG confirmed

that he always measured the vertical distance of the tympanum relative to head position and

WRH took the measurement at the point of greatest tympanum diameter, irrespective of

position of the tympanum relative to the head. For the width of the fourth toe, we obviously

used different criteria of how much contact of the disk with the calipers was used. The most

inconsistent measurement is eye length. That is, we measure the variable differently as well as

imprecisely. This suggests that this variable should not be used for morphometric analyses in

Vanzolinius discodactylus. We further suggest that because this variable is affected by preser-

vation artifact to a great degree, it should probably not be included in any frog morphometric

study.

There is one result we find surprising. Overall, we measured larger variables (such as

snout-vent length) equally as well (or poorly, depending on perspective) as smaller variables

(such as third finger disk width).

Source : MNHN, Paris

166 ALYTES 18 (3-4)

Table 4. — Descriptive statistics for 20 repeated measurements of a single specimen of Vanzolinius

discodactylus.

Variable Minimum | Maximum | Mean | Slendare | Cocficient

Snout-vent length 26.1 26.7 264 0.16 0.01

Nostril separation 20 24 22 009 0.04

Eye width anterior A À 5.6 54 0.12 0.02

Eye width posterior 74 8.0 77 0.17 0.02

Head width 9.0 9.3 9.2 0.10 0.01

Head length 10.0 10.6 103 016 0.02

Eye-nostril distance 2.9 32 3.0 0.09 0.03

Eye length 3.0 38 34 0.19 0.06

Tympanum diameter 1.6 LS P? 0.06 0.03

Thigh length 11.0 118 114 0.24 0.82

Shank length 11.8 12.1 12.0 0.07 0.00

Foot length 12.8 13.7 13.2 0.24 0.02

Third finger disk width 0.5 0.6 0.6 0.02 0.04

Fourth toe disk width 0.7 0.8 0.8 0.04 0.05

INTRA-OBSERVER DIFFERENCES

Standard descriptive statistics for the twenty repeated measurements on each morpho-

logical variable of the single specimen (tab. 4) generally mirror inter-observer variation. That

is, SVL, which CG and WRH measured with greatest precision, has a low intra-observer

coefficient of variation. Eye length, which was the most imprecise inter-observer variable, has

the highest intra-observer coefficient of variation.

Given the thousands of frogs that WRH has measured, one would predict that there

would not be a change (improvement) in measurement accuracy from the first re-measure to

the twentieth. Two sample 1-tests of measurements 1-10 against measurements 11-20 were not

statistically significant, except for posterior eye width. Given that the eye that was measured

was misshapen with preservation, it is likely that the landmarks used by WRH changed over

the re-measurement process.

BIOLOGICAL INTERPRETATIONS OF MEASUREMENT DIFFERENCES

INTER-OBSERVER DIFFE

Our inter-observer differences over sets of measurements are unarguably statistically

different at highly significant levels, yet it does not necessarily follow that such inter-observer

Source : MNHN, Paris

HAYEK, HEYER & GASCON 167

measurement differences lead to different biological conclusions for the same set of speci-

mens. For example, it seems likely that some of our measurement differences are due to

consistent differences in the way we took the measurements. Given a large enough sample,

such differences would be statistically significantly different. However, because the measure-

ments would have been taken consistently by each observer, the variation described in the two

sets of measurements would be equivalent, and, hence, lead to similar conclusions for any

biological inferences drawn from the data. We test this idea using our measurement data in

two analyses aimed at obtaining insight into biological processes through analyses of mor-

phometric data.

Geographic variation

Multivariate discriminant function analyses are often used to analyze patterns of geo-

graphic variation in study organisms. For our purposes, we grouped the specimens from

Gascon et al.’s (1996: 377, fig. 1)eleven numbered localities into four major groups, separated

linearly along the Rio Juruä. Our Area 1 is GASCON et al.’s (1996) locality 1 (7 = 7), Area 2 is

localities 2+3+8+9 (n = 20), Area 3 localities 4+5+10+11 (7 = 50) and Area 4 localities 6+7

(n = 11). We use only WRH-defined adult specimen raw data (n = 88) in the analyses.

As described previously, the data for males and females are significantly different (P <

0.001). The values for each of the variables are assumed to have a multivariate normal

distribution with equal variance-covariance matrices (VCV) within the 4 areas. To decide

whether to combine the sexes, locality tests should be performed. However, all tests of VCV

equality are highly sensitive to normality. In addition, there is no practical, effective test for

multivariate normality for our smaller-sized samples. We can hypothesize that since the sexes

are highly significantly different over the entire sample then they should be different in and

over each area. Alternatively, we might not.

Let us use the untransformed measurements to examine the results of a discriminant

analysis by sex. We use WRH's designations of adult males and females and compare final

results when using each observer’s measurements.

For the female data (Area 1: n = 5; Area 2: n = 12; Area 3: n = 34; Area 4: n = 6; total: N

= 57), the discriminant analysis results for each of the observer’s data sets are far from

identical (tab. 5, fig. 5). Of particular interest is that, in the stepwise procedure, the variable

entered in the first step (that which explains the greatest amount of unconditional univariate

variance among area samples) differed, as did the variables used in the final model. Since the

variable impact differed between the two data sets in the discriminant model, it is not

surprising that there were differences in the values for the canonical functions, first axis

variable loading, and posterior classifications (tab. 5).

Male data (Area 1: n= 2; Area 2: n = 8: Area 3: n = 16; Area 4: n = 5; total: 31) results

are similar (tab. 6, fig. 6) to the female results in the kinds of discrepancies that measurement

differences caused in the discriminant function analyses for the two sets of measurement data.

Would the different results from these analyses result in different biological interpreta-

tions? One of the main methods for evaluating such geographic variation analyses is the plot

of the first two canonical axes. The discriminant function program in SYSTAT 9 (ANONY-

Source : MNHN, Paris

168 ALYTES 18 (3-4)

Table 5. - Comparison of discriminant function analysis results for female data of Vanzolinius discodactylus by

geographic regions, with two sets of measurements taken on the same individuals.

CG measurements

‘WRH measurements

Significant univariate F-test

SVL

Head length

Head width

Nostril separation

Eye-nostril distance

Eye width anterior

Eye width posterior

Tympanum diameter

Thigh length

Shank length

Foot length

Significant univariate F-test

SvL

Head length

Head width

Nostril separation

Eye-nostril distance

Eye width anterior

Eye width posterior

Tympanum diameter

Thigh length

Shank length

Foot length

Stepwise discriminant model

First variable tried

Thigh length

Final model uses

Posterior eye width

Head width

Thigh length

Foot length

Eye length

Third finger disk width

All groups separable at 0.00! level

in final model

Stepwise discriminant model

First variable tried

Tympanum diameter

Final model uses

Posterior eye width

Shank length

Tympanum diameter

Final model cannot separate

Group 4 from Group 1

Canonical discriminant function

F.# Eigenvalue variation —2

il 12801 0.55 0.000

z 0.8429 0.36 0.000

3 0.2028 0.09 0.052 ns

Canonical discriminant function

F.# Eigenvalue % variation 7?

1 1.1674 0.77 0.000

2 0.2750 0.18 0.002

3 0.0718 0.04 0.056ns

First axis explanation

Thigh length (0.94)

Head width (- 0.66)

Foot length (0.63)

Third finger disk width (- 0.52)

First axis explanation

Tympanum diameter (0.93)

Posterior eye width (- .058)

Shank length (0.51)

Overall classification

Group %

L 100

2 88

L } 69

4 80

Overall 774

Overall classification

roup %

LL 80

2 83

# 83

4 67

Overall 80.7

Source : MNHN, Paris

HAYEK, HEYER & GASCON 169

Female Data

CG Measurements WRH Measurements

af \

El ct Re #5, SL e Mye or

-3 -2 -1 0 1 2 3 4 4 -3-2-10 1 23 4

First Canonical Variable First Canonical Variable

Second Canonical Variable

Fig. 5. Discriminant function analysis results for female Vanzolinius discodactylus by geographic Areas

1-4 (see text for definition of areas).

Male Data

CG Measurements WRH Measurements

Second Canonical Variable

0 1 L 1 1 1 1 RC EE Ve P

un 5. 298A0 Cia 25 -6-5-4-3-2-1 0 1 2 3 4

First Canonical Variable First Canonical Variable

S results for male Vanzolinius discodactylus, by geographic Areas

as).

Fig. 6. Discrimant function an:

1-4 (see text for definition of à

Source : MNHN, Paris

170

ALYTES 18 (3-4)

Table 6. — Comparison of discriminant function analysis results for male data of Vanzolinius discodactylus by

geographic regions, with two sets of measurements taken on the same individuals.

CG measurements

WRH measurements

Significant univariate F-test

SVL

Head width

Tympanum diameter

Thigh

Shank

Foot

Significant univariate F-test

SVL

Nostril separation

Eye-nostril distance

Eye length

Tympanum diameter

Thigh

Shank

Foot

Third finger disk width

Fourth toe disk width

Stepwise discriminant model

First variable tried

Tympanum diameter

Final model uses

Head width

Eye width posterior

Tympanum diameter

Shank

Final model cannot separate

Area 1 from Area 3

Area 1 from Area 4

Stepwise discriminant model

First variable tried

Tympanum diameter

Final model uses

Head length

Eye length

Eye width posterior

Shank

Final model cannot separate

Area 2 from Area 3

Area 3 from Area 4

Canonical discriminant function

F.# Eigenvalue % variation

1 1.1000 0.49

2 0.8908 0.40

F1 0.2416 0.11

0.000

0.001

0.0600 ns

Canonical discriminant function

F.# Eigenvalue % variation —x

1 4.4500 0.89 0.000

2 0.5020 0.10 0.080

3 0.0272 0.01 0.708 ns

First axis explanation

Head width (- 1.97)

Shank (1.23)

First axis explanation

Head length (- 2.99)

Tympanum diameter (1.43)

Third finger disk width (1.55)

Eye length (0.91)

Overall classification

Group %

1 100

2 58

3 71

4 100

Overall 737

Overall classification

Group %

1 100

2 100

3 6°

4 80

Overall 80.7

Source : MNHN, Paris

HAYEK, HEYER & GASCON 171

MOUS, 1999) was used to produce fig. 5 and 6. The forward step option was used. The female

data differ in the distinctiveness of specimens from Area 1 (fig. 5) and might or might not be

given different biological interpretations by different researchers. For example, the CG results

(fig. 5, left) could be interpreted as supporting a model of more-or-less linear differentiation

along the river, whereas the WRH results (fig. 5, right) could be interpreted as showing slight

differentiation of samples without any geographic pattern evident. However, the very dif-

ferent results in distinctiveness of male specimens from Area 2 (fig. 6) would certainly be given

different biological interpretations for the two data sets.

Riverine hypothesis of differentiation

Gascon et al. (1996) used multivariate analyses of morphometric data to determine

whether there was a riverine effect on differentiation to compare with a data set derived from

allozymic variation. We use our measurement data to address the same question, but in a

slightly different way from the GAscoN et al. (1996) approach.

There are two matched sets of localities immediately across the Rio Juruä available for

comparison. Our Group 1 (localities 2+3 of GASCON et al., 1996) is immediately across the

river from Group 2 (localities 8+9) and both are geographically separated from Group 3

(localities 4+5), which is immediately across the river from Group 4 (localities 10+11). Groups

land 3 are on the same riverbank, as are Groups 2 and 4. If the riverine hypothesis of

differentiation were operational, we would predict that there should be less differentiation

between Group 1 & 3 and 2 & 4 than between Group 1 & 2 and 3 & 4.

We used raw measurement data for adults and ran discriminant function analyses

separately on male and female adult WRH-defined specimens. Each observer data set was

used separately and results compared.

The sample size for males is 24 (Group 1: 7 = 3, Group 2: n = 5; Group 3: n = 4; Group

4: n = 12); for females it is 46 (Group L: #7 = 10; Group 2: n Group 3: n = 6; Group 4: n =

28).

We also explore possible differences between discriminant function criteria. The Wilks’

criterion finds axes that account for the greatest separation among groups. The Mahalanobis

criterion finds axes that maximize pairwise separation of groups. In this case, the Mahalano-

bis criterion model is more appropriate to test the riverine barrier hypothesis, as we are

interested in pairwise differences among the four groups we are analyzing.

For the Mahalanobis pairwise separation criterion, the 0.05 probability level was used

rather than the approximate F-level as the cutoff stepwise criterion for entrance and removal

of variables. For the Wilks’ separation criterion, the approximate F-level for removal/entrance

was used.

The results (tab. 7-8) indicate pronounced differences both due to measurement differ-

ences and model differences. In no case is the set of variables used in the final model the same

for the CG versus WRH measurement data. As a consequence, none of the discriminant

function results are the same when the CG data set analyses are compared with the WRH data

set analyses. The differences due to model separation criterion differences are of the same

magnitude, however. For example, only in the case of the CG male data did the Mahalanobis

Source : MNHN, Paris

172

Table 7. - Comparison of discriminant function analysis results for male data of Vanzolinius discodactylus,

testing the riverine hypothesis, using two sets of measurements taken on the same individuals.

ALYTES 18 (3-4)

CG measurements

WRH measurements

Significant univariate F-test

SVL

Head length

Head width

Eye-nostrl distance

Eye width anterior

Eye width posterior

Tympanum diameter

Thigh

Shank

Foot

Significant univariate F-test

SVL

Head length

Nostril separation

Eye-nostil distance

Eye length

Eye widih anterior

Eye width posterior

Tympanum diameter

Thigh

Shank

Foot

Third finger disk width

Fourth toe disk width

Mahalanobis criterion, 0.05 probability eutoff

Stepwise discriminant model

First variable tried

SVL

Final model uses

SVL

Thigh

Shank

Fourth toe disk width

Final model separates all groups

Stepwise discriminant model

First variable tried

Eye-nostril distance

Final model uses

SVL

Eye-nostril distance

Tympanum diameter

Foot

Third finger disk width

Final model separates all groups

Significant canonical axes

Three, explaining 100 % of variance

Significant canonical axes

Three, explaining 100 % of variance

Overall classification

Group %

1 100

2 100

5 75

4 83

Overall 88

Overall classification

Group %

1 100

2 100

3 100

4 100

Overall 100

Wilks’ criterion, approximate F-level cutoff

Stepwise discriminant model

First variable tried

Tympanum diameter

Final model uses

Tympanum diameter

Final model cannot separate

Group 1 from Group 2

Group 1 from Group 3

Group 2 from Group 3

Stepwise discriminant model

First variable tried

Tympanum diameter

Final model uses

SVL

Eye-nostril distance

Tympanum diameter

Foot

Third finger disk width

Final model separates all groups

Significant canonical axes

One, explaining 100 % of variance

Significant canonical axes

Three, explaining 100 % of variance

Overall classification

Group %

1 33

2 80

3 Q

4 83

Overall 88

Overall classification

Group %

1 100

2 100

3 100

4 100

Overall 100

Source : MNHN, Paris:

HAYEK, HEYER & GASCON

173

Table 8. — Comparison of discriminant function analysis results for female data of Vanzolinius discodactylus,

testing the riverine hypothesis, using two sets of measurements on the same individuals.

CG measurements

WRH measurements

Significant univariate F-test

SVL

Head length

Head width

Nostril separation

Eye-nostril distance

Eye width anterior

Eye width posterior

Tympanum diameter

Thigh

Shank

Foot

Significant univariate F-test

SVL

Head length

Head width

Nostril separation

Eye-nostril distance

Eye width anterior

Eye width posterior

Tympanum diameter

Thigh

Shank

Foot

Mahalanobis criterion,

0.05 probability cutoff

Stepwise discriminant model

First variable tried

Thigh

Final model uses

Tympanum diameter

Thigh

Third finger disk width

Final model cannot separate

Group 1 from Group 2

Group 1 from Group 3

Stepwise discriminant model

First variable tried

Eye-nostril distance

Final model uses

SVL

Eye-nostril distance

Tympanum diameter

Shank

Final model cannot separate

Group 1 from Group 2

Group 2 from Group 3

Significant canonical axes

Three, explaining 100 % of variance

Significant canonical axes

Three, explaining 100 % of variance

Overall classification

Group %

1 40

2 100

3 83

4 82

Overall 74

Overall classification

Group %

À 60

2 100

3 83

4 96

Overall 87

Wilks’ criterion, approximate F-level cutoff

Stepwise discriminant model

First variable tried

Thigh

Final model uses

Thigh

Final model cannot separate

Group 1 from Group 2

Group 1 from Group 3

Group 2 from Group 3

Stepwise discriminant model

First variable tried

Tympanum diameter

Final model uses

Tympanum diameter

Final model cannot separate

Group 1 from Group 2

Group 1 from Group 3

Group 2 from Group 3

Significant canonical axes

One, explaining 100 % of variance

Significant canonical axes

One, explaining 100 % of variance

Overall classification

Group %

1 10

2 50

3 3

4 93

Overall 65

Group %

1 0

2 100

3 50

4 7)

Overall 59

Source : MNHN, Paris

174 ALYTES 18 (3-4)

Table 9. — Biological interpretations of morphometric data analyses relative to the riverine hypothesis. Distances

(i.e., amount of differentiation) based on centroids for first or first and second canonical functions. S,

data set supports prediction; R, data set rejects prediction; +, equivocal.

Predictions

Data set Group 183 distance < 182 distance | Group 2&4 distance < 3&4 distance

S'Wilks” criterion, CG S S

S' Wilks” criterion, WRH R R

d'Mehalanobis criterion, CG R #

Q Wilks” criterion, CG s R

Q Wilks” criterion, WRH R R

Q Mahalanobis criterion, CG s R

Mahalanobis criterion, WRH R R

criterion and Wilks’ criterion models try the same variable first (thigh). In all other cases,

different variables were tried first under the two model criteria.

As the statistical results for these data (tab. 7-8) are quite different, it is no surprise that

their biological interpretations also differ. There are differences of whether the results support

or reject the predicted pairwise differences among the four groups (tab. 9), not only due to

measurement differences, but to model criteria as well. It should be noted that this data set is

not as large as one would like to have strong confidence in the statistical model results.

However, for demonstrating inter-observer and inter-model effects, it is adequate.

INTRA-OBSERVER DATA

The impact of individual measurement error in making biological interpretations of the

data is difficult to assess in general, but can be done within the context of specific analyses. We

examine the repeated measurements in the context of the male discriminant analysis of

geographic variation as an illustration. The 20 remeasurement values were incorporated into

the analysis but not for the production of the original discriminant function model. The

results were incorporated only in the final classification stage. The canonical discriminant

scores were plotted on the first two canonical axes (fig. 7). The results indicate that the

remeasurement variability can compromise the biological interpretation of the results. For

example, if the polygon encompassing the variation exhibited by the 20 remeasurements on

fig. 7 were transferred to the specimen at the top of the polygon encompassing individuals

from Area 2, the intra-individual measurement differences would then bridge the gap between

the polygons encompassing individuals from Areas 2 and 4. It is likely that without the

estimate of individual measurement error, the results would be interpreted as Area 2 being

distinct from a combination of Areas 1, 3 and 4. With the estimate of individual measurement

Source : MNHN, Paris

HAYEK, HEYER & GASCON 175

NT On ss IN 00

Second Canonical Variable

QU je fn es jt pe sf)

6 -4 -3 -22 1 0 1 2 3 4 5

First Canonical Variable

Fig. 7. - Discrimant function analysis results for male Vanzolinius discodactylus, by geographic Areas

1-4 (see text for definition of areas), WRH mc rements, With remeasurement data (R) plotted

(remeasurement data incorporated only at final classification stage).

error, the results would be interpreted as all four areas demonstrating modest differentiation

from each other, with no real distinctions among them.

We inadvertently found that statistical results vary among versions of the same statistical

package. Fig. 7 was produced from SYSTAT version 7 (ANONYMOUS, 1997); fig. 6 was

produced from SYSTAT version 9 (ANONYMOUS, 1999). Note the different polygon shapes in

fig. 6 (right) and fig. 7, which preferably should be identical (excluding the remeasurement

polygon in fig. 7).

CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS

Intra- and inter-observer differences in recording frog measurement data can lead to

statistically significant differences in the variables. Because of the soft and flexible nature of

preserved frogs, measurements cannot be made with great precision, even by the same

individual.

Statistical modeling results of intra- and inter-observer differences in measurements may

well result in different biological interpretations, as demonstrated in this study.

The criteria chosen (for example, Mahalanobis or Wilks) for discriminant function

analysis can give different results for the same data, which in some cases would lead to

Source : MNHN, Paris

176 ALYTES 18 (3-4)

different biological interpretations. Researchers should be aware that either using the default

option or the only option available in any given discriminant function analysis software

program package may not be the most appropriate option for their data.

Bearing the above in mind, together with other general results discussed in this paper, we

offer the following recommendations:

(1) Use of eye length as a morphometric variable should be tested for measurement

precision before being used in a study. We recommend against using eye length lacking such

testing.

(2) Select the most appropriate statistical model options for the data being analyzed.

Different model options do give different results.

(3) Assume measurement differences between sexes in frogs and analyze data separately

by sex. Combine male, female and juvenile data only after statistical validation that it is

appropriate to do so.

(4) It is appropriate to include variables that are smaller (in terms of measurement

length) with larger variables in multivariate analyses of frog morphometric data.

(5) Pseudo-precision, while statistically and biologically indefensible, does not have a

meaningful impact on multivariate analyses of frog morphometric data. While we recom-

mend avoidance of pseudo-precision, there is no need to discredit studies characterized by

pseudo-precise data.

(6) Because frog measurements are not precise, but approximate, any biological infer-

ences drawn from morphometric analyses of frogs must be based only on very robust effect

size estimates and differences. With the use of even large or moderately large sample sizes only

the most conservative interpretations of the analyses should be made.

(7) Do not rush to logarithmic transformation, Measured morphological variables can

serve biology well without transformation. Scatter plots, histograms and comparisons with

the best-fitting normal distribution are tools to determine whether transformation is neces-

sary or not.

(8) At least one individual in a frog study should be remeasured a number of times. These

remeasures should be included in analyses in the manner shown in fig. 7.

HAYEK & BUZAS (1997) deal with the issue of adequate sample size. They demonstrate

(1997: 66-69) that without any prior knowledge of the distribution or of any population

characteristics, a sample size of 20 will always be adequate. Intuitively, a minimum sample size

for characterizing 95 % confidence on measurement error should be less than 20 individuals.

HAYEK & BUZAS (1997: 69-70) discuss how assuming a normal distribution can reduce the

adequate sample size below 20. However, from a statistical perspective, because repeated

measurements by a trained observer will result in a relatively extreme variance estimate, the

alternative sample size estimates discussed by Hayek and Buzas will result in a size of less than

one individual. We therefore are left with the recommendation of a sample size of 20

remeasurements of a specimen for estimation of intra-individual measurement error unless or

until a measurement effect size is repeatedly calculated and comes into general use in the frog

research community.

Source : MNHN, Paris

HAYEK, HEYER & GASCON 177

ACKNOWLEDGMENTS

Kay Bradfield, James Cook University, and George R. Zug, Amphibians & Reptiles, National

Museum of Natural History, Smithsonian Institution, critically reviewed the manuscript.

WRH thanks support from the Neotropical Lowland Research Program, Smithsonian Institution,

Dr. Richard P. Vari, Principal Investigator.

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Corresponding editor: Alain Dusois.

Source : MNHN, Paris

Alytes, 2001, 18 (3-4): 178-186.

Redescription of the tadpole

of Phlyctimantis boulengeri Perret, 1986

(Anura, Hyperoliidae)

with preliminary comments on the biology

of the species

Mark-Oliver RôDEL & Raffael ERNST

Theodor-Boveri-Institute (Biocenter of the University),

Department of Animal Ecology and Tropical Biology (Zoology II),

Am Hubland, 97074 Würzburg, Germany

[roedel@biozentrum.uni-wuerzburg.de]

We redescribe the tadpole of Phiyctimantis boulengeri Perret, 1986

based on specimens from Taï National Park, Ivory Coast. The tadpoles

resemble very much those of the genus Kassina. We found no hints for

arboreal spauning, as described by Guit & Lamorre (1958) for this species.

Eggs were laid singly below the surface of water. Adults showed a conspic-

uous defence behaviour.

INTRODUCTION

In 1986, PERRET separated the West African and Cameroon specimens of Phlycrimantis

leonardi (Boulenger, 1906) from those of Gabon describing the western forms as Phlycrimantis

boulengeri. According to SCHi6TZ (1999), two distinct forms of P boulengeri ex

one occurs in Cameroon and eastern Nigeria, the western one is in Ivory Coas

Our specimens from Taï National Park, Ivory Coast, fit SCHIOTZ's description of the western

form. In 1958, Guisé & LAMOTTE published a description of a tadpole which they named

Hylambates leonardi. While their adult voucher specimens are P boulengeri, the tadpole they

described was Chiromantis rufescens (Günther, 1868) (LAMOTTE & PERRET, 1963; Sc

1975). LAMOTTE & PERRET (1963) noted that the tadpole descriptions of C. rufescens and P.

boulengeri given by GUIBÉ & LAMOTTE (1958) were simply reversed (this was already clarified

in the errata added to the latter paper). This view was accepted by ScHioTz (1975), DREWES

(1984) and AzTiG & MCDiarmiD (1999). GUIBÉ & LAMOTTE (1958) described arboreal

spawning in both species, although this is clearly not the case in P boulengeri. Their drawings

t still possesses external gills and the oral disc of a certainly much older

specimen. An identification of 2 houlengeri tadpoles seems impossible with their description,

even if it was based on that species. We present a description based on older tadpoles of

known parents.

figure a tadpole tha

Source : MNHN, Paris

RÔDEL & ERNST 179

MATERIALS AND METHODS

STUDY AREA

Our study area was in the Taï National Park (6°10°-5°10°N, 7°20°-6°50°W), Ivory Coast.

This is the largest protected rain forest area in West Africa. Annual precipitation reaches

2,200 mm in the south-west and 1,700 in the northeast of the park. Precipitation is highest

from April-May to June-July and from September to October-November. A first dry period

lasts from December to February. A second dry period normally occurs in August. Temper-

atures vary between 20 and 33°C, daily temperature differences are up to 10°C. Mean annual

temperature is about 25°C. Humidity fluctuates from 85 % during day to 90-100 % during

night. This area is situated within the equatorial climate zone which is influenced by the

southern passat (RIEZEBOS et al., 1994). Floristically it belongs to the Guinea-Congo Region

(GUILLAUMET, 1967). Our main investigation area was located about 23 km southeast of the

small town of Taï and comprises an area of about 30 km? around the SRET station (Station

de Recherche en Ecologie Tropicale; 05°50.003°N, 007°20.536°W). Precipitation at the SRET

was 1,820 mm in 1999. Field data were collected from January to May and August to

December in 1999 and March to October 2000.

REARING

In 1999, we got fertilised eggs from an amplectant pair of Phlyctimantis boulengeri

(SMNS 9271.1-2). AII tadpoles were reared in plastic aquaria (PT2 Firma Hoch, 25 x 15cm,

16 cm water depth), filled with rain water and fed ad libitum with commercial fish food

(TetraMin*). Water was changed every second to third day. In 1999 the tadpoles had not

reached metamorphosis before our field season was finished. Therefore the most advanced

tadpole of that series had only reached stage 32 after GOsNER (1960). In 2000 we collected

tadpoles of more advanced stages but unknown age in two rock-pools on an inselberg,

surrounded by primary rain forest.

PRESERVATION AND DESCRIPTIVE METHODS

Tadpoles of various developmental stages were preserved in 4% formaldehyde. As,

according to our experience, developmental time of West African tadpoles, even under best

rearing conditions, is always slower in captivity than in the field (RÔDEL, 1998), we do not give

developmental time tables. We only preserved tadpoles that already swam. All collected

specimens, including the tadpoles’" parents, are deposited in the collection of the Staatliches

Museum für Naturkunde Stuttgart (SMNS). In total we preserved 18 specimens (stage 25-42;

SMNS 9271.3-20). Staging is according to GOSNER (1960). Nomenclature of morphological

features is combined after VAN Duk (1966), ALTIG & JOHNSTON (1989) and ALTIG &

McDiarMib (1999). The keratodont formula is after DuBois (1995). Measurements were

Source : MNHN, Paris

180 ALYTES 18 (3-4)

taken with dial callipers (+ 0.5 mm) or with a measuring ocular at a dissecting (+ 0.1 mm,

Zeiss” Stemi SV 6) or compound microscope (+ 0.01 mm, Leitz® Laborlux S), respectively.

Drawings were done with the aid of a camera lucida. We noted coloration of several dozen live

P. boulengeri tadpoles and then released them in their natural ponds. The tadpole description

is mainly based on specimens of the Gosner stages 27-28 (tab. 1). Data are given for all

preserved tadpoles.

RESULTS

TADPOLE DESCRIPTION

Compact body, oval but compressed viewed dorsally (fig. la-b), body length 1.5 (1.2-1.9)

times body width (measured at the plane of eyes); tail about two times (1.7-2.5) as long as

body, more or less straight; if extrapolated, the axis of the tail passes dorsal to the eyes; tail

with high fins, fin height 1.1 times body height, highest point of dorsal fin at the same level as

highest point in ventral fin; dorsal fin originating anterior to dorsal tail-body junction; dorsal

and ventral fin evenly curved along the first 2/3 of tail length, then evenly converging; small

oral disc anteroventral (fig. 2a), bordered by a multiple row of papillae that has a rostral gap,

additional papillae groups occurring in the oral angles; jaw sheaths very powerful and black;

upper jaw sheath uniformly U-shaped; lower jaw sheath deeper than wide, V-shaped; edges of

both jaw sheaths slightly serrated; labial tooth row formula 1/2+2:1; supra-angular labial

teeth positioned on a bulging lip, infra-angular labial teeth positioned on separate skin folds;

third infra-angular tooth row always very short; labial teeth multidenticulate, four times as

long as wide (fig. 2b); nostrils dorsal (in stages 25-28 hardly visible); internasal distance as

long as distance eye-nostril; distance nostril-snout tip 0.7 times the distance nostril-eye; eyes

lateral; spiracle sinistral, visible from dorsal; vent opening medially in basicaudal position. In

the two tadpoles of stage 40 and 41, a narrow groove stretches from the nostrils to the eyes.

Measurements and ratios of the preserved tadpoles are summarised in tab. 1. Two especially

large, uncollected tadpoles measured respectively 63 mm TL (stage 36), and 21 mm BL and

52 mm TL (stage 43). Older stages developed an increasingly elongated body (stage to

BL/BW: Spearman rank, r, = 0.459, P = 0.055, n = 18; for abbreviations see tab. 1). Larger

tadpoles had comparatively higher fins (TL to FH, r, = 0.982, P < 0.001, n = 18), but

comparatively more flattened bodies (stage to BL/FH, r, .946, P < 0.001, n = 18). The

anterior region of the caudal muscles in stages more advanced than 26 was obscured by

connective tissue giving the appearance of a more muscular tail. The basic colour of all

investigated tadpoles is dark grey to black (fig. la-b). The fin is always transparent. The

ventral parts of body and tail are slightly clearer coloured than the dorsal ones, or mottled

black.

BIOLOGY

We never detected any P. houlengeri -even during rainy weather — from January to May.

In 1999, we found choruses on two ponds from September to the beginning of October. In

Source : MNHN, Paris

Table 1. - Measurements (mm) and ratios of 18 Phlyctimantis boulengeri tadpoles (SMNS 9271.3-20). Staging after GOSNER (1960). BL, body

length; AL, tail axis length; TL, total length; BW, body width; BH, body height; FH, fin height (including dorsal and ventral part of fin and

muscular portion of tail); KF, keratodont formula (afier DUBOIS, 1995).

ISNYA Ÿ TIAOYW

Stage BL AL TL BW BH FH BL/BW | AL/BL BL/FH TL/FH KF

25 52 LE 14.7 37 3.9 43 14 LS 12 34 1/2+2:1

25 54 102 15.6 3.9 43 4.8 14 1.9 1.1 #3 1/2+2:1

25 53 9.9 15.2 3.8 41 4.6 14 19 12 33 1/2+2:1

25 5.1 9.6 147 3.8 4.0 43 35 ES 1 34 1/2+2:1

| 25 49 10.0 14.9 3.6 3.6 42 14 2.0 12 3.5 1/2+2:1

25 74 15.1 22.5 5.1 52 5.5 15 2.0 13 4.1 1/2+2:1

26 9.0 212 30.2 74 75 73 LZ 2.4 12 4.1 1/2+2:1

26 92 19.5 28.7 6.1 5.9 6.5 15 2.1 14 44 1/2+2:1

26 8.6 17.8 26.4 6.0 6.5 7.0 14 2.1 12 3.8 1/2+2:1

27 10.6 21.5 32.1 7.5 7.8 74 14 2.0 14 43 1/2+2:1

27 10.6 21.5 32.1 6.9 15 7.1 ts; 2.0 1.5 45 1/2+2:1

27 10.8 18.1 28.9 6.6 6.8 6.9 1.6 17 1.6 42 1/2+2:1

L 28 10.6 222 32.8 73 73 8.0 1.5 2.1 13 4.1 1/2+2:1

31 11.5 244 35.9 7.6 8.1 84 15 2.1 14 43 1/2+2:1

31 142 24.6 38.8 7.4 8.1 8.7 1.9 17 16 45 1/2+2:1

32 14.5 275 43.0 7.7 8.0 8.5 1.9 8 17 5.1 1/2+2:1

40 17.0 43.0 60.0 13.0 14.0 15.0 13 25 1.1 4.0 1/2+2:1

[= 42 18.0 41.0 59.0 12.0 12.0 115 15 23 1.6 5.1 1/2+2:1

Source : MNHN, Paris

182 ALYTES 18 (3-4)

Fig. 1. Lateral (a) and dorsal (b) view of a Phlyctimantis boulengeri tadpole from Taï National Park,

Ivory Coast (Gosner stage 28). Scale bar: 10 mm:

2000, we found the first chorus on June 2, after heavy rainfalls. The choruses comprised

5-20 males, all sitting in small trees and bushes at the edge of temporary ponds. Two ponds

were situated in the forest, along an old logging road (pond diameter 15-30 m, maximal water

depth 40-100 cm). Two other ponds were situated on a rocky inselberg (pond diameter 2 m,

maximal water depth 20 cm). When disturbed, all adult P boulengeri showed a conspicuous

defence behaviour. They bent their back, hiding their head between the forelegs, and pre-

sented the red parts of the hind limbs (fig. 3). The animals secreted a sticky substance that

covered their skin. On September 17, 1999, at 9:00 p.m., two hours after a heavy rainfall, we

observed three amplectant pairs of P boulengeri. The pairs were floating close to the edges of

a large pond that had filled during the preceding days (fig. 4). When the frogs were disturbed

they retreated to deeper sections of the pond, and re-appeared a few minutes later. We caught

one pair (SVL: male 42 mm, female 52 mm) and transferred it to a plastic aquarium where

they spawned the same night. The eggs were attached singly to the aquarium walls below the

water surface. The clutch comprised 185 eggs. The ovum size was 2-2.5 mm (3-3.5 mm

including the jelly capsule, n = 20), they had a small black and a large yellow pole. The first

tadpoles hatched on September 26. On November 25, we preserved the last five tadpoles of

Source : MNHN, Paris

RÔDEL & ERNST 183

a b

Fig. 2. - Oral disc (a) and single infra-angular labial tooth (b) of the specimen figured in fig. 1. Scale bar

a, 1 mm; b, 0.1 mm

Fig. 3. - Defence behaviour of an adult male Phlyctimantis boulengeri

Source : MNHN, Paris

184 ALYTES 18 (3-4)

Fig. 4. - Amplectant Phlycrimantis boulengeri pair floating in shallow water of a large forest pond.

our 1999 series (stages 27-32). Three other clutches that we got from amplectant pairs (SVL:

males 43-48 mm, females 51.5-54 mm) in June and September 2000 comprised 110, 210 and

339 eggs, respectively. Egg colour, egg size and time until hatching was equal to that of the first

clutch. In the ponds, eggs were attached to the pond bottom or to rotten leaves.

DISCUSSION

An identification of Phlyctimantis boulengeri tadpoles with the description given by

GUIBÉ & LAMOTTE (1958) under the name C. rufescens is not possible. These authors pictured

a tadpole with external gills and an oral disc that clearly belongs to a much older specimen.

The given keratodont formula fits nearly the formula of our tadpoles (they figured 1/1+1:2),

but the fact that they reported P boulengeri to deposit its eggs on leaves above the water

surface leaves doubt concerning the correct identification of their specimens. According to

our observation, P boulengeri lays its eggs in the water. The same behaviour was described by

LAURENT (1976) for Phlyctimantis verrucosus (Boulenger, 1912).

ScHiorz (1975) described the tadpole of P verrucosus. According to his description the

tadpoles resemble our P boulengeri. He indicated the keratodont formula of his two speci-

mens as being 1/3 and 1/2+2:1. The fin of these tadpoles is rather high, but not as high as in

Source : MNHN, Paris

RÔDEL & ERNST 185

Kassina Girard, 1853. ALTIG & MCDiaRMID (1999) characterised the species as exotroph,

lentic and benthic. The body pattern is described as uniformly pale with blotches. Our

tadpoles fit this ecological characterisation. They closely resemble the tadpoles of Kassina

Jfusca Schiotz, 1967 with transparent fins (RÔDEL, 2000). This might be a further hint for the

supposed close relationship of Kassina with Phlyctimantis Laurent & Combaz, 1950

(DREWES, 1984). However, this could be also a plesiomorphic character. To clarify the

phylogenetic relationship of Kassina and Phlyctimantis we propose a closer examination of

their genetic and call characters.

ScHioTz (1999) wrote that all four currently recognised Phlyctimantis species require

forest conditions at their breeding localities. According to ScHiorz (1975) and LAURENT

(1976), in eastern Zaire and Uganda the breeding sites of P verrucosus were small stagnant,

probably temporary pools in very dense forests. Males of P. boulengeri called in vast numbers

around small waterholes in forest and sometimes in bushland (ScHieTz, 1975). PERRET (1966)

reported that P leonardi occurs near rivers in forests of low altitude in Cameroon. Males of P.

leonardi from the Republic of Congo called from elevated (1-2.5 m) positions in large bushes

at the edge of deep, but temporary ponds (LARGEN & DOWSETT-LEMAIRE, 1991). These males

called from bushes in flooded grassland, but not from the nearby flooded forest. Phlyctimantis

keithae Schiotz, 1975 from Tanzania called around artificial ponds in very open farmland

(ScHioTz, 1999). The males were concealed in grass-tufts near the water’s edge and quietly

slipped into the water if disturbed. All our P. boulengeri records lay within or in close vicinity

to forest habitats. However, we never found that species within closed primary forest. The

breeding sites were all in degenerated forest or in habitats without a closed canopy. We

detected calling males of P boulengeri exclusively in small trees and shrubs in close vicinity to

their breeding ponds. It might therefore be concluded that Phlycrimantis species most often

require forest habitats, but avoid closed primary forest.

Disturbed P boulengeri displayed a conspicuous defence behaviour. During that behav-

iour their skin turned very sticky. DREWES & VINDUM (1994) reported a similar observation on

P. verrucosus. Their specimens were covered with a latex-type liquid which had a rather

noxious smell. The biological significance of this behaviour and the chemical nature of the

secretions need further investigations.

ACKNOWLEDGEMENTS

MOR was supported by a scholarship of the German Academic Exchange Service (DAAD).

TROPENBOS-Côte d'Ivoire provided transportation and various administrative services. Lodging

facilities were provided by the “Centre de Recherche en Ecologie”. The research permission was given by

the “Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique”, Republic of Ivory Coast.

Access permit to TNP was issued by the “Ministère de la Construction et de l'Environnement”. Ronn

Altig, Alain Dubois, Heinz Grillitsch and two anonymous reviewers provided valuable comments on a

previous draft of the manuscript. These supports are gratefully acknowledged

Source : MNHN, Paris

186 ALYTES 18 (3-4)

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RÔDEI

Corresponding editor: Alain DUROIS

Source : MNHN, Paris

Alytes, 2001, 18 (3-4): 187-200. 187

Microanatomia del aparato bucal

y cavidad bucofaringea

de la larva de Alsodes gargola

Gallardo, 1970

(Leptodactylidae,Telmatobiinae)

Dinorah D. ECHEVERRIA *, Cecilia A. ALONSO **,

Maria Susana PILLADO ** & Carmen A. UBEDA **

* Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA), Departamento de Ciencias Biolégic:

Laboratorio de Vertebrados, (1428) Buenos Aires, Argentina

fecheverria@bg.fcen.una.ar]

** Centro Regional Universitario Bariloche, Universidad Nacional del Comahue,

Unidad Postal Universidad, (8400) San Carlos de Bariloche, Argentina

[cubeda@bariloche.com.ar]

Based on specimens collected in Provinces Neuquén and Rio Negro

(Argentina), the microanatomy of the buccal apparatus and the buccophar-

yngeal cavity of Alsodes gargola larvae are described as observed with light

and scanning electron microscopy. The buccal apparatus has keratodonts

formed by a long base, a short neck, and a multicusped paddle, with 14 to

20 denticles. The horny beak is wider than high, and the rostrodonts are

unicusped with the tips sharply pointed with smooth margins. The bucco-

pharyngeal cavity has two pairs of infralabial papillae and one single

prenarial papilla. Papillae and pustulations are present on both oral floor

and roof. Lateral ridges with digitiforms projections of different length are

present. The velum and glandular zone are located in posterior area. The

tongue anlage possesses from 2 to 4 papillae and the median ridge can have

distal projections. Though both larvae have the same papillae pattern

arrangement in the buccal cavity, labial papillae of Alsodes gargola

neuquensis are longer and thinner than those of Alsodes gargola gargola.

The comparative analysis of the microanatomy of the buccopharyngeal

cavity of À. gargola and other species of telmatobiines, which inhabit the

temperate forests of Patagonia, shows similarities with other free

larvae, especially those belonging to the genus Batrachyla. Mainly epi

hytic diatoms were found in the digestive contents, correspont

to anatomical structures of larvae that forage at the bottom of water bodies.

INTRODUCCION

nero Alsodes contiene 12 especies distribuidas en Argentina y Chile (LaviLLa, 1992,

1994; FORMAS, 1995; Formas et al., 1997, 1998). GALLARDO (1970) describié a 4/sodes gargola

con ejemplares provenientes de la laguna Tonchek en el Cerro Catedral (41°12'S, 71°30°W:

1750 m s.n.m.; Parque y Reserva Nacional Nahuel Huapi, Argentina). Esta especie, endémica

Source : MNHN, Paris

188 ALYTES 18 (3-4)

del noroeste patagénico, hasta el momento s6lo citada para Argentina, habita cuerpos de

agua permanentes lénticos de altura y léticos de montaña, hasta los 2000 metros de altitud

(ÜBEDa et al., 1998). Cr (1976) propuso la existencia de dos subespecies, Alsodes gargola

gargola para la localidad tipo y A/sodes gargola neuquensis para una nueva forma proveniente

de la Meseta de Lonco Luan (provincia de Neuquén, Argentina).

La morfologia externa de la larva de A/sodes gargola fue descripta por PILLADO et al.

(2000) sobre ejemplares provenientes del Parque y Reserva Nacional Nahuel Huapi. Hasta el

presente se ha descripto la microanatomia bucofaringea de las larvas de A/sodes barrioi y

Alsodes monticola (WASSERSUG & HEYER, 1988). De acuerdo con las investigaciones previa-

mente realizadas por Ügrpa (1998), que señalan la falta de informaciôn que existe actual-

mente en diversos aspectos de la historia de vida de los anuros patagônicos, comenzamos el

estudio de las larvas desde el punto de vista de la anatomia del aparato bucal externo e interno.

En este trabajo se describe la conformacién anatémica del piso y del techo de la cavidad

bucofaringea de la larva de A/sodes gargola y se amplia la descripcién del disco oral.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se colectaron larvas de A/sodes gargola gargola (sensu Cr1, 1976) en el Valle de los

Perdidos y Cerro Challhuaco (Parque y Reserva Nacional Nahuel Huapi, Provincia de Rio

Negro, 1997 y 1998) y larvas de A/sodes gargola neuquensis (sensu Cet, 1976) en La Atravesada

(Provincia del Neuquén, 1999). Se determiné la posicién geogräfica de las localidades de

muestreo por medio de las cartas del Instituto Geogräfico Militar a escala 1:50.000, a saber:

Valle de Los Perdidos, 41°14°32" S, 71°167,4° W; Cerro Challhuaco, 41°15°59"S, 71°18°25°

W:; La Atravasada, 38°52’S, 70°34°W. Las larvas se capturaron con redes de mano, se

anestesiaron con benzocaina en solucién acuosa y se fijaron in toto en formalina 10 % neutra.

Los estadios larvarios se determinaron estableciendo una equivalencia con la tabla propuesta

por GOsNER (1960). Para detectar las posibles variaciones en la férmula dentaria de la larva de

Alsodes gargola, se examinaron 20 ejemplares de À. gargola gargola y 10 de A. gargola

neuquensis. Para realizar el examen del disco oral con microscopio electrénico de barrido, se

extrajo esta estructura previamente a su deshidratacién. La descripcién de las estructuras

bucofaringeas se realizé con 12 especimenes de A/sodes gargola gargola y ocho de À. gargola

neuquensis comprendidos entre los estadios 26 y 37. De estos ejemplares, cuatro de À. gargola

gargola y cinco de À. gargola neuquensis se destinaron para ser observados con microscopio

electrénico de barrido (estadios 31 y 37 en ambos taxa). Todos los especimenes utilizados

formaron parte del lote 1, de la coleccién de Vertebrados de la Universidad Nacional del

Comahue . Rio Negro, que se detallan en la tabla 1.

La disecciôn de la

(1980). Para las observe

piso y del techo de la c

vidad oral se realizé siguiendo la técnica sugerida por WASsERs

iones con microscopio estereoscépico, se coloreé la superficie del

dad bucofaringea con dos o tres gotas de hematoxilina de zio

con azul de metileno acuoso al 1 %. El disco oral, el piso y el techo de la cavidad bucofaringea

destinados para la obser scopio electrénico de barrido fueron deshidratados

con alcoholes de graduacin creciente, segün la técnica propuesta por FIORITO DE LOPEZ &

ECHEVERRIA (1984), a la cual se le modificé el tiempo de deshidrataciôn en alcohol etilico

Source : MNHN, Paris

Tabla 1.- Material de Alsodes gargola estudiado (coleccién de Vertebrados de la Universidad Nacional del Comahue, lote 1).

Estadio

Taxén n

26 27 28 29 31 32 34 36 37

Alsodes gargola gargola 12 _- - = 2 2 3 2 2 1

Alsodes gargola neuquensis 8 1 2 2 = = - _ _ 3

V4 A @ OAVTId OSNOTY “VRRITAIHOT

681

Source : MNHN, Paris

190 ALYTES 18 (3-4)

(80 %, 8 h;96 %, 2 h; 100%, 1 h), en la mezcla alcohol etilico-acetona (3:1, 1h; 1:1, 1h; 1:3, 1h)

y en acetona pura donde permanecieron como mäximo dos horas antes de proceder a la

desecaciôn final. Las piezas se secaron al vacio con un secador Balzers CPD 030 hasta

alcanzar el punto critico de desecacién y se metalizaron con oro en un metalizador ION

Sputtering Balzers SCD 040. Las observaciones se realizaron con un microscopio electrénico

de barrido Philips 505.

La terminologia utilizada para la descripciôn de la anatomia del aparato bucal externo

fue la sugerida por vaN Dux (1966); para las estructuras côrneas se utilizé la propuesta por

DEUNFF & BEAUMONT (1959); la terminologia para la descripciôn de la cavidad bucofaringea

se ajusté a la presentada por VIERTEL (1982), siguiendo las sugerencias de MCDIARMID &

ALTIG (1999). La férmula dentaria se expresé segün DuBois (1995). Las ilustraciones fueron

realizadas con microscopio estereoscépico Carl Zeiss provisto de câmara clara Carl Zeiss

BH2-DA 2148.

Para determinar cualitativamente la composiciôn del contenido intestinal de la larva, se

examiné el primer tercio del intestino de seis ejemplares fijados, comprendidos entre los

estadios 28 y 37. Para la identificacién taxonémica se utilizé un microscopio invertido

Hydro-BIOS y se consulté principalmente a GERMAIN (1981) y SMITH (1950).

Las caracteristicas de la cavidad bucofaringea de la larva de A/sodes gargola fueron

comparadas con las caracteristicas de A/sodes barrioi y Alsodes monticola y con las de otras

especies de telmatobinos cuyas cavidades bucofaringeas han sido descritas: Arelognathus

patagonicus, Atelognathus reverberi, Batrachyla antartandica, Batrachyla leptopus, Batra-

chyla taeniata, Caudiverbera caudiverbera, Hylorina sylvatica, Telmatobius jelskii, Telmatobius

marmoratus, Thoropa miliaris y Thoropa petropolitana (BRIEVA VASQUEZ, 1988; WASSERSUG &

HEYER, 1988).

RESULTADOS

DESCRIPCION DEL APARATO BUCAL

El aparato bucal estä en posiciôn subterminal ventral. El disco oral presenta constric-

ciones (emarginado) y un amplio claro rostral, una hilera de papilas marginales, una hilera de

papilas intramarginales mentonianas y papilas intramarginales laterales supra e infrangula-

res. Las papilas marginales e intramarginales mentonianas estän bien desarrolladas, son

énicas, con el extremo distal liso y redondeado; la hilera de papilas marginales puede

presentar papilas bifidas y trifidas en nümero variable (fig. la-b). El disco sobresale del

contorno de la cabeza cuando est relajado. Las papilas intramarginales laterales son cénicas,

bajas y simples, pueden presentarse en la regiôn supra o infra-angular en forma aislada o en

grupos de hasta cuatro papilas (fig. 1e). Existen cinco pliegues labiales paralelos entre si, dos

anteriores curvos y tres posteriores mäs cortos y rectos; la férmula dentaria es 1:<1>/<1>:2.

Sobre el pliegue labial los queratodontes forman una hilera continua y homogénea:; el nümero

de queratodontes oscila entre seis y siete cada 100 1m; estän formados por una base larga, un

cuello corto, angosto y marcado y una espätula levemente concava y alargada que presenta en

Source : MNHN, Paris

ECHEVERRIA, ALONSO, PILLADO & ÜBEDA 191

Fig. 1. - (a) Aparato bucal de A/sodes gargola. Estadio 31. Escala: 1mm. — (b) Detalle de las papilas

mentonianas del disco oral, marginales (J) e intramarginales (T), de Alsodes gargola. Estadio 31.

Escala: L mm. - (c) Papilas intramarginales infraangulares (flechas). Estadio 30. Escala: 0,1 mm.

(d) Queratodontes de la primera hilera inferior de Alsodes gargola. Estadio 30. Escala: 10 um. —

(e) Suprarrostrodonte de Alsodes gargola. Estadio 30. Escala: 0,1 mm.

su borde libre de 14 a 20 denticulos cortos (fig. 1d); la longitud total de los queratodontes se

encuentra aproximadamente entre 50 y 60 um; la longitud de la espätula puede variar de 35 a

40 sm y su ancho es de aproximadamente 10 um, lo que representa ‘4 de la longitud de la

misma. En las espätula

de À. g gargola se regi

de Alsodes g. neuquensis se registraron de 18 a 20 denticulos, y en las

aron 14 a 18

Los rostrodont n bien desarrollados y fuertemente

ados. El infrarrostrodonte o pieza inferior tiene forma de “V” y el suprarrostro-

donte o pieza superior, de arco; el ancho del suprarrostrodonte disminuye abruptamente en

los extremos laterales, en tanto que el infrarrostrodonte mantiene un ancho uniforme y sus

extremos son redondeados; las aserraduras son mäs pronunciadas en la regién medial. El

nümero de rostrodontos varia entre tres y cuatro cada 100 um: los rostrodontos poseen el

extremo distal liso y agudo, son siempre mäs altos que anchos y su longitud total es

son mâs anchos que alto

queratini:

aproximadamente 75 um (fig. le). Los denticulos de los queratodontes y los âpices de los

s o redon-

rostrodontos, cuando emergen, presentan sus cüspides agudas, tornändose rom:

deadas cuando afloran totalmente de la estructura que los sostiene.

Source : MNHN, Paris

192 ALYTES 18 (3-4)

La pigmentacién del disco oral es escasa, formada por cümulos irregulares y aislados de

cromatéforos que le otorgan una coloracién castaño claro; la mayor pigmentacién se presenta

en la cara dorsal de las papilas marginales; las papilas intramarginales laterales pueden

carecer de pigmentacién. Las partes expuestas de las estructuras cérneas estän intensamente

pigmentadas y su color puede variar desde castaño oscuro a negro.

DESCRIPCIÔN DE LA CAVIDAD BUCOFARÎNGEA

Piso de la cavidad bucofaringea

La regiôn prelingual presenta cuatro papilas infralabiales, dos laterales y dos ventrales.

El esbozo lingual es redondeado, y sobre él se desarrollan de dos a cuatro papilas linguales,

siendo las centrales mäs altas; las papilas linguales son digitiformes y simples, aunque pueden

presentar el extremo distal mäs delgado o con ramificaciones; la superficie es lisa o verrugosa

(fig. 2a-b). La arena del piso de la cavidad oral estä limitada lateroposteriormente por

abundantes y desarrolladas papilas periféricas de forma cénica, que se disponen formando un

arco; la superficie de la arena del piso de la cavidad oral estä tapizada por papilas bajas,

simples y digitiformes y por püstulas. En el ärea anterior a las hendiduras bucales, se

encuentran papilas y un pliegue que estä orientado transversalmente a la arena del piso de la

boca y dirigido hacia la luz de la cavidad bucofaringea; esta estructura es laminar y presenta

de dos a cuatro proyecciones desarrolladas y generalmente digitiformes (fig. 2c). Las

hendiduras bucales son alargadas y estän ubicadas transversalmente con respecto a la

linea media y con el extremo interno dirigido levemente hacia la regiôn anterior de la

cavidad oral. El borde posterior libre del velo ventral tiene de tres a cinco proyecciones

marginales simples y estâ interrumpido en la regién media por una escotadura mediana,

enmarcada por proyecciones desarrolladas que le confieren forma de “V”. El borde del velo y

sus proyecciones presentan una regiôn glandular angosta con fosetas secretoras redondeadas

(fig. 2d-3a).

Techo de la cavidad bucofaringea

En el centro del ärea prenarial, se encuentra una papila impar de mediano tamaño. Las

narinas internas son prominentes, perforadas, de forma eliptica y con välvulas moderada

mente desarrolladas y con borde libre liso; el extremo interno estä orientado hacia la regiôn

anterior de la cavidad oral. El ârea postnarial presenta de tres a cinco pares de papilas

postnariales de diferente tamaño; estas papilas se disponen a ambos lados del eje longitudinal

de la cavidad bucofaringea, siguiendo una linea oblicua con respecto a este eje y con una

orientaciôn similar a la de las narinas internas. Los pliegues laterales estän bien desarrollados,

son laminares y presentan de tres à cuatro proyecciones generalmente digitiformes de dife-

rente longitud. El pliegue mediano tiene forma variable, paredes lisas o verrugosas, y

suextremo distal puede ser ünico o presentar pequeñas proyecciones en nümero variable (fig.

4a-b). La arena del techo està delimitada posteriormente por papilas bajas y lateralmente por

Source : MNHN, Paris

ECHEVERRIA, ALONSO, PILLADO & ÜBEDA 193

Fig. 2. — (a) Piso de la cavidad bucofaringea de Alsodes gargola. Estadio 31. Escala: 1 mm. -

(b) Tres papilas infralabiales de Alsodes gargola. Estadio 31. Escala: 1 mm. - (c) Pliegue (PH) anterior

a la hendidura bucal izquierda (H), de A/sodes gargola. Estadio 26. Escala: Imm. — (4) Borde (V) y

proyecciôn (F) del velo ventral de Alsodes gargola. Estadio 26. Escala: 0,1 mm.

cuatro a cinco papilas marginales bien Joe as y encens SEApies Todas las

arena del techo (fig. 4). La region dote se encuentra en nel ärea posterior a la arena y estä

dispuesta en una franja ancha con forma de “U” abierta; las fosetas sec: n redondea-

das (fig. 4c). El velo dorsal tiene el borde libre liso y estä interrumpido en la linea media (fig.

2b).

rvado escasas variaciones en el nümero de papilas linguales del piso de la

cavidad bucofaringea. En algunos casos y en ambos taxa (4. gargola gargola y A. gargola

neuquensis), en estadios no consecutivos y avanzados, 28, 31 y 37, registramos ejemplares con

atro papilas linguales. En cuanto al desarrollo de las papilas linguales, en 4.

Hemos obs

dos, tres o ©

Source : MNHN, Paris

194 ALYTES 18 (3-4)

Fig. 3.- Morfologia de la cavidad bucofaringea de la larva de Alsodes gargola (estadio 37). (a) piso: (b)

techo. C, coana; E, escotadura mediana: F, proyecciôn marginal: G, regiôn glandular; H, hendidura

bucal; HE, pliegue anterior a la hendidura; I, papila infralabial: L, esbozo lingual: LP, pliegue lateral;

M, pliegue mediano: N, papilas postnariales; P, papilas periféricas del ârea del piso de la cavidad

bucofaringea; PI, papila prenarial impar; PL, papilas linguales: PM, papilas del margen del ârea del

techo de la cavidad bucofaringea: R, infrarrostrodonte: S, suprarrostrodonte; U, välvula de la coana;

V, velo. Escala: 2 mm.

gargola neuquensis, éstas se observan mäs largas y delgadas que en A. gargola gargola

cualquiera sea el estadio considerado.

COMENTARIO SOBRE EL CONTENIDO DEL TUBO DIGESTIVO

Los resultados del anälisis del contenido muestran que està compuesto por varios items

alimentarios, principalmente diatomeas perifiticas; entre estas algas los géneros predominan-

tes son Diatoma, Fragilaria, Nitzschia ÿ Cymbella. En menor medida, también se encuentran

algas Cianofitas y Clorofitas, protozoos ciliados, fragmentos de origen vegetal, hifas de

hongos y material orgänico amorfo.

Source : MNHN, Paris

ECHEVERRIA, ALONSO, PILLADO & ÜBEDA 195

Fig, 4. — (a) Techo de la cavidad bucofaringea de A/sodes gargola. Estadio 31. Escala: 1 mm. - (b) Detalle

de papila prenarial impar (PI), papilas postnariales (N), pliegue mediano (M), coana izquierda (C)

y pliegue lateral (LP). Estadio 31. Escala: 1 mm. - (c) Detalle de regiôn glandular en zona posterior

del techo de la cavidad bucal de À. gargola. Estadio 31. Escala: 0,1 mm.

DISCUSIÉN Y CONCLUSIONES

El estudio realizado de la morfologia oral y bucofaringea de la larva de A/sodes gargola

pone en evidencia caracteristicas propias y en comün con las otras larvas de telmatobinos del

bosque templado patagénico descriptas o comentadas por diversos autores (CE1 & RoIG,

1965; FORMAS, 1975, 1981; FORMAS & P

1983, 1988; Diaz PÉREZ, 1984; Diaz & VALENCIA, 1985; Diaz & NU 1988; BRIEVA

VASQUEZ, 1988; WassERSUG & HEYER, 1988; ForMaS et al., 1997). Coincidiendo con la

descripciôn realizada por PiLLADO et al. (2000), las larvas de 4. gargola tienen un aparato

bucal generalizado y bien desarrollado, con un disco oral con constricciones angulares. Estas

caracter s las comparte con la mayoria de las especies de telmatobinos estudiadas, con

excepciôn de Telmatobius jelskii y Telmatobius marmoratus (LAVILLA, 1988). Entre los telma-

tobinos, el género A/sodes es el ünico que posee papilas intramarginales mentonianas. La

férmula dentaria de A. gargola (1:<1>/<1>:2) es compartida por la mayoria de los telmato-

1978; Busse, 1980; VELosoet al., 1981; Lavir

Source : MNHN, Paris

196 ALYTES 18 (3-4)

binos, excepto el género Eupsophus que presenta una reduccién en el nümero de hileras de

queratodontes, asociada a una alimentacién endotrôfica (FORMAS & PUGIN, 1978; FORMAS,

1989a-b, 1992). La formula dentaria se caracteriza por presentar una gran constancia en la

distribuciôn de las hileras de queratodontes. El numero de denticulos en las espätulas de los

queratodontes varia entre 14 y 20 unidades. El nümero es levemente mayor en À. g. neuquensis

(18-20) que en 4. g gargola (14-18). Consideramos que dichas variaciones en el nümero de

denticulos no resultarian en una diferencia funcional puesto que no afectan la morfologia de

la espätula. Las leves variaciones morfolégicas encontradas en los âpices de los rostrodontes

yen los denticulos de los queratodontes estarian asociadas al proceso de crecimiento, desgaste

y recambio de los mismos.

La larva de Alsodes gargola comparte con otras larvas del género A/sodes y las de otros

leptodactilidos de los géneros Caudiverbera, Atelognathus, Batrachyla, Hylorina, Pleurodema

y Odontophrynus (següûn BRIEVA VASQUEZ, 1988 y WASSERSUG & HEYER, 1988), la presencia de

4 papilas infralabiales. En cuanto a las papilas linguales, se observa una cierta variabilidad en

su nümero, especialmente entre los telmatobinos (2 a 8) incluyendo 4. gargola: sin embargo,

4 papilas linguales es el nümero mäs frecuente entre los leptodactilidos patagénicos (BRIEVA

VASQUEZ, 1988; WassERSUG & HEYER, 1988). Las caracteristicas del techo de la cavidad

bucofaringea son coincidentes con Batrachyla taeniata en cuanto a la presencia de una papila

impar prenarial y al pliegue mediano desarrollado. A/sodes gargola comparte con Batrachyla

antartandica, B. leptopus y B. taeniata una papilacién abundante en las arenas del piso y del

techo de la cavidad bucofaringea. Estas caracteristicas podrian estar mäs asociadas a una

relaciôn de parentezco entre las especies aludidas que a la alimentaciôn y a los microambien-

tes que habitan durante el desarrollo. Las especies de Batrachyla se desarrollan en cuerpos de

agua lénticos, temporarios (B. taeniata yÿ B. leptopus) o permanentes (B. leptopus y B.

antartandica) (FORMAS, 1981: SALLABERRY et al., 1981) y la larva de À. gargola habita sélo

ambientes permanentes tanto lôticos como lénticos de altura (ÜBEDA et al., 1998). En estas

especies, la tendencia comün al desarrollo de largas y robustas papilas a la entrada de la boca

podria sugerir una funcién involucrada con la deteccién o repulsién de particulas, alimenti-

cias o de otro tipo, que pudieran ingresar con el agua. La distribucién y el conspicuo

desarrollo de las papilas de las arenas del techo y del piso de la cavidad bucofaringea de la

larva de A/sodes gargola son caracteristicas semejantes a otras larvas de leptodactilidos de

ambientes léticos de montaña (Was & HEYER, 1983, 1988).

Las fosetas secretoras ocupan el borde del velo ventral y una banda posterior en el techo

de la cavidad bucofaringea. äreas tienen un escaso desarrollo en relacién con las

proporciones que la cavidad bucal adquiere, especialmente en la ültima etapa del desarrollo,

en el que la larva puede alcanzar una longitud total de hasta 87 mm (PILLADO et al., 2000). Sin

embargo, esta caracteristica parece no tener influencia en la cantidad de sustancia mucosa

secretada, puesto que en todos los especimenes examinados, se halla extendida

en forma abundante en toda la superficie de la cavidad buc:

Alsodes gargola presenta un periodo prolongado de desarrollo larvario, que supera el año

(Ürepa et al., 1998). Los ambientes que habita la larva son arroyos de montaña y lagos de

altura por encima del limite de vegetacién. Los primeros carecen de plancton, mientras que en

los segundos la comunidad fitoplancténica estä representada por nanoplancton y una por-

ciôn substancial de la producciôn primaria total estä a cargo de las algas bénticas (epiliton)

Source : MNHN, Paris

ECHEVERRIA, ALONSO, PILLADO & ÜBEDA 197

(ZAGARESE et al., 2000). La posicién del disco oral y la morfologia de sus estructuras permiten

a la larva de Alsodes gargola la recoleccién del alimento epilitico o perifitico desarrollado

sobre diversos sustratos (rocas, vegetacién acuâtica, troncos sumergidos, etc.). Probable-

mente una exitosa soluciôn para segurar la recolecciôn de particulas sueltas, ha sido, en el

caso de À. gargola, aumentar el nûmero, tamaño y densidad de las papilas bucofaringeas que

pudieran seleccionar el tamaño de la particula ingerida, y por otra parte, aumentar la

densidad y el largo de los queratodontes que actuarian como cepillos barriendo las superficies

de los sustratos y reuniendo los organismos que sobre ellas se desarrollan, para luego

retenerlos en el mucus de la cavidad bucofaringea. La acciôn de tales estructuras aseguraria la

recolecciôn y seleccién de particulas, tanto en aguas quietas como en movimiento. Esto

conduce a pensar que la conformaciôn del aparato bucal y de la cavidad bucofaringea de la

larva de À. gargola le otorga cierta versatilidad que la hace häbil para proveerse de su alimento

en el fondo, tanto de particulas sueltas como adheridas a un sustrato.

En cuanto a las escasas variaciones en nûmero de las papilas linguales halladas en

algunos estadios avanzados de 4. gargola, las consideramos como casos individuales, puesto

que no reflejan un patrén de desarrollo paulatino, en el cual el nümero de papilas se podria ir

incrementando a medida que transcurre el desarrollo de la cavidad bucal. En los ejemplares de

estadios menores (estadios 26 y 27), se registraron cuatro papilas linguales. Considerando

ademäs las especies estudiadas por otros autores (BRIEVA VASQUEZ, 1988: WASSERSUG &

HEYER, 1988; ECHEVERRIA, 1995), surge que el nümero de cuatro papilas linguales es el caso

mäs frecuente entre las larvas exotréficas de leptodactilidos, independientemente del

ambiente en que se desarrollen y de su grado de afinidad filogenética. Las variaciones

morfolégicas de las papilas linguales entre À. g. gargola y A. g. neuquensis podrian atribuirse,

fundamentalmente, a factores genéticos. Aunque ambas larvas mantienen un patrôn morfo-

légico estable en su cavidad bucal, en A. g. neuquensis el conjunto de papilas se observa, en

general, mäs alargadas y delgadas que en 4. g. gargola. Esta afirmaciôn incluye a las papilas

linguales de À. g. neuquensis.

RESUMEN

Se describe la microanatomia del aparato bucal y la cavidad bucofaringea de la larva de

Alsodes gargola observada con microscopio electrénico de barrido y microscopio estereoscé-

pico sobre especimenes colectados en las provincias de Neuquén y Rio Negro (Argentina). El

aparato bucal presenta queratodontes formados por una base larga, cuello corto y espätula

multicuspidada, con 14 a 20 denticulos. El pico cérneo es mäs ancho que alto y los rostro-

dontos son unicuspidados con el extremo liso y agudo. La cavidad bucofaringea tiene dos

pares de papilas infralabiales y una papila impar prenarial, papilas y püstulas tanto en el piso

como en el techo, pliegues laterales con proyecciones digitiformes de diferente longitud, velo

y ärea glandular en la parte posterior. El esbozo lingual tiene de dos a cuatro papilas y el

pliegue mediano puede presentar proyecciones distales. Las variaciones morfolégicas de las

papilas linguales entre À. g gargola y À. g. neuquensis podriamos atribuirlas a factores

genéticos, sin otorgarles, por el momento, importancia taxonémica. El anälisis comparativo

realizado sobre la microanatomia de la cavidad bucofaringea entre 4. gargola y otras especies

Source : MNHN, Paris

198 ALYTES 18 (3-4)

de telmatobinos que habitan el bosque templado patagénico evidencia las similitudes con las

larvas de vida libre, especialmente con las del género Batrachyla. En el contenido del tubo

digestivo se encontraron principalmente diatomeas epiliticas y perifiticas, en concordancia

con las adaptaciones anatémicas a una alimentacién de fondo.

AGRADECIMIENTOS

A la Administraciôn de Parques Nacionales de Argentina por autorizar la realizacién de los

muestreos en el Parque y Reserva Nacional Nahuel Huapi. À D. Giménez del Servicio de Microscopia

Electrénica de Barrido dependiente del Instituto de Investigaciones Cientificas y Técnicas de las Fuerzas

Armadas (CITEFA), por la asistencia técnica brindada. A G. Baflico por su colaboraciôn en la

determinacién del contenido del tubo digestivo, a R. Albariño y a M. Weigandt por sus sugerencias

metodolégicas para la determinaciôn taxonémica de los items tréficos y a F. Pedrozo por facilitar el uso

de instrumental éptico (Universidad Nacional del Comahue). Este estudio fue financiado en parte con un

subsidio para la investigaciôn otorgado por la Universidad Nacional del Comahue (proyecto 04/B083) y

con un subsidio de la Agencia Nacional de Promociôn Cientifica y Tecnolôgica (ANPCYT) de Argentina

(PICT 01-0368)

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Corresponding editor: Karen R. LiPs.

Source : MNHN, Paris

Alytes, 2001, 18 (3-4): 201-207 201

Bacterias coliformes

y otras bacterias de interés sanitario

en larvas de Bufo arenarum Hensel, 1887

(Anura, Bufonidae)

en Santa Fe (Argentina)

Rafael C. LAIMANOVICH, Federico EMILIANI & Paola M. PELTZER

Instituto Nacional de Limnologia (INALI, CONICET),

José Maciä 1933, Santo Tomé, Santa Fe (3016), Argentina

{inali@arcride.edu.ar]

This study was carried out to give a preliminary, quantitative descrip-

tion of gut bacteria of Bufo arenarum tadpoles. The results revealed that

bacterial concentrations in larva intestines were higher than bacterial

concentrations in water. The number of Escherichia coli revelated in the

guts of larval B. arenarum represented 3 % of thermotolerant coliforms.

Taxonomic entities of coliforms were composed by Klebsiella pneumo-

niae, Enterobacter cloacae and Enterobacter aerogenes. In addition,

species of Vibrio, Pseudomonas and Aeromonas were found in these

intestines.

INTRODUCCION

Como se puede comprobar en la extensa compilaciôn de MACKIE & WHITE (1997a-b),

existe abundante informacién sobre enterobacterias en animales de sangre caliente, pero en

mucho menor grado en animales de sangre fria.

Los estudios sobre la microbiologia de los anuros se han desarrollado principalmente

siguiendo dos lineas. Por un lado, se ha investigado el contenido intestinal (e.g., INGER, 1986;

LAIMANOVICH & FERNANDEZ, 1995; LAIMANOVICH, 1997) y el rol potencial de los microorga-

nismos en el intestino de las larvas (BIORNDAL, 1997). Por otro lado, otras lineas de estudio

han considerado a los anfibios principalmente como reservorios de microorganismos patôg:

nos para otros animales (HiRD et al., 1981, 1983) y para el hombre (TRUST & BARLETT, 1974;

TRUST et al., 1981; RAJENDRAN et al., 1998). Dentro de esta temätica, se ha sugerido

(GELDREICH & CLARKE, 1966) que la flora bacteriana en estos animales puede reflejar las

condiciones bacteriologicas de su ambiente y, por lo tanto, ser un indicador potencial de

polucién. Esta hipôtesis supone que los coliformes fecales no son habitantes normales de su

intestino; solamente pasan en forma breve e inalterada por su tracto intestinal. Con respecto

a las larvas de anuros, la informacién bacteriolégica existente està limitada a aspectos

cualitativos de bacterias de interés sanitario (BIORNDAL, 1997); no se ha encontrado informa-

Source : MNHN, Paris

202 ALYTES 18 (3-4)

ciôn cuantitativa (sobre cualquier tipo de bacterias). Sin embargo, el significado sanitario de

las bacterias coliformes no solamente estä determinado por la informaciôn sobre sus posibles

fuentes o reservorios sino, ademäs, por el conocimiento de su distribucién cuantitativa

(GELDREICH et al., 1964).

Por eso, nuestro objetivo fue realizar una primera descripciôn cuantitativa de las bacte-

rias de interés sanitario en el intestino de las larvas de Bufo arenarum; ademäs, nos propusi-

mos comparar sus concentraciones con las de su medio ambiente para establcer si existe un

fenômeno de concentraciôn microbiana. El presente estudio forma parte de un proyecto sobre

la distribucién de estas bacterias en diferentes organismos acuâticos (peces, almejas, rizésfera

de plantas flotantes, etc.).

MATERIALES Y MÉTODOS

Las muestras de agua y de larvas de Bufo arenarum se recolectaron en zanjones colectores

de aguas pluviales. Estos canales estän situados en la periferia de la ciudad de Santo Tomé,

provincia de Santa Fe, Argentina (31°39°59°S, 60°45°20"O). La vegetaciôn de las märgenes

estaba compuesta principalmente por A/ternanthera philoxeroides, Cynodon dactylon, Bromus

Sp. y Ludwigia Sp.; no se detecté la presencia de peces.

Las muestras de agua para bacteriologia se recolectaron en frascos de vidrio estériles

(500 ml) y se almacenaron a 3-6°C durante 3 h, antes de los anälisis. Por otra parte, se

colectaron 125 larvas de Bufo arenarum con un copo de nylon, con poros de 2 mm. Las larvas

se almacenaron a la misma temperatura, cada larva fue pesada y medida: el peso medio fue de

0.31 g (s: 0.06); la longitud promedio (hocico-cloaca) de 11.8 mm (s: 1.14). El estadio mäs

representativo de desarrollo resulté 37 (de acuerdo a la tabla de GOsNER, 1960). En la

coleccién Herpetolégica del Museo Provincial de Ciencias Naturales Florentino Ameghino

(Zoologia Vertebrados) de la ciudad de Santa Fe (Argentina) se conserva un lote de referencia

de 13 ejemplares (MFA-ZV-H 691) que formaban parte de la cohorte utilizada en este estudio.

Los intestinos fueron macerados en un mortero estéril; se utilizaron 100 g (25.4 % peso

seco; relaciôn p/v = 1.25) del macerado para realizar las diluciones destinadas al anälisis

bacteriolôgico.

Para el recuento de Escherichia coli y coliformes termotolerantes se utilizaron las placas

rehidratables “Petrifilm!" EC” (de 3M). Las placas se colocaron en bolsas estériles a prueba

de agua (*Whirl-Pack!"”, de Nasco) e incubadas en baño termostätico 44,5 + 0.2°C durante

24 h (EMILIANI & LAJMANOVICH, 1998). Para la evaluaciôn del nümero de unidades formado-

ras de colonias (UFC) se utilizé el medio “Yeast Peptone agar/25° (FONDEN, 1969). De

acuerdo con la divisién de las bacterias en grupos eco-trôficos, el medio usado evalüa el

nümero de UFC mesotréficas (EMILIANI, 1984). Las de Petri fueron sembradas por el

método de la triple capa (EmiL1ANI & DUCE, 1985), con cinco repeticiones por cada diluciôn

(1/1000 a 1/1000000) e incubadas a 20°C. Las lecturas se hicieron periédicamente hasta que el

nümero de colonias fue constante (lo que ocurrié en 15 dias). El nümero de Coliformes

Totales, Estreptococos Fecales y Pseudomonas aeruginosa fue determinado por la técnica del

nümero mäs probable (NMP), segün APHA (1989). El nümero de Vibrio cholerae, de acuerdo

Source : MNHN, Paris

LAJMANOVICH, EMILIANI & PELTZER 203

con BOCKEMUHL et al. (1986). Ademäs, se seleccionaron cepas de Coliformes Fecales y vibrios

para identificarlos bioquimicamente con el sistema “API 20E” (de bioMérieux, Francia) y el

programa para computadora de taxonomia numérica “APILAB plus” de la misma empresa

(ANONIMO, 19984).

Para estimar si las diferencias entre cada par de recuentos realizados por el método del

nümero mäs probable (NMP) eran estadisticamente significativas, se utiliz la prueba acon-

sejada por ORMEROD et al. (1982). La prueba se basa en el error del método y se usa para

confirmar o rechazar la hipôtesis nula que dos resultados (x, y x,) provienen de poblaciones

con medias idénticas: para ello se calculé el estadistico z = (log NMP, - log N MP) / 0.58 Vn,

donde n = nümero de repeticiones por dilucién. Para estimar si las diferencias entre cada par

de recuentos de unidades formadoras de colonias (UFC) eran estadisticamente significativas,

se utilizé el test de Student, de acuerdo con PARKINSON et al. (1971). Para determinar la

significancia de los estadisticos / y z se usé el programa GraphPad SiaMate (ANONIMO, 1998).

RESULTADOS

Los resultados (tab. 1) muestran que el nümero de bacterias, especialmente las del grupo

coliforme, es varias veces mayor en los intestinos de las larvas que en su ambiente; aunque las

diferencias entre las concentraciones Estreptococos Fecales y W cholerae, no resultaron

estadisticamente significativas (P > 0.05).

El nümero de Coliformes Totales se aproxima a los valores mäs altos encontrados en

peces por GELDREICH & CLARKE (1966), e inferior al encontrado en los diversos insectos

estudiados por GELDREICH et al. (1964). Sin embargo, el nümero de Coliformes Fecales en las

larvas resulté mayor que el encontrado en peces y en insectos. El nümero de Estreptococos

Fecales, por lo contrario, resulté menor que los citados para intestinos de peces e insectos.

Ademäs de Escherichia coli, las principales especies integrantes del grupo coliforme

sultaron ser: Xlebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae y Enterobacter aerogenes (como

asi también en las muestras de agua). Estas especies también fueron encontradas por HIRD et

al. (1983) en larvas de Rana pipiens. Ademäs de enterobacterias, en el intestino de las larvas

encontramos especies de Pseudomonas y de Vibrio (al igual que RAJEDRADAN et al., 1998: en

Rana hexadactyla de la India). Por otra parte, aislamos especies de Aeromonas salmonicida y,

al igual que otros autores (HiRD et al., 1981 y 1983 en intestinos de larvas de Rana pipiens),

encontramos Aeromonas hydrophila. Esta bacteria fue señalada como posible responsable de

la declinacién de poblaciones de Rana pipiens en algunas regiones de Estados Unidos (GiBBs

et al., 1971).

DISCUSION

Como se sabe (ALLEN & EDBERG, 1997), Escherichia coli es de distribuciôn universal en

los intestinos de animales de sangre caliente, con densidades desde 10% hasta 10° por gramo:

lo cual representa del 90 % al 100 % del total de coliformes termotolerantes. Si bien las

Source : MNHN, Paris

204 ALYTES 18 (3-4)

Tabla 1. - Nümero de bacterias en el tracto digestivo de larvas de Bufo arenarum y en el agua del

ambiente. UFC: unidades formadoras de colonias; NMP: nümero mäs probable.

Nümero de bacterias

Larvas (L) | Agua (A) L/A P

Bacterias viables cultivables (UFC/100 ml) 392x 10° | 430 x 10° 912 0.0001

Coliformes totales (NMP/100 ml) 230 * 107 80 x 10° 28750 0.0006

Coliformes fecales (UFC/100 ml) 193 x10$ | 28.7 x 10° 6725 0.0001

Estreptococos fecales (NMP/100 ml) 50 x 10° 9.0 x 10° 5s 0.5775

Escherichia coli (UFC/100 ml) 533x10% | 30x10? 1777 0.0001

Pseudomonas aeruginosa (NMP/100 ml) 17.5 x 10° 30 583 0.0320

Vibrio cholerae (NMP/100 m1) 400 30 133 0.3830

concentraciones de E. coli en larvas de Bufo arenarum resultaron altas (tab. 1), solamente

representaron el 3 % de los Coliformes Fecales. RENNIE et al. (1982) y NiEMi (1985) señalaron

que los porcentajes de Klebsiella y Enterobacter son mäs altos en aguas residuales ricas en

carbono y en la rizésfera de las plantas. Dada la amplia relaciôn C/N, estos ambientes resultan

favorables para las enterobacterias fijadoras de N,. Probablemente, la predominancia de

Klebsiella y Enterobacter (que son especies fijadoras de N,) en el grupo de los Coliformes

Fecales, se deba a la misma razén.

Noes extraño el hallazgo de especies de Aeromonas ni de Vibrio, pues tienen una amplia

distribucién en las aguas naturales, incluso en el zooplancton y en las rizésfera de los

camalotes (Eichhornia crassipes) (ALONSO et al., 1996; EMiL1ANI et al., 1997).

La mayor concentracién de bacterias en los intestinos de las larvas con respecto a su

ambiente puede deberse a que las bacterias se concentran con el alimento ingerido por lo cual

habria, al igual que en peces (NiEMI, 1985), una relacién entre el nümero de bacterias en el

tracto digestivo de las larvas y el grado de contaminacién de los alimentos y del agua. Otra

posible razôn del mayor recuento en larvas podria ser debido a la multiplicacién bacteriana en

su intestino, tal como DEL R10-RODRIGUEZ et al. (1997) verificaron en peces, para Æ. coli. Sin

embargo, debido a las pocas horas que el alimento permanece en el tracto digestivo de las

larvas de anuros (BIORNDAL, 1996), tal posibilidad es poco probable.

Otra explicacién estaria relacionada con una eventual selecciôn o preferencia de las

larvas por algün tipo de microorganismo. Esta bien documentado el hecho de que las colonias

bacterianas pueden ser quimio-atractivas, repulsivas o neutras para la microfauna (proto-

z00s, cladéceros, nematodes, larvas de insectos, etc.) (RHEINHEIMER, 1994; GRIFFITHS &

BARDGETT, 1997), pero no hemos encontrado referencias con respecto a larvas de anuros. Las

bacterias en el ambiente acuätico pueden estar libres o adheridas (EMILIANI, 1984); en este

ültimo caso, forman microcolonias sobre particulas, especialmente sobre algas (RE

MER, 1994). Es probable que las larvas de anuros realicen una mayor ingesta de bacterias que

colonizan particulas (algas o detritus) y que, por lo tanto, se pueda comprobar un mayor

nümero de esas bacterias en su tracto intestinal. En este trabajo, verificamos una significativa

Source : MNHN, Paris

LAJMANOVICH, EMILIANI & PELTZER 205

acumulacién de enterobacterias (tab. 1, P < 0,05); éstas, posiblemente, se encontraban

colonizando particulas o formando biofilms (su capacidad de hacerlo es conocida: PACKER et

al, 1997). Las demäs bacterias, que no se concentraron en forma significativa (tab. 1, P > 0,05)

enelintestino de las larvas, podrian haber estado en forma de vida libre (fase plancténica). No

discriminamos entre bacterias libres y adheridas en las muestras de agua, pero en trabajos

anteriores (EMILIANI, 1984), encontramos que la mayor parte de la poblacién bacteriana

(61%, V = 38.7 %) estä adherida al seston.

RESUMEN

El objetivo del presente trabajo fue brindar una descripciôn cuantitativa preliminar

sobre bacterias intestinales en larvas de Bufo arenarum. Los resultados mostraron que el

nümero de bacterias es varias veces mayor en los intestinos de los renacuajos que en su

ambiente. El nümero de Escherichia coli en intestinos larvales de B. arenarum representé un

3% de los coliformes termotolerantes. Las entidades taxonémicas de coliformes fueron

Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae y Enterobacter aerogenes. Ademäs, se encontra-

ron especies de Vibrio, Pseudomonas y Aeromonas.

AGRADECIMIENTOS

A la Bioq. Estella M. Gonzälez de Paira por su colaboraciôn en los trabajos de laboratorio. A los

revisores de la revista Alpes y al editor Dr. Karen R. Lips, por las observaciones, comentarios y

sugerencias.

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NE, R. J., FREITAS, J. R. DE, RUSCHEL, P. & Vos, P. B., 1982. - Isolation and identification of N,

fixing bacteria associated with sugar cane (Saccharum sp.). Canad. J. Microbiol.. 28 (5): 462-467.

RHEINHEIMER, G., 1994. — Aquatic microbiology. 4" ed. Chichester, J, Wiley & Sons: 1-364.

Source : MNHN, Paris

LAJMANOVICH, EMILIANI & PELTZER 207

TRUST, T. J. & BarrierT, K. H., 1974. - Occurrence of potential pathogens in water containing

ornamental fishes. Appl. Microbiol., 28 (1): 35-40.

TRUST, T. J., BARTLETT, K. H. & LiOR, H., 1981. - Importation of salmonellae with aquarium species.

Can. J Microbiol., 27 (5): 500-504.

Corresponding editor: Karen R. Lis.

Source : MNHN, Paris

Alytes, 2001, 18 (3-4): 208. Announcement

Complete collection of Alvtes

Entering the new millenium, ISSCA is glad to offer all individuals and institutions who

wish so the possibility to receive a free complete collection of back issues of Alytes, from

volume 1 of 1982 to volume 18 of 2000, just by entering a combined 5-year subscription

(2001-2005) to ISSCA, Circalytes and Alytes (volumes 19 to 23). The all-in price of the offer,

including postage and packing of the 18 volumes of back issues, is 3500 FF or 700 USS.

Please send your order to: ISSCA Secretariat, Laboratoire des Reptiles et Amphibiens,

Muséum National d'Histoire Naturelle, 25 rue Cuvier, 75005 Paris, France [e-mail :

ohler@mnhn.fr; fax: (33).1.40.79.34.88].

Please make your payment according to one of the following modes:

— In French Francs, by cheque drawn on a French bank payable to “ISSCA””, sent to the

ISSCA Secretariat (address above).

— In French Francs, by direct postal transfer to our postal account: “ISSCA”, Nr.

1-398-91-L, Paris. /f you use this mode of payment, please add 15 FF to your payment for postal

charges at our end.

— In US Dollars, by cheque payable to “ISSCA”, sent to: Rafael O. de Sä, Associate

Professor, Department of Biology, University of Richmond, Richmond, VA 23173, USA

[e-mail: rdesa@richmond.edu; fax: (804).289.8233]

If you need an invoice before paying, please write to the ISSCA Secretariat (address

above).

The set of 18 free volumes of back issues of 4lytes will be sent to you after receipt of your

payment.

Source : MNHN, Paris

ATES

International Journal of Batrachology

published by ISSCA

EDITORIAL BOARD

Chief Editor: Alain Duois (Laboratoire des Reptiles et Amphibiens, Muséum national d'Histoire naturelle, 25

rue Cuvier, 75005 Paris, France).

Deputy Editor: Thierry Lobé (Laboratoire d'Ecologie animale, Université d'Angers, 2 boulevard Lavoisier,

49045 Angers Cedex, France):

Editorial Board: Franco ANDREONE (Torino, Italy): Lauren E. BROWN (Normal, USA); Janalee P. CALDWELL

(Norman, USA); Ulisses CARAMASCHI (Rio de Janeiro, Brazil); Günter GOLLMANN (Wien, Austria); Tim

HALLIDAY (Milton Keynes, United Kingdom): W. Ronald Heyer (Washington, USA); Esteban O. LAVILLA

(Tucumän, Argentina): Karen R. LiPs (Canton, USA): Masafumi Maïsut (Kyoto, Japan): Donald F.

MCALPINE (Saint-John, Canada); John C. PoyNToN (London, England).

Technical Editorial Team (Paris, France): Alain Duois (texts); Roger BOUR (tables); Annemarie OHLer (figures).

Book Review Editor: Annemarie OHLER (Paris, France).

SHORT GUIDE FOR AUTHORS

(for more detailed Instructions to Authors, see Alytes, 1997, 14: 175-200)

Alytes publishes original papers in English, French or Spanish, in any discipline dealing with amphibians.

Beside articles and notes reporting results of original research, consideration is given for publication to synthetic

review articles, book reviews, comments and replies, and to papers based upon original high quality illustrations

(such as colour or black and white photographs), showing beautiful or rare species, interesting behaviours, etc.

The title should be followed by the name(s) and address(es) of the author(s). The text should be typewritten

or printed double-spaced on one side of the paper. The manuscript should be organized as follows: English

abstract, introduction, material and methods, results, discussion, conclusion, French or Spanish abstract,

acknowledgements, literature cited, appendix.

Figures and tables should be mentioned in the text as follows: fig. 4 or tab. 4. Figures should not exceed 16

* 24 cm. The size of the lettering should ensure its legibility after reduction. The legends of figures and tables

should be assembled on a separate sheet. Each figure should be numbered using a pencil.

References in the text are to be written in capital letters (BOURRET, 1942; GRAF & POLLS PELAZ, 1989; INGER

et al., 1974). References in the Literature Cited section should be presented as follows:

BouRRET, R., 1942. - Les batraciens de l'Indochine. Hanoï, Institut Océanographique de l’Indochine: i-x + 1-547,

pl. 14.

GRAF, .-D. & PoLLS PELAZ, M. 1989. - Evolutionary genetics of the Rana esculenta complex. In: R. M. DAWLEY

& I. P. BoGarT (ed.), Evolution and ecology of unisexual vertebrates, Albany, The New York State Museum:

280-302.

INGER, RE, Voris, H. K. & Voris, H. H. 1974.

Asian frogs of the genera Bufo and Rana. Bi

enetic variation and population ecology of some Southeast

‘hem. Genet. 12: 121-145.

Manuscripts should be submitted in triplicate either to Alain Duos (address above) if dealing with

amphibian morphology, systematics, biogeography, evolution, genetics, anomalies, pathology or developmental

biology, or to Thierry LODÉ (address above) if dealing with amphibian population genetics, ecology, ethology.

life history, conservation biology or declining populations. Acceptance for publication will be decided by the

editors following review by at least two referces.

If possible, after acceptance, a copy of the final manuscript on a floppy disk (3 V4 or 5 %4) should be sent 10

the Chief Editor. We welcome the following formats of text processing: (1) preferably, MS Word (1.1 10 6.0, DOS

or Windows), WordPerfect (4.1 to 5.1, DOS or Windows) or WordStar (3.3 to 7.0); (2) less preferably, formated

DOS (ASCIT) or DOS-formated MS Word for the Macintosh (on a 3 "4 high density 1.44 Mo floppy disk only).

…… Page charges are requested only from authors having institutional support for this purpose, The publication

of colour photographs is charged. For each published paper, 25 free reprints are offered by ISSCA to the

author(s). Additional reprints may be purchased.

Published with the support of AALRAM

(Association des Amis du Laboratoire des Reptiles et Amphibiens

du Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris, France).

Directeur de la Publication: Alain Dusois.

Numéro de Commission Paritaire: 64851.

©ISSCA 2001

Source : MNHN, Paris:

Alytes, 2001, 18 (3-4): 97-208.

Contents

Charles HOUILLON

Quatre décennies d’expérimentation embryologique

chez-les'Amphibiens Urodeles nette tnt eUnlt nel 97-126

R. BOISTEL & J.-L. AMIET

Une nouvelle espèce de Wolterstorffina (Amphibia, Anura, Bufonidae)

de l’étage afro-subalpin du Mont Okou (Cameroun) ................. 127-140

Stephen J. RICHARDS & Djoko T. ISKANDAR

A new species of tree frog (Anura, Hylidae, Litoria)

from the mountains of Irian Jaya, Indonesia ........................ 141-152

Lee-Ann HAYEK, W. Ronald HEYER & Claude GAsCON

Frog morphometrics: a cautionary tale ............................. 153-177

Mark-Oliver RôDEL & Raffael ERNST

Redescription of the tadpole of Phyctimantis boulengeri Perret, 1986

(Anura, Hyperoliidae) with preliminary comments

onthe:DIOIOB ONE SDECIES Re LE LUE LU An a RU A GG E Le 178-186

Dinorah D. EcHEvERRiA, Cecilia A. ALONSO, Maria Susana PILLADO & Carmen A. ÜBEDA

Microanatomia del aparato bucal y cavidad bucofaringea de la larva de

Alsodes gargola Gallardo, 1970 (Leptodactylidae, Telmatobiinae) 187-200

Rafael C. LAIMANOVICH, Federico EMILIANI & Paola M. PELTZER

Bacterias coliformes y otras bacterias de interés sanitario

en larvas de Bufo arenarum Hensel, 1887 (Anura, Bufonidae)

CSA (ATCeNtINA) ner uus SR ne 201-207

Announcement

Complete CONETIOn OP Al PIS 28020 Mug à PARTS 208

Alytes is printed on acid-free paper.

Alytes is indexed in Biosis, Cambridge Scientific Abstracts, Current Awareness in Biological

Sciences, Pascal, Referativny Zhurnal and The Zoological Record.

Imprimerie F Paillart, Abbeville, France.

Dépôt légal: 1 trimestre 2001.

Source : MNHN, Paris