BULLETIN

MUSÉUM NATIONAL D’HISTOIRE NATURELLE

57, rue Cuvier, 75005 Paris

Directeur : Pr M. Vachon.

Comité directeur : Prs J. Dorst, C. Lévi et R. Laffitte.

Conseillers scientifiques : Dr M.-L. Bauchot et Dr N. Halle.

Rédacteur : M me P. Dupérier.

Le Bulletin du Muséum national d’Histoire naturelle, revue bimestrielle, paraît depuis

1895 et publie des travaux originaux relatifs aux diverses branches de la Science.

Les tomes 1 à 34 (1895-1928), constituant la l re série, et les tomes 1 à 42 (1929-1970),

constituant la 2 e série, étaient formés de fascicules regroupant des articles divers.

A partir de 1971, le Bulletin 3 e série est divisé en six sections (Zoologie — Botanique —

Sciences de la Terre — Sciences de l’Homme — Sciences physico-chimiques — Écologie

générale) et les articles paraissent, en principe, par fascicules séparés.

S’adresser :

— pour les échanges, à la Bibliothèque centrale du Muséum national d’His¬

toire naturelle, 38, rue Geoffroy-Saint-Hilaire, 75005 Paris (C.C.P.,

Paris 9062-62) ;

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International Standard Serial Number (ISSN) : 0027-4070.

BULLETIN DU MUSÉUM NATIONAL D’HISTOIRE NATURELLE

3 e série, n° 424, novembre-décembre 1976, Sciences physico-chimiques 11

Application de la RMN du Carbone-13 à la détermination

de la biosynthèse d’un métabolite des Champignons :

l’acide spiculisporique

par Bernard Bodo, Marcel Massias, Lucie Molho, Darius Molho et Suzanne Combrisson *

Abstract. — 13 C NM R spectra of spiculisporic acid enriched with [1- 13 C] and [2- 13 C] sodium

acetate by the fungus Pénicillium funiculosum, atypic, show its biosynthetic origin from conden¬

sation of lauric acid produced by the acetate-polymalonate pathway and a-ketoglutaric acid

related to the tricarboxvlic cycle.

On connaît chez les Lichens et les Champignons un groupe d’acides aliphatiques dont

la structure est caractérisée par une longue chaîne alkyle reliée à une plus courte portant

plusieurs fonctions carboxyliques. Ces dernières peuvent, dans certains cas, être sous la

forme d’esters internes pour former des y Jactones. On peut citer, comme exemples-types,

l’acide décyl-citrique 1, métabolite de Champignons, et l’acide protolichestérinique 2 pro¬

duit par divers Lichens du genre Cetraria.

CH^—(CHjlj

COOH CHj-COOH

\ P

HC-ÇHOH

/ \

^.CR, COOH

COOH CH,

\ Il

HC-C

/ \

CHj-lCH^^O'

D’après la structure qui a été assignée à ces composés, il est possible d’interpréter leur

biogenèse en admettant la condensation d’un acide gras à longue chaîne avec une unité,

généralement en C-4, issue du cycle tricarboxvlique.

Ainsi l’acide décyl-citrique 1 dérive d’un point de vue formel de la condensation du

carbonyle de l’acide oxalacétique avec le méthylène en a du carboxyle de l’acide laurique (1).

COOH

' S CH,

CHj— ICH^-J»,

^CH—COOH

COOH

* B. Bodo, M. Massias, L. Molho, D. Molho, Laboratoire de Chimie appliquée aux Corps organisés,

Muséum national d'Histoire naturelle, 63, rue de Bujjon, 75005 Paris.

S. Combrisson, Laboratoire de Chimie organique de l’École supérieure de Physique et Chimie, 10, rue

Vauquelin, 75005 Paris.

424 , 1

B. BODO, M. MASS1AS, L. MOLHO, D. MOLHO ET S. COMBRISSON

La biosynthèse de l’acide protolic lies téri nique 2 a été élucidée par Bloomer et coll.

(2, 3. 4) au moyen de précurseurs radioactifs ( 14 C). Ces auteurs ont montré qu’il était formé

effectivement par condensation d’une molécule d’acide palmitique, issue d'une biosynthèse

acétique-polymalonique, avec une molécule en C-4 (l’acide succinique) issue du cycle tri¬

carboxylique puisque l’acide acétique et l’acide succinique ont été incorporés dans les

positions attendues ; une décarboxylation ultérieure conduit à l’acide protolichestérinique.

CHj-COOH

CHj-lOy^COOH

CH 5 -COOH

CH—COOH

Mais la difficulté d’obtenir des incorporations importantes des précurseurs par les

Lichens, par suite de leur lente croissance, a rendu l’analyse de l’incorporation de l’acide

succinique délicate.

Ce type de biosynthèse, impliquant la condensation d’un acide à longue chaîne linéaire

avec une unité issue du cycle tricarboxylique a été suggéré par Mentzer (5) et démontré

par Tanabe et coll. (6) pour l avénaciolide 3, métabolite d’Aspergillus avenaceus. L’acide

oxo-3 décanoïquc formé par la voie acétique-polymalonique est condensé avec le succinyl-

coenzyme A. Le triacide intermédiaire obtenu est ensuite transformé en avénaciolide 3.

Nous avons examiné la biosynthèse de l’acide spiculisporique 4, métabolite de diffé¬

rents Pénicillium (7, 8, 9) dont P. spiculisporum Lehman et P. funiculosum Thom. atypique.

Cet acide peut être rattaché au groupe de produits naturels que nous venons de décrire,

bien que sa biosynthèse implique la condensation d’un acide gras à longue chaîne avec

cette fois une unité à cinq atomes de carbone — l’acide a cétoglutarique — issue également

du cycle tricarboxylique.

Gatenbeck ( 10 , 11 ) a réalisé une synthèse enzymatique de cet acide à partir de lauryl-

coenzyme A et d’acide a cétoglutarique en utilisant des enzymes extraits de Pénicillium

spiculisporum.

Nous avons étudié celte biosynthèse en suivant l’incorporation d’acide acétique mar¬

qué, par Pénicillium funiculosum atypique, pour former l’acide spiculisporique. Nous

avons choisi de travailler avec un précurseur marqué au Carbone -13 et d’analyser le pro¬

duit formé par la spectrométrie de RMN, ce qui permet de mieux localiser la marque et

d’éviter les opérations de fragmentations chimiques de la molécule inévitables avec le mar-

Biosynthèse de l’acide spiculisporique

quage au carbone -14. Il fallait donc dans un premier temps attribuer chacun des signaux

du spectre de RMN de l’acide spiculisporique naturel aux différents atomes de carbone

de cette molécule. Puis nous avons comparé à ce spectre ceux de l’acide spiculisporique

enrichi en Carbone -13 par les précurseurs marqués.

COOH

Attribution des signaux

L’attribution des signaux du spectre de RMN du C-13 de l’acide spiculisporique naturel

(fig. 1 a) aux différents atomes de carbone de cette molécule est fondée d’une part sur la

comparaison du spectre « ofî-resonance » et du spectre totalement découplé et d’autre part

sur le calcul des déplacements chimiques théoriques des atomes de carbone de la chaîne.

Comme il existait encore des incertitudes pour l'observation et l’attribution des atomes

de carbone du cycle lactonique dont les signaux apparaissent dans des massifs, nous avons

préparé un dérivé de l’acide spiculisporique — l’anhydride correspondant 5 — que nous

avons également analysé en RMN du Carbone -13.

La comparaison des spectres totalement découplés et «ofî-resonance» de l’acide spicu-

lisporique 4 montre que le signal à 13,fl ppm correspond à un méthyle, ceux à 22,0 et

31,2 ppm à deux méthylènes (—C II 2 -), celui à 50,8 ppm à un carbone tertiaire (—CII<)

et ceux à 85,8, 172,0, 173,0 et 175,7 ppm à des carbones quaternaires. Le signal à 85,8 ppm

doit être attribué au carbone -14 qui porte un atome d’oxygène et celui à 175,7 ppm au

carbonylc lactonique. Les atomes de carbone des carbonyles lactoniques apparaissent à

champ plus faible que les carbonyles d’acides (12) dont les déplacements chimiques sont

ici de 172,0 et 173,0 ppm. Les deux massifs situés vers 28 et 29 ppm ne renferment que des

groupes méthylènes.

Nous avons calculé les déplacements théoriques des atomes de carbone de la chaîne

en appliquant la règle de Grant et Paul (13), modifiée par Lin o f.man et Adams (14) qui

permet de calculer « priori le déplacement chimique dans le cas des alcanes. Nous avons

ensuite tenu compte des incréments dus aux substituants. Ces paramètres ont été déter¬

minés par Roberts, Jackman et LIagen (15, 16, 17).

Le déplacement du kième atome de carbone est donné par la relation :

A 0 (k) = B s -f- D m A s „ -f- y s Nk3 -f- As Niy

M==2

ou B s , A sm , y s et As sont des constantes ; N KP est le nombre d’atomes de carbone à P

liaisons du carbone k, I) M est le nombre d’atomes de carbone liés au carbone k.

Le résultat des attributions est consigné dans le tableau T. On observe une bonne

concordance entre les valeurs calculées et les valeurs trouvées expérimentalement.

424 , 2

56 B. BODO, M. MASSIAS, L. MOLHO, D. MOLHO ET S. COMBRISSON

Tableau I. — Valeurs des déplacements chimiques.

Acide spiculisporique 4 Anhydride 5

S ppm 8 ppm

trouvé

calculé

trouvé

C-l

13,9

C-2

22,0

22,6

22,0

C-3

31,2

32,4

31,2

C-4

29,7

C-5 !

C-6

C-7 \

^ 28,9

29,0

30,0

1 28,7

1 28,9

C-8

^ 27,2

30,0

]

C-9

27,9

27,1

C-10

27,6

28,2

23,6

C-ll

50,8

144,4

C-12

173,0

( 165,8

C-13

172,2

1 166,0

C-14

85,8

142,7

C-15

19,4

C-16

31,0

C-17

175,7

172,9

Il est difficile de localiser avec précision, comme on l’a vu, les signaux des atomes de

carbone -15 et -16 de l’acide spiculisporique qui apparaissent dans l’un et l’autre des

massifs à 27 et 29 ppm. Or, il est important de les distinguer pour mesurer leur enrichisse¬

ment lors des expériences de marquage. Dans ce but nous avons transformé l’acide spicu¬

lisporique en l’anhydride correspondant 5 par chauffage vers 175°C sous pression réduite.

COOH

4 5

Le spectre de RMN du Carbone.-13 de cet anhydride 5 (fig. 2) dont les valeurs des

déplacements chimiques sont consignées dans le tableau I met bien en évidence les car¬

bones -15 et -16 à 19,4 et 31,0 ppm respectivement. Les carbones -12 et -13 apparaissent

à 165,8 et 166,0 ppm, positions voisines de celles des carbonyles de l’anhydride maléique

(18) ce qui est en accord avec la structure indiquée pour 5.

Incorporation d’acide acétique marqué : méthode et résultats

Le champignon Pénicillium funiculosum est mis en culture de surface sur un milieu

Czapek-Dox stérile auquel est ajouté le précurseur — acétate de sodium — marqué. La

1. — a. Spectre de RMN du l3 C de l’acide spiculisporique 4 naturel ; b, spectre après incorporation

d’acide acétique marqué sur le carbone -1 (CH 3 - 13 COOH) ; c, spectre après incorporation d’acide acé¬

tique marqué sur le carbone -2 ( 13 CH 3 -COOH).

—OH—CHj-CHj-CHj- CHj—CH- CH

14 .

:H r CH r COOH

J^Lv

VVvJv

BIOSYNTHÈSE DE L’ACIDE SPICULISPORIQUE

culture est poursuivie pendant 15 jours à 24°C, à l’obscurité sans agitation ni aération.

Le mycélium est alors essoré, séché et extrait. L’acide spiculisporique est isolé de l’extrait

brut par chromatographie sur colonne de gel de silice.

Des expériences ont été réalisées en utilisant successivement comme précurseurs

l’acide acétique marqué sur le carbone -1 (CH a - 13 COOH) et sur le carbone -2 ( 13 CH 3 -

C001I). Les spectres de RMN de l'acide spiculisporique obtenu dans chacune de ces expé¬

riences sont représentés respectivement dans les figures 1b et le.

La figure lb (spectre après incorporation de C1 l ;i - 13 COOI!) fait apparaître une augmen¬

tation importante de l’intensité relative des signaux des atomes de carbone -2, 4, 6, 8,

10 et 12 de la chaîne. Le taux d’enrichissement est d’environ 7 %. Le signal dû au car¬

bone -17 est aussi augmenté et de façon sensiblement égale ; en revanche, le signal du

carbone -13 subit un accroissement faible. Ces données impliquent une incorporation du

carbone -1 de l’acide acétique dans ces positions de l’acide spiculisporique.

La figure le (spectre après incorporation de 13 C1 l 3 -COO11 } montre une augmentation

de l’intensité des signaux des atomes de carbone alternants et complémentaires de la chaîne :

on observe, en effet, un accroissement relatif des signaux des atomes de carbone -1, 3, 5,

7, 9, et 11 de la chaîne ainsi que du carbone -14 pour lequel on observe par ailleurs un

couplage (J = 36Hz) avec Je carbone -IL

Ces résultats sont confirmés par l’analyse des spectres de l’anhydride 5 dérivant de

l’acide spiculisporique (fig. 2 b et 2 c). Ces spectres permettent en plus de préciser que le

carboxyle de l'acide acétique ne s’incorpore pas dans les positions -14, 15 et 16. En revanche,

le méthyle de l’acide acétique s’incorpore dans ces positions. En effet, on note un fort

accroissement du signal correspondant au carbone -16 et un plus faible pour les carbones

-14 et 15.

Interprétation et conclusions

L’acide acétique marqué est transformé dans un premier temps en acétyl-coenzyme A

qui intervient aussi bien dans la formation des acides gras que dans le cycle tricarboxylique.

Formation de la chaîne

L'acétyl-coenzyme A initie la chaîne qui

est allongée par du maionyl-coenzyme A, formé

par carboxylation de l’acétyl-coenzyme A. Il se

produit ensuite une décarboxylation et une réduc¬

tion des carbonyles cétoniques (voie acétique-

polymalonique) (schéma 1).

Schéma 1

CH 3 -CH r iCH--CH 2 + n 'CH r COOH

B. BODO, M. MASSIAS, L. MOLHO, D. MOLHO ET S. COMBRISSON

Le fait qu’on observe une marque sur Jes atonies de carbone alternés de la chaîne

indique qu’elle a une origine acétique-polymalonique.

Incorporation de l’acide acétique dans le cycle tricarboxijlique

L’acide acétique, sous la forme d’acétyl-eoenzyme A intervient dans le cycle tricar-

boxylique. En schématisant, dans un premier temps il est condensé avec l’acide oxalacé-

tique pour donner une molécule d’acide citrique, laquelle est oxydée et décarboxylée en

acide x cétoglutarique. 11 faut noter que, malgré la symétrie de la molécule d’acide citrique,

les systèmes enzymatiques qui la transforment en acide a cétoglutarique ne sont pas symé¬

triques et donc que les groupes carboxyles -1 et -5 de cette molécule ne sont pas équi¬

valents. Il en résulte que le carbone -1 de l’acide acétique est incorporé surtout dans le

carbone -5 de l’acide x cétoglutarique.

Les étapes suivantes, en revanche, forment successivement de l’acide succinique puis

l’acide oxalacétique. La dissymétrie des unités se perd au niveau de l’acide succinique et

la marque de l'acide acétique se disperse comme cela est indiqué dans le schéma simplifié 2.

°CH—COOH

CO-COOH

CH r COOH

°CHr-COOH

.1 .

CHj-COOH

j-COOH

HO-C—COOH

CHr—COOH

Schéma 2

CHj-COOH

CH,

CO—COOH

Les résultats obtenus sont en accord avec cette hypothèse. On observe, en effet, qu’après

incorporation d'acide acétique CLI 3 - 13 COOH, le carbone -17 de l'acide spiculisporique,

issu du carbone -5 de l’acide a cétoglutarique, est marqué de façon notable, alors que le

carbone -13 (issu du carbone -1 de Lacide x cétoglutarique qui ne peut être marqué

qu’après un tour complet du cycle) l’est, mais très faiblement par suite d’une dilution dans

le cycle tricarboxylique.

De même, après incorporation d’acide acétique 13 CH 3 -COOH, on remarque une aug¬

mentation importante du signal du carbone -16 de l’anhydride 5, issu du carbone -4

de l’acide x cétoglutarique et une plus faible pour les carbones -14 et -15 issus des car¬

bones -2 et -3 de l’acide a cétoglutarique. La dissymétrie de l’acide citrique dans son

utilisation est clairement mise en évidence dans cette expérience. De plus, ceci indique

que l’acide x cétoglutarique formé dans le cycle tricarboxylique par condensation d’une

molécule d’acide acétique et d’une molécule d’acide oxalacétique est utilisé, pour l’essen¬

tiel, directement sans qu’il accomplisse plusieurs tours du cycle. Cependant, la faible marque

BIOSYNTHÈSE DE L’ACIDE SPICULISPORIQUE

observée pour les carbones -13, 14 et 15 de l’acide spiculisporique montre qu’une partie

mineure effectue un ou plusieurs tours du cycle.

La jonction des deux unités — acide laurique et acide a cétoglutarique — se mani¬

feste par l’apparition d’un couplage (J = 36Hz) entre Jes atomes de carbone marqués

-11 et -14 lors de l’incorporation d’acide acétique [2- 13 C].

L’acide spiculisporique est donc formé in vivo par condensation d’une molécule d’acide

laurique provenant de la voie acétique-polymalonique et d’une molécule d’acide a céto¬

glutarique synthétisé dans le cycle Iriearboxvlique comme cela est explicité dans le schéma 3.

‘bHj-boOH

Voie acetique-polymaionique

Cycle tricarboxylique

Schéma 3

PARTIE EXPÉRIMENTALE

Une culture de Pénicillium funiculosum Thom. atypique (détermination CBS ; déposé

sous le n° 2101 à la Mycothèque du Muséum national d’Histoire naturelle, Paris) a été

développée sur un milieu Czapek-Dox, en fioles de Roux contenant chacune 180 cm 3 de

milieu, pendant 5 jours à 24°C, sans agitation et à l’obscurité. On ajoute alors une solution

aqueuse, stérile d'acétate de sodium marqué au Carbone-13 (100 mg d’acétate par fiole).

On laisse la culture se poursuivre pendant 15 jours dans les mêmes conditions. Le mycé¬

lium est ensuite essoré et séché, et extrait en continu par de l'éther. Le milieu de culture

est par ailleurs acidifié et extrait plusieurs fois à l’éther. Les solutions éthérées sont ras¬

semblées et concentrées. Le résidu obtenu est chromatographié sur colonne de gel de silice

avec comme éluant le mélange benzène-dioxanne-acide acétique (45/12,5/2). L’acide spicu¬

lisporique obtenu est cristallisé dans un mélange acide acétique-cau (50/50) puis dans

l’eau [Fusion = 145°C, Litt. : F — 145°C ( 7 )], L’identité du produit isolé avec l’acide

spiculisporique a été vérifiée par l’analyse de ses spectres de RMN du proton, d’absorption

dans l’infrarouge et de masse.

Les spectres de RMN du Carbone -13 ont été enregistrés pour des solutions dans le

diméthylsulfoxydc (D6) sur un spectrographe Varian XL 100. Les déplacements chimiques

sont exprimés en ppm (S), le tétraméthylsilane étant pris comme référence interne.

B. BODO, M. MASSIAS, L. MOLHO, D. MOLHO ET S. COMBRISSON

Formation de F anhydride décyl-h ( carhoxy-2 éthyl )-3 maléique 5

58 mg d’acide spiculisporique sont chauffés vers 175°C, sous 5 mm de pression pendant

30 mn. On recueille un liquide visqueux (44 mg). Ses caractéristiques spectrales conduisent

à attribuer à ce composé la structure 5.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

1. W. B. Turner, Fungal métabolites, Academie Press, New York and London, 1971.

2. J. L. Bi.oomer, W. R. Edek et \V. F. Hoffman, Chem. Cornm., 1968 : 354.

3. J. L. Bi.oomer et W. F. Hoffman, Tetrahedron Le.tt,, 1969 : 4339.

4. J. L. Bloomer, W. R. Edeh et W. F. Hoffman, chern. Son (C), 1970 : 1848.

5. C. Mentzer, Comparative phytochemistry, ed. T. Swain, Academie Press, 1966 : 26.

6. M. Tanabf,, 'I'. IIamasaki, Y. Suzuki et L. F. .Johnson, Chem. Comm., 1973 : 212.

7. P. W. Cli tterbi ck, H. Raistrick et M. L. Rintoul, Phil. Trans. r. Sor. London, 1931,

220 B : 301.

8. A. E. Oxford et II. Raistrick, Biochem. .J., 1934, 28 : 828.

9. M. Asano et S. Kameda, ./. pharm. Soe. Japon, 1941, 61 : 80.

10. S. Gatenbeck et A. Mahlen, Antibiot. Advan. Iles. Prod. Clin. Use, Prague, 1964 : 540 ;

Chem Abstr., 1967, 66 : 44470 v.

11. S. Gatenbeck et A. Mahlen, Acta (lient, scand., 1968, 22 : 2613.

12. G. C. L evy et G. L. Nei.son, Carbon-13 nuclcar magnetic résonance for organic chemists,

Wiley-interscience. N. Y., London, 1972.

13. D. M. Grant et .T. Paul, J. ont. chem. Soc., 1964, 86 : 2984.

14. L. P. Lindeman et J. Q. Adams, Analyl. Chem., 1971, 43 : 1245.

15. J. D. Roberts, F. J. Weigert, J. I. Krosciiwitz et II. .1. Reich, J. am. chem. Soc., 1970,

92 : 1338.

16. L. M. Jackman et D. P. Kelly, ./. chem Soc. (B), 1970 : 102.

17. R. IIagf.n et J. D. Roberts, J. am. chem. Soc., 1969, 91 : 4504.

18. L. F. .Johnson et W. C. Jankoavski, Carbon-13 NMR Spectra, Wiley-interscience, N. Y.,

London, 1972.

Manuscrit déposé le 19 juillet 1976.

Bull. Mus. natn. Ilist. nat., Paris, 3 e sér., nov.-déc. 1976, n° 424,

Sciences physico-chimiques 11 : 53-62.

Achevé d’imprimer le 28 février 1977.

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6 564 004 5

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qués devront être préparés de façon à pouvoir être clichés comme une figure.

Les références bibliographiques apparaîtront selon les modèles suivants :

Bauchot, M.-L., J. Daget, J.-C. Hureau et Th. Monod, 1970. — Le problème des

« auteurs secondaires » en taxionomie. Bull. Mus. Hist. nat., Paris, 2 e sér., 42 (2) : 301-304.

Tinbergen, N., 1952. — The study of instinct. Oxford, Clarendon Press, 228 p.

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