BULLETIN

MUSÉUM NATIONAL D’HISTOIRE NATURELLE

57, rue Cuvier, 75005 Paris

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Secrétaire de rédaction : M me I’. Dupérier.

Conseiller pour l’illustration : Dr. N. Halle.

Le Bulletin du Muséum national d’Ilistoire naturelle, revue bimestrielle, paraît depuis

1895 et publie des travaux originaux relatifs aux diverses branches de la Science.

Les tomes 1 à 34 (1895-1928), constituant la l re série, et les tomes 35 à 42 (1929-1970),

constituant la 2 e série, étaient formés de fascicules regroupant des articles divers.

A partir de 1971, le Bulletin 3 e série est divisé en six sections (Zoologie — Botanique —

Sciences de la 3’erre — Sciences de l’Homme — Sciences physico-chimiques — Écologie

générale) et les articles paraissent, en principe, par fascicules séparés.

S’adresser :

— pour les échanges, à la Bibliothèque centrale du Muséum national d’His¬

toire naturelle, 38, rue Geoffroy-Saint-Hilaire, 75005 Paris (C.C.P.,

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36, rue Geoffroy-Saint-Hilaire, 75005 Paris (C.C.P., Paris 17591-12 —

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International Standard Serial Number (ISSN) : 0027-4070,

BULLETIN DU MUSÉUM NATIONAL D’HISTOIRE NATURELLE

3 e série, n° 177, juillet-août 1973, Sciences physico-chimiques 2

Biosynthèse et iodation des protéines thyroïdiennes

chez quelques Vertébrés inférieurs.

Sur l’existence de différences spécifiques

des thyroglobulines 1

par Andrée Brisson *

Abstract. Molecular organisation, ami no acid composition, biosyril hesis and iodination

of the major thyroid protein, the thyroglobulin, front various lower Vcrtebrat.es were studied.

The results filted in « il h the hypothesis of Üie homologv of this iodoprotein throughout ail classes

of Vertebral.es ; howevcr, they pointed ont sonie interspecies différences in the primary structure

and physicochemical propertîes (sédimentation coefficient) of this macromolecule. On the other

hand, the optimal biosynthesis of the thyroglobulin seemed to be in relation with the zone of

thermal tolérance of each species studied.

SOMMAIRE

Introduction. 3

Matériel et techniques . 5

I. Mise en évidence des iodoprotéines solubles thyroïdiennes chez diverses espè¬

ces de Vertébrés inférieurs . 13

A. — Caractérisation des iodoprotéines thyroïdiennes solubles et nomencla¬

ture . 15

B. — Proportions relatives des iodoprotéines thyroïdiennes solubles. Taux

d’iodation moyen de ces protéines. 18

Discussion. 22

II. Biosynthèse in vitro des protéines thyroïdiennes chez différentes espèces de

Poissons . 26

A. — Etude qualitative des protéines solubles synthétisées in vitro dans la

thyroïde des Poissons. 27

B. — Influence de la température d’incubation sur la biosynthèse des pro¬

téines thyroïdiennes. 32

Discussion. 43

1. Thèse de doctorat ès Sciences naturelles, soutenue le 15 janvier 1973 à Paris.

* Laboratoire de Physiologie générale et comparée, Muséum national d'Histoire naturelle ; Laboratoire

d’Endocrinologie comparée associé au CNRS, 7, rue Cuvier, 75005 Paris.

177, 1

ANDRÉE BRISSON

III. Iodation in vivo des protéines thyroïdiennes. 49

A. — Mise en évidence de l’hétérogénéité d’iodation au sein de la thyroglobu¬

line TG 2 et du polymère TG 4 . 50

B. — Hétérogénéité du renouvellement de l’iode dans les iodoprotéines thy¬

roïdiennes . 53

C. — Hétérogénéité d’iodation et stabilité de la structure quaternaire de la

thyroglobuline TG 2 . 58

Discussion. 66

IV. Différences structurales interspécifiques des thyroglobui.ines et aspect

ÉVOLUTIF. . 72

A. — Mise en évidence des variations interspécifiques des coefficients de

sédimentation des protéines thyroïdiennes chez les Poissons. 74

B. — Iodation et variations interspécifiques du coefficient de sédimenta¬

tion de la thyroglobuline. 78

C. — Composition en acides aminés des thyroglobulines de diverses espèces de

Poissons . 81

Discussion. 89

Conclusions générales. 93

Références bibliographiques. 97

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

INTRODUCTION

L’homologie, au sens donné par Florkin (1962), de la fonction thyroïdienne dans la

série phylétique des Vertébrés est établie grâce à divers critères d’ordre embryologique,

morphologique et biochimique.

Le développement de la thyroïde à partir d’un diverticule du plancher du pharynx

est uniforme chez les Vertébrés. Quel que soit l’aspect général ou l’état de dispersion de

la thyroïde, la structure folliculaire de cette glande est mise en évidence à partir des Agna-

thes adultes (Egoert, 1938 ; Fontaine et al., 1952) jusqu’aux Mammifères, et constitue

l’unité morphologique de base de la thyroïde. Les hormones thyroïdiennes 3,5,3'-triiodo-

thyronine et 3,5,3,5'-tétraiodothyronine ou thyroxine sont identifiées dans l’ensemble du

phylum des Chordés, mais ne semblent pas exister en dehors de celui-ci (voir mises au

point Leloup, 1964a, et Salvatore, 1969).

Phylum des chordés

Chordés

Urochordés (ex : Ascidie)

Céphalochordés (ex : Amphioxm)

Vertébrés ( Agnathes : Cyclostomes

( Gnathostomes Chondrichthyens

Ostéichthyens

Amphibiens

Reptiles

Oiseaux

Mammifères

Bien que les hormones thyroïdiennes soient mises en évidence dans l’endostyle des

Céphalochordés (Barrington, 1959) et dans la tunique des Urochordés (voir mise au point

Salvatore, 1969), ces structures, contrairement à la glande sous-pharyngienne des larves

d’Agnathes, ne. peuvent être considérées comme homologues de la thyroïde des Verté¬

brés.

La biosynthèse des iodothyronines n’est pas nécessairement liée à la structure follicu¬

laire thyroïdienne, puisque celle-ci n’est pas observée chez les Céphalochordés, les Uro¬

chordés et les larves d’Agnathes. Elle aurait donc précédé dans l’évolution l’apparition

de cette structure folliculaire.

Cependant, le fait même de l’existence des hormones thyroïdiennes chez tous les Chor¬

dés implique-t-il une identité dans les processus de formation des iodothyronines dans

ce phylum ?

Les diverses étapes du métabolisme iodé intrathyroïdien sont assez bien connues chez

les Mammifères (Pitt-Rivers et Cavalieri, 1964). La biogenèse hormonale est le résultat

ANDRÉE BRISSON

d’une chaîne de réactions biochimiques qui comprend la concentration de l’iodure, son

oxydation et sa substitution sur les restes de tyrosine d’une glycoprotéine spécifique, la

thyroglobuline, et surtout la condensation de deux iodotvrosines en iodothyronines selon

un processus encore hypothétique,

La thyroglobuline, principal constituant protéique de la thyroïde des Mammifères,

renferme, sous forme d’iodotyrosines et d’iodothyronines, la majeure partie de l’iode de

la glande. De nombreuses recherches ont porté sur la structure (Edelhoch et Rall, 1964 ;

Edelhoch, 1965), sur la biosynthèse et l’iodation de cette protéine (Seed et Goldberg,

1963 : Lissitzky et al., 1964 ; Nünez et al., 1965a), ainsi que sur la régulation de ces deux

processus biochimiques par l’hormone thyréotrope (voir mises au point Nunez, 1968 ;

Rappaport, 1970).

La structure de la thyroglobuline, dans laquelle 30 % de l’iode environ sont sous forme

de thyroxine, joue vraisemblablement un rôle dans la biogenèse, hormonale. Roche (1950),

Roche et Michel (1955), Roche et al. (1963) ont suggéré que l’absence d’iodothyronine

dans les scléroprotéines iodées des invertébrés pouvait résulter de la structure fibreuse

de ces protéines, qui est défavorable au rapprochement des résidus d’iodotyrosine, indis¬

pensable à la formation des hormones thyroïdiennes.

Iri vitro, l’iodation chimique (Roche, 1950) ou enzymatique (Taurog et Howells,

1966 ; Coval et Taurog, 1967 ; Pkrlman et Edelhoch, 1967 ; Taubog, 1970) de diverses

protéines conduit à la formation de thyroxine. Mais pour obtenir une quantité importante

d’iodothyronine, il semble que les protéines à ioder doivent présenter un poids moléculaire

élevé, supérieur à 300 000 ; en outre, le rendement en thyroxine est plus élevé dans le cas

de la thyroglobuline que dans celui des autres protéines (Taurog, 1970).

Chez les Vertébrés inférieurs, grâce à l’utilisation des isotopes radioactifs, le métabo¬

lisme de l’iode a été bien étudié (voir mises au point Berg étal., 1959 ; Leloup et Fontaine,

1960 ; Dodd et Matty, 1964). Chez tous les Vertébrés, la biosynthèse hormonale semble

procéder selon un schéma similaire, mais plus lentement chez les Vertébrés inférieurs et à

des vitesses très variables selon l’espèce et la température à laquelle vit l’animal. Elle est

en effet contrôlée, comme chez les Mammifères, par l’hormone thyréotrope (voir mise au

point Gorbman, 1969), mais est aussi soumise à l’influence des variations du milieu envi¬

ronnant.

Ces données suggéraient implicitement la présence dans la thyroïde des Vertébrés

inférieurs d’une protéine iodée similaire ou identique à la thyroglobuline des Mammifères,

mais aucune étude n’avait porté sur les protéines thyroïdiennes des Vertébrés inférieurs

au moment où ce travail a été entrepris.

En premier lieu, nous nous sommes proposée de caractériser les protéines thyroïdiennes

chez diverses espèces de Vertébrés inférieurs, représentant un éventail zoologique assez

large et dont la physiologie constitue depuis longtemps un sujet de recherches permanentes

en laboratoire.

Puis, nous avons étudié, chez divers Poissons, la biosynthèse et les processus d’halo¬

génation des protéines thyroïdiennes avant de pouvoir envisager le problème de leur régu¬

lation par l’hormone thyréotrope.

Au cours de ces recherches, nous avons été amenée à mettre en évidence l’existence

de certaines différences spécifiques entre les protéines thyroïdiennes des divers Vertébrés

considérés.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

MATÉRIEL ET TECHNIQUES

I. Matériel

La liste taxinomique des espèces de Vertébrés inférieurs étudiés est donnée dans le tableau I.

L’expérimentation a porté principalement sur des Poissons présentant des conditions physio-

écologiques bien différentes et variables au cours du cycle vital, qui ont fait antérieurement l’objet

de nombreuses études en laboratoire.

Nous rappellerons les principales étapes du cycle migratoire du Saumon atlantique. Les jeunes

Saumons, de parrs se transforment en parr-smolts puis en smolts et effectuent alors leur migration

catadrome (vers la mer:. Après leur période d’engraissement en mer, ils effectuent la migration

anadrome de reproduction. Ils sont désignés sous les termes de. Saumon de montée quand ils sont

capturés au printemps dans les parties basses de l’Adour, puis de Saumons de frayères quand ils

sont pècliés en hiver sur les lieux mêmes de reproduction. A la lin de la fraye, le Saumon succombe

ou reprend une robe argentée ; dans ce dernier cas il est nommé Mended et entreprend sa seconde

migration catadrome.

Tableau I. —- Liste taxinomique et origine des animaux étudiés.

Classes

Noms taxinomiques Noms communs

Origines

GÉOGRA PtlIQU ES

Cyclostomes

Chondrtchthyens

OsTÉICHTHYENS

s/classe : Dipneustes

s/classe : Actinoptérygiens

Sup. O. Téléostéens

O Clupéiformes

O. Anguilliformes

Reptiles

Sup. O. Chéloniens

Sup. O. Lépidosauriens

s/O. Lacertiliens

s/O. Ophidiens

Sup. O. Archosauriens

O. Crocodiliens

Petromyzon marinus L. Lamproie marine

Scyliorhinus canicula L. Petite Roussette

Protopterus annectens Ow. Protoptère

Loire, en migra¬

tion anadrome

reproductrice

Manche et Médi¬

terranée

Tchad

Salmo salar L.

Salrno trutta L.

Salmo gairdnerii Rich

Anguilla anguilla L.

Testudo radiata Shaw

Saumon atlantique

Truite de mer

Truite de rivière

Anguille européenne

Tortue terrestre

Adour, en migra¬

tion anadrome,

catadrome et

phase reproduc¬

trice

Adour, en migra¬

tion anadrome

Pisciculture Gra-

tereau

Somme

Madagascar

Uromastix acanlhinurus

Bell

Python sehae (Gmelin)

Crocodilus niloticus Laur.

Fouette-queue

Python

Crocodile

Algérie

Congo

Égypte

ANDRÉE BUISSON

II. Processus expérimental

A. — Méthodes de marquage des protéines

1. Expériences effectuées in vivo

Les animaux sont sacrifiés à des temps variables après injection dans la cavité générale

de 131 I ou 125 I (0,1 à 1 mC selon la taille des individus et l’isotope utilisé).

Après saignée des animaux, les thyroïdes ou nodules thyroïdiens sont rapidement prélevés

et pesés. I.a thyroïde de la plupart des Téléostéens se disperse en nodules répartis autour de l’aorte

ventrale et à proximité des bifurcations des artères branchiales. Les régions thyroïdiennes sont

utilisées dans le cas de la Lamproie chez laquelle les follicules thyroïdiens sont disséminés dans

les tissus adjacents, sans constituer de nodules.

2. Expériences effectuées in vitro

Les thyroïdes sont, prélevées à 5°C, coupées, rincées dans le milieu d’incubation préalablement

oxygéné, puis épongées sur du papier Joseph avant d’être pesées cl réparties en lots homogènes

d’environ 50 mg.

Chaque lot est incubé à l’aide d’un appareil Gilson ou DubnolT, sous agitation continue, en

atmosphère de carbogène (95 % 0 2 ; 5 % C0 2 ) dans 1 ml de milieu en présence de 200 à 600 p.C

de tyrosine tritiée selon l’activité spécifique de cet. acide aminé (0,4 à 32 C/mmole) ou de 100 à

200 |xC de l25 I, à diverses températures et pendant des temps variables de 2, 6 ou 24 h.

La composition saline du sérum des Téléostéens étant très similaire à celle du sérum des Mam¬

mifères (Fiei.d et al., 1943; Phillips et al., 1957), les solutions salines de type rnammalien con¬

viennent très bien à la culture des cellules de Poissons (Wolf, 1963). Au contraire, les milieux

hypotoniques utilisés pour les cellules des Ampliibiens sont déconseillés.

Le milieu de Campagne et Grftber (1962) a été utilisé pour incuber les thyroïdes des Mammi¬

fères (Nunez et al., 1964).

A titre de comparaison, nous avons incubé des nodules thyroïdiens de Saumon dans le milieu

rnammalien et dans la solution de Cortland employée pour les cellules des Salmonidés (Phillips

et al., 1957), supplémentée en acides aminés et fumarate dans des proportions identiques au milieu

précédent. Les résultats obtenus dans ces deux milieux sont similaires.

Le milieu de Campagne et Grüber a ensuite été choisi, puisque les solutions de type rnammalien

conviennent aussi à la survie des cellules de Reptiles (Stephenson, 1966). Il est additionné d’urée

et de NaÇI dans le cas de thyroïde de Chondrichthyens (Lockwood. 1961). Comme nous le verrons

dans la seconde partie, la structure folliculaire des thyroïdes de Poissons est bien conservée après

24 h d’incubation à 20°C dans le milieu de Campagne et Grüber (fig. 9-10'.

Dans certains cas, des antithyroïdiens, perehlorate de sodium et propyltliiouraeile, sont ajou¬

tés dans le milieu d’incubation, aux concentrations respectives de 2 et 1 tnM.

B. — Préparation des protéines solubles

Les diverses manipulations sont effectuées à basse température (5°C).

1. Expériences effectuées in vivo

Les thyroïdes sont broyées à l’aide d’un homogénéiseur de Potter dans un faible volume d’un

tampon phosphate standard (pH 7,4; 0,02M Na 2 HPG 4 ; 0,1M NaCl ; p. 0,15) la concentration

finale étant de 5 à 10 % (poids de tissu frais/volume).

biosynthf.se et iodation des protéines thyroïdiennes

Les régions thyroïdiennes sont broyées dans un plus grand volume de tampon ; 90 % de la

radioactivité sont alors extraits.

L’hornogénat thyroïdien est centrifugé à 100 000 g pendant 1 h (rotor 40/2) afin d’éliminer

les particules. Le surnageant est ensuite analysé.

2. Expériences effectuées in vitro

A la fin de l’incubation, le tissu thyroïdien est homogénéisé dans le milieu d’incubation. Une

partie aliquote de l’hOmogénat thyroïdien est chromatographiée sur papier en butanol - acide

acétique - eau (78-5-17 v/v) afin de déterminer les pourcentages d’incorporation des traceurs

dans les glandes.

L’excès de 3 H-Tyr ou de I25 I est éliminé par dialyse prolongée (24 h) contre 2 à 3 X 1 litre

de tampon phosphate (pH 7,4; fi 0,15). La chromatographie d’une partie aliquote de l’homogénat

thyroïdien dialysé permet de vérifier l’élimination des marqueurs.

Le dialysat est ensuite centrifugé à 100 000 g pendant 1 h. Les protéines solubles marquées

du surnageant sont analysées. Les protéines particulaires contenues dans le culot ne sont pas étu¬

diées.

III. M ÉTHODES ANALYTIQUES

1. Ultracentrifugation en gradient linéaire de saccharose

Les extraits thyroïdiens solubles sont analysés selon la technique de Martin et Ames (1961).

Les solutions de saccharose sont préparées dans le tampon phosphate précité (pIT 7,4 ;

B = 0,15).

Les caractéristiques des gradients linéaires de saccharose et les conditions d’ultracentrifuga¬

tion (ultracentrifugeuses Spinco L 50 et I. 2 65 B) sont données dans le tableau II pour chaque, type

de rotor utilisé. Les rotors SW 39, SW 50, SW 65 et SW 41 ont été successivement employés. Les

meilleurs pouvoirs de. résolution des centrifugations sont obtenus avec les deux derniers types

de rotor, La température de centrifugation est de 5°C en général.

A la fin de la centrifugation, les gradients de densité sont fractionnés selon la technique décrite

par Martin et Ames (1961). Les fractions sont recueillies dans des tubes ou sur des rectangles

de papier Whatman n° 3 (3 X 6 cm) si les protéines sont marquées par le tritium. Les mesures

de radioactivité et/ou les dosages de protéines (Lovvry et al., 1951) sont effectués dans chaque

fraction.

Tableau IL — Caractéristiques des gradients linéaires de saccharose. Conditions d’ultra-cen-

trifugation dans les différents types de rotors utilisés (ultracentrifugeuses Spinco L50 et

L 2 65 B).

Rotors

Concentrations

EXTRÊMES

EN SACCHAROSE

Volume total

DES GRADIENTS

(ml)

Extrait

DÉPOSÉ SUR LE

gradient (ml)

Vitesses

(tpm)

Durée

(h)

Volume

DES FRAC¬

TIONS (ml)

SW 39

5-20 %

4,6

0,1

38 000

5 h 30

0,09 à 0,13

SW 50

5-20 %

4,6

0,1

48 000

3 h 45

0,09 à 0,13

SW 65

5-20 %

4,6

0,1

65 000

2 h 15

0,09 à 0,13

SW 41

7-24 %

11,0

0,1-0,2

41 000

7 à 8

0,23

ANDRÉE BRISSON

Détermination des coefficients de sédimentation

La technique 8e Martin et Ames permet d’évaluer indirectement le coefficient de sédimen¬

tation d’une protéine à partir de celui d’une protéine référence dont le coefficient de sédimenta¬

tion est connu.

Toutefois, pour déterminer plus précisément ce paramètre, il est nécessaire d’utiliser la tech¬

nique du « standard interne » (Lachiver et al., 1966). Un mélange de la protéine référence (20 (il)

et de l’extrait thyroïdien à analyser (89p.l) est délicatement déposé sur le gradient linéaire de sac¬

charose, puis centrifugé. Ainsi, les protéines référence et à étudier sont centrifugées dans des con¬

ditions rigoureusement identiques.

La protéine référence est marquée par l'un des isotopes de l’iode ,3l l ou l25 I. Les protéines

référence et à analyser sont identifiées par les mesures des isotopes radioactifs qui les marquent

respectivement. La protéine à analyser peut être également identifiée par le dosage desp rotéines

selon Loavry et al, (1951).

Références

Lors de nos premières expériences, la thyroglobuline de Rat marquée in vivo par 131 1 ou 125 I

a été utilisée comme référence (Lachiver et al., 1965). Mais ultérieurement, après avoir constaté

que le coefficient de la thyroglobuline de Rat varie sensiblement avec son taux d’iodation et la

teneur en iode du régime alimentaire (Lachiver et al., 1966), nous avons adopté comme terme

de référence la valeur 19 S pour la thyroglobuline de Mouton et de Bœuf (Edpi.hocit et R ali ,

1964).

Fig. 1. — Ultracentrifugation en gradient de saccharose

de la thyroglobuline purifiée de Boeuf marquée in vitro par la5 7.

500 mg de thyroïde de Bœuf sont incubés en présence de 500 pC de 125 1. Ultracentrifugation à 65 000 tpm.

Ordonnées : l25 I exprimé en pour cent de la radioactivité totale déposée sur le gradient. Protéines

pg, dosées selon Lownv et al. (1951). Abscisses : Nombre de fractions recueillies.

O : sommet du gradient ; F : fond.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

Ces préparations de thyroglobuline sont réalisées en incubant des coupes de thyroïde de Mou¬

ton ou de Bœuf dans un milieu de Campagne et Griiber (1962) en présence de 131 I ou 125 I. Les

homogénals thyroïdiens sout ensuite purifiés par relargage au sulfate d'ammonium entre 1,4 et

2 M, à 5°C (fig. 1). Dans ces préparations, le pic de radioactivité et celui de densité optique déter¬

miné selon Lovvry et al., coïncident exactement (fig. J). La protéine référence ainsi purifiée doit

présenter une radioactivité spécifique élevée (5 à 10 000 cpm/p.g protéine) de façon à ce que la

quantité de protéine ajoutée comme standard interne soit négligeable comparativement à la

quantité de matériel protéique analysé.

Calcul Au coefficient de sédimentation

Dans les gradients linéaires de saccharose, il existe une relation linéaire entre le coefficient

de sédimentation et la distance parcourue par les macromolécules.

Si Sj et S 2 sont les coefficients de sédimentation de la protéine référence et de la protéine

à analyser et x x et x 2 les distances parcourues respectivement par ces deux protéines, nous avons :

S, x

En pratique, nous comptons le nombre de fractions comprises entre l’origine de la migration

des molécules (O) et les sommets respectifs des pics de la protéine standard (n t ) et de la protéine

à étudier (n 2 ). Nous avons :

S 2 = Sj x " a

n i

Lorsque les pics protéiques sont légèrement asymétriques, les sommets de ces pics sont déter¬

minés par l’intersection des droites joignant les différents points des branches ascendante et des¬

cendante de chaque pic.

Quelle que soit la thyroglobuline référence utilisée (Bœuf ou Rat), la valeur de S obtenue pour

la thyroglobuline d’un extrait thyroïdien donné est la même.

En accord avec Inoi e et Taurog (1968), la reproductibilité des valeurs de S obtenues est

de ± 0,1 S.

Pour des protéines de volume spécifique partiel et de forme identique, Svedberg et Pedersen

(1940) ont mis en évidence l’existence d’une relation entre les coefficients de sédimentation et les

masses moléculaires de ces protéines, telle que :

s t /s 2 ^ (MJM*)*/»

où S x et Mi sont respectivement le coefficient de sédimentation et la masse moléculaire d’une pro¬

téine référence et S 2 et M s , ces mêmes paramètres pour une protéine inconnue.

La détermination du coefficient de sédimentation S 2 de cette dernière permet donc de calculer

son poids moléculaire approximatif.

2. Radioisotopes utilisés. Méthodes de comptage

a — Iode radioactif : 131 1 et 125 1

Deux isotopes radioactifs de l’iode sont utilisés : 181 1 : période de 8 jours, rayonnement y de

360 Kev : 12S I : période de 57 jours, rayonnement, x de 29 et 32 Kev.

Les mesures de radioactivité sont effectuées dans un compteur à scintillation (cristal puits

INa activé au thallium) muni d’un spectromètre à deux échelles de comptage (Nuclear Chicago-

Ultrascaler II). Les valeurs obtenues pour 125 I sont corrigées de la faible interférence (7 %) du

spectre de 131 1 dans celui de 125 1.

b — Tyrosine tritiée : 3-5 3 H 2 -tyrosine

La tyrosine marquée par le tritium est synthétisée par M. Pommier (CHU Kremlin-Bicêtre)

selon la technique de Nunez et al. (1962).

Les comptages de tritium sont réalisés à l’aide d’un compteur à scintillation liquide à trois

canaux (Nuclear Chicago n° 725 ou Intertechnique SL 40).

ANDRÉE BRISSON

Pour des mesures d’activité relative, les échantillons sont déposés sur des rectangles de papier

Whatman 3 MM imhibé de mélange scintillant (Nunez et Jacquemin, 1901). Le rendement du

comptage atteint respectivement 10 et 20 % avec ces compteurs.

Pour les mesures d’activité absolue, les échantillons sont précipités par l’acide trichloracétique

(Allen et Sc.hweet, 1962), puis dissous dans 1 ml de « Soluène » (Packard). Après hydrolyse à

50°C, on ajoute 50 pi de CH a COOH, puis 15 ml de mélange scintillant (PPO + POPOP). La cor¬

rection d’absorption est effectuée par la méthode du standard externe. Les résultats sont exprimés

en désintégrations par minute.

e — Iode radioactif ( vi:, lJ cl tritium ( 3 IIJ

Lorsque ces isotopes sont, contenus dans un mélange, leurs spectres d’énergie ne pouvant être

séparés, l'iode est d'abord mesuré seul dans le compteur y. Puis les comptages en scintillation

liquide, qui correspondent au rayonnement 3 H et à l’interférence de 125 I (80 %) sont effectués.

Afin de diminuer la valeur de la correction, des activités en 3 H très supérieures à celles du 125 I

sont déposées sur le gradient.

3. Dosages de l’iode 127 I et des protéines

Après ultracentrifugation en gradient de saccharose des extraits thyroïdiens, les dosages de

127 I et des protéines sont réalisés à l’aide de l’autoanalyseur Technicon, dans chaque fraction recueil¬

lie.

a — Iode 127 /

L’iode stable est dosé, selon la méthode classique au sulfate cérique après minéralisation

en milieu acide des substances organiques (Foissac, 1964).

La sensibilité des mesures permet de doser 0,5 à 1 pg de 127 1 %.

b — Protéines

Le dosage des protéines, selon la technique de Folin-Lowry (Lowry et al., 1951) a été adapté

à l’emploi de l’autoanalyseur (Lachiver, sous presse). L’étalonnage est réalisé à l’aide d’une thy¬

roglobuline de Bœuf purifiée par relargage au sulfate d’ammonium et filtration sur Sépharose

6 B.

La limite de sensibilité du dosage est de 0,5 à 1 pg de protéine par ml.

Les récupérations sur la totalité des gradients sont de l’ordre de 90 à 95 %, tant pour les pro¬

téines que pour l’iode 127 1.

Ces dosages permettent de déterminer les taux d’iodation des protéines au niveau de chaque

fraction du gradient.

127 j

Auparavant, il a été vérifié que le rapport -^ — est sensiblement constant pour une

gamme étendue de concentration en thyroglobuline de Bœuf allant de 5 à 100 pg de protéines/ml.

Par ailleurs, les courbes d’étalonnage des thyroglobulines des diverses espèces de Poissons étudiées

et celles de Bœuf sont superposables.

4. Détermination de la composition en acides aminés des thyroglobulines

Les thyroglobulines de diverses espèces de Poissons sont préalablement purifiées avant de

déterminer leurs compositions en acides aminés.

Les hydrolyses de quelques centaines de pg (250 à 1 000 pg) de ces thyroglobulines, par HCl

6N, en tube scellé sous atmosphère d’azote, sont conduites pendant 22 h et 48 h à 110°C.

Des essais préliminaires effectués sur la thyroglobuline de Bœuf nous avaient permis de consta¬

ter qu’après 72 h d’hydrolyse les pourcentages de la plupart des acides aminés étaient inférieurs

à ceux obtenus après 22 et 48 h d’hydrolyse.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

La composition en acides aminés des hydrolysats est déterminée selon Moore et al, (1958)

à l’aide de l’autoanalyseur Beclunan (modèle 120 B). La cystine et la valine sont totalement sépa¬

rées. Pour chaque préparation de thyroglobuline purifiée, les analyses sont réalisées au minimum

en double pour chaque temps d’hydrolyse.

La précision du dosage, évaluée sur un grand nombre de mesures réalisées sur mélange étalon,

est de î 2 %.

IV. Méthodes préparatives : purification des thyroglobui.ines

La rareté du matériel à analyser nous a conduite à choisir des méthodes de purification effi¬

caces et présentant un rendement assez élevé.

A. — Ultracentrifugation préparative en gradient de saccharose 5-20 %

Réalisée avec le rotor SW 25-1 pendant 23 h à 25 000 tpm (Sai.vatorf. et al., 1964), elle est

utilisée pour purifier de petites quantités de protéine. Sur chacun des trois tubes de centrifugation,

1 ml d’extrait thyroïdien, marqué par l’iode radioactif, contenant environ 10 mg de protéines,

est déposé. La thyroglobuline est identifiée après mesure de la radioactivité dans chaque fraction

des gradients. Le rendement de cette technique atteint 70 % environ.

B. — Filtration sur gel Sépharose 6B

Elle permet de purifier 100 à 200 mg de protéines en une seule opération. Le gel, mis en sus¬

pension dans l’eau distillée, est versé dans des colonnes dont les dimensions sont choisies en fonc¬

tion de la quantité de matériel à purifier (tabl. III). Abondamment lavé à l’eau distillée, le gel est

ensuite équilibré avec le tampon phosphate (pH 7,4 ; p = 0,15) à 5°C sous légère pression.

Tableau III. — Purification des thyroglobulines par filtration sur gel Sépharose 6 B.

Quantité de protéines

Dimensions des

Extrait thyroï-

Débit (ml/h)

Volume des

FRACTIONS

A PURIFIER (mg)

COLONNES (cm)

DIEN DÉPOSÉ (ml)

(ml)

100 — 200

120 X 2

5 à 10

100

78 X 1

1,5

1,6

1,3

Après dépôt de l’extrait sur les colonnes, l’élution est réalisée dans le même tampon. Les frac¬

tions sont recueillies automatiquement à l’aide d’un collecteur de fraction Beckman LKB. Les

mesures de densité optique à 280 rnp sont effectuées pour chaque fraction. Cette technique permet

de séparer partiellement la thyroglobuline de ses polymères. Le rendement atteint 60 à 70 %.

Dans le cas de ces deux techniques, les fractions correspondant à la thyroglobuline sont réu¬

nies puis relarguées par du sulfate d’ammonium.

L’analyse des préparations de thyroglobuline obtenues est ensuite réalisée (cf. 4 e partie).

ANDREE BRISSON

V. Traitements divers

1. Traitement des extraits thyroïdiens par le dodécyl sulfate de sodium

Le dodécyl sulfate de sodium (SDS) est ajouté aux extraits thyroïdiens solubles, afin d’obtenir

une concentration bnale de 1,5 X 10- 3 M de SDS. Le mélange est laissé 1 h à 20°C. Le rapport :

pg de SDS

pg de protéines totales de l’extrait

est compris entre 0,1 et 0,3. Dans cet intervalle, la dissociation de la thyroglobuline par le SDS

est quasi maximale.

2. Précipitation des protéines par l’acide trichloracétique

La méthode utilisée est celle d’ Allen et Schwef.t (1962). Après incubation des thyroïdes,

des aliquotes de l'homogénat thyroïdien total sont précipitées par l’acide trichloracétique en pré¬

sence de 7 ing de caséine entraîneur. Le culot est lavé deux fois par l’acide trichloracétique. dissous

dans la soude (N), puis précipité à nouveau par l’acide trichloracétique. Le précipité est ensuite

lavé par l’acide trichloracétique, puis par l’alcool, avant d’être dissous dans le « Soluène ».

VI. Produits utilisés

Les produits chimiques courants proviennent de Prolabo, et Touzart et Matignon. Ils sont

tous de pureté maximale (« Pour analyse »). Les acides aminés ont été fournis par Calbiochem et

Prolabo, La provenance des autres substances utilisées est la suivante : Saccharose : Analar ;

Sépharose 6 B : Pharmacia ; Pénicilline et Streptomycine (sulfate) : Laboratoire Spécia ; Soluène :

Packard C° : POPOP (50 mg/1) PPO (4 g/l) : Nuclear Chicago.

125[ e4 isiJ sans entraîneur et sans réducteur ont été fournis par le Commissariat à l’Énergie

atomique.

3 H-Tvr a été gracieusement fournie par le, Dr Nunez, directeur de l’Unité de Recherche

INSERM sur la glande thyroïde et la Régulation Hormonale (CHU Bicêtre).

VIL Abréviations

TG 2 ou TG

thyroglobuline.

TGj, TG 4 , TG 6

iodoprotéines thyroïdiennes apparentées à la thyroglobuline TG a

préTG

préthyroglobuline.

MIT

monoiodotyrosine.

DIT

diiodotyrosirie.

TSH

hormone thyréotrope.

PTU

propylthiouracile.

NaClO.

perchlorate de sodium.

SDS

dodécyl sulfate de sodium.

DPM

désintégrations par minute.

MI-Tyr

tyrosine tritiée en position 3 et 5.

RAS

radioactivité spécifique.

D.O.

densité optique.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

I. MISE EN ÉVIDENCE DES IODOPROTÉINES SOLUBLES THYROÏDIENNES

CHEZ DIVERSES ESPÈCES DE VERTÉBRÉS INFÉRIEURS

La thyroglobuline de poids moléculaire 670 000 et de coefficient de sédimentation

19 S constitue la principale protéine de la thyroïde des Mammifères et renferme 80 % de

l’iode total de la glande (Robbins et Rall, 1960 ; Edei.koch et Rall, 1964).

S il u lm an el al, (1955). Edeliioch (1960), Ui et Tarutani (1961) ont montré que les

extraits thyroïdiens mammalicns, après ultracentrifugation analytique, contiennent plu¬

sieurs constituants protéiques en dehors de la thyroglobuline. En effet, les protéines iodées

purifiées par fractionnement par les sels neutres selon Derrien et al. (1948) se révèlent

hétérogènes en chromatographie sur colonne de diéthylaminoéthyl cellulose (Ingbar et

al., 1959 ; Roche el ai, 1960 ; Sri no, 1961 ; Ut et al., 1961), en électrophorèse sur gel d’ami¬

don (Spiro, 1961) et en électrophorèse sur gel de polyacrylamide (Torhesani et al., 1968a).

Des iodoprotéines thyroïdiennes de poids moléculaire différent de celui de la thyro¬

globuline sont séparables par ultracentrifugation en gradient de saccharose (Fon taine et

Lachiver, 1964 : Salvatore el al., 1964).

Une iodoprotéine 27 S de poids moléculaire double de celui de la TG a été isolée à par¬

tir des glandes de divers Mammifères et caractérisée par Salvatore et al. (1965a). La

similitude de la composition en acides aminés et des propriétés immunochimiques de la

thyroglobuline 19 S et de la 27 S (Carlomagno et al., 1970), ainsi que les expériences de

dissociation de la 27 S (Vecchio el al., 1966a) suggèrent que cette iodoprotéine est un

dimère de la thyroglobuline 19 S.

La présence d’une protéine de vitesse de sédimentation plus élevée ~ 32 S a parfois

été observée (Salvatore et al., 1964 ; Lachiver et al., 1965).

Une iodoprotéine 12 S, de poids moléculaire moitié moindre de celui de la 19 S, a été

mise en évidence, en proportion variable, dans les extraits thyroïdiens de diverses espèces

de Mammifères, en particulier chez le Lérot (Lachiver et Fontaine, 1964) et chez le Cobaye

(Lachiver et al., 1965 ; Salvatore et al., 1965c). L’origine de cette protéine est très contro¬

versée car celle-ci peut correspondre à un précurseur ou à un produit de dissociation de la

thyroglobuline 19 S.

Ces diverses iodoprotéines thyroïdiennes, bien que de poids moléculaire différent,

présentent en commun un certain nombre de propriétés physico-chimiques qui permet

de les distinguer des autres protéines présentes dans les extraits thyroïdiens et susceptibles

de s’ioder, comme l’albumine (Torresani el al., 1968è ; Jonckheer et Karcher, 1971),

ou non, comme l’hémoglobine :

—- les iodoprotéines thyroglobuliniques précipitent dans une zone étroite de concen¬

tration en di\ r ers sels neutres (36 à 41 % de la saturation en sulfate d’ammonium pH 6,9 ;

43 à 48 % du mélange équimoléctilaire des phosphates mono- et dipotassique 3,5 M à 20°C

(Derrien et al., 1948) :

—- elles sont éluées en front de colonne après filtration sur gel Sephadex G 200 ou

sur gel d’Agar (Salvatore et al., 1964) ;

19 S -

Fig. 2. — Ultracentrifugation en gradient de saccharose des protéines solubles marquées in vivo

dans la thyroïde de divers Poissons.

Après dialyse contre tampon phosphate (pH 7,4 ; (X : 0,15), 100 pi île l'extrait thyroïdien marqué par 131 I

et 20 pl d'une solution de 135 I TG de Bœuf (19 S) sont, centrifugés à 5®C, pendant 7 h à 41 000 tpm.

Radioactivité en 1,1 T : exprimée en pour cent, de ta radioactivité déposée sur le gradient.

Abscisses ; nombre de fractions recueillies (20 gouttes).

O : sommet du gradient; F : fond.

Pour chaque espèce, la position de la thyroglobuline de Bœuf 19 S dans le gradient est indiquée

par une llèclie, ainsi que celles des coefficients de sédimentation 12, 27, 32 S.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

— elles présentent une meme composition en acides aminés et contiennent en par¬

ticulier des acides aminés iodés : mono- et diiodotyrosines, et de la thyroxine T 4 .

L’utilisation de divers critères d’identification nous a permis de mettre en évidence,

dans les extraits thyroïdiens de plusieurs Vertébrés inférieurs appartenant à des classes

différentes, la présence d’iodoprotéines thyroglobuliniques analogues à celles existant

dans la thyroïde des Mammifères.

Nous avons étudié la répartition de ces iodoprotéines thyroïdiennes et déterminé le

taux d’iodation de la thyroglobuline chez diverses espèces.

A. — Caractérisation des iodoprotéines thyroïdiennes solubles et nomenclature

1. Ultracentrifugation en gradient de saccharose

Après injection d’iode radioactif quelques heures ou plusieurs jours avant le sacrifice

des animaux, les protéines thyroïdiennes solubles sont analysées par ultracentrifugation

en gradient linéaire de saccharose, La radioactivité, les teneurs en protéines et en 127 1 sont

déterminées dans chaque fraction du gradient. Les coefficients de sédimentation des diverses

protéines séparées sont calculés par rapport à celui d’une thyroglobuline de Bœuf 19 S

purifiée, marquée par 125 I ou 131 I selon l’isotope injecté aux animaux et ajoutée à l’état de

trace à l’extrait analysé.

6,3 S

Fig. 3. — Ultracentrifugation en gradient de saccharose des protéines solubles marquées in vivo

dans la thyroïde de deux Reptiles et d'un Cy clos tome.

L’Uromastix, la Tortue et la Lamproie sont sacrifiés respectivement 4 h, 24 li et 8 jours après l’injection

de 125 1. 80 p.1 de chaque extrait thyroïdien soluble et 20 pi d’une solution de 131 I TC de Bœuf (19 S)

sont centrifugés pendant 3 h 30 à 48 000 tpm. Fractionnement du gradient en 10 gouttes.

ANDRÉE BRISSON

Les profils des gradients obtenus pour diverses espèces de Poissons, deux Reptiles et

la Lamproie sont représentés sur les figures 2 et 3.

L’ultracentrifugation sépare par ordre croissant de coefficient de sédimentation :

a — Une zone située en front de gradient correspondant aux protéines (3-8 S) de faible

poids moléculaire. Cette zone contient les protéines non thvro globuliniques (albumine,

hémoglobine) qui sont en partie d’origine plasmatique et ne sont pas ou très peu iodées.

Chez la Roussette (lig. 2 d), une fraction de 127 1 se situe à l’origine du gradient sans corres¬

pondre au pic de protéines ; chez la Lamproie un pie radioactif ~ 5 S est mis en évidence

même huit jours après l’injection d’iode radioactif (fig. 3 c).

b — Une fraction protéique dont le coefficient de sédimentation est voisin de 12 S.

Elle n’existe pas dans tous les extraits thyroïdiens.

c — Une protéine iodée dont le coellieienl de sédimentation voisin de 19 S permet

de l'identifier provisoirement à la thyroglobuline. Chez la Lamproie, cette protéine n’est

décelable qu’après marquage par l’iode radioactif (fig. 3 c).

d — Enfin deux lodoprotéines de vitesse de sédimentation respectivement voisines

de 27 et 32 S. Le composé 32 S n’est pas toujours mis en évidence.

La radioactivité liée à ces diverses fractions protéiques 12, 19, 27 et 32 S est précipi¬

table à 95 % par l’acide trichloraeétique.

Les extraits thyroïdiens des diverses espèces de Vertébrés inférieurs étudiés contien¬

nent donc des iodoprotéines solubles fixant in vivo l’iode radioactif, dont les coefficients

de sédimentation sont voisins de ceux des protéines thyroïdiennes des Mammifères, mais

qui varient très sensiblement selon l’espèce considérée (fig. 2 et 3) (Lachiver et Martin,

1966 ).

Les variations spécifiques des coefficients de sédimentation des protéines thyroïdiennes

seront discutées ultérieurement.

2. Filtration sur gel Sépharose 6 B

La filtration sur gel Sépharose 6 B des extraits thyroïdiens de diverses espèces de Pois¬

sons et de Reptiles montre qu’ils contiennent principalement une protéine dont le volume

d’élution est proche de celui de la thyroglobuline 19 S de Bœuf.

La figure 4 donne un exemple des profils d’élution d’un extrait thyroïdien brut de

Truite et d’un extrait thyroïdien de Bœuf purifié par relargage au sulfate d’ammonium

entre 1,4 et 2,2 M à 5°C.

L’épaulement de la courbe d’absorption à 280 mp au niveau des premières fractions

éluées après le volume mort de la colonne, correspond aux protéines les plus lourdes de

l’extrait thyroïdien.

La fraction protéique de faible importance qui est éluée le plus tardivement et pré¬

sente un spectre d’absorption à 414 mp est identifiable à l’hémoglobine contenue dans cet

extrait.

Les fractions de la partie apicale du principal pic protéique sont réunies puis concen¬

trées par dialyse sous vide. Ce matériel protéique, analysé par ultracentrifugation en gra¬

dient de densité présente un coefficient de sédimentation égal à celui du constituant pro¬

téique majeur présent dans l’extrait thyroïdien salin, dans le cas de chacune des espèces

étudiées.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

0.0. 280 mjj

Fig. 4. —» Filtration sur gel Sépharose 6 B d’un extrait thyroïdien brut de Truite (a) et d'un extrait thyroïdien

de Bœuf (b) purifié par relargage au sulfate d’ammonium entre 1,4 et 2,2 M à 5°C.

3. Autres critères d’identification de la thyroglobuline

La protéine iodée de coefficient de sédimentation voisin de 19 S a été isolée par filtra¬

tion sur gel Sépharose 6 B ou par centrifugation préparative (rotor SW 25-1), puis purifiée

par relargage au sulfate d’ammonium pH 6,9 entre des solutions 1,4 et 2,2 M ou 1,4 et 2,7 M

selon l’espèce considérée.

Dans les divers cas étudiés, l’hydrolyse par HCl 6N de Cette protéine montre que sa

composition en acides aminés, déterminée selon Moore et. al. (1958), est, qualitativement

similaire de celle de la thyroglobuline mammalienne (cf. 4 e partie).

Enfin l’hydrolyse de cette protéine par la pronase et la leueylaminopeptidase libère

177, 2

ANDRÉE BRISSON

des acides aminés iodés, mono- et diiodotyrosines et de la thyroxine qui sont identifiés

après chromatographie sur papier en butanol acétique et ammoniacal, par mesure de l’iode

radioactif ou de l’iode 127.

Les divers critères d’identification utilisés montrent que la thyroïde des Vertébrés

inférieurs étudiés contient principalement une iodoprotéine analogue à la thyroglobuline

des Mammifères.

L’analogie du profil d’ultracentrifugation des diverses fractions protéiques iodées

thyroïdiennes chez les Vertébrés inférieurs, avec celui des iodoprotéines existant dans la

thyroïde des Mammifères, permet de penser qu’elles correspondent par ordre croissant

de coefficient de sédimentation à la sous-unité de la thyroglobuline, à la thyroglobuline

et aux polymères de cette protéine.

Dans la littérature, les iodoprotéines thyroïdiennes des Mammifères sont généralement

désignées par la valeur de leur constante de sédimentation : 12, 19, 27, 32 S. Mais l’exis¬

tence de variations du coefficient de sédimentation de chacune d’entre elles chez les Pois¬

sons rend une telle notation inexacte et ambiguë dans certains cas (fig. 2 et 3). Aussi nous

utiliserons la nomenclature proposée par Lissitzky et al. (1966) (tabl. IV).

Tableau IV. — Nomenclature des iodoprotéines thyroïdiennes apparentées

à la thyroglobuline chez les Vertébrés inférieurs.

Sigles Coefficients de Iodoprotéines

UTILISÉS SÉDIMENTATION APPROXIMATIFS TH YROGLOBULINIQU ES

TGj

tg 2

tg 4

tg 6

sous-unité de TG 2

thyroglobuline sensu

stricto

polymère de TG a

polymère de TG 2

B. — Proportions relatives des iodoprotéines thyroïdiennes solubles.

Taux d’iodation moyen de ces protéines

1. Proportions relatives des iodoprotéines

L’ensemble des protéines thyroïdiennes TG X , TG 2 , TG 4 et TG 6 représentent de 55 à

80 % des protéines totales solubles contenues dans les extraits. Environ 90 % de l’iode

127 I total sont liés à ces protéines.

Les proportions relatives de chacune de ces iodoprotéines et la distribution de 127 I

entre elles sont calculées en pour cent de la somme de ces protéines et de l’iode 137 1 qui leur

est lié. La fraction 3-8 S contenant essentiellement les protéines non apparentées à la thy¬

roglobuline n’est pas prise en considération (tahl. V).

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTEINES THYROÏDIENNES

— Chez les diverses espèces étudiées, à l’exception de la Lamproie, la thyroglobuline

TG 2 est le principal constituant protéique et contient la majeure partie de l’iode 127 I. Par

contre, la TG 2 native n’existe qu’à l’état de traces chez le Cyclostome (fig. 3 c).

— Le pourcentage de TG 4 est très variable selon l’espèce. Elle constitue la principale

iodoprotéine dans le cas de Ja Lamproie et existe en proportion relativement importante

chez le Saumon, la Roussette et la Tortue. Mais elle n’est pas identifiée chez l’Uromastix

et est rarement décelable chez l’Anguille.

— Les polymères T G,, et TG 6 représentent chez les Poissons étudiés un pourcentage

élevé qui atteint le plus souvent 20 % et même 33 % chez la Truite de mer. Iles propor¬

tions équivalentes en 127 1 correspondent à ces protéines. Les proportions de ces polymères

sont beaucoup plus faibles chez deux Reptiles : Uromastix et Tortue.

Tableau V. — Proportions relatives des diverses iodoprotéines et distribution de

127 I entre elles dans les extraits thyroïdiens de différents Vertébrés inférieurs.

—

Proportions relatives des iodoproteines thyroïdiennes

solubles en p. cent du total ( TG 1 -pTG 2 + TG 4 +TGç )*

Especes

IC,

tg 2

tg 4

rc 6

Protéines

127|

Proteines

1271

Proteines

,27 i

Proteines

,27 l

Lamproie marine 6 **

100

Petite Roussette

— Manche 4

16,0

13,4

74,3

77,6

6,8

8,3

— Mediterrannee 5

7,6

5,0

81,8

83,0

7,2

9,3

1.9

2,5

Protoptere 5

2,6

73,6

79,1

15,4

14,3

7,4

3.9

Saumon atlantique

— de montée 5

6,8

4,0

69,9

74.5

17,9

17.2

4,8

4,1

— de frayeres a

9,6

7,3

69,7

72,5

11,0

13,6

9,4

6,2

Truite de mer 2

4,9

3,9

62,6

60,0

20,5

25,7

12,0

12,1

Anguille 2

80,0

76,6

14,6

17,2

6,3

6,1

Pjthon 1

3,4

90,1

82,8

8.3

10,2

1,5

Croüdilt t

6,6

14,7

80,6

69,3

12,8

15.9

Uromastii 7

97,5

2,5

n d

Tortue B

n d

* Valeurs moyennes déterminées par analyse en gradient de saccharose des extraits thyroïdiens solu¬

bles de (n) animaux ; nd, non déterminé ; ** un pic protéique de coefficient de sédimentation 5 S est marqué

par l’iode radioactif.

Les teneurs moyennes en thyroglobuline TG 2 et en polymère TG 4 des thyroïdes des

divers Poissons étudiés sont données dans le tableau VL Des variations individuelles impor¬

tantes sont enregistrées, mais les teneurs moyennes en TG 2 chez les différentes espèces

considérées sont plus homogènes (2 à 3 %) que celles du polymère TG 4 (0,2 à 0,8 %).

ANDRÉE BRISSON

Tableau VI. — Teneurs moyennes en thyroglobuline TG 2 et en polymère TG 4

des extraits thyroïdiens de diverses espèces de Poissons.

Espèces

Petite Roussette

— Manche * (60)

— Méditerranée (5)

Protoptère (5)

Saumon atlantique

— frayères (14)

— montée (7)

Truite de mer (2)

Truite de rivière * (3)

Anguille * (15)

Teneurs moyennes des thyroïdes

(mg/100 mg de glande fraîche)

TG 2

tg 4

1,74

2*58 ± 0,790

2,14 ± 0,222

2,62 ± 0,223

3,37 ± 0,617

2,02 ± 0,638

2,36

1,74

0,21 ± 0,025

0,44 ± 0,034

0,34 ± 0,078

0,86 ± 0,016

0,64 ± 0,024

0,56

0,24

(n), nombre d’animaux considérés ; * (n), nombre d’animaux dont les thyroïdes ont été groupées.

Ces valeurs sont déterminées par analyse en gradient de saccharose des extraits thyroïdiens solubles,

puis dosage des protéines selon Lowry et al. (1951).

2. Taux d’iodation moyen des protéines thyroïdiennes

Les teneurs en 127 1 total des thyroïdes et les taux d’iodation moyens de la thyroglo¬

buline et de ses polymères, exprimés en p.g de 127 I/100pg de protéines sont donnés dans

le tableau VII.

Tableau VII. — Teneurs en 127 I total des thyroïdes

et taux d’iodation moyens des diverses iodoprotéines thyroïdiennes.

Espèces

Teneur moyenne

EN 127 I TOTAL

([Ag/l00 rag thyroïde

fraîche)

Taux d’iodation moyen des protéines thyroï¬

diennes (en (jtg 127 I/100 (i.g de protéines)

r 2

tg 4

TG e

Petite Roussette

— Manche * * (60)

73,8 ± 13,15

1,47 ±

0,095

—

— Méditerranée * (60)

57,0

0,77

0,82

—

Protoptère (5)

42,2 ± 6,39

1,18 ±

0,063

1,05 ± 0,082

0,52

Saumon atlantique

— de montée (5)

91,6 ± 19,42

1,57 ±

0,056

1,49 ± 0,068

1,27 ± 0,066

— de frayères (14)

38,1 ± 3,70

0,98 ±

0,072

1,03 ± 0,062

0,40 ± 0,083

Truite de iner (2)

65,1 ± 15,15

1,45 ±

0,125

1,79 ± 0,320

1,54 ± 0,235

Truite de rivière * (3)

43,9

1,05

1,12

Anguille * (15)

0,77

1,06

—

(2)

35,6 ± 28,35

0,66

0,85

Python (1)

37,4

0,35

0,40

Crocodile (1)

4,0

0,07

(n), nombre d’animaux ; * (n), nombre d’animaux dont les thyroïdes ont été groupées ; ** (n), les thyroïdes

sont réparties en deux groupes.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

L’examen de ce dernier montre que :

a — Les teneurs en 127 1 total varient selon l’espèce considérée et présentent aussi

dans certains cas de fortes variations individuelles. Les valeurs obtenues sont du même

ordre de grandeur que celles rapportées par Roche et al. (1963).

b — Aux teneurs les plus élevées en 127 I total des thyroïdes de la Roussette pêchée

dans la Manche, du Saumon de montée et de la Truite de mer, capturés au début de leur

migration anadrome, correspondent les plus forts taux d’iodation de la thyroglobuline

(~ 80 at. 127 l/moléeule pour un poids moléculaire de 670 000) et du polymère TG 4 .

c — Chez tous les Poissons étudiés, le taux d’iodation de la thyroglobuline est rela¬

tivement élevé par rapport à celui de la thyroglobuline des Mammifères. La thyroglobuline

des deux Reptiles étudiés est faiblement, iodée.

d — Le taux d’iodation du polymère TG 4 est voisin de celui de la thyroglobuline,

e — Il semble exister, chez le Saumon atlantique, des différences intraspécifiques

du contenu en iode des glandes et des taux d’iodation des protéines thyroïdiennes qui

paraissent liées aux variations de l’état physiologique de l’animal (Lachiver et Martin,

1968). En effet, les tests F de Fischer (tabl. VIII) effectués sur les teneurs en 127 I des glandes

et sur les taux d’iodation moyens respectifs de TG. TG 6 mettent en évidence l’exis¬

tence de variations très hautement significatives (p < 0,01) de ces paramètres entre les

Saumons d’hiver et de printemps, et leur absence entre les Saumons de deux hivers diffé¬

rents (p > 0,05). En revanche, les teneurs en TG 2 ne présentent pas de variation globale

significative entre les deux saisons considérées, ceci provenant d’une forte variabilité annuelle

et individuelle.

Tableau VIII. — Taux d’iodation des protéines thyroïdiennes et teneur en iode

de la thyroïde des Saumons de frayères (hiver) et de montée (printemps).

Taux d'iodation moyens

Saumons

TG,

TG.

TG„

Teneurs moyennes Analyse

( en 127 I [ig/100 mg de

de glande fraîche) variance

(7)

Hiver

67-68

1,08

0,082

1,08

0,096

0,46

0,109

41,8

4,856

(7)

(5)

(7)

Hiver

68-69

0,88

0,111

0,94

0,054

0,30

0,130

34,0

5,621

Moyenne

(14)

(12)

(14)

des 2 hivers

0,98

0,072

1,03

0,062

0,40

0,083

38,1

3,701

(5)

Printemps 68

1,57

0,056

1,49

0,068

1,27

0,066

91,6

19,421

(n), nombre d’animaux étudiés ; i Sm, erreur standard de la moyenne.

ANDRÉE BRISSON

Chez le Saumon atlantique, les différences entre les teneurs en 127 1 des thyroïdes aux

deux étapes du cycle vital étudiées semblent donc résulter d’une diminution chez le Sau¬

mon de frayères, en hiver, du taux d’iodation de chaque entité protéique plutôt que d’un

changement dans les quantités de ces iodoprotéines.

Chez les Roussettes pêchées en Méditerranée, les teneurs en iode des glandes et surtout

le taux d’iodation moyen de la thyroglobuline sont significativement inférieurs à ceux

des Roussettes provenant de la Manche. Salvatohe et al. (1965c) ont déterminé un taux

d’iodation égal à 0,50 pour la thyroglobuline d’une espèce de Sélacien très voisine ( Scijli.o -

rhinus stellaris L.) également originaire de Méditerranée.

Discussion

Analogie du spectre des iodoprotéines thyroïdiennes dans la série des Vertébrés

Les extraits thyroïdiens des divers Vertébrés inférieurs étudiés, appartenant aux classes

des Cyclostomes, Chondrichthyens, Osteichthyens et Reptiles, contiennent en proportions

variables des iodoprotéines solubles, de poids moléculaires différents, que nous avons nom¬

mées TGj, TG a , TG 4 et TG 6 par ordre croissant de coefficient de sédimentation. L’analogie,

en particulier des spectres d’ultracentrifugation de ces protéines et de ceux des protéines

thyroïdiennes mammaliennes, permet de penser qu’elles correspondent respectivement à la

12, 19, 27 et 32 S des Mammifères.

Des données semblables ont été obtenues par Sat.vatore et al. (1965c), puis par Roche

et al. (1968) pour cinq autres espèces de Vertébrés inférieurs.

Ces résultats suggèrent que dans l’ensemble de l’échelle phylogénique des Vertébrés,

des plus primitifs (Cyclostomes) aux plus évolués (Mammifères), les iodoprotéines thyroï¬

diennes présentent une organisation moléculaire similaire.

— Chez les Vertébrés inférieurs, à l’exception du cas de la Lamproie, la thyroglobu¬

line native ou TG 2 , dont le coellieient de sédimentation est voisin de 19 S mais diffère selon

l’espèce considérée (Lachiver et al., 1965 ; 1966), représente comme chez les Mammifères

le principal constituant protéique (de 60 à 95 %). La teneur moyenne en thyroglobuline

des thyroïdes des Poissons étudiés est égale à 2 ou 3 % du poids frais environ.

— Chez la Lamproie marine ( Petromyzon marinus L.) la TG 2 native n’existe qu’à

l’état de traces ; par contre deux composés protéiques marqués par l’iode radioactif, de

coefficient de sédimentation voisins de 5 et 12 S, sont mis en évidence. Àloj et al. (1967)

ont obtenu des résultats analogues pour une espèce de Cyclostome voisine : Lampetra

fluviatilis, et ont suggéré que la protéine 5 S marquée par le radioiode pouvait être une

sous-unité de la thyroglobuline et correspondre au composé 8 S obtenu par de Crombrugghe

et al. (1966), après réduction des liaisons disulfures intracaténaires dans la thyroglobuline

bovine.

— Le ou les polymères TG 4 et TG 6 sont présents dans les extraits thyroïdiens des

divers Poissons et. Reptiles étudiés et atteignent un pourcentage important O 20 %)

chez les Actinoptérygiens.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

— S’il est probable que la thyroglobuline TG 2 et le polymère TG 4 , qui sont mis en

évidence dans la plus grande majorité des cas, existent réellement à l’état natif dans la

colloïde des vésicules thyroïdiennes, la présence irrégulière et occasionnelle de la protéine

iodée TG X est très sujette à controverses tant chez les Mammifères que chez les Vertébrés

inférieurs. En effet, représente-t-elle le précurseur de la TG 2 , existant à l’état stable et

susceptible de s’ioder, ou n’est-elle qu’un produit de dissociation de la TG 2 ?

Le même problème se posera pour la protéine néosynthétisée in vitro en présence de

3 H-Tyr, et nous en discuterons plus loin.

Proportions relatives des diverses iodoprotéines et signification physiologique

Quelle que soit l’origine de la protéine TGj, peut-on attribuer une signification fonc¬

tionnelle à la répartition des diverses iodoprotéines ?

Roche et al. (1968) notent que les extraits thyroïdiens de cinq espèces de Vertébrés

inférieurs semblent contenir moins de protéine 27 S que ceux de divers Mammifères, et

que la protéine 12 S, souvent identifiée dans les thyroïdes des premiers, ne l’est que très

rarement dans celles des Mammifères. De plus, Salvatore et al. (19656, c) constatent,

lorsque des variations intraspécifiques de la teneur en 27 S sont observées, que les thyroïdes,

d’après leur étude histologique, sont d’autant plus actives qu'elles contiennent davantage

de 27 S. Pour ces auteurs, une proportion élevée de ce polymère dans les extraits thyroïdiens

constituerait donc un critère positif d’intensité du fonctionnement thyroïdien. En revanche,

la présence de l’iodoprotéine 12 S chez les Vertébrés inférieurs et son importance chez le

Cobaye, dont on considère la thyroïde comme peu active, serait un signe d’hypoactivité

des glandes chez ces animaux.

Cependant, les résultats que nous avons obtenus pour d’autres espèces de Poïkilothermes

ne confirment pas ces hypothèses. En effet, d’une part nous avons constaté que les propor¬

tions des polymères TG 4 et TG # chez les Poissons, loin d’être inférieures & celles trouvées

chez les Mammifères, leur sont souvent supérieures. D’autre part, le composé iodé TGj ~

12 S n’est pas mis en évidence à l’état stable chez l’Anguille, l’Uromastix, le Python, et

seulement en faible pourcentage et occasionnellement chez d’autres espèces (Protoptère,

Truite de rivière). Inversement, une proportion toujours importante de 12 S iodée est mise

en évidence chez le Lérot [Elyomis quercinus L.) en hibernation ou avant l’automne (Lachi-

ver et Fontaine, 1964 ; Laciiiveii et al., 1965) et au cours des réveils périodiques, phases

pendant lesquelles l’activité thyroïdienne est très élevée relativement à celle du Cobaye.

Par ailleurs, bien que l’intensité du fonctionnement thyroïdien du Saumon de montée soit

très supérieure à celle du Saumon sur les frayères (Fontaine et Leloup, 1962), les propor¬

tions relatives des différentes iodoprotéines sont sensiblement identiques à ces deux stades

du cycle vital.

Plusieurs expérimentations ont été réalisées afin d’étudier l’influence de l’axe hypo-

physothyroïdien sur la distribution des protéines thyroïdiennes. Nous savons que la TSH

accélère les di\erses étapes du métabolisme iodé et qu’elle semble stimuler aussi la synthèse

de la thyroglobuline chez le Rat (Rappaport, 1970). L’hypophysectomie de Rats (Fon¬

taine et Lac hiver, 1964) ou l’immunisation de Lapins contre la TSII bovine (Lachiver

et al., 1969) entraîne relativement aux témoins un ralentissement important de l’organifi-

ANDRÉE BRISSON

cation de l'iodure et une augmentation significative de la quantité de matériel colloïdal

dans les follicules, sans que le spectre des iodoprotéines soit modifié. Chez des Anguilles

hypophysectomisées depuis é mois, le renouvellement de l’iode est également ralenti, mais

les proportions des divers composés protéiques et des pics radioactifs sont semblables à

celles observées chez les Anguilles témoins (données inédites). En accord avec l’ensemble

de ces résultats, Salvatore et al. (1965c) ont constaté que chez des Cobayes traités par

TSH, l’organification de l’iodure radioactif est accélérée, mais que sa distribution entre

les protéines thyroïdiennes n’est pas affectée.

Il ne semble donc pas valable de juger de l’intensité du fonctionnement thyroïdien

en considérant les proportions relatives des iodoprotéines thyroïdiennes. Par ailleurs,

Roche et a.1. (1968) et Salvatore (1969) attribuent une signification d’évolution à la pré¬

sence de 12 S, cette protéine représentant le principal constituant protéique de la thyroïde

chez les Vertébrés les plus primitifs (Cyclostomes) et étant identifiée préférentiellement,

d’après ces auteurs, chez les Vertébrés inférieurs. Mais nos résultats montrent qu’il est

prématuré, dans l’état actuel de nos connaissances, d’établir une relation entre le degré

d’évolution des différentes classes de Vertébrés en fonction de la présence ou de l’absence

de la protéine TG 4 ~ 12 S.

Taux d’iodation des protéines thyroïdiennes

La thyroglobuline des divers Poissons étudiés présente un degré d’iodation élevé,

souvent voisin ou supérieur à 1 %. Les taux d’iodation moyens de la thyroglobuline de diffé¬

rentes espèces de Mammifères, rapportés par divers auteurs, présentent des valeurs maxi¬

males de 1,1 % mais sont le plus souvent compris entre 0,20 et 0,70 % (Rolland et al.,

1970). Les teneurs en iode correspondant à 80 at. 127 I/molécule, déterminées chez certains

Poissons (Saumon, Roussette atlantique) vivant dans leur environnement naturel, ne sont

atteints chez les Mammifères qu’après iodation chimique (Edei.uocu et Lippoldt, 1962)

ou enzymatique (Nuisez et al., 1966 ; de Crombruggiie et al., 1967 ; Tarutani et Ui,

1969u).

Par ailleurs, en accord avec les résultats de Lissitzky et al. (1965), et non avec ceux

de Salvatore et al. (1965a), de Robbins et al. (1966), et de Roche et al (1968), le polymère

TG 4 ~ 27 S présente un degré d’iodation du même ordre de grandeur que celui de TG 2 ,

tant chez les divers Poissons que chez les Mammifères que nous avons étudiés (Bœuf, Rat).

Ce désaccord apparent concernant la richesse relative en iode du polymère ~ 27 S peut

résulter de différences méthodologiques et de variations selon les animaux étudiés. Roche

et al. (1968) n’observent pas régulièrement pour une espèce donnée que le polymère 27 S

présente une teneur en iode très supérieure à celle de la TG 19 S. Ainsi les polymères sans

nous paraître avoir le privilège d’être proportionnellement deux à trois fois plus riches

en iode que la thyroglobuline peuvent néanmoins constituer une réserve d’iode non négli¬

geable pour la synthèse hormonale, tout particulièrement dans le cas des Poissons où la

proportion de polymère est importante.

Quels sont les facteurs susceptibles d’être responsables des taux d’iodation élevés

des protéines thyroïdiennes chez les diverses espèces de Poissons étudiés ?

En première approximation, le degré d’iodation de la thyroglobuline peut varier en

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

fonction de l’apport iodé à la thyroïde et de la vitesse de renouvellement de cette protéine.

Par exemple, le taux d’iodation de la thyroglobuline de Rats nourris d'un régime carencé

en iode (0,03 pg 127 I/g), dont l’activité thyroïdienne est très intense, est de 0,2 %, alors

qu’il atteint 1,1 % pour des Rats soumis à un régime riche en iode (0,6 (xg 127 1/g) (Lachiver,

données inédites).

Plusieurs hypothèses peuvent donc être formulées :

1. Chez les Vertébrés aquatiques, le milieu extérieur constitue une source potentielle

d’iodure. Leloup (1970) a montré que, si Piodurémie des Téléostéens d’eau douce est éle¬

vée, même chez des espèces soumises à un jeûne physiologique prolongé comme l’Anguille

ou le Saumon atlantique au cours de sa migration anadrome, c’est grâce à l’existence au

niveau branchial d’un transport actif de l’iodure à partir du milieu extérieur. L’iodurémie

atteint des valeurs maximales chez les Téléostéens Clupéiformes migrateurs amphihalins

(Fontaine, 1970), par suite de la présence dans leur plasma d’une protéine liant liodure

(Fontaine et Leloup, 1958 ; Leloup, 1964F), appelée iodurophorine.

L’iodurémie élevée chez ces Poissons peut donc vraisemblablement assurer un apport

d’iode important à la thyroïde.

La diminution de la teneur en iode de chaque entité protéique du Saumon de montée

au Saumon de frayères peut s’expliquer par une chute de Piodurémie, elle-même due à

une moindre capacité de liaison de l’iodure par l’iodurophorine, concomitante d’une réduc¬

tion du pouvoir de. concentration de l’iodure par la thyroïde (Fontaine et Leloup, 1962).

Toutefois, le mécanisme de concentration des indurés par la Franchie assure leur apport

de façon à maintenir un taux d’iodation encore élevé des protéines thyroïdiennes et à subve¬

nir à la biosynthèse hormonale. Dans ce cas, les variations du taux d’iodation des protéines

thyroïdiennes semblent donc être en relation avec l’état physiologique des animaux.

2. Un renouvellement plus lent de la thyroglobuline chez les Poissons permettrait

l’iodation d’un plus grand nombre de résidus t.yrosyls et serait responsable du taux d’ioda¬

tion élevé de cette protéine, même chez des espèces d’eau douce comme le Protoplère dont

l’iodurémie est aussi faible que celles des Mammifères et des Oiseaux (Leloup, 1970).

Des variations dans la vitesse du renouvellement de la thyroglobuline, en fonction

de certains facteurs écologiques (température du milieu ambiant, alimentation), pourraient

aussi être impliquées dans les différences du taux d’iodation entre les thvroglobulines des

Roussettes pêchées en Manche et celles des Poissons de même espèce capturés en Méditer¬

ranée alors que les uns et les autres vivent dans des milieux marins dont les teneurs en iode

sont similaires (~ 51 ug 127 1/1), et présentent sensiblement la même iodurémie.

3. L’analyse des acides aminés des thyroglobulines des Poissons étudiés montre cjue

le pourcentage de tyrosine varie peu et est voisin de celui déterminé pour les thyroglobulines

de Mammifères, mais suggère que cette macromolécule protéique ne présente pas une struc¬

ture identique chez les diverses espèces étudiées. S’il en est ainsi on peut envisager que cer¬

taines différences dans la structure primaire et tertiaire de cette protéine sont susceptibles

de rendre les résidus t.yrosyls plus ou moins accessibles à l’iodation.

ANDRÉE BRISSON

II. BIOSYNTHÈSE IN VITRO DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

CHEZ DIFFÉRENTES ESPÈCES DE POISSONS

Au cours de ces dernières années, les différentes étapes de la biosynthèse de la thyro¬

globuline dans la thyroïde des Mammifères ont été étudiées.

Divers auteurs ont montré in vitro (Seed et Goldbehg, 1963,1965a ; Lissitzky et

al., 1964 ; Nunez et al., 1965a), puis in vivo (Vecchio et al., 19666 ; C avarie ri et Searle,

1967a ; Ekholm et Strandberg, 1967 a,b ; Nunez et al., 1967a) que les acides aminés

marqués sont incorporés dans des protéines de coefficient de sédimentation 3-8 S et 12 S,

avant de l'être dans une protéine non iodée, nommée préthyroglobuline (Nunez et al.,

1965a) dont la vitesse de sédimentation est sensiblement inférieure à celle de la thyroglo¬

buline native (19 S).

Toutefois, la relation précurseur à produit entre ces composés de faible poids molé¬

culaire et la thyroglobuline, que semblaient mettre en évidence les études cinétiques pré¬

citées, a été récemment remise en question par les travaux de Schneider et al. (1970,1971).

Vecchio et al. (1971) pensent, par voie de conséquence, que les protéines 6 S, 7 S et 12 S

peuvent provenir de la dissociation des molécules de thyroglobuline néosynlhétisées et peu

iodées n’ayant pas encore acquis leur configuration la plus stable.

Par ailleurs, il est bien établi que les processus de biosynthèse protéique sont indé¬

pendants de ceux de l’iodation (Lissitzky et al,, 1964 ; Maeoof et al., 1964 ; Seed et Gord-

berg, 1965a,6 ; Tisiiler et Ingbar, 1965 ; Nunez et al., 1965a,6), En effet, la présence

in vitro ou in vivo de puromycine inhibe totalement la synthèse de thyroglobuline, sans

affecter l’iodation des molécules préformées. Inversement, la présence d’antithyroïdiens,

inhibiteurs spécifiques de l’iodation, n’alfeete pas la synthèse des chaînes précurseurs et

leur polymérisation, ni l’incorporation des glucides (Herskovics, 1969).

L’ensemble des études cinétiques de l’incorporation des acides aminés et sucres mar¬

qués, et de l’iode radioactif dans les thyroïdes des Mammifères montre que le squelette

peptidique de cette glycoprotéine est synthétisé avant l’addition séquentielle des sucres

(Spiro et Spiro, 1966 ; Ciiefter et Bouchii.loux, 1968a,6 ; Whur et al., 1969 ; IIaddad

et al., 1971), qui elle-même semble précéder l’iodation (Herskovics, 1969).

Nous avons montré que les protéines iodées thyroïdiennes chez les Vertébrés inférieurs

présentaient ime organisation moléculaire similaire de celle observée chez les Mammifères.

Nous nous sommes ensuite proposée d’étudier la biosynthèse de ces protéines et de son con¬

trôle chez les Poissons. La synthèse de la thyroglobuline chez ces Poïkilothermes procédait-

elle selon un schéma identique à celui décrit chez les Mammifères et quels étaient les facteurs

susceptibles de la réguler ou de l’influencer ?

Chez les Mammifères, la synthèse protéique thyroïdienne est contrôlée par Taxe hypo¬

physe-thyroïdien. L’hormone thyréotrope (TSH), injectée in vivo, accélère l’incorpora¬

tion in vitro et in vivo des acides aminés dans les protéines thyroïdiennes (Ragupathy

et al., 1963; Bradley et Wissig, 1966; Ekholm et Strandberg, 1966; Cavarieri et

Searle, 19676 ; Pavlovic-Hournac et al., 1967) et semble exercer une action sélective

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

sur la synthèse de thyroglobuline (Rappaport, 1970). Par ailleurs, Heywood (1966)

montre que la thyroxine et l’iode inorganique de. la glande sont susceptibles d’intervenir

dans la régulation de l’incorporation des acides aminés dans les protéines thyroïdiennes

en l’inhibant au niveau ribosomal.

Le contrôle de la fonction thyroïdienne chez les Poissons a fait l’objet de diverses

études. La compilation des données obtenues (Gorbman, 1969) permet de penser, du moins

pour les Téléostéens, que l’activité thyroïdienne est contrôlée par la glande pituitaire et

la TSH (Fontaine et al., 19536 ; Pickeord, 1959 ; Donn et Matty, 1964). A côté de cette

régulation intrinsèque par l’axe h y po p hy so -1 h y roïdie n, d’autres facteurs externes liés à

l’environnement, en particulier la température, sont susceptibles de modifier le fonctionne¬

ment thyroïdien chez les Poïkilothermes.

Les données obtenues chez diverses espèces de Poissons, relatives aux variations de

l’activité thyroïdienne en fonction de la température, sont sujettes à controverses (Drury

et Eales, 1968). D’après les critères histologiques, une augmentation de la température

environnante peut diminuer l’activité thyroïdienne (Fontaine et al., 1953a, 6 ; Ivanova,

1954 ; Olivereatj, 1955a ; Eales, 1964, 1965 ; Swift, 1959 ; Drury et Eales, 1968), ne

pas la modifier (Olivereau, 19556, c) ou la stimuler (Barrington et Matty, 1954 ; For¬

tune, 1955). Cependant l’utilisation des isotopes radioactifs de l’iode met le plus géné¬

ralement en évidence une influence positive de la température sur le métabolisme iodé

thyroïdien des Poissons : la vitesse de fixation et d’organification de l’iodure ainsi que celle

de la sécrétion des hormones thyroïdiennes croissent avec la température (Gorbman et

Berg, 1955 ; Fontaine et Fontaine, 1957 ; Leloup, 1958 ; Leloup et Fontaine, 1960 ;

Drury' et Eales. 1968 ; Smith et Eales, 1971).

Ces diverses données nous ont conduite à étudier, chez quelques Poissons présentant

des exigences thermiques bien différentes, l'influence de la température in vitro sur la bio-

synthèse de la thyroglobuline qui constitue également un aspect fondamental de l’activité

thyroïdienne (Brisson-Martin et Lachiver, 1972a).

A. —■ Étude qualitative des protéines solubles synthétisées in vitro

DANS LA THYROÏDE DES POISSONS

Cette étude a été réalisée chez trois Téléostéens (Saumon, Truite, Anguille) et un

Dipneuste (Protoptère). L’expérimentation a porté sur des animaux de grande taille chez

lesquels le tissu thyroïdien peut être prélevé à l’état pur.

Les nodules thyroïdiens des Téléostéens et la thyroïde du Protoptère sont incubés

en présence de L 3-5 3 H 2 -Tyrosine ( 3 II-Tyr) pendant 2, 6 ou 24 heures dans du milieu de

Campagne et Grüber (voir Techniques).

Chez les Mammifères, la thyroglobuline synthétisée in vitro à 38°C en présence d'acides

aminés marqués est principalement identifiée par sa vitesse de sédimentation en gradient

de saccharose et ses limites de précipitation par le sulfate d’ammonium (1,4 M — 1,8 M).

La précipitation de cette protéine par un antisérum antithyroglobulinique constitue éga¬

lement un excellent critère d’identification (Seeü et Goldberg, 1963, 1965a ; Lissitzky

et al., 1965). Les comportements en chromatographie sur DEAE-cellulose, en filtration

sur gel G-200 du matériel néosynthétisé ont aussi été étudiés.

ANDRÉE BRISSON

Dans ce travail, les propriétés de sédimentation et de précipitation par le sulfate d’ammo¬

nium ont essentiellement servi à caractériser la thyroglobuline néosynthétisée dans les thy¬

roïdes des Poissons. En raison de la faible quantité de matériel disponible, des antisérums

antithyroglobulines de Poissons n’ont pu être préparés.

Après dialyse des homogénats thyroïdiens contre le tampon phosphate standard

(pli = 7,4 ; [i. : 0,15) et élimination des particules, les protéines solubles marquées par

3 H-Tyr sont analysées à 5°C en gradient de saccharose (5-20 %).

Les coefficients de sédimentation de ces protéines tritiées sont déterminés en prenant

pour référence une thyroglobuline purifiée de Bœuf, 19 S, marquée in vitro par 12o I et éga¬

las

Fig. 5. — Ultracentrifugation en gradient de saccharose des protéines solubles marquées in vitro

par 3 H-Tyr ou 125 / dans les thyroïdes de Saumon et de Truite.

Incubations réalisées à 15°C, séparément en présence de *H-Tyr ou de >“[, pendant 24 h (a) et G h (b). 80 jxl

d’extrait thyroïdien marqué par 3 H et 20 (il de celui marqué par 1 25 I sont centrifugés pendant 3 h 30

à 48 000 tpm. Radioactivités en 3 H et 126 I exprimées en pour cent des radioactivités déposées sur le

gradient.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

lement pour chaque espèce par rapport à leur propre thyroglobuline marquée in vitro ou

in vivo par 125 I.

Les profils des gradients obtenus (fig. 5, 6) montrent que la radioactivité se distribue

entre trois fractions d’importance inégale :

19 S

il? s J

Fractions

Fig. G. — Ultracentrifugation en gradient de saccharose des protéines solubles marquées in vitro

par *U-Tyr ou in vivo par 125 / dans les thyroïdes aAnguille et de Protoptère.

Les thyroïdes de certains animaux sont incubées à 30°C, en présence de 8 II-Tyr t pendant G h. Les protéines

thyroïdiennes d’autres animaux sont marquées in vivo par 126 I pendant 8 jours (a) et 17 h (b). 80 p.1

d’extrait thyroïdien marqué in vitro par 3 H et 20 [J.I de celui marqué in vivo par 125 1 sont analysés.

Ultracentrifugation : 5 h 30 à 39 000 tpm (a) ; 2 h 15 à 65 000 tpm (b).

ANDRÉE BRISSON

a -— La fraction protéique qui migre le plus rapidement présente dans le cas de chaque

espèce un coefficient de sédimentation voisin et légèrement inférieur à celui de la thyro¬

globuline correspondante marquée par 125 1. Les différences interspécifiques entre les valeurs

obtenues seront discutées dans la 4 e partie.

Pour chaque espèce, les vitesses de sédimentation des protéines marquées par 3 H-Tyr

sont identiques, que les incubations de thyroïdes soient réalisées en présence ou non de

propylthiouracile (1 mM), inhibiteur de l’iodation (fig. 7).

Après isolement de cette fraction protéique par centrifugation en gradient de saccha¬

rose (Rotor SW 50), 90 % de la radioactivité qui lui est liée est précipitée entre 1,4 et 2,2 M

de sulfate d’ammonium à 5°C. Cette protéine tritiée ainsi purifiée présente un coefficient

Fractions

Fig. 7. — Profils d'ultracentrifugation et coefficients de sédimentation des protéines thyroïdiennes

de Saumon marquées in vitro par 3 H-Tyr.

Incubations réalisées à 15°C pendant 24 h en présence de propylthiouracile et de perchlorate de sodium

(a) ou en absence d’antithyroïdiens (b).

19 S

Fig. 8. ■— a : Profil d'ultracentrifugation des protéines solubles synthétisées in vitro à 15°c

dans la thyroïde de Saumon en présence de 3 H-Tyr.

80 (il d’extrait thyroïdien de Saumon, marqué par a H, et 20 (il d'une solution de 125 l TG do Bœuf (19 S)

sont centrifugés à 48 000 tpm, pendant 3 11 80.

b : Profil d'ultracentrifugation de la thyroglobuline néosynthélisèe, marquée par 3 U (préTG) après purifi¬

cation sur gradient de saccharose (5-20 % ; rotor SfV 50) et relargage au sulfate d'ammonium entre 1,4

et 2,2 XI.

La solution de préTG purifiée est analysée en gradient de saccharose dans les conditions de la figure 8 a.

■c : Dissociation par le SDS de la thyroglobuline néosynthélisèe de Saumon, préalablement purifiée.

80 pi de la solution de préTG purifiée, traitée par du SDS (concentration finale 1,5 X 10" 3 M ; 1 h à 20°C),

et 20 pi d’une solution contenant de la thyroglobuline 19 S de Bœuf marquée par 125 I et sa sous-unité

12 S obtenue par dissociation préalable par du SDS, sont centrifugés pendant 4 h à 65 000 tpm.

ANDREE BRISSON

de sédimentation identique à celui déterminé à partir de l’extrait thyroïdien soluble total

(fig. 8 a et b).

Ces diverses données, par analogie avec celles obtenues chez les Mammifères, suggèrent

que cette protéine correspond à la préthyroglobuline (préTG) des Mammifères.

b — Une autre fraction protéique, dont la proportion est très variable, est séparée

dans les extraits thyroïdiens de certaines espèces. Elle sédimente comme la sous-unité

marquée in vitro par 125 1 de la thyroglobuline (fig. 5 a) et comme la sous-unité obtenue

par dissociation par le docécyl sulfate de sodium de la préTG purifiée (fig. 8 c).

c — Enfin un composé de plus faible poids moléculaire migre en front de gradient

dans la zone 3-8 S. Une proportion toujours importante de la radioactivité lui est liée (fig. 5

et 6).

B. — Influence de la température d’incubation

SUR la biosynthèse des protéines thyroïdiennes

1. Biosynthèse protéique totale

La biosynthèse protéique totale est évaluée à partir d’une fraction aliquote de l’homo-

génat thyroïdien :

en mesurant la radioactivité qui est liée aux protéines totales néosynthétisées,

précipitées par l’acide trichloracétique selon Allen et Sciiweet (1962) ;

— en déterminant par chromatographie sur papier en butanol-acide acétique-eau

(78 — 5 — 17 v/v) l’incorporation de 3 If-Tyr dans les protéines thyroïdiennes, en pour cent

de la radioactivité totale ajoutée au milieu d’incubation.

Le tissu thyroïdien prélevé puis incubé présentant un degré d’homogénéité et de pureté

satisfaisant, ces valeurs peuvent être rapportées à 100 mg de tissu thyroïdien ou à 100 mg

de protéines totales.

Chez les diverses espèces de Téléostéens étudiés, l’incorporation totale de 3 II-Tyr

dans les nodules thyroïdiens augmente avec la durée d’incubation de 6 à 24 heures (tahl. IX).

Par ailleurs, la présence de propylthiouracile (1 mM) et de perchlorate de sodium (2 mM)

dans le milieu d’incubation inhibe à 96 % l’organification de l’iodure, mais n’affecte pas

l’incorporation de 3 H-Tyr dans la thyroïde. Celle-ci est donc indépendante des processus

de l’iodation.

Tableau IX. — Incorporation globale de 3 H-Tyr dans les nodules thyroïdiens

de trois Téléostéens en fonction de la durée d’incubation.

Espèces

% *H-Tyr incorporés/100

6 li

mg tissu thyroïdien

24 h

Saumon

6,3

14,9

Truite

4,8

33,5

Anguille

9,3

33.8

Incubations à 15°C en présence de : 50 gg de 3 H-Tyr (0,44 C/mmole) dans le cas du Saumon ; 13 :xg

de ®H-Tyr (G,8 C/mmole) dans le cas de la Truite ; 30 pg de 3 H-Tyr (0,44 C/mmole) dans le cas de l’Anguille.

Incorporations déterminées par chromatographie sur papier.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTEINES THYROÏDIENNES

L’étude histologique des thyroïdes de Truite et d'Anguille montre que dans les con¬

ditions expérimentales adoptées la structure folliculaire est bien conservée après 24 h

d’incubation à 20°C, température physiologique pour ces Téléostéens (fig. 9 a, b ; 10 a, b).

Par contre, la structure spécifique du tissu thyroïdien de Truite et d’Anguille n’est que

partiellement bien préservée après 6 h d’incubation à 30 et 38°C respectivement (fig. 11 a,

12 a). Après 24 h à ces températures d’incubation élevées, les cellules thyroïdiennes sont

lysées : les membranes cytoplasmiques sont déchirées et les noyaux pycnotiques sont reje¬

tés dans les vésicules colloïdes (fig. il b, 12 b).

Ceci nous a conduite à étudier préférentiellement l’influence de la température sur la

synthèse des protéines thyroïdiennes après 6 h d’incubation.

Des expériences préliminaires réalisées à 15 et. 30°C (Lacuiver et Martin, 1967 ;

Martin et Lacuiver, 1968) suggéraient que l’intensité de la biosynthèse protéique thyroï¬

dienne variait avec la température d’incubation et différemment selon l’espèce étudiée.

Cependant une influence quantitative de ce facteur était difficile à mettre en évidence pour

plusieurs raisons :

a — Les incorporations de 3 H-Tyr dans les thyroïdes présentent de plus importantes

variations individuelles chez des animaux capturés dans leur environnement naturel, que

chez des animaux élevés en laboratoire dans des conditions standard. Pour une même espèce,

l’activité thyroïdienne des Poissons utilisés peut varier aussi d’une expérimentation à une

autre, en fonction de la saison à laquelle ils sont étudiés. De plus, des différences dans le

degré de stimulation de la thyroïde par l’hormone thyréotrope peuvent entraîner des modi¬

fications de la teneur en tyrosine libre de la glande (Melmon cl al., 1964) et donc de l’acti¬

vité spécifique réelle de la 3 II-Tyr.

h — Les thyroïdes ont été incubées en présence de 10 à 50 pg de tyrosine selon l’acti¬

vité spécifique de cet acide aminé. Or la teneur en tyrosine du milieu d’incubation semble

susceptible de modifier la vitesse d’incorporation de 3 H-Tyr dans les protéines thyroïdiennes

(Rappaport, 1970).

L’influence de la température d’incubation doit donc être étudiée dans des conditions

expérimentales bien précises. Les thyroïdes ou nodules thyroïdiens de plusieurs animaux

de taille voisine sont fragmentés, répartis en lots homogènes, puis incubés simultanément

pendant un temps donné à différentes températures, en présence d’une quantité déterminée

de 3 H-Tyr. Dans ces conditions, les résultats obtenus en fonction de la température pour

une série d’incubations peuvent être confrontés.

La figure 13 donne un exemple des résultats obtenus pour des lots homogènes de Truite,

incubés pendant 6 b à différentes températures. L’incorporation de 3 H-Tyr augmente avec

la température d’incubation de 5 à 25°C, puis diminue fortement à 30°C. Quel que soit

le mode d’expression des résultats en DPM ou % 3 H-Tyr incorporés par 100 mg de tissu

ou de protéines, le profil des courbes est analogue.

Dans la figure 14 sont comparées les données obtenues pour les quatre espèces de Pois¬

sons étudiées. Les séries d’incubation concernant ces diverses espèces étant réalisées en

présence de quantités variables de 3 H-Tyr selon l’activité spécifique de celle-ci, les résultats

sont exprimés en p.g de Tyr incorporés par 100 mg de tissu thyroïdien et ne sont sans doute

pas comparables quantitativement d’une espèce à une autre.

Chez les Téléostéens, l’accroissement de la température d’incubation de 5 à 20 - 25°C

177, 3

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

jig Tyrosine

Fig. 13. — Influence de la température d’incubation sur la synthèse protéique totale

dans les nodules thyroïdiens de Truite.

Fig. 14. — Influence de la température d’incubation sur la biosynthèse protéique thyroïdienne totale

chez diverses espèces de Poissons.

Les résultats sont exprimés en [xg de tyrosine incorporée par 100 mg de tissu thyroïdien et calculée à partir

de la 3 H-Tyr ajoutée et de son activité spécifique.

Saumon : 0,44 C/mmole, 50 fxg tyrosine/ml ; Truite : 6,8 C/mmole, 13 [xg tyrosine/ml ; Anguille :

3,2 C/mmole, 12 jxg tyrosine/ml ; Protoptère : 24 C/mmole, 7 fxg tyrosine/ml.

Fig. 9-12. — 9 et 10 : Nodules thyroïdiens de Téléostéens après 24 h d'incubation à 20°C

dans le milieu de Campagne et Griiber.

Fixation : Bonin ; coloration : Llétnulun-Losine. Notez que la structure folliculaire est bien conservée.

9a : Truite G X 80 ; 9b : Truite G X 360 ; 10a : Anguille G X 80 : 10b : Anguille G X 360.

11 : Nodules thyroïdiens de Truite incubés à 30°C dans le milieu de Campagne et Griiber à différents temps.

Fixation : Bouin -, coloration : Hérnalun-Éosine.

a : Durée d'incubation 6 h ; G x 80, Notez que la structure folliculaire n'est que partiellement conservée,

b : Durée d'incubation 24 h ; G X 80, Notez que les cellules thyroïdiennes sont lysées et que les noyaux

pycuotiques sont rejetés dans les vésicules colloïdes.

12 : Nodules thyroïdiens d'Anguille incubés à 3S°C dans Le milieu de Campagne et Griiber à différents temps.

Fixation : Bouin ; coloration : Hérnalun-Eosine.

a : Durée d'incubation 6 h; G X 80. Même observation que dans le cas de la figure lia. b : Durée d’incu-

batiou 24 b ; G x 80. Mêmes observations que dans le cas de la figure 11b.

ANDRÉE BRISSON

détermine une augmentation de l’incorporation de 3 H-Tyr dans la thyroïde. Une nette

réduction de cette incorporation est observée à 30°C chez les Salmonidés et à 38°C chez

l’Anguille (fig. 14). Une influence analogue de la température d’incubation est constatée

lorsque les nodules thyroïdiens de Saumon sont incubés dans le milieu de Cortland.

Dans le cas du Protoptère, la synthèse protéique totale semble beaucoup plus intense

à 30°C qu’à 15 et 5°C (fig. 14).

2. Synthèse des protéines solubles

L’accroissement de la température d’incubation exerce une inlluence comparable sur

la synthèse protéique totale et sur celle des protéines solubles, le pourcentage de la radio-

SflUMON

Fig. 15. — Profils d'ultracentrifugation des protéines solubles nèosynthélisèes in vitro

à différentes températures dans la thyroïde de Saumon et de Protoptère en présence, de 3 H-Tyr.

Saumon : centrifugation 3 h 30 à 48 000 tpm ; fractions de 7 gouttes ; Protoptère : centrifugation 2 h 15

à 65 000 tpm ; fractions de 10 gouttes.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTEINES THYROÏDIENNES

Fig. 16. — Profils d'ultracentrifugation des protéines solubles néosynthétisées in vitro

à différentes températures dans la thyroïde d'Anguille et de Truite en présence de 3 H-Tyr.

Activités spécifiques de 3 H-Tyr données figure 14. Fractions de 7 gouttes.

ANDRÉE BRISSON

activité totale liée à la fraction soluble étant le plus souvent voisin de 52 %. Cependant,

il semble que l’incorporation de 3 H-Tyr dans les protéines thyroïdiennes solubles chez

l’Anguille diminue à 30 et 38°C, la proportion de radioactivité liée à la fraction particulaire

étant plus élevée à ces températures.

a — Analyse des protéines thyroïdiennes solubles

Les profils d’ultracentrifugation des protéines néosynthétisées in vitro à différentes

températures dans la thyroïde des divers Poissons étudiés (fig. 15 et 16) montrent que :

— Dans tous les cas, une proportion non négligeable de thyroglobuline est synthétisée

après 6 h d’incubation à 5°C. A cette basse température, on note que le pourcentage de

radioactivité qui est localisée dans la zone de la sous-unité est faible et comparable à celui

observé à des températures d’incubation supérieures.

— La proportion de préTG néosynthétisée augmente avec la température d’incubation,

mais semble atteindre une valeur maximale à des températures différentes selon l’espèce

de Poisson considérée. En effet, un pourcentage maximum de préTG est obtenu à 15 - 20°C

chez les Salmonidés, à 25°C chez l’Anguille et à 30°C chez le Protoptère. Dans certains

cas, à 30°C, chez le Saumon, aucun pic radioactif n’est mis en évidence au niveau de la préTG.

Chez l’Anguille, la proportion de préTG décroît de 25 à 38°C, mais est encore importante

à 30°C.

Tableau X. — Teneurs en protéines totales solubles et thyroglobuline native soluble

de 100 mg de tissu thyroïdien incubé à différentes températures.

Espèces

Températures

d’incubation (°C)

Protéines solubles

TOTALES ([xg/100 mg

thyroïde)

TG SOLUBLE

(ftg/100 mg thyroïde)

Saumon 15

Truite 20

7 270

2 500

5 640

2 380

7 054

2 566

7 486

2 600

11 015

5 893

10 770

5 812

9 260

5 494

10 025

6 530

11 170

4 950

3 400

1 485

4 500

2 188

3 500

1 527

3 200

1 424

3 100

1 544

Anguille

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

La diminution du pourcentage de préTG synthétisée à 25-30°C chez les Salmonidés

et à 38°C chez l’Anguille peut résulter soit d’un ralentissement de la polymérisation des

protéines sous-unitaires en thyroglobuline, soit d’une hydrolyse ou d’une dénaturation

rapide de la préTG néoformée. Cependant certaines données ne semblent pas en faveur

de cette dernière hypothèse. D’une part, le pourcentage de préTG présent dans un extrait

thyroïdien de Saumon, provenant d’une incubation à 15°C, n’est pas modifié par une incu¬

bation ultérieure à 30°C pendant 24 h. D’autre part, les teneurs en thyroglobuline native

des thyroïdes incubées à 30 ou 38°C chez ces Téléostéens ne sont pas plus faibles que celles

des glandes incubées à des températures inférieures (tabl. X).

b — Synthèse de la thyroglobuline

L’influence de la température d’incubation sur la synthèse de la thyroglobuline est

établie de deux façons (fig. 17) :

Fig. 17. — Influence de la température d’incubation sur la synthèse in vitro de thyroglobuline

dans la thyroïde de Truite et d’Anguille.

Activités spécifiques de 3 II-Tyr données figure 14.

— SoiL en déterminant l’activité spécifique de la thyroglobuline, exprimée en DPM

incorporés dans la s H-préTG par mg de thyroglobuline native. Dans les conditions expéri¬

mentales adoptées, les teneurs en thyroglobuline des divers lots de nodules thyroïdiens

pour une espèce donnée sont du même ordre de grandeur quelle que soit la température

d’incubation (tabl. X).

ANDRÉE BRISSON

— Soit en calculant l’incorporation de tyrosine en pg, dans la thyroglobuline néosyn-

thétisée par 100 ing de thyroïde, à partir de l’incorporation de 3 II-Tyr dans la fraction

soluble et de la proportion de 3 H-préTG déterminée par ultracentrifugation en gradient

de saccharose.

Les résultats obtenus selon ces deux modes d’expression sont, similaires (fig. 17).

La figure 18 montre que chez les divers Poissons étudiés, l’accroissement de la tempé¬

rature d’incubation détermine une augmentation de la quantité de thyroglobuline néo-

formée, jusqu’à une température limite supérieure variable selon l’espèce, puis s’accompagne

au-delà d’une diminution de la synthèse de thyroglobuline chez les trois Téléostéens consi¬

dérés.

La température optimale de biogenèse in v itro de cette protéine chez les Téléostéens

est inférieure à la température d’incubat ion de 38°C utilisée pour les thyroïdes mammaliennes.

Elle est de 20°C chez les deux Salmonidés et de 25°C chez l’Anguille.

A la différence de ce qui esl observé chez ces trois Téléostéens, la synthèse de préTG

est beaucoup plus intense à 30 qu’à 15°C chez le Protoptère. Ceci permet de supposer,

bien que des résultats à des températures intermédiaires fassent défaut, que la température

optimale de synthèse de la thyroglobuline chez le Protoptère est voisine ou supérieure à

30°C.

5 15 20 25 30 38 5 15 20 30

Température d’incubation °C Température d’incubation °C

18 19

Fig. 18. — Influence de la température d'incubation sur la synthèse in vitro de la thyroglobuline

dans la thyroïde de diverses espèces de Poissons.

Activités spécifiques de 3 H-Tyr données figure l'i.

Fig. 19. — Influence de la température d'incubation sur la synthèse de thyroglobuline

dans les nodules thyroïdiens de Saumon.

-6 h ; -. 24 h.

Incubations réalisées pendant :

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

Les réductions de la biogenèse de préTG à 30°C chez les Salmonidés et à 38°C chez

l’Anguille sont comparables (fig. 18).

Les valeurs optimales obtenues pour la synthèse de cette protéine en fonction de la

température d’incubation ne résultent pas d’une simple, influence de ce facteur sur la

cinétique des processus de biosynthèse. En effet, après 24 h comme après 6 h d’incubation,

l’intensité delà biosynthèse de préTG dans les nodules thyroïdiens de Saumon est maximale

à 20°C (fig. 19). A 5, 15 et 20°C la quantité de préTG formée augmente avec la durée d’incu¬

bation, mais demeure pratiquement constante à 30°C, de 6 à 24 h.

3. Température d’incubation et coefficient de sédimentation de la thyroglobuline néosynthé-

tisée

Pour chaque espèce de Poisson étudiée, les coefficients de sédimentation des préTG syn¬

thétisées in vitro à des températures inférieures à 30°C chez les Salmonidés et à 38°C chez

l’Anguille ne varient pas significativement entre eux, ni avec la durée d’incubation. Ils

sont inférieurs de 1 S à ceux des thyroglobulines correspondantes, iodées in vivo et natives

(tabl. XI).

Tableau XI. — Influence de la température d’incubation sur le coefficient de sédimentation

de la 3 H-préTG synthétisée in vitro dans les nodules thyroïdiens des Téléostéens.

Espèces

Température d’inctj-

Coefficient de sédimentation (en S ±sm)

bation (en °C)

3 H préTG

TG native

Saumon

5-15-20

(10) 16,7 ± 0,030

(17) 17,7 ± 0,080

(5) 18,6 ± 0,120

Truite

5-15-20

(7) 16,8 ± 0,071

(8) 17,7 ± 0,055

(2) 18,5 ± 0,220

Anguille

5-15-20-25-30

(9) 18,2 ± 0,044

(7) 19,2 ± 0,038

(2) 19,4 ± 0,010

Les coefficients de sédimentation sont déterminés par ultracentrifugation en gradient de saccharose

d’un mélange de thyroglobuline néosynthétisée in vitro marquée par 3 H-Tyr et de 125 I TG de Bœuf (19 S),

(n), nombre de déterminations ; Sm : erreur standard de la moyenne,

Par contre, lorsque les incubations sont réalisées à 30°C et 38°C respectivement chez

les Salmonidés et l’Anguille, les coefficients de sédimentation des protéines néosynthétisées

sont nettement plus élevés et atteignent des valeurs supérieures à celles des protéines nati¬

ves (tabl. XI). Cet accroissement est observé en présence ou non de propylthiouracile et

de perchlorate de sodium dans le milieu d’incubation et est donc indépendant des processus

d’iodation.

Les vitesses de sédimentation des thyroglobulines marquées in vitro par 125 1 et natives

ne sont pas modifiées après incubation à ces températures élevées.

ANDRÉE BRISSON

Ce phénomène a été étudié en particulier chez le Saumon atlantique (Brisson-Mak-

tin et Laciiiver, 19726) où un accroissement du coefficient de sédimentation est déjà

observé au niveau de la sous-unité marquée par la tyrosine tritiée à 30°C.

La constante de sédimentation de la préTG synthétisée à une température déterminée

{30 ou 15°C) n’est pas altérée si l’extrait thyroïdien est placé ultérieurement pendant 24 h à

une température inférieure (15°C) ou supérieure (30°C).

0 40 30 20 io F

0 40 30 20 10 F

Fractions

Fig. 20. — Dissociation par le SDS de la thyroglobuline de Saumon de montée synthétisée in vitro

en présence de 3 U-Tyr A 15 n t' [a) et à 30°C (h).

Les incubations sont réalisées en présence de PTU (1 mJVl) et de NaC10 4 (2 mM). La préTG marquée par

3 H-Tyr est. purifiée selon le protocole décrit figure 8 b, puis traitée pur le SOS et analysée en gradient

de saccharose dans les conditions décrites figure 8 o.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

Par ailleurs, nous avons étudié l’action du dodécyl sulfate de sodium sur la préTG

synthétisée in vitro à différentes températures dans les nodules thyroïdiens du Saumon

de printemps (Brisson-Martin et Lachiver, 1972£i), après isolement et purification de

cette protéine selon le protocole précédemment décrit.

Pour les températures d’incubation 5, 15 ou 20°C, 85 % environ de la préTG se disso¬

cient en sous-unités 10,6 S (fîg. 20 a). Par contre, la préTG synthétisée à 30°C se montre

plus résistante au détergent : 35 % seulement de cette protéine sont dissociés en sous-unités

11,9 S (6g. 20 b).

Discussion

Analyse des protéines synthétisées in vitro dans la thyroïde des Poissons

Les processus de biosynthèse in vitro des protéines thyroïdiennes chez les Poissons

étudiés présentent divers points communs avec ceux décrits chez les Mammifères :

— Les thyroïdes incorporent la tyrosine tritiée dans différentes fractions protéiques

solubles dont le spectre d’ultracentrifugation en gradient de saccharose est analogue à

celui des protéines synthétisées in vivo et in vitro dans la thyroïde des Mammifères. Leurs

coefficients de sédimentation sont voisins, par ordre croissant, de 3-8, 12 et 19 S.

— La biosynthèse de ces protéines est indépendante de. l’iodation.

— Dans le cas de chacune des espèces étudiées, la protéine tritiée qui migre le plus

rapidement présente un coefficient de sédimentation voisin, mais légèrement inférieur

(1 S) à celui de la thyroglobuline native, que les incubations soient réalisées en présence

ou non d’inhibiteur de l’iodation. Cette protéine qui n’est donc pas ou très peu iodée et qui

est précipitée par le sulfate d’ammonium dans les mêmes limites de concentration que la

thyroglobuline, correspond vraisemblablement à la préthyroglobuline des Mammifères.

La fraction protéique tritiée ~ 12 S présente une importance très variable selon les

espèces, mais aussi au sein d’une même espèce. Chez l’Anguille, en particulier dans des

conditions expérimentales apparemment identiques, la proportion de cette protéine peut

varier de 25 à ~ 0 % (fîg. 6 a et 16) sans qu’il soit possible de relier cette variabilité à un

facteur expérimental précis.

L’origine de cette fraction protéique a fait l’objet de nombreuses discussions. Repré-

sente-t-elle un précurseur de la thyroglobuline ou n’est-elle qu’un produit de dissociation

de cette protéine ?

Ce composé ~ 12 S, marqué par les acides aminés radioactifs, mis en évidence dans

les extraits thyroïdiens de certains Mammifères (Seed et Goldberg, 1963, 1965a; Lts-

sitzky et al., 1964, 1965; Nunkz et al., 1967a; Cavalieri et Searle, 1967a; Ekiiolm

et Strandberg, 1967a, b ; Thomson et Goldberg, 1968) a généralement été considéré

comme le précurseur de la thyroglobuline.

Mais actuellement la seconde hypothèse semble prévaloir (Vecchio et al., 1971), car

Schneider et al. (1970, 1971) ont montré que la présence du composé 12 S dépend des

conditions expérimentales utilisées. En effet, à basse température (2 à 9°C) et force ionique

de 0,15, la thyroglobuline nêosynthélisée à 38°C et la thyroglobuline peu iodée de Cobaye

et de Rat, mais non celles de Bœuf, se dissocient en sous-unités 12 S, qui peuvent se réasso-

ANDRÉE BRISSON

ciei - à 23°C en 19 S. Ces résultats suggèrent que la sous-unité n’est pas normalement présente

in situ dans la thyroïde des Homéothermes. La mise en évidence de cette protéine serait

due à la dissociation de la thyroglobuline néoformée dont la structure est plus labile que

celle de la thyroglobuline préformée (Sellin et Goldberg, 1965 ; Lissitzkv et al., 1965a ;

Nuisez et al., 1966 ; Simon et al., 1966 ; [noue et Taurog, 19686, c).

Les divers degrés de stabilité thermique des préTG selon l’espèce de Mammifères

étudiée sont vraisemblablement liés à des variations dans la structure primaire de cette

protéine. Il doit en être de même chez les Poïkilothermes dont les thyroglobulines présentent

des compositions différentes entre elles et de celles des Mammifères (Marchelidon et al.,

1972).

Dans le cas des Poïkilothermes et des Mammifères hibernants, dont la température

corporelle subit d'amples variations, le problème de la stabilité thermique de la préthyro¬

globuline en fonction des conditions expérimentales se pose différemment et doit être envi¬

sagé en considérant les caractéristiques thermiques de chaque espèce.

En effet, la température expérimentale de 5°C utilisée est physiologique pour les Téléos-

téens étudiés. Par ailleurs, la mise en évidence d’une proportion non négligeable de préTG

synthétisée à 5°C dans les thyroïdes de ces Poissons, sans que le pourcentage de la sous-

unité augmente, suggère que la thyroglobuline nouvellement synthétisée présente une cer¬

taine stabilité à basse température chez les Poissons.

L'accumulation in situ de la sous-unité due à une faible vitesse de polymérisation

et l'iodation éventuelle de cette protéine n’est donc pas entièrement exclue chez les Poïki¬

lothermes et chez certains Mammifères hibernants comme le Lérot (Lachiveh et Fontaine,

1964).

Dans l’hypothèse inverse, la dissociation et la réassociation de la thyroglobuline néo-

formée ou peu iodée en fonction de la température corporelle pourrait constituer un phé¬

nomène naturel dans le domaine des températures physiologiques de chaque espèce animale.

Le matériel migrant dans la zone 3-8 S n’a pas été analysé chez les Poissons, mais

est probablement de nature hétérogène comme chez les Mammifères où il contient en plus

des précurseurs de la thyroglobuline (Roques et al., 1969 ; Vecchio et al., 1969, 1971 ; Ceriani

et al., 1971) d’aulres protéines susceptibles d’être synthétisées in vitro dans la thyroïde

(Otten et al., 1971).

Température d’incubation et biosynthèse de la thyroglobuline

L’étude de l’influence de la température d’incubation sur la synthèse protéique thy¬

roïdienne chez les Poissons met en évidence d’une part un certain nombre de phénomènes

communs pour les diverses espèces considérées et. d’autre part l’existence de différences

interspécifiques dans les zones de températures optimales pour la synthèse de thyroglo¬

buline (Brisson-Mahtin et Lachiver 1972a).

Chez les divers Poissons étudiés, l’accroissement de la température d’incubation jusqu’à

une valeur limite supérieure s’accompagne d’une augmentation de l’incorporation de 3 H-Tyr

dans la thyroïde et de la quantité de thyroglobuline néosynthétisée. Ces données, bien

qu’obtenues in vitro, sont en accord avec l'influence positive de la température in vivo

sur le métabolisme iodé thyroïdien des Poissons (voir Introduction). Bien que la synthèse

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

et l’iodation des protéines thyroïdiennes soient indépendantes l’une de l’autre, il est vrai¬

semblable que ces deux processus sont plus ou moins synchronisés afin d’assurer un fonc¬

tionnement thyroïdien harmonieux.

Un elîet direct ou indirect de la température d’incubation sur la synthèse protéique

thyroïdienne peut être envisagé.

Les travaux de Leloup et Fontaine (i960) suggèrent que le relais hypophysaire est

mis en jeu dans l’influence de la température in vivo sur le métabolisme iodé thyroïdien,

puisque cette dernière disparaît chez l'Anguille hypophysectomisée. L’élévation de la tem¬

pérature pourrait entraîner une augmentation du taux de TSH circulant (Fontaine et

Fontaine, 1957). Cependant dans nos conditions expérimentales in vitro, l’hypothèse

d’un effet direct de la température sur la synthèse protéique thyroïdienne est plus vraisem¬

blable.

L’élévation de la température peut jouer à différents niveaux de la synthèse des pro¬

téines thyroïdiennes.

Ne ville (1971) observe que la pénétration in vitro de la cycloleucine dans le muscle

de Grenouille est plus rapide à 25 qu’à 0°C. Morris et Smith (1967) constatent que la vitesse

d’incorporation in vivo de certains acides aminés dans la muqueuse intestinale du Poisson

rouge augmente en fonction de la température d’acclimatation de l'animal. Il est donc

probable que l’augmentation de la température d’incubation accélère l’entrée des acides

aminés dans les cellules thyroïdiennes, ainsi que les vitesses des diverses réactions enzy¬

matiques impliquées dans la synthèse des protéines thyroïdiennes.

Une influence positive de l’élévation de la température d’incubation est observée

chez les divers Poissons étudiés, mais cette action s’exerce jusqu’à une température limite

supérieure qui diffère selon l’espèce considérée.

La mise en évidence in vitro d’un optimum thermique de synthèse de la thyroglo¬

buline peut a priori résulter de conditions expérimentales artefactuelles ou correspondre

à certains caractères spécifiques des cellules thyroïdiennes. Envisageons successivement

ces possibilités.

— In vitro, l’optimum thermique de certaines fonctions physiologiques varie avec

les conditions ioniques du milieu ; la valeur de cet optimum tend à s’élever lorsque le rapport

K+/Na + augmente (Bachrach et Guillot, 1941). Alors que les concentrations en Na +

dans la colloïde de la thyroïde et dans le plasma de Hat sont similaires ( ~ 140 mEq/1),

la concentration en K + dans la colloïde thyroïdienne (~ 1.0 mEq/1) est deux à trois fois

supérieure à celle du plasma (Yotjni; et al., 1970). Ces auteurs suggèrent que la forte con¬

centration en K+ de la thyroïde est en relation avec l’état fonctionnel de la glande. Par

ailleurs, un environnement intracellulaire riche en K+ et pauvre en Na + est nécessaire aux

étapes initiales de la synthèse protéique (Lubin, 1964) et à l’entrée des acides aminés et

des sucres dans les cellules. Nous savons aussi que l’incubation à 5°C de tissus de Mammi¬

fères entraîne un appauvrissement de ceux-ci en K 4 , appauvrissement beaucoup plus

atténué dans les tissus des Hibernants que dans ceux des Homéothermes (Willis, 1972) ;

Smith (1972) suppose qu’il en est de même pour les tissus des Poïkilotherines. Or les milieux

de Campagne et Grüber ou de Cortland, qui sont sensiblement isoosmotiques au plasma

des Poissons étudiés, présentent respectivement un rapport K+/Na+ de 0,1 et 0,06, supérieur

à celui du plasma (~ 0,03 dans le cas de l’Anguille). Sous cet aspect, les conditions ioniques

ANDRÉE BEISSOIN

des milieux utilisés semblent donc convenables pour la synthèse de thyroglobuline chez

les Poissons à toutes les températures étudiées.

— Pour chaque espèce étudiée, une légère variation de cet optimum en fonction de

la température à laquelle sont acclimatés les animaux n’est pas exclue. Aussi nous indiquerons

que les Saumons furent péchés dans les gaves dont la température est voisine de 10°C

(± 2°C), que les Truites et les Anguilles furent maintenues en eau courante au laboratoire

entre 12-15°C et les Protoptères dans de l’eau à 20°C.

— Cependant la zone de température optimale à la biogenèse in vitro de la thyroglo¬

buline semble varier selon l’espèce en fonction des caractéristiques thermiques des Poissons

étudiés.

Ainsi une intensité maximale de la synthèse de la thyroglobuline est observée à 20°C

chez les deux Salmonidés, Poissons des régions tempérées qui présentent la zone de tolé¬

rance thermique la plus basse (Brett, 1956). Leurs températures léthales inférieure et supé¬

rieure sont respectivement voisines de 2 et 25°C.

La température optimale de synthèse de la thyroglobuline est de 25°C chez l’Anguille

européenne. Or ce Téléostéen est beaucoup plus eurytherme que les Salmonidés et est

susceptible de vivre dans des biotopes très variés. Aucune donnée précise sur la zone de

tolérance thermique de cet Apode n’a été trouvée dans la littérature, mais nous savons

que des Anguilles sont fréquemment pêchées dans des eaux de 25°C et qu’elles ne présen¬

tent un bon développement en pisciculture qu’au-dessus de 18°C (Huet, 1970), tempéra¬

ture quasi maximale utilisée dans les piscicultures de Truite. Par ailleurs, nous avons cons¬

taté que des Anguilles, maintenues préalablement à 15°C supportent pendant plusieurs

jours une température de 30°C et meurent après 24 ou 48 b à 35°C. La température léthale

supérieure de l’Anguille est donc nettement plus élevée que celle des Salmonidés et doit

être voisine de 35°C.

Chez le Protoptère, la biosynthèse de la thyroglobuline est beaucoup plus intense

à 30°C qu’elle ne l’est à 15°C. Ceci permet de penser que la température optimale de synthèse

de cette protéine est voisine de 30°C chez ce Poisson. Or ce Dipneuste, originaire du Tchad,

vit dans des eaux calmes dont la température peut atteindre 30°C dans les mares isolées

et présente vraisemblablement une température léthale supérieure encore plus élevée que

celle de l’Anguille européenne.

Au-delà de ces températures optimales d’incubation la quantité de thyroglobuline

néosynthétisée diminue chez les trois Téléostéens étudiés pour être nettement réduite à

30 et 38°C respectivement chez les Salmonidés et l’Anguille.

On peut supposer qu’au-delà d’une certaine température critique, l'élévation de la

température exerce une action dénaturante sur les systèmes enzymatiques en entraînant

leur inactivation.

11 est probable que certaines étapes de la biosynthèse de la thyroglobuline ne se réali¬

sent pas à des températures d’incubation supraphysiologiques car il est généralement

admis qu’une correspondance étroite existe entre les températures léthales supérieures

des cellules et celles des organismes entiers dans les différentes classes de Vertébrés (Ste-

phenson, 1966 ; l.rcHT, 1969). Ainsi Wolf et Quimby (1962) constatent que la température

limite de survie en culture des gonocytes de Salmonidés est de 26°C. Cette température

ne correspond pas cependant à la disparition de tous les processus métaboliques dans les

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

divers organes : la consommation d’oxygène in vitro du cerveau de Salnio salar L. et Sal¬

ve! inus fontinalis Mitch. augmente de 6 à 30°C (Peterson et Anderson, 1969).

Nous constatons que les thyroïdes des Salmonidés et de l’Anguille, incubées pendant

6 h à 30 et 38°C, températures léthales pour ces Téléostéens, ne présentent qu’une structure

folliculaire partiellement bien conservée.

Chez les Mammifères, la synthèse de thyroglobuline a été mise, en évidence en système

acellulaire (Nunez et al., 1967 b ; Mobajs et Goi.dherg, 1967 ; de Nayer et de Vissciier,

1969, 1970). Il est intéressant de noter une certaine analogie entre les phénomènes observés

dans le système précité (accroissement du coefUcient de sédimentation de la protéine syn¬

thétisée et résistance accrue au détergent) et les résultats obtenus à 30 et 38°C chez les

Téléostéens étudiés, températures auxquelles une désintégration cellulaire partielle est

observée. En effet, alors que dans un domaine de températures physiologiques pour ces

Poissons, le coefficient de sédimentation de la préTG pour chaque espèce ne varie pas,

une augmentation significative du coefficient de sédimentation de cette protéine est consta¬

tée à des températures supraphysiologiques. Dans le cas du Saumon, l’accroissement, de

ce paramètre est déjà mis en évidence au niveau de la sous-unité (Brisson-Martin et Lachi-

ver, 19726), et la préTG synthétisée à 30°C présente aussi une résistance accrue au dodécyl

sulfate de sodium. Ceci permet de supposer que les températures d’incubation élevées

favorisent la formation de liaisons covalentes entre les sous-unités, mais sont susceptibles

de modifier aussi la structure tertiaire des sous-unités et donc la structure quaternaire de

la thyroglobuline.

La synthèse in vitro de la thyroglobuline dans les thyroïdes des Téléostéens étudiés

est donc optimale à des températures d’incubation très nettement inférieures à celles de

38°C utilisée pour incuber les thyroïdes mammaliennes, lesquelles conservent leur structure

spécifique après 24 h à cette température (Nunez et al., 1964).

Les différences d’activité thyroïdienne et de capacité de biosynthèse protéique en

fonction de la température entre les thyroïdes des Poissons et des Mammifères apparaissent

nettement aussi à de basses températures dans des conditions expérimentales d’incubation

identiques.

Alors qu’à 5°C une synthèse de préTG est mise en évidence chez les divers Poissons

étudiés, fincorporation de 3 H-Tyr et la formation de thyroglobuline sont pratiquement

milles dans les thyroïdes d’un I loniéol hernie, le Rat, et d’un Hibernant, le Lérot (Elyamis

quercinas L.), incubées à 5°C pendant 6, 24 ou 48 h (Lachiver, 1969). Les cellules en incu¬

bation conservent cependant leur faculté de synthèse protéique, qui reprend rapidement

dès que les coupes sont portées à 38°C et plus lentement à 20°C.

Des différences analogues dans le comportement des thyroïdes des Mammifères et des

PoïkiInthermes, incubées à basse température, sont observées en étudiant le métabolisme

iodé (voir Lachiver, 1969).

L’ensemble des données relatives à l’influence de la température in vitro sur

la biosynthèse protéique thyroïdienne, obtenues chez les différents Vertébrés étudiés,

est à rapprocher de certains travaux réalisés sur divers Poïkilothermes et Mammifères.

Hochachka et Somero (1968), Somero et Hochachka (1968), Johansson (1969), Behrish

(1969), Somero (1969, 1972) montrent que la température peut, par divers mécanismes,

jouer un rôle important dans la régulation de l'activité enzymatique. Ces ajustements

thermiques sont considérés comme adaptatifs si les enzymes présentent une activité maxi-

ANDRÉE BRISSON

male pour des températures correspondant à celles de l’environnement naturel des animaux.

Par ailleurs, Licht (1967, 1969) observe un parallélisme entre les différences interspéci¬

fiques des thermopreferenda de divers Lézards, les différences des températures optimales

d’activité des muscles et de l’adénosine triphosphatase musculaire et les différences des

températures de dénaturation de cet enzyme.

A la lumière de ces différents résultats, bien que la biosynthèse de la thyroglobuline

constitue un phénomène global très complexe, l’hypothèse d’une certaine adaptation

thermique des processus enzymatiques impliqués dans la synthèse de cette protéine, en

fonction de la zone de tolérance thermique de chaque espèce, peut être envisagée.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

III. IODATION IN VIVO DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

Dans la thyroïde des Mammifères, la thyroglobuline et l’iode jouent un rôle capital

dans la biogenèse hormonale. L’iodation de certains résidus de tyrosine de la thyroglo¬

buline et le couplage de deux iodotyrosines conduit à la formation des hormones thyroï¬

diennes, qui sont ensuite libérées lors de la protéolyse de la thyroglobuline et sécrétées

dans le sang.

Chez les Vertébrés inférieurs, dans la thyroïde desquels les iodothyronines T 4 et T 3

ont été identifiées, l’hormonogenèse s’effectue vraisemblablement selon un schéma simi¬

laire, mais à des vitesses plus faibles et très variables Selon l’espèce (voir mises au point

Berg el al., 1959; Leloup et Fontaine, 1960; Dodu et Matty, 1964 ; Gorbman, 1969).

Nous avons montré que la thyroïde des Vertébrés inférieurs étudiés contient des pro¬

téines thyroglobuliniques, atteignant des taux d’iodation élevés, dont la synthèse est indé¬

pendante de Tiodalion et probablement antérieure à ce processus comme chez les Mammi¬

fères.

Dès 1948, Deriuèn el al. avaient émis l’hypothèse que toutes les molécules de thyro¬

globuline présentes dans les vésicules colloïdes n’étaient pas uniformément iodées et que

la thyroglobuline était constituée par un mélange de fractions d'une même protéine, plus

ou moins halogénées.

Une telle hétérogénéité d’iodation a été mise en évidence par chromatographie sur

DEAE-ccIlulose des extraits thyroïdiens mammaliens (Ingbar et al., 1959 ; Roche et al.,

1960 ; Ui et al., 1961 ; Robbins, 1961, 1963 ; Shulman et Stanley, 1961 ; Bouchilloux

et al., 1964 ; Robbins et al., 1966).

Après équilibrage isotopique de la glande thyroïde de Rat avec 126 1, Lissitzky el al.

(1965), Robbins et al. (1966), Rappaport (1.970), Gavaret et al. (1971) ont mis eu évi¬

dence d’autres aspects de l'hétérogénéité d’iodation, en observant les modifications de cer¬

tains caractères physico-chimiques de la thyroglobuline, quisonl concomitantes de l’iodation.

En particulier, un accroissement du coefficient de sédimentation et de la stabilité de la struc¬

ture quaternaire de cette protéine est généralement constaté (Nunez et al., 1966).

Ces résultats suggèrent que la thyroglobuline des Mammifères est constituée de molé¬

cules présentant des degrés divers d’iodation. La thyroglobuline analysée étant extraite

de l’ensemble des vésicules colloïdes d’une ou de plusieurs glandes, une telle hétérogénéité

d’iodation peut se concevoir au niveau de chacun ou des divers follicules thyroïdiens.

Le fait que le métabolisme iodé thyroïdien soit beaucoup plus lent chez les Poissons

que chez les Mammifères nous a paru favorable à l’analyse des processus d’halogénation

dans la thyroïde.

Les dosages de 127 T ont été réalisés afin de mettre directement en évidence l’hétérogé¬

néité d’iodation susceptible d’exister au sein des thyroglobulines fortement iodées des

Poissons étudiés.

De plus, par double marquage des animaux par les isotopes radioactifs 131 I et 125 I à

des temps variés, la cinétique d’incorporation de l’iode dans les diverses protéines thyroï¬

diennes a été étudiée afin d’analyser le renouvellement de l’halogène dans la glande et au

sein de ces protéines.

177, 4

ANDRÉE BRISSON

A. — Mise en évidence de l’hétérogénéité d’iodation

AU SEIN DE I.A THYROGLOBULINE TGg ET DU POLYMERE TG 4

Une telle hétérogénéité, pour être significative, doit, être observée dans une thyroïde

unique et ne pas résulter d’un mélange de glandes. Aussi l’extrait thyroïdien de chaque

animal appartenant aux diverses espèces étudiées est analysé séparément par ultracentri¬

fugation en gradient linéaire de saccharose. Les protéines et l’iode sont dosés dans chaque

fraction du gradient avec une précision de 5 % environ.

Les figures 21 a, h, c, donnent un exemple des résultats obtenus pour les thyroïdes

de Saumon, de Roussette et d’Anguille.

Les courbes représentant respectivement les protéines et l’iode 127 I présentent un déca¬

lage net (d’une fraction environ) au niveau de TG 2 et moins accentué à celui de TG 4 .

T 127 1 pg

Le rapport-- -

protéines pg

lentes aux plus rapides où il présente un maximum puis décroît. Ainsi pour la TG 2 de Sau¬

mon, dont le taux d’iodation moyen est de 1,1 % dans le cas considéré (fig. 21 a), le degré

d’halogénation varie de 0,6 (32 at. 127 I/mole) à 1,3 % (68 at. 127 I/mole). Pour la TG 2 de

Roussette (fig. 21 h), dont le taux d’iodation moyen est de 0,5 %, les teneurs extrêmes

en iode sont de 0,3 % et 0,65 %.

Fig. 21. — Hétérogénéité d'iodation des protéines thyroïdiennes de divers Poissons.

L’hétérogénéité d’iodation a été mise en évidence dans la thyroglobuline de toutes

les espèces étudiées appartenant, aussi bien aux Vertébrés inférieurs (Poissons, Reptiles)

qu’aux Mammifères (Bœuf, Rat, Lérot). Elle est observée pour des valeurs moyennes ou

élevées du taux d’iodation moyen de la thyroglobuline, mais est moins accusée et parfois

presque inexistante dans le cas de glandes très faiblement iodées (I % = 0,1).

% ou taux d’iodation (I %) augmente des fi actions les plus

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

En accord avec les données obtenues chez les Mammifères, l’interprétation la plus

classique de ce phénomène, et qui sera retenue, paraît être la suivante :

1. La thyroglobuline présente dans la thyroïde des Poissons étudiés est constituée

des molécules d’une même protéine, à différents degrés d’iodation. L’hétérogénéité d’ioda¬

tion serait l’image, à un moment donné, des processus continus d’iodation de la molécule

depuis sa biosynthèse jusqu’à son hydrolyse.

2. Cet accroissement dans l’halogénation des molécules détermine des modifications

importantes de leurs propriétés (forme ou densité) qui entraînent leur séparation dans le

gradient.

Cependant certaines objections peuvent être formulées à l’égard d’une telle interpré¬

tation :

a — Les variations apparentes du rapport 127 I/protéines dans le pic de TG 2 pourraient

être déterminées par la présence de protéines non apparentées à la thyroglobuline et migrant

au niveau de celle-ci (immunoglobuline IgM 19 S). Il faudrait alors supposer, hypothèse

peu vraisemblable, que ces protéines présentent des variations spécifiques de leur coeffi¬

cient de sédimentation étroitement parallèles à celles de la thyroglobuline. Par ailleurs,

l’hétérogénéité d’iodation est toujours observée après purification de la thyroglobuline

par relargagc au sulfate d’ammonium selon Derrien et al. (1948).

b — La présence, au niveau de certaines fractions de la thyroglobuline, de fragments

de celle-ci provenant d’une hydrolyse partielle et donc plus ou moins halogènes, pourrait

aussi rendre compte, tout au moins pro parte, des phénomènes observés. Les étapes de la

dégradation in vivo de la thyroglobuline sont mal connues. In vitro, son hydrolyse est lente

et donne des dérivés de faible poids moléculaire. L’hypothèse d’une réutilisation d’une

partie de la molécule de thyroglobuline après hydrolyse a été envisagée (Pitt-Rivers,

1963 ; Wollman, 1969).

c L’iodation et les modifications éventuelles de la molécule qu’elle entraîne (forme

ou densité) est-elle le seul facteur susceptible de rendre compte de la stratification des

molécules de TG 2 dans le gradient ?

Il faut remarquer tout d’abord que les fractions les plus lentes qui doivent contenir

les molécules de TG, néosynthétisée non iodée, ont un taux d’iodation relativement élevé.

Il est probable que les phénomènes de diffusion tendent à masquer l’existence d’une hété¬

rogénéité d’iodation plus accentuée que celle mise en évidence. Chaque fraction est elle-

même constituée d’un mélange de molécules plus ou moins iodées et. le taux d’iodation

maximal, que la TG 2 peut atteindre, doit donc être supérieur à la valeur déterminée.

De Ckombruggre et al. (1967) constatent que le coefficient de sédimentation de la

thyroglobuline humaine croît de 1 S environ pour une augmentation de la teneur en iode

de I %. Pour les diverses espèces de Poissons étudiées, nous avons aussi observé une telle

différence do 1 S entre les coefficients de sédimentation moyens respectivement de la prcTG

non iodée et de la TG a fortement iodée (I % 1). Mais des variations aussi faibles, en fonc¬

tion du taux d’iodation, des propriétés physico-chimiques de la TG 2 , de la densité par

exemple, ne devraient pas permettre une séparation des molécules en fonction de ce facteur,

telle que nous l'observons.

Il faut noter que les dilférences de coefficient de sédimentation, que l’on peut calculer

ANDRÉE BRISSON

le long du gradient pour les fractions protéiques présentant les degrés d’iodation extrêmes,

ne correspondent pas aux variations réelles de ce paramètre en fonction de la teneur en

iode. En effet, à différentes augmentations du taux d’iodation de 0,67 % (Saumon, fig. 21 a),

de 0,36 % (Roussette, fig. 21b), de 0,13 % (Rat carencé, fig. 25 c) correspond un même

accroissement apparent du coefficient de sédimentation de 4 à 5 S qui résulte essentiellement

de la distribution gaussienne des molécules centrifugées en gradient de saccharose.

Aussi, la répartition des molécules dans le pic de thyroglobuline selon leur degré d’ioda¬

tion reste délicate à interpréter.

Un déplissement partiel, dû à la basse température de centrifugation (Schneider

et al., 1970, 1971) affectant les molécules peu iodées delà thyroglobuline peut être envisagé,

ce déplissement ayant pour conséquence de réduire le coefficient de sédimentation de ces

molécules et de permettre ainsi leur séparation des molécules plus halogénées.

Afin de tester la validité de cette hypothèse, des extraits thyroïdiens de Rat et de Truite

ont été conservés, puis analysés à 5°C ou 23°C. A ces deux températures expérimentales,

les courbes d’iodation dans la thyroglobuline restent très similaires (fig. 22 a, b, c, d). Cette

hypothèse ne se vérifie donc pas.

a BIT 5 C b BAI 23 C c TRUITE 5°C d TRUITE 23°C

Prot.uB 4_nJ) 12 u _

^ r,tl,0,ls Fractions

Fig. 22. — Hétérogénéité d'iodation de la thyroglobuline et température de centrifugation.

Les extraits thyroïdiens de Rat (régime standard) et de Truite sont ultracentrifugés en gradient de saccha¬

rose à 65 000 tpm pendant 2 h 15 à 5°C et pendant 1 h 45 à 23°C. Seules les fractions correspondant

à la thyroglobuline sont représentées sur les graphiques.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

Il est vraisemblable qu’à l’hétérogénéité d’iodation observée se superpose et s’ajoute

un autre type d’hétérogénéité des molécules de thyroglobuline qui contribue à déterminer

une telle répartition des molécules dans le pic de thyroglobuline en fonction de leur teneur

en iode. Les modifications induites dans la thyroglobuline lors de l’addition séquentielle

des motifs glucidiques sont mal connues, mais cette dernière est susceptible de jouer un rôle

important dans l’élaboration de la structure de la thyroglobuline (Tarutani, 1971).

B. — Hétérogénéité du renouvellement

de l’iode dans les iodoprotéines thyroïdiennes

A l’aide des isotopes radioactifs de l’iode, un aspect complémentaire de l’hétérogénéité

d’iodation à l’égard du renouvellement de l'iode est mis en évidence d’une part entre les

protéines thyroïdiennes de poids moléculaire différent et d’autre part au sein de la thyro¬

globuline TG 2 et du polymère TG 4 .

1. Cinétique d’incorporation de l’iode radioactif dans les différentes protéines thyroïdiennes

Des expériences de simple et de double marquage ont été réalisées sur plusieurs ani¬

maux de chacune des espèces considérées afin d’étudier la cinétique d’incorporation de

l’iode radioactif dans les iodoprotéines thyroïdiennes des Poissons. Ces protéines sont ana¬

lysées par ultracentrifugation en gradient de saccharose.

Un exemple des résultats obtenus par double marquage in vivo est donné pour le Sau¬

mon, le Protoptère et l’Anguille (fig. 23) injectés par 131 1 et 125 1 respectivement quelques

heures et plusieurs jours avant le sacrifice.

La répartition de l’iode radioactif incorporé dans les diverses iodoprotéines est exprimée

en pour cent de la radioactivité totale de chaque extrait thyroïdien soluble dialysé. Elle

varie sensiblement en fonction du temps de marquage (Laoiiiver et al., 1966).

Chez le Saumon, le pourcentage de radioactivité liée à la protéine TG 1; qui est de

14 %, 3 h après l’injection de 131 1, est réduit à 4 % 8 jours après l’injection de 125 I. Simul¬

tanément la proportion de TG 2 augmente peu, tandis que celle du polymère TG 4 passe

de 12 à 20 %.

Dans les cas du Protoptère et de l’Anguille où la protéine TG 4 est quasi inexistante,

le pourcentage, de TG a diminue légèrement de quelques heures à plusieurs jours après l’injec¬

tion des isotopes radioactifs. Inversement, les proportions du ou des polymères TG 4 et

TG e cioissent nettement pendant ce temps.

La fixation et l’organifieation de l’iode radioactif par la thyroïde des Poissons aug¬

mentent lentement en fonction du temps (tabl. XII). Il en résulte que les BAS globales de

la glande et de l’extrait thyroïdien soluble croissent progressivement de quelques heures

à plusieurs jours après l’injection (tabl. XII).

Cependant la RAS globale de chacune des diverses protéines thyroïdiennes TG 4 , TG 2 ,

TG 4 , exprimée en % de la dose injectée/fig de 127 I évolue différemment en fonction du

temps de marquage (tabl. XII).

ANDRÉE BRISSON

SAUMON

PROT OPTERE

lus.

ANGUILLE

Fig. 23. — Évolution en jonction du temps de marquage des proportions relatives et des coefficients

de sédimentation des différentes iodoprotéines thyroïdiennes chez divers Poissons.

Tableau XII. — Évolution en fonction du temps de marquage des radioactivités spécifiques

globales des protéines thyroïdiennes solubles séparées par ultracentrifugation en gradient de

saccharose.

Espèces

Temps de

MARQUAGE

Fixation en

% dose

RAS

dose

GLOBALES Cil %

X 10-3/tXg 127 1

TGi

tg 2

tg 4

Saumon

3 h

131J

0,06

4,8

1,1

0,7

8 j

125 J

2,10

Protoptère

4 h

131J

0,56

19 j

125 J

24,40

740

730

Anguille

9 h

131J

0,54

8 j

125 J

4,83

390

255

Dans le cas du Saumon, 3 h après l’injection de 131 I la RAS de la protéine TG X est nette¬

ment supérieure à celles de TG 2 et de TG 4 . Huit jours après l’injection, elle est encore la

plus élevée, mais les RAS de TG 2 et TG 4 ont respectivement augmenté trois et quatre fois

plus que celle de TG 4 .

Pour le Protoptère et l’Anguille, on observe que la RAS du polymère TG„ est nettement

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

inférieure à celle de la thyroglobuline TG 2 dans les premières heures après l’injection, mais

qu’elle augmente beaucoup plus en fonction du temps de marquage que celle de TG 2 .

Ces divers résultats suggèrent que la vitesse d’incorporation de l’iode décroît des pro¬

téines thyroïdiennes les plus légères aux protéines de poids moléculaire plus élevé.

2. Hétérogénéité du renouvellement de l’iode au sein de la thyroglobuline TG„ et du polymère

TG 4

a — Coefficient de sédimentation et âge des molécules

La ligure 23 montre que pour chaque espèce le coefficient de sédimentation moyen

des molécules de thyroglobuline augmente sensiblement en fonction du temps de mar¬

quage. Chez les diverses espèces étudiées, l’accroissement du coefficient de sédimentation

de lapréTG non iodée, marquée par les acides aminés radioactifs, à la thyroglobuline native

iodée, est généralement égal à une unité Svedberg.

Dans le cas du polymère TG 4 , la constante de sédimentation des molécules natives

est légèrement supérieure à celle des molécules marquées par 131 1 ou 125 I.

b — Evolution de la RAS dans les iodoprotéines TG 2 et TG 4 en fonction du temps de

marquage

Les résultats obtenus pour les divers Poissons étudiés étant qualitativement analo¬

gues, les cas d’un Saumon et d’un Protoptère doublement marqués seront pris comme

exemples. Ils reçoivent respectivement 1 000 et 225 pC de m I, 8 et 19 jours avant le sacri¬

fice ainsi que 1 800 et 500 pC de 131 I, 3 et 4 h avant le sacrifice.

A titre de comparaison, une expérimentation a été réalisée sur des Rats carencés en

iode, dont on sait que l’activité thyroïdienne est très intense. On injecte à chacun d’eux

10 pC de 128 1 intrapéritonéalement et 100 pC de m I dans la veine jugulaire, respectivement

24 h et 5 rnn ou 2 h avant le sacrifice.

Au niveau de chaque fraction de TG 2 et de TG. t , les RAS et les fixations des deux

isotopes radioactifs injectés sont calculées respectivement en % de la dose injectée par pg

de 127 I et par pg de protéines (fig. 24 et 25).

L’examen de ces figures montre que dans les premiers temps après l’injection, c’est-à-

dire après quelques heures pour les Poissons (fig. 24) et après 5 mn pour les Rats caren¬

cés (fig. 25), la RAS et la fixation de 131 1 par pg de protéines sont maximales au niveau

des molécules de TG 2 et TG t de plus faillie vitesse de sédimentation et de moindre teneur

en iode. Elles diminuent très nettement comme le taux d’iodation des molécules augmente

et deviennent minimales au niveau des fractions les plus rapides et les plus iodées.

La confrontation des profils des courbes de RAS et de fixation montre que ce sont

les fractions protéiques les plus lentes qui présentent la RAS maximale, non seulement

parce qu’elles sont les moins riches en 127 1 niais aussi parce qu'elles fixent le plus intensément

l’iode par pg de protéines.

A des temps plus longs après l’injection, la RAS et l’incorporation de l’iode dans les

différentes fractions protéiques constituant la thyroglobuline évoluent très différemment

en fonction du temps de marquage chez les Poissons et les Rats carencés.

Dans le cas des Poissons, plusieurs jours après l’injection de 125 I, la RAS ainsi que la

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

Fractions

Fig. 25. — Évolution de la RAS et de la fixation de l'iode en fonction du temps de marquage

par Viode radioactif dans la thyroglobuline de Rat carencé en iode.

fixation ont augmenté au niveau de toutes les fractions protéiques, mais sont encore maxi¬

males pour les molécules les moins iodées et les plus lentes, tant dans TG 2 que dans TG 4 .

Cependant, Faccroisserrieut de ces paramètres est 2 à 3 fois plus important pour les frac¬

tions rapides de taux d’iodation élevé que pour les fractions lentes peu iodées (fig. 24 a,

h, c, d).

Au contraire, chez les Rats carencés, les valeurs maximales de RAS (fig. 25 a, e) et

de fixation (fig. 25 b, d) tendent à être transférées des molécules lentes aux molécules

ANDRÉE BRISSON

les plus rapides et plus halogénées en fonction du temps de marquage. On observe aussi,

24 h après l’injection de 125 I, que la RAS des diverses molécules de TG 2 est plus homogène

et est égale à la moitié de celle de 181 1 injecté 2 h avant le sacrifice.

Par ailleurs, nous avons constaté que le coefficient de sédimentation de la TG 2 de ces

Rats carencés croît rapidement en fonction du temps de marquage et présente dès 24 h

après l’injection un coefficient de sédimentation égal ou supérieur à celui de la thyroglo¬

buline native.

L’évolution très différente en fonction du temps du profil des courbes de RAS et de

fixation dans la thyroglobuline des Poissons et des Rats carencés résulte probablement

de différences profondes dans les vitesses du métabolisme iodé thyroïdien et du renouvelle¬

ment de la TG 2 .

En effet, chez les Poissons, la fixation de l’iode radioactif par la glande croît lentement

en fonction du temps. La RAS de l’iodure intrathyroïdien croît jusqu’à être en équilibre

avec celle de l’iodure plasmatique et demeure sensiblement constante pendant le temps

de l’expérimentation. Chez le Saumon, elle est égale à 0,038 et 0,047 respectivement. 3 h

et 8 jours après l’injection. Chez le Protoptère, elle passe de 1,21 à 1,04 de 4 h à 19 jours.

En revanche, chez les Rats carencés, la fixation de l’iode radioactif par la thyroïde

est très intense ; elle atteint un maximum 1 ou 2 b après l'injection, puis diminue rapide¬

ment. Il en résulte que 24 h après l’injection, les molécules néosynthétisces non iodées

fixent un iodure thyroïdien dont la RAS a décru de moitié par rapport au temps 2 h. Cepen¬

dant un recyclage rapide de l’iodure radioactif dans la thyroïde peut tendre à donner une

RAS plus homogène à l’ensemble des molécules de TG 2 .

En outre, la TG 2 des Rats carencés présentant une teneur en iode très faible compara¬

tivement à celle des Poissons, les molécules néosynthétisées peuvent atteindre beaucoup

plus vite le taux d’indation moyen ou maximal de la TG 2 . Elles peuvent donc être rapidement

transférées vers les fractions protéiques les plus riches en iode, ce qui se traduit par l’augmen¬

tation rapide du coefficient de sédimentation de la TG 2 en fonction du temps de marquage.

C. — Hétérogénéité b iodation et stabilité

DE LA STRUCTURE QUATERNAIRE DE LA THYROGLOBULINE TG 2

1. Dissociation par le dodécyl sulfate de sodium des iodoprotéines thyroïdiennes

Les extraits thyroïdiens sont traités par le détergent dodécyl sulfate de sodium (SDS)

pendant 1 h à 20°C dans des conditions telles que la dissociation soit quasi maximale (voir

Techniques).

Les figures 26 a, b, c, d représentent les profils d’ultracentrifugation des extraits

thyroïdiens d’un Saumon et d’un Protoptère avant et après traitement par le SDS.

L’addition de ce détergent provoque une dissociation partielle de la thyroglobuline

en sous-unités, mais également une dissociation importante des polymères de la thyroglo¬

buline.

Dans le cas du Protoptère, la proportion de matériel 3-8 S augmente nettement et une

fraction non négligeable de 127 I se trouve à ce niveau après addition de SDS. Certaines

molécules se dissocient donc en composés, de poids moléculaire inférieur à celui de la sous-

unité ~ 12 S.

ANDREE BRISSON

Dans tous les cas étudiés, les molécules résistantes au SDS présentent une teneur

moyenne en 127 I supérieure à celle des molécules dissociées (tabl. XIII). On constate éga¬

lement, qu’après traitement par le SDS, une forte hétérogénéité d'iodation est mise en évi¬

dence, principalement au niveau de la sous-unité ~ 12 S obtenue par dissociation. En

effet, dans cette fraction protéique dissociée, le taux d’iodation, qui présente la valeur

minimale au niveau des molécules lentes de TG 1; augmente progressivement vers les molé¬

cules plus rapides (fig. 26 b, d).

Tableau XIII. — Taux d’iodation moyen des molécules de thyroglobuline

avant et après dissociation par le dodécyl sulfate de sodium.

Taux d

iodation moyen (en % de TG 2 )

Espèces

Avant SDS

Après SDS

Fraction

dissociée

Fraction

résistante

Saumon

1,46

0,96

1,59

Protoptère

1,18

1,03

1,25

Anguille

0,71

0,65

0,80

2. Dissociation et âge des molécules

Les figures 27 a et b montrent que plus les molécules sont marquées pendant des temps

courts, plus elles se dissocient en sous-unités. Ce phénomène déjà observé chez les Mammi¬

fères a été constaté chez les diverses espèces de Vertébrés inférieurs étudiés.

Dans le tableau XIV sont indiqués les taux de dissociation et les coelficients de sédi¬

mentation respectifs des molécules marquées par m I et I2o I, et des molécules natives iden¬

tifiées par les dosages de protéines et de 127 I. La TG 2 marquée pendant quelques heures

par 131 1, qui présente la plus faible vitesse de sédimentation moyenne, est beaucoup plus

dissociable que la TG a native ou marquée par 123 I plusieurs jours avant le sacrifice des

Poissons.

De plus, la comparaison des résultats obtenus pour les Saumons à deux étapes de leur

cycle vital (fig. 28) montre que la thyroglobuline des Saumons de fravères après un même

temps de marquage présente une structure nettement plus labile que celle des Saumons

de montée.

Un cas extrême est représenté par les Saumons de fravères pêchés pendant l’hiver

1968-1969, dont la TG a et les polymères, tant natifs que marqués à différents temps, se

sont dissociés intégralement en présence; de SDS, en un composé migrant dans la zone

3-8 S (fig. 29 a, b). Les taux d’iodation moyens de ces diverses iodoprotéines n’étaient

cependant pas significativement différents de ceux des protéines des autres Saumons de

frayères (tabl. VIII).

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTEINES THYROÏDIENNES

Fig. 27.— Dissociation par le SD S des protéines iodées de Saumon et de Protoptère en /onction du temps

de marquage.

Centrifugation 3 h 45 à 48 000 tpm, fractions de 10 gouttes (a) ; centrifugation 7 h à 41 000 tpm, fractions

de 20 gouttes (b).

ANDRÉE BRISSON

Tableau XIV. — Coefficients de sédimentation et dissociation

des molécules de thyroglobuline en fonction du temps de marquage.

Espèces Molécules 131 I TG 2 125 I TG 2 TG 2 native 12, I TG 2

3 h 8 j

Saumon

Dissociation

en %

17,0

17,3

17,4

17,6

4 h

21,8

19 j

22,1

22,3

22,7

Protoptère

Dissociation

en %

9 h

18,6

8 j

19,0

19,2

19,4

Anguille

Dissociation

en %

Les extraits thyroïdiens solubles sont analysés par ultracentrifugation en gradient de saccharose avant

et après traitement par le SDS.

La dissociation des molécules marquées et natives de thyroglobuline est évaluée par le rapport :

variation du pourcentage TG 2 avant et après SDS

pourcentage TG 2 avant SDS

1 4 8

Temps apres I injeclion ( jours) TG 2 native

Fig. 28. — Dissociation par le SDS de la thyroglobuline marquée in vivo à différents temps

par l’iode radioactif et de la thyroglobuline native chez les Saumons de montée et de frayères.

La dissociation est évaluée par le rapport : Variation du pourcentage de TG 2 avant et après SDS/pourcentage

initial de TG 2 .

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTEINES THYROÏDIENNES

Fig. 29. — Profil d'ultracentrifugation des protéines thyroïdiennes marquées in vivo

par Viode radioactif et natives d'un Saumon de frayères pêché en hiver 1968-1969.

Conditions d’ultracentrifugation comme indiquées figure 27 b. Avant traitement par le SDS (a) ; après

dissociation par le SDS (b).

ANDRÉE BRISSON

Par ailleurs, on constate pour le Protoptère (fîg. 27 b) que les molécules natives ( 127 I

TG 2 ) se dissocient partiellement en 3-8 S et dans une proportion supérieure à celle des molé¬

cules marquées par 131 I et 125 I.

3. Radioactivités spécifiques des iodoprotéines après traitement des extraits thyroïdiens par

le SD S

Dans le tableau XV sont indiquées les RAS moyennes des fractions dissociée et non

dissociée de la thyroglobuline en fonction du temps de marquage.

Dans tous les cas, la fraction résistante au détergent, qui correspond aux molécules

les plus riches en 127 I (tabl. XIII), présente quelques heures après l'injection de 131 I une

RAS plus faible, de quatre fois environ, que celle de la fraction dissociée (tabl. XV), et du

même ordre de grandeur que celle du polymère TG 4 (tabl. XII). Plusieurs jours après l’injec¬

tion de 125 I, la RAS de la fraction résistante tend à devenir égale à celle de la fraction dis¬

sociée (tabl. XV).

Tableau XV. — Évolution en fonction du temps de marquage des radioactivités spéciliques

de la fraction dissociée et de la fraction résistante de la thyroglobuline après addition de dodé-

cyl sulfate de sodium aux extraits thyroïdiens.

RAS en % dose X 10 -3

Espèces

Temps

par pg

127 J

_ fraction dissociée

MARQUAGE

fraction

fraction résistante

dissociée

résistante

Saumon

3 h

131J

2,8

0,9

3,1

8 j

125 J

1,4

Protoptère

4 h

131J

7,3

4,3

19 j

125 J

981

676

1,4

Anguille

9 h

131J

3,7

8 j

125 J

520

333

1,5

Par ailleurs, la RAS varie considérablement au sein de la fraction dissociée (fig. 30 a,

c). Ceci met en évidence l’hétérogénéité du renouvellement de l’iode dans les diverses molé¬

cules de la fraction dissociable de la thyroglobuline.

L’examen des courbes de RAS (fig. 30 a, c) et de fixation de l’iode par p.g de protéine

(fig. 30 b, d) en fonction du temps de marquage montre que les phénomènes étudiés sont

très complexes. En effet, après addition de SDS, deux pics s’individualisent ; l’un, A, se

situe au niveau des fractions lentes et moins iodées de la sous-unité, et l’autre, B, au niveau

des fractions rapides et plus iodées de cette sous-unité ou occupe parfois une position inter¬

médiaire entre la thyroglobuline et la sous-unité.

ANDRÉE BRISSON

L'jmportance relative de ces deux pics semble varier en fonction du temps. Quelques

heures après l’injection de 131 I, la RAS du pie A est nettement supérieure à celle du pic B ;

mais plusieurs jours après l’injection de 125 1, la RAS du pic B tend à devenir égale à celle

du pic A.

En outre, dans le cas du Protoptère (fig. 30 c), les RAS des isotopes 125 I et 131 1, qui

sont très faibles dans la zone 3-8 S, indiquent qu’une partie des molécules de TG 2 ou TG 4

de forte teneur en iode sont susceptibles de se dissocier en 3-8 S.

Discussion

Iodation et caractéristiques physico-chimiques de la thyroglobuline

Chez toutes les espèces étudiées, la thyroglobuline et son polymère TG 4 contenus dans

une thyroïde semblent constitués, quels que soient les taux d’iodation moyens de ces pro¬

téines, par une population de molécules présentant des degrés divers d iodation.

Les variations du taux d iodation sont concomitantes de modifications du coelïicient

de sédimentation et de la structure quaternaire de la thyroglobuline.

D’aprcs les résidtats de de Crombrucghe et al. (1967) et de Schneider et Edelhoch

(1971a, b) obtenus chez les Mammifères, l'accroissement de I S du coelïicient de sédimen¬

tation, de la préTG non iodée à la TG 2 native, observé chez les Poissons, est vraisembla¬

blement déterminé par une augmentai ion de la densité de la molécule résultant de l'incor¬

poration des atomes d’iode en son sein. Ceci n’exclut cependant pas certaines modifica¬

tions discrètes de la structure de cette protéine que doivent entraîner les réarrangements

stériques dans la molécule lors des réactions de substitut ion de l'iode dans les résidus tvro-

syls (Nünez et al., 1966).

Par ailleurs, il a été généralement constaté que la proportion de thyroglobuline disso¬

ciable en présence d’agents dénaturants ou à pli alcalin est. d’autant plus importante que

la teneur en iode de la protéine est plus faible (Nuisez et al., 1966 ; Tarutani et Ui, 1969a,

b; Eaciiiver et al., 1969; Andreoli et al., 1969; Gavaret et al., 1971 ; Rosenberg et

Cavalieri, 1969, 1971). En accord avec ces données obtenues chez les Mammifères, le trai¬

tement par le SDS de la thyroglobuline des Poissons suggère qu’elle est constituée de deux

sortes de molécules différant, dans leur structure quaternaire :

— les unes faiblement iodées seraient composées de sous-unités associées entre elles

par des liaisons non covalentes et seraient facilement dissociables en sous-unités ;

— dans les autres, dont le taux d’iodation moyen est plus élevé, les sous-unités seraient

lices par des liaisons covalentes et ne seraient pas dissociées par le détergent.

Un des effets de l’iodation consisterait à favoriser la formation d’une ou de quelques

liaisons covalentes entre les sous-uuités. 1)e Crombbugciie et al, (1966), de Crombrugghe

(1968), Edelhoch et al. (1969), Andreoli et al. (1969) émettent l’hypothèse que ces liai¬

sons sont de type disulfure. Cependant Tarutani et Ui (1969a) n’ont pas réussi à identifier

la nature disulfure de ees liaisons covalentes. Valenta et Lissitzky (1971) ont constaté

que les détergents, mais non les agents réducteurs, déterminent un déplissement et une

dissociation partiels de la thyroglobuline iodée de Rat. Pour ces auteurs, l’incorporation

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTEINES THYROÏDIENNES

des atomes d’iode dans la molécule aurait pour effet de stabiliser les liaisons non covalentes

plutôt que de créer des ponts disulfures.

Quelle que soit l’hypothèse à retenir, une corrélation entre la teneur en iode et la sta¬

bilité de la structure quaternaire des molécules semble exister, mais plusieurs données

(Edeliioch et Lippoldt, 1962 ; Valenta et al., 1968) indiquent que la relation entre ces

deux paramètres n’est pas absolue. De plus, la mise en évidence d’une importante hété¬

rogénéité d’iodation dans la fraction dissociée de la thyroglobuline des Poissons montre

que des molécules présentant des taux d’iodation bien différents sont dissociables en sous-

unités. En accord avec les observations de Gavaret et al. (1971) chez le Rat, la fraction

dissociable d’une thyroglobuline donnée peut présenter une teneur moyenne en iode supé¬

rieure à celle de la fraction résistante d’une autre thyroglobuline originaire de la même

espèce ou d’une espèce différente (tabl. XIII). fi est probable que les divers atomes de

127 I modifient plus ou moins la structure de la thyroglobuline selon la position où ils sont

incorporés dans la molécule. La formation des iodothyronines pourrait être susceptible

de jouer un rôle dans la stabilité de la thyroglobuline.

Renouvellement de l’iode dans les protéines thyroïdiennes. Représentation schématique en

divers compartiments

La généralité de l’hétérogénéité d’iodation observée dans les thyroïdes des diverses

espèces étudiées doit traduire l’existence d’un phénomène commun, consistant en l'halo-

génatiori continue des protéines thyroglobuliniques depuis leur biosynthèse jusqu’à leur

hydrolyse.

La cinétique d’iodation des protéines thyroïdiennes, étudiée à l’aide des isotopes

radioactifs de l’iode, permet de préciser les relations existant entre ces diverses molécules

différant par leur taux d’iodation et leur structure.

D’après l’ensemble des résultats obtenus, la thyroglobuline peut être représentée

schématiquement par deux compartiments C t cl C 2 d’inégale importance et le polymère

TG 4 par un autre compartiment C a (fig. 31).

— C t correspond aux molécules de TG., les moins iodées, de forte RAS, dissociables

en sous-unités par le SDS, et représente 20 à 30 % de la thyroglobuline. Dans le cas du

Saumon, la protéine TGj mise en évidence dans les extraits thyroïdiens avant traitement

par le SDS, qui résulte peut-être de la dissociation des molécules de TG 2 les plus labiles,

peut être classée dans le compartiment C 4 de RAS élevée.

— C 2 correspond aux molécules de TG 2 les plus riches en iode, de faible RAS et résis¬

tantes au détergent.

— Bien que de nature hétérogène, le polymère TG 4 ne constituant que 15 à 20 %

des protéines totales solubles est représenté par un compartiment C 3 .

La cinétique d’incorporation de l’iode radioactif tend à montrer que l’ensemble de ces

divers compartiments participe au métabolisme de l’iode, mais que ces derniers présentent

des vitesses d halogénalion k 4 , k 2 , k 3 différentes, telles que k t > k 2 k 3 .

Dans les premières heures après l’injection, la RAS de C 4 est 3 à 4 fois supérieure à

celle de C 2 (tabl. XV), mais nettement inférieure à celle de l’iodure intrathyroïdien. Le

ANDRÉE BRISSON

compartiment C 4 , dont l’hétérogénéité d’iodation est très prononcée, contient en effet

les molécules les moins iodées qui fixent le plus intensément l’halogène par pg de protéines.

Ceci est en accord avec les résultats de Inoue et Taxjrog (1970) obtenus chez le Rat, qui

suggèrent que les molécules néosynthétisées et peu iodées jouent un rôle plus important

dans l'organification de l’iodure que les molécules préexistantes riches en iode, stockées

dans la glande.

En fonction du temps de marquage, les RAS des divers compartiments augmentent,

tendent à s’égaliser entre elles (tabl. XV) et à atteindre la RAS de l’iodure intrathyroï-

dien.

Plusieurs jours après l’injection de 12o I, C, présente encore la RAS la plus élevée, du

fait (pie la RAS de l’iodure intrathyroïdien chez les Poissons croît, puis reste constante

ou diminue peu pendant le temps de l’expérimentation.

Les courbes de RAS dans la fraction dissociée de la thyroglobuline (fig. 30 a, c) mon¬

trent que le renouvellement de l’iode dans le compartiment C 4 est beaucoup plus hétéro¬

gène qu’il ne l’est dans la fraction résistante (C 2 ). Mais dans l’état actuel de nos données,

aucune explication ne nous paraît valable pour interpréter la présence des pics de RAS,

A et R, et leur évolution en fonction du temps de marquage.

L’accroissement de la RAS de C 2 résulterait de son iodation directe à partir de l’iodure

intrathyroïdien, mais aussi de la transformation des molécules de C 4 dissociables en molé¬

cules résistantes au détergent, lorsqu’elles atteignent un certain degré d’iodation qu’il est

difficile de préciser. Puis ces molécules, sous forme résistante, fixeraient l’iode plus lentement.

Le compartiment C 4 peut donc être considéré comme le précurseur de C 2 .

En ce qui concerne TG 4 , l’évolution parallèle des RAS des compartiments C 2 (frac¬

tion résistante, labl. XV) et de C 3 (TG 4 , tabl. XII) en fonction du temps suggère

en accord avec l’hypothèse de Rai.i. el al. (1971.) que le polymère TG 4 provient, au moins

pro parte, de la polymérisation de molécules de TG 2 fortement iodées, résistantes au déter¬

gent. Cependant la mise en évidence d’une hétérogénéité au sein de TG 4 indique que ce

polymère est également composé de molécules de thyroglobuline originaires du comparti¬

ment C 4 .

- • I

«1 «2 H 3

Fig. 31. — Répartition de l'iode organique thyroïdien selon un modèle, à trois compartiments.

C, : Thyroglobuline TG 2 dissociable par le SDS ; C 2 ; Thyroglobuline TG 2 résistante au SDS ; C 3 : TG 4 ( ~

27 S).

Les dimensions respectives de ces divers compartiments sont exprimées en jig de 12, I calculées

pour 100 pg d’iode. Le cas d’un Protoptère est pris comme exemple.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

Les résultats de Lissitzky et al. (1965) obtenus chez le Rat permettent de supposer

que les hormones thyroïdiennes sont synthétisées dans les différents compartiments, puis

sécrétées selon des vitesses H x , H 2 , H 3 . Le recyclage de l’iodure marqué à partir de chacun

des compartiments C x , C 2 , C 3 , résultant de la désiodation des iodotyrosines libérées par

hydrolyse est indiqué par les coefficients k' x , k' 2 , k' 3 (fig. 31).

Importance relative de ces divers compartiments thyroïdiens en fonction de l’état physiolo¬

gique des animaux

Un tel schéma (fig. 31) peut être généralisé à la thyroïde des Mammifères, mais l’impor¬

tance relative des divers compartiments doit varier avec l’état d’activation de la glande,

dans la mesure où ce dernier conditionne l’halogénation des protéines.

En effet, f hypophysectomie de Rats (Fontaine et Lachiver, 1964 ; Rosenberg et

Cavalieri, 1969, 1971 : Cavalikri et al., 1970) ou l’immunisation de Lapins contre la TSH

bovine (Lachiver et al., 1969) semble entraîner une augmentation du compartiment C x .

Dans ces deux conditions expérimentales, la protéolyse de la thyroglobuline est ralentie,

mais comme la synthèse de cette protéine n’est pas totalement supprimée, il y a accumu¬

lation d’une thyroglobuline uéosyuthétisée peu iodée, dont la structure est plus labile que

celle de la protéine préexistant dans la glande.

Ces résultats permettent de penser que la dissociation plus élevée de la TG 2 des Sau¬

mons de frayères, après marquage in vivo pendant un temps donné, comparativement à

celle de la TG 2 des Saumons de montée (fig. 28), reflète l’hypoactivité thyroïdienne (Ou-

vereait, 1954) et le ralentissement du métabolisme iodé (Fontaine et Leloup, 1962)

chez les Saumons d’hiver sur les aires de fraye.

Dans la thyroïde des llats carencés en iode, le compartiment Cj qui atteint 50 à 60 %

du total, est augmenté par un mécanisme très différent. La stimulation très inLense de la

thyroïde de ces Rats par la TSH accélère les processus de synthèse et de protéolyse des

molécules protéiques. La thyroglobuline néosynthéfisée dans ces glandes carencées en

iode, n’est que faiblement halogénée et une fraction relativement réduite de cette pro¬

téine est. en mesure d’acquérir une structure stable, avant d’être hydrolysée.

La thyroglobuline des Saumons de frayères de l’hiver 1968-1969 constitue un cas

particulier. Cette protéine, dont la teneur en iode est identique à celle des autres Saumons

d’hiver, se dissocie en sous-unités 3-8 S en partie spontanément ou intégralement en pré¬

sence de SDS. Il faut donc supposer qu’aucune liaison covalente intercaténaire ne se soit

formée entre les chaînes peptidiques des sous-unités à moins que ceci ne soit dû à une acti¬

vité endopeptidasique intense dans la thyroïde de ces Saumons. D’après les critères histo¬

logiques, Oi.ivereau (1954) signale que l’hypoactivité des thyroïdes des Saumons de frayères

est plus ou moins accentuée selon les années considérées. Un hypofonctionnement pro¬

noncé se traduit; par une désintégration de nombreux follicules et la présence de colloïde

dans les vaisseaux. Il est. possible d’envisager que la structure anormalement labile de

la TG 2 des Saumons de frayères 1968-1969 correspond à un état d’hypoactivité thyroïdienne

particulier de ces Saumons.

ANDRÉE BRÏSSON

Hétérogénéité fonctionnelle de la thyroïde •

Nos résultats suggèrent que l’ensemble des protéines thyroglobuliniques participe au

métabolisme iodé thyroïdien, mais que la vitesse de renouvellement de l’iode est variable

dans les divers compartiments envisagés selon leur teneur en iode.

Peut-on attribuer à ces diverses iodoprotéincs une localisation particulière dans la

thyroïde ?

De nombreuses études autoradiographiques de la thyroïde de Rat ont été réalisées.

La thyroglobuline après sa libération des polysomes, où elle est synthétisée, migre (Nadler

et al., 19(14) jusqu’au(x) site(s) d'iodation intracellulaire pour Pitt-Rivers et al. (1964),

Tixier-Vidal et al. (1969), Crokt et Pitt-Rivers (1970), Fujita (1972), ou extracellu¬

laire et localisé à l’interface cellule/colloïde selon Leblond et Gnoss (1948), Wollman

et Wodïnsky (1955), Nadler et Leblond (1955), Stein et Gaoss (1964), Loevvenstein

et Wollman (1967), Fujita (1972). La thyroglobuline est ensuite sécrétée dans la vésicule

colloïde où elle est mise en réserve pendant un temps plus ou moins long, avant d'être

réincorporée dans les cellules folliculaires par un mécanisme de pinocytose (Wollman,

1969 ; Fujita, 1970) qui aboutit à la libération des hormones thyroïdiennes.

Quels que soient la position exacte et le nombre de sites d’iodation au niveau de chaque

follicule thyroïdien, les études autoradiographiques montrent que dans les premiers temps,

après l’injection de 131 1, les petits follicules thyroïdiens et la périphérie de la colloïde des

plus grands fixent plus intensément l’isotope radioactif. Le marquage des divers folli¬

cules varie aussi selon leur localisation dans la glande (Loewenstein et Wollman, 1970).

Des autoradiographies de thyroïdes de Saumon, Anguille, Truite et Congre marqués

pendant plusieurs jours par m l (Olivkhiîau, 1954) montrent également un noircissement

de l’émulsion plus intense au niveau des petits follicules thyroïdiens. Peut-être des images

typiques en anneaux auraient pu être observées ù des temps de marquage plus courts.

La concentration de l’iode 127 I apparaît uniforme dans la thyroïde de Rat. après équi¬

librage isotopique avec 128 1 (Wollman, 1965 ; Loewenstein et Wollman, 1967). Il en

résulte que dans les premiers temps, après l’injection, la RAS de l31 l est plus éle vée dans les

petits follicules et à la périphérie des plus grandes vésicules colloïdes.

D’après ces données, les iodoprotéines du compartiment C n de RAS élevée pourraient

donc être localisées à ces niveaux et correspondre aux molécules de thyroglobuline de

forte RAS libérées dans la cellule et/ou venant d’être sécrétées dans la colloïde au pôle

apical des cellules.

Par ailleurs, les observations de Loewenstein et Wollman (1967) impliquent néces¬

sairement, pour qu’un état d’équilibre soit; maintenu dans la glande, que le renouvellement

de l’iode est plus rapide dans ces zones de RAS élevée.

Or, dès 1958, Tuiantaphyllidis à partir d’études très différentes avait émis l’hypo¬

thèse d’une hétérogénéité fonctionnelle dans la thyroïde en constatant que l'iode radioactif

quitte la glande plus rapidement que l’iode 127 I. Divers travaux sont venus ensuite étayer

cette hypothèse. Schneider (1964), Rosenberg et al. (1966), Haibacfi et Kobayashi

(1971) montrent que l’iode thyroïdien semble être sécrété selon le concept de « last corne,

first served » de Schneider. Pitt-Rivers et Cavalieri (1963), Haney et Lissitzky (1963),

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

Simon et al. (1964) observent que la RAS de l’iode des mouoiodo tyrosines libres dans la

glande, est supérieure à celle des rnonoiodotyrosines liées. Lissitzky (1964) envisage l’exis¬

tence de deux formes de thyroglobuline dans lesquelles l’iode serait métabolisé à des vitesses

différentes. Cette hétérogénéité vis-à-vis de la vitesse de renouvellement de l’iode peut

correspondre à la fois à l’hétérogénéité inter- et intrafolliculaire.

Diverses hypothèses ont été émises pour expliquer une sécrétion sélective de l’iode

dans la glande (Wollman, 1969). La protéolyse des iodoprotéines se réalisant à l’inté¬

rieur de la cellule (voir mise au point Wollman, 1969), la protéine néosynthétisée et récem¬

ment iodée, qui est localisée à proximité du pôle apical des cellules avant de diffuser len¬

tement dans la colloïde, occupe une situation privilégiée pour être hydrolysée. Le concept

de Schneider est très conciliable avec une telle répartition anatomique des iodoprotéines

dans la glande.

A partir de ces données, on peut envisager qu’une partie des molécules peu iodées

du compartiment C l sont les premières à être hydrolysées et à libérer les hormones thyroï¬

diennes. Mais, comme il semble que la teneur en thyroxine des protéines augmente avec

leur degré d’iodation (Inoue et Tatjrog, 1968a; Perlman et Edeluoc.u, 1967 ; de Crom-

brugghe el al ., 1967 ; Taurog, 1970), l’hydrolyse de chacune des molécules riches en iode

des compartiments C, et C 3 est susceptible de libérer une plus grande quantité d’iodothy-

ronines. S’il en est ainsi, en dépit d’une vitesse de renouvellement inférieure de l’halogène,

les compartiments C 2 et C 3 pourraient jouer un rôle prépondérant dans la sécrétion des

hormones thyroïdiennes.

ANDRÉE BRISSON

IV. DIFFÉRENCES STRUCTURALES INTERSPÉCIFIQUES

DES THYROGLOBULINES ET ASPECT ÉVOLUTIF

Dans la première partie de ce travail, nous avons vu que les protéines iodées thyroï¬

diennes présentent un spectre d’ultracentrifugation similaire chez les Vertébrés inférieurs

et chez les Mammifères.

Il est en général admis que la constante de sédimentat ion de la thyroglobuline ne varie

pas significativement chez de nombreuses espèces mammaliennes (Edelhocii et Rall,

1964). De ce fait, Roche et al. (1968) ont implicitement admis que la thyroglobuline des

Vertébrés inférieurs présente un coefficient de sédimentation de 19 S comme la thyro¬

globuline des Mammifères. De plus Aloj et al. (1967) ont déterminé un poids moléculaire

de 331 000 pour la sous-unité de la thyroglobuline de Lamproie (Petromyzon flunatilis),

valeur qui correspond à la moitié du poids moléculaire de la thyroglobuline des Mammi¬

fères.

Toutefois le problème de la non-identité de la thyroglobuline dans la série zoologique

des Vertébrés pouvait être posé, comme dans le cas d’autres protéines.

Un certain nombre de données électrophorétiques et surtout immunologiques con¬

cernant les tliyroglobulines mammaliennes (Robbins et Rai.l, 1960) suggéraient l’exis¬

tence possible de différences spécifiques dans les propriétés physico-chimiques de ces thy¬

roglobulines. Ceci nous a conduit à déterminer le coefficient de sédimentation de la thy¬

roglobuline de diverses espèces appartenant à des classes différentes.

L’existence de différences interspécifiques du coefficient de sédimentation de la thy¬

roglobuline (Lachiveb et al., 1965, 1966), que nous allons exposer maintenant, a pu être

mise en évidence.

Nous avons cherché ensuite à interpréter ces différences. Le coefficient de sédimenta¬

tion d’une macromolécule dépend essentiellement de trois paramètres : le poids molécu¬

laire, la conformation générale et la densité.

Plusieurs hypothèses qui ne s’excluent d’ailleurs pas entre elles pouvaient donc être

formulées.

1. Sachant que le coefficient de sédimentation de la thyroglobuline des Mammifères

augmente sensiblement avec le taux d’iodation par suite de modifications dans la forme

ou la densité de la molécule (Nunez et al., 1966 ; de Crombkugchk et al., 1967), on pouvait

envisager en premier lieu que les différences interspécifiques de coefficient de sédimentation

résultent simplement de variations dans les teneurs en iode des diverses thyroglobulines

étudiées.

2. Les compositions en acides aminés et/ou les structures primaires des diverses thyro¬

globulines seraient variables et détermineraient des différences importantes de conforma¬

tion.

3. Enfin le poids moléculaire varierait selon l’espèce.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

Fig. 32. —• Coefficients de sédimentation des protéines thyroïdiennes de Saumon (a)

et de Protoptère (b) marquées in vwa par l'iode radioactif.

Détermination par ultracentrifugation on gradient do saccharose (5-20 % ; en tampon phosphate pli 7,4 ;

p. 0,15) d’un mélange d’extraits thyroïdiens de Poisson et de Rat, chacun d’eux étant marqué par

l’un des isotopes de l’iode. Centrifugation à 5°C pendant 5 h 30 à 39 000 tpm. Radioactivités : expri¬

mées en pour cent des radioactivités déposées sur le gradient.

Abscisses : nombre de fractions recueillies (7 gouttes). O : sommet du gradient ; F : fond.

ANDRÉE BRISSON

A. — Mise en évidence des variations interspécifiques

DES COEFFICIENTS DE SÉDIMENTATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

chez les Poissons

Les coefficients de sédimentation des iodoprotéincs thyroïdiennes marquées in vivo

par l’iode radioactif et/ou natives des diverses espèces de Vertébrés inférieurs étudiées

ont été systématiquement déterminés selon la technique de Martin et Ames (4961) (voir

Techniques).

La ligure 32 a montre que la 131 1 TG 2 de Saumon présente un coefficient de sédimentation

de 17,3 S nettement inférieur à celui de la TG a de Rat, dont le coefficient de sédimentation

de 19,5 S a été évalué par référence à la TG S de Bœuf 19 S. Au contraire, la 125 I TG 2 de

Protoptère (fig. 32 b) atteint un coefficient de sédimentation beaucoup plus élevé de 21,6 S.

Lm exemple des résultats obtenus pour les TG 2 natives d’Anguille et de Protoptère

est donné dans les figures 33 a et 33 b. On constate que le coefficient de sédimentation de

la TG 2 native d’Anguille (19,2 S) est très voisin de celui de la TG a de Bœuf (19 S), mais

que le coefficient de sédimentation de la TG 2 native de Protoptère (22,3 S) lui est très supé¬

rieur.

Pour chaque espèce, le coefficient de sédimentation déterminé pour la TG 2 contenue

dans l’extrait thyroïdien salin ou pour cette protéine purifiée présente une valeur iden¬

tique.

Toutes les déterminations ont été réalisées à 5°C. Mais à la suite des résultats de Schnei¬

der et al. (1970, 1971), l’influence éventuelle de la température de centrifugation sur les

valeurs des coefficients de sédimentation des thyroglobulines des Poissons et des Mammi¬

fères a été envisagée.

Les coefficients de sédimentation des thyroglobulines de Rat et de plusieurs espèces

de Poissons ont donc été déterminés à 5°C et 23°C afin de confronter les résultats obtenus

à ces deux températures.

Un exemple est donné pour la thyroglobuline de Truite et de Rat soumis à un régime

carencé en iode. Les valeurs respectives obtenues pour les coefficients de sédimentation

de la 131 1 TG 2 et de la TG 2 native de Truite (fig. 34 a, b) et de Rat (fig. 34 c, d) sont iden¬

tiques après centrifugation à 23 ou 5°C. Les diiîérences interspécifiques mises en évidence

à ces deux températures expérimentales sont rigoureusement les mêmes. La TG a de Rat

présente dans tous les cas un coefficient de sédimentation légèrement supérieur à celui

de la TG 2 de Bœuf.

Les moyennes des coefficients de sédimentation des protéines thyroïdiennes des diver¬

ses espèces étudiées, marquées in vivo par l’iode radioactif pendant quelques heures ou plu¬

sieurs jours, sont classées par ordre croissant dans le tableau XVI.

Les variations individuelles et celles résultant des faibles variations du coefficient

de sédimentation (0,2 à 0,8 S) en fonction du temps de marquage (voir tabl. XIV) sont

comprises dans l’erreur standard de la moyenne (s m ).

L’analyse de variance des données du tableau XVI est effectuée à l’aide du test F de

Fischer (tabl. XVII).

Dans le cas des Poissons, des différences hautement significatives du coefficient de

ANDREE BRISSON

Fie. 3L — Température de centrifugation et coefficients de sédimentation

des indoprotéines thyroïdiennes de Truite et de Hat.

Les coefficients de sédimentation des 1 hyroglobulines marquées in vivo par 131 1 et natives de Truite (a, b)

et de Rat soumis à un régime carencé en iode (c, d) sont déterminés à deux températures de centrifu¬

gation (5 et 23°C), en utilisant comme standard interne la 125 I TG de Bœuf (19 S). Centrifugation à

65 000 tpm pendant 2 h 15 à 5°C (a, c) ; centrifugation à 65 000 tpm pendant 1 h 45 à 23°C (b, d).

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

sédimentation sont observées non seulement pour la thyroglobuline TG 2 . mais aussi pour

la sous-unité TG 4 et le polymère TG 4 .

Les coefficients de sédimentation des protéines thyroïdiennes marquées ou natives

des deux Salmonidés, Truite et Saumon, ne varient pas significativement entre eux. En

revanche, ils sont très significativement inférieurs à ceux des protéines thyroïdiennes de

l’Anguille et des divers Reptiles considérés. Chez ces Reptiles, appartenant à différentes

sous-classes, les différences interspécifiques ne sont pas significatives.

Enlin les protéines thyroïdiennes de la Roussette et surtout du Protoptère présentent

des coefficients de sédimentation très supérieurs à ceux des protéines des autres Poissons

et des divers Reptiles et Mammifères étudiés.

Par ailleurs, il est intéressant de constater que les coefficients de sédimentation res¬

pectifs de la sous-unité TG 4 et du polymère TG 4 varient selon l’espèce parallèlement à

celui de la thyroglobuline TG 2 .

Du test global F n’est, décelée aucune variation significative du rapport des coefficients

de sédimentation

tg 4

TC,,

entre les diverses espèces de Poissons,

Reptiles et Mammifères

(tabl. XVI). La plus grande variabilité du rapport des coefficients de sédimentation de

TG2

TG 4

est probablement due à la moins bonne résolution des pics de TG 4 au cours de l’ultracen¬

trifugation et au nombre plus restreint de valeurs obtenues.

Tableau XVI. — Coefficients de sédimentation par protéines thyroïdiennes

de divers Vertébrés inférieurs, marqués in vivo par l’iode radioactif.

Espétes

Coefficients de sédimentation 8

Rapport des coefficients de sédimentation

!G 2

TG 2 / TG,

Ili 4 / tü 2

-Sm

± S m

± Sm

± S B

Truite rtc

riviere

10,8

17.4

24,6

0,140

1.61

1.41

0.012

Saumon

- montée

i - t rayures

; - mended

10,4

10.7

10.8

0.133

0,067

17,4

17,3

0,081

0,086

24,9

25,0

0,119

0,248

1.66

0,016

1.43

0.005

Avilit

11,4

0.131

19,0

0,117

26,5

0,298

1,67

0.019

1.40

0,017

Python

19,3

27.5

1.65

0,013

1,45

0.018

ümaslii

19,4

0,120

28.6

0.300

Tortue

11.9

0,132

19.8

r- 145

28,5

0.404

Lamproie

13.0

0.750

19,B

0.058

0,689

1,53

0.089

1.39

0,038

Roussette (Mani'M

12.‘J

0,217

21.0

0,098

30,2

0,384

1.63

0.029

1.44

0.014

Protoptere

_ 5 J

13,4

0,102

21,8

0,159 j 7

30,7

0,469

1,62

0,011

1.41

0,016 !

(n), nombre d’animaux ; S m , erreur standard de la moyenne.

ANDRÉE BRISSON

Tableau XVII. — Analyse de variance des coefficients de sédimentation

des protéines thyroïdiennes de divers Vertébrés inférieurs.

Tests F

TGj

tg 2

tg 4

Test global

IIS

Poissons entre eux

Reptiles entre eux

—•

—

Saumon v.s Truite

—

Anguille v.s Salmonidés

I1S

Anguille v.s Roussette

I1S

IIS

Roussette v.s Protoptère

Niveaux de signification : S, significatif au seuil de 5 % ; HS, hautement significatif au seuil de 1 %

—, non significatif ; nd, non déterminé.

B. •— Iodation et variations interspécifiques

du coefficient de sédimentation de la thyroglobuline

L’existence de différences atteignant 4 à 5 S entre les coefficients de sédimentation

moyens des thyroglobulines natives des Salmonidés et du Protoptère suggérait que ces

différences interspécifiques ne résultaient pas de simples variations dans la teneur en iode

de ces protéines.

Nous avons vérifié cette hypothèse :

— en montrant que les différences spécifiques du coefficient de sédimentation de la

thyroglobuline sont indépendantes du degré d’iodation de cette molécule ;

— en mettant en évidence des variations interspécifiques des constantes de sédimen¬

tation des protéines thyroïdiennes non iodées, parallèles à celles des coefficients de sédimen¬

tation des protéines natives (Brisson-Martin et Lachiver, 1970).

1. Coefficients de sédimentation et taux d’iodation moyens des thyroglobulines

l’examen du tableau XVIII montre clairement que les différences interspécifiques

du coefficient de sédimentation des thyroglobulines natives sont indépendantes du taux

d’iodation moyen de ces protéines.

En effet :

— les thyroglobulines du Saumon de montée et de la Truite de mer, qui atteignent

un degré d’halogénation aussi élevé que celui de la thyroglobuline des Roussettes pêchées

dans la Manche, présentent cependant un coefficient de sédimentation très inférieur à celui

de la TG 2 de ce Sélacien ;

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

- la th vroglobuline du Protoptère, dont le coefficient de sédimentation est le plus

élevé parmi les diverses espèces étudiées, a néanmoins une teneur en iode inférieure à celle

des espèces précitées ;

— les thyroglobulines de Rat soumis à un régime carencé en iode, d’Anguille, de Cro¬

codile, de Python et de Bœuf dont les constantes de sédimentation sont voisines de 19 S,

présentent des taux d'iodation moyens très différents.

En revanche, des variations intraspécifiques du coefficient de sédimentation de la

thyroglobuline, de faible amplitude, sont vraisemblablement liées aux différences de teneur

en iode dans les cas de la Roussette et du Rat. Toutefois pour le Saumon, le coefficient

de sédimentation de la thyroglobuline reste sensiblement identique, malgré une variation

importante du degré d’halogénation moyen de cette protéine aux deux étapes du cycle

vital.

Tableau XVIII. — Coefficients de sédimentation et taux d’iodation moyens

des thyroglobulines de divers Vertébrés.

Noms communs

DES ESPÈCES

Coefficient de sédimen¬

tation de la thyroglo¬

buline native en S

Taux d’iodation

moyen de la

thyroglobuline en "

Truite de mer

17,7

1,45

Truite de rivière

17,7

1,05

Saumon de montée

17,7

1,57

Saumon de f ray ères

17,6

0,98

Crocodile

18,6

0,07

Bœuf

19,0

0,60

Anguille

19,2

0,77

Rat régime carencé en iode

19,6

0,22

Rat régime riche en iode

20,5

1,10

Python

19,7

0,35

Roussette (Méditerranée)

20,4

0,77

Roussette (Manche)

21,0

1.47

Protoptère

22,5

1,18

2. Variations interspécifiques des coefficients de sédimentation des protéines thyroïdiennes

néosynthétisées in vitro en présence d’antithyroïdiens

Les thyroïdes sont incubées en présence de 3 1I-Tyr et d’antithyroïdiens, perchlorate

de sodium (2 mM) et de propylthiouracile (1 mM) inhibiteur spécifique de l’iodation. Les

protéines néosynthétisées dans ces conditions expérimentales ne sont donc pas iodées.

La confrontation des figures 35 a, b, c met en évidence l’existence de différences inter¬

spécifiques entre les coefficients de sédimentation des thyroglobulines et ceux de leurs sous-

ANDRÉE BRISSON

Fig. 35. — Coefficients de sédimentation des protéines marquées in vitro par 3 H-Tyr

dans la thyroïde de Saumon (a), d’Anguille (b) et de Protoptère (c).

Le tissu thyroïdien est incubé dans du milieu de Campagne et Grüber à 15°C pour les Téléostéens, 30°C

pour le Protoptère. Les coefficients de. sédimentation sont déterminés par référence à la 125 I TG de Bœuf

(19 S). Centrifugation à 5°C pendant 2 b 15 à 65 000 tpm. Fractions de 7 gouttes (a, b) et 10 gouttes

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

unités synthétisées in vitro à des températures physiologiques pour chacune des espèces

considérées.

En accord avec ces résultats, Mauchamp et Nunez (1968) ont constaté que les coeffi-

cients de sédimentation des thyroglobuline» néosynthétisées in vitro de deux espèces

d’Amphibiens sont légèrement différents (18,2 et 18,9 S).

Dans le tableau XIX sont données les valeurs moyennes des coefficients de sédimen¬

tation déterminés à 5°C, de la sous-unité et de la préTG marquées par 3 H-Tyr et des ihy-

roglobulines natives pour les divers Vertébrés inférieurs étudiés.

Le coefficient de sédimentation de la 3 H-préTG non iodée est le plus généralement

inférieur de 1 S à celui de la thyroglobuline native iodée correspondante. Les variations

interspécifiques des coefficients de sédimentation des préTG sont sensiblement parallèles

à celles observées pour ce paramètre dans le cas des thyroglobulines marquées in vivo par

l’iode radioactif et natives.

Tableau XIX. — Coefficients de sédimentation des protéines thyroïdiennes marquées

in vitro par 3 H-Tyr et natives de divers Vertébrés inférieurs.

Espèces

Température d’in-

Coefficients de sédimentation S

curation (°C)

3 H sous-unité

3 H préTG

TG 2 native

Truite de rivière

16,8

17,7

Saumon

10,5

16,7

17,7

Anguille

11,1

18,2

19,2

Roussette

—

19,8

21,0

Protoptère

12,8

21,0

22,5

Python

18,4

19,7

Uromastix

18,6

19,5

C. — Composition en acides aminés des thyroglobulines

DE DIVERSES ESPÈCES DE POISSONS

1. Purification des thyroglobulines

L’ultracentrifugation préparative en gradient de saccharose (fig. 36 a) et la filtration

sur gel Sépharose 6 B ont été utilisées pour purifier quelques milligrammes de thyroglo¬

buline de cinq espèces de Poissons.

Dans le cas de ces deux techniques les fractions correspondant à la thyroglobuline,

comprises entre les flèches sur les figures 36 a et 36 c, sont réunies, puis concentrées sous

vide dans des tubes de dialyse Visking afin d’obtenir des concentrations voisines de 10 mg/ml.

Elles sont ensuite relarguées entre 1,4 et 2,2 M de sulfate d’ammonium ou 1,4 et 2,7 M

pour la thyroglobuline de Protoptère.

177, 6

ANDRÉE BRISSON

Fig. 36. — Thyroglobuline d'Anguille purifiée par ultracentrifugation en gradient de saccharose (a, b)

et par filtration sur gel Sépharose 6 B (c, d).

Après dialyse prolongée contre du NaCl 0,001 M, les solutions de thyroglobuline sont

lyophilisées et gardées dans un dessinateur à 5°C.

Les préparations obtenues sont analysées par ultracentrifugation en gradient de sac¬

charose (fig. 36 b, d ; fig. 37 a, h, c). Les dosages de protéines et de 127 1 sont réalisés dans

chaque fraction des gradients.

Quelques pi d’une solution de 131 I ou 125 I TG 2 de Bœuf, de radioactivité spécifique

élevée (10 000 epm/pg protéine), sont ajoutés à l’état de trace comme standard interne.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

Pour chaque espèce, le principal pic protéique présente un coefficient de sédimentation

identique à celui déterminé pour la thyroglobuline présente dans l’extrait thyroïdien salin

(fig- 37).

Proteines ug (-J •— )

Fig. 37. — Profils d'ultracentrifugation des thyroglobulines purifiées de Saumon (a), de Truite (b)

et de Roussette (c).

Quelle que soit la technique de purification utilisée, les profils d’ultracentrifugation

des thyroglobulines purifiées sont très similaires (fig. 36 b, d). Dans tous les cas (fig. 36 et

37) les protéines étrangères de faible vitesse de sédimentation, présentes dans les extraits,

sont éliminées. Des pics protéiques de vitesse de sédimentation inférieure et supérieure à

celle de la thyroglobuline sont observés. Toutefois, la détermination d’une teneur en iode

similaire dans ces pics et dans la thyroglobuline constitue un critère d’homogénéité de

l’ensemble du matériel analysé et démontre son origine thyroglobulinique. La présence

de différents pics protéiques est probablement due à la dialyse prolongée contre des solu¬

tions de faible force ionique (NaCl 0,001 M) qui entraîne une dissociation et une aggréga-

tion partielles de la thyroglobuline (Spiro, 1961).

2. Composition en acides aminés des différentes thyroglobulines

Compositions centésimales

Pour chaque espèce considérée, plusieurs préparations de thyroglobuline ont été ana¬

lysées ; quelle que soit la méthode de purification utilisée, les résultats obtenus sont iden¬

tiques.

Dans le tableau XX sont données les compositions centésimales des thyroglobulines

de Bœuf et des cinq Poissons étudiés. Les résultats sont exprimés, pour chaque acide aminé,

en pour cent du poids sec de la protéine hydrolysée, en mg/lOOmg. Les rendements obtenus

ANDREE BRISSON

après hydrolyse de ces diverses thyroglobulines sont voisins de 84 % du poids sec de la

protéine hvdrolysée. Ils atteignent environ 95 %, si l’on suppose que les taux moyens en

tryptophane, iode et glucides sont respectivement voisins de 3, 1 et 7 %.

La teneur en eau de la thyroglobuline de Bœuf a été évaluée en déterminant la perte

de poids d’une vingtaine de mg de cette protéine lyophilisée, portée à l’étuve à 80°C jusqu’à

poids constant. Elle est égale à 5,2 % ; cette valeur a été adoptée pour les thyroglobulines

de Poissons.

Les données obtenues pour la composition en acides aminés de la thyroglobuline bovine

sont en accord avec celles rapportées par Piez et Morris (1960), Rolland et al. (1966)

et Spiro (1970).

Tableau XX. — Composition en acides aminés des thyroglobulines

des différentes espèces étudiées (en mg/100 mg).

Chaque nombre correspond à la moyenne des valeurs maximales obtenues pour 22 h ou 48 h d’hydrolyse

selon l’acide aminé considéré. Les valeurs données pour la thréonine et la sérine sont extrapolées au

temps zéro selon la méthode des moindres earrés. V : volume spécifique partiel des thyroglobulines,

évalué selon Cohn et Edsali, (1943).

Bien que les compositions en acides amines des diverses thyroglobulines présentent

une certaine similitude avec celle de la thyroglobuline bovine, l’étude statistique des résul¬

tats du tableau XX met en évidence l’existence de variations très significatives dans les

teneurs en de nombreux résidus (tabl. XXI). L’analyse de variance, selon le test F de

Fischer, est réalisée pour chaque acide aminé pris séparément, en établissant un certain

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

nombre de comparaisons indépendantes les unes des autres (tabl. XXI). Les valeurs obte¬

nues pour la 1/2 cystine sont trop hétérogènes pour permettre un calcul statistique.

La comparaison globale des données obtenues pour les diverses thyroglobulines étu¬

diées montre que les pourcentages de thréonine, acide glutamique et glycine sont les seuls

à ne pas présenter globalement de variations significatives.

Nous avons étudié les variations de la composition de la thyroglobuline chez les Pois¬

sons en considérant d’une part les relations phylogéniques des espèces étudiées et d’autre

part les coefficients de sédimentation de cette protéine. La thyroglobuline de Bœuf est

également confrontée à celles des divers Poissons, par ordre croissant de coefficient de sédi¬

mentation (tabl. XXI).

Tableau XXI. — Analyse de variance de la composition en acides aminés

des thyroglobulines des diverses espèces étudiées.

Acides

aminés

Comparaison

globale

Saumon/

17,7/

/l7,7

/ Truite

Angullli /

19,2,/

/l7,7

/ Saumon

/+Trmte

ProlopHre/

22,5 /

/ Saumon

/+Truite

Roussette/

21/

/17,7

/ SillOM

+Tti/ile

’rotoptére/

22,5/

/ 21

/ Roussette

B moi /

19 /

/19,2

'Anguille

Bien! /

19 /

/17,7

/ Saumon

5 Truite

Bœuf /'

/ 22

/Protoptere

+Roussette

Lys

THS

—

THS

Hîs

THS

•h s

THS

Asp

THS

Tlir

Ser

DJ S

Glu

THS

Pro

CI)'

Ala

THS

CJ S

THS

%Cys

Val

THS

/N» S

rJ 8

THS

Met

THS

_„

THS

Ile

THS

Le»

THS

ro 8

THS

. HS

Tyr

—

THS

Plie

THS

S, à la limite de signification p ~ 5 % ; S, significatif si 5 < p < 1 % ; HS, hautement significatif

si 1 < p < 0,5 % ; THS, très hautement significatif si p < 0,5 %.

Les comparaisons réalisées entre les thyroglobulines de Poissons de plus en plus éloi¬

gnés phylogénétiquement montrent que :

a — Les thyroglobulines des deux Salmonidés étudiés appartenant au genre Salmo,

ANDRÉE BRISSON

dont les coefficients de sédimentation sont identiques (17,7 S), présentent des compositions

très similaires. Des différences, seulement significatives (S), sont observées pour quatre

résidus : Arg, Pro, Val, Leu.

b — La comparaison de la thyroglobuline d’Anguille 19,2 S à celle des deux Salmo¬

nidés, ces divers Poissons faisant partie du super-ordre des Téléostéens, ne met en évi¬

dence qu’une variation très hautement significative (THS) au niveau de l’histidine et quatre

autres S ou à la limite de signification (~ S),

c — Entre les thyroglobuline» du Protoptère et des Salmonidés appartenant respec¬

tivement aux sous-classes des Dipneustes et des Actinoptérygiens, mais dérivant de lignées

phylétiques distinctes (Grasse, 1958) et dont les coefficients de sédimentation atteignent

les valeurs extrêmes de 22,5 et 17,7 S, les compositions en acides aminés sont beaucoup

plus dissemblables. Les variations pour sept résidus sont T HS et quatre autres sont S ou ~ S.

d —- Pour les thyroglobuline» de Poissons n’appartenant pas à la même classe, c’est-

à-dire : Roussette (Chondrichthyens) versus Salmonidés ou Protoptère (Ostéichthyens),

les résultats obtenus diffèrent en fonction des écarts des coefficients de sédimentation

existant entre les thyroglobulines considérées.

En effet :

— Les compositions en acides aminés des thyroglobulines de Roussette et des Salmo¬

nidés, protéines dont les coefficients de sédimentation diffèrent de ~ 3 S, varient consi-

Tableau XXII. — Distribution des acides aminés selon leur caractéristique chimique dans les

différentes thyroglobulines analysées. Calcul de l’hydrophobicité moyenne et de la fraction

des résidus ioidsés dans ces thyroglobulines, selon Wf.lscher (1969).

Caractéristique nhimiqun

Bœuf

Truite

Sinon

Angoille

Roussette

Proloptere'

Holes/ioo railes d'acides aminés totam

Aliphatiques

non polaires

34.2

36,4

34.6

35,4

34.1

31,4

hydroxylés

15.0

14.8

15,5

14,6

14.7

17.7

Aromatique hydroxylc(Tyr)

2,1

1.9

2,0

1.7

2,4

2,3

Dicarboxyliques

19,6

20.3

20,8

21.5

21,6

21,8

Basiques

10,4

10,5

10,4

11,0

11.2

10,4

Imidazo! (Pro)

7,9

7 8

6.8

7 2

6.5

5,6

Soufre (Met)

0,9

1. 3

1,6

1.3

1, 2

1,3

Hydrophobicité moyenne

110 cal./ res.

1036

1021

994

1019

1065

1020

Fraction des res. ionises

FCh uoitéschargo/res.

0,30

031

0.31

0,32

0.33

0.32

5,33

5,39

5,23

5,07

5,14

FCh

Aliphatiques non polaires : Gly, Ala, Val, Leu, Ile ; Aliphatiques hydroxylés : Thr, Ser ; Dicarboxyliques :

Asp, Glu ; Basiques : Lys, His, Arg ; Hydrophobicité moyenne : H0 de chaque résidu/résidus totaux ;

Fraction des résidus ionisés : résidus basiques acides/résidus totaux.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

dérablement. Comme dans le cas précédent sept vaiiations THS et quatre autres S ou ~ S

sont mises en évidence et souvent pour les mêmes acides aminés.

— Les thyroglobulines de Protoptère et de Roussette dont les coefficients de sédi¬

mentation, sans être identiques, sont cependant nettement supérieurs à 19 S, présentent

des compositions beaucoup plus voisines. Seules, les variations dans les teneurs en Gly,

Leu, Ile sont HS et THS pour l’arginine.

En outre, la comparaison de la thyroglobuline mammalienne à celles des divers Pois¬

sons montre que les différences observées sont d’autant plus nombreuses et plus signi¬

ficatives que les coefficients de sédimentation des thyroglobulines considérées sont plus

éloignés (tabl. XXI).

Distribution des acides aminés selon leur caractéristique chimique

Dans le tableau XXII est donnée la distribution des acides aminés, classés selon leur

caractéristique chimique, dans les différentes thyroglobulines considérées.

On constate :

— Bien que les teneurs en acides aminés basiques varient considérablement selon

l’espèce, les proportions globales de résidus basiques dans les diverses thyroglobulines

étudiées, sont peu différentes.

— Les teneurs en acides aminés dicarboxyliques sont sensiblement plus élevées dans

les thyroglobulines des Poissons que dans celle de Bœuf, ceci résultant d’une augmentation

du taux d’acide aspartique. D’après les rapports résidus basiques/résidus acides, les thyro¬

globulines de Protoptère et de Saumon semblent être les plus acides.

— L’hydrophobicité moyenne des différentes thyroglobulines et la fraction des rési¬

dus ionisés qu’elles contiennent ont été calculées selon Welscher (1969). Les valeurs

obtenues pour la fraction des résidus ionisés (FCh) exprimée en unités de charge/résidu

sont maximales, puisque les analyses effectuées ne permettent pas de distinguer l’aspara¬

gine et la glutamine des acides correspondants. Le rapport de ces deux paramètres H0/FCh

est sensiblement constant.

Par ailleurs, les volumes spécifiques partiels V de ces thyroglobulines, évalués selon

Cohn et Edsall (1943) à partir de leurs compositions centésimales et des volumes spéci¬

fiques partiels de chacun des acides aminés qui les constituent, sont sensiblement identiques

(tabl. XX).

Confrontation des compositions des thyroglobulines de Vertébrés représentant différentes

classes de Gnathostomes

Dans le tableau XXIII, les teneurs en acides aminés des thyroglobulines des divers

Poissons et celles que nous avons obtenues pour un Reptile (Python) et un Mammifère

(Bœuf) sont exprimées en moles/100 moles d’acides aminés totaux afin de pouvoir les com¬

parer à celles des thyroglobulines d’un Amphibien ( Xenopus laevi.s), de deux Oiseaux (Pou¬

let, Canard) et d’un autre Mammifère (Homme) données par Hcishino et Ui (1970) et

Rolland et al. (1966).

ANDRÉE BRISSON

Tableau XXIII. — Composition en acides aminés des thyroglobulines

de divers Vertébrés appartenant à différentes classes.

Acides

amines

Imite

177 S

Saumon

17,7 S

Anguille [ Roussette

192 S 21S

Protoplere

22,5 S

Xenopus*

19.3 S

Pytlion

19 3 S

Canard

19 8

Poulet’'

19 5 S

Bœuf

19 S

Homme*

19 S

Ijs

3 1

3.2

3.4

L4JL

4.8

5,0 '

aa2

3 9

3.7

2,7

3.4

His

2,0

2.0

1,7

L 2 1

2,1

2 3]

1.2

1.1

1,4

tfg

5,4

5 9

□J

3,5

4,0

4.9

4.7

6.4

5.9

Asp

8.8

| 9.5

~9.7

10,5

96 |

6.8

8,4

Thr

5.4

5.8

5 9

6,2

6,7

5.3

5 0

5 . 4 !

Ser

9,4

8.7

8,5

11,0

7,6

10.1

8 9

10.0

97 I

Gin

12,8

13.1

12.7

12,1

12.1

11.7

14.2

13.5

12.2

12 8

13.1

7 8

6.8

[V5_

5.6

5.7

6.8 |

5,3 |

9.7

7 1

SI)

7.7

7.8

6.8

73 j

7.3

7.5

Ali

8.1

7.4

5.2

5,7

6 5 1

6,1

6.3

8 6

7 6

%Cjs

2.3

3.6

1.8

2,1

2.4

2.0

4,0

2,6

4,1

2.6

Vil

L«,i

7.5

751

6,8

6 2

6,1

5,8

6.5

6,4

1.3

1.6

1.3

1 2

1.3

1.8

0.9

0,4

lit

2,0

2,1

&2 _

3.9

4.2

4.4

3.8

4 2

2.4

2.9

Leu

10 3

9,9

9.8

9.3

8,3

9.3

9.2

8.9

9.Z

9.5

Tjr

1,9

2.0

1.7

2.4

2.3

2.5

2,5

3,4

3.2

2,1

2,2

Phe

[38

3.7

j4j]

5.3

5.4

5.9

5.8

5.3

5,5

5,0

5,3

Les résultats sont exprimés en moles/100 moles d’acides aminés totaux. ** Données de Rolland et

al., 1966 ; * données de Hoshino et Ui, 1970.

On constate :

— Bien que les coefficients de sédimentation des thyroglobulines de l’Amphibien,

du Reptile et des deux Oiseaux soient voisins de 19 S, il existe un degré de similitude très

remarquable entre les thyroglobulines de ces quatre Vertébrés avec celles de la Roussette

et du Protoptère. Leurs compositions diffèrent très nettement de celles des thyroglobulines

des trois Téléostéens et de celles des Mammifères par leurs teneurs en Lys, Arg, Asp, Pro,

Ala et Ile.

— En accord avec les résultats du tableau XXII, les thyroglobulines des Téléostéens

ont une composition en acides aminés plus proche de celles des Mammifères que de celles

des autres Vertébrés considérés, mais présentent des teneurs en Val et Phe différentes de

l’ensemble des autres espèces étudiées.

— Par ailleurs, les teneurs en Met des thyroglobulines des Poissons n’apparaissent

pas supérieures à celles des thyroglobulines mammaliennes, lorsque l’on considère également

la thyroglobuline humaine.

biosynthf.se et iodation des protéines thyroïdiennes

L’existence de différences interspéciliques du coefficient de sédimentation est mise

en évidence chez les Poissons non seulement aux niveaux de la thyroglobuline TG 2 et du

polymère TG 4 , mais aussi à celui de la sous-unité TG r

Chez les diverses espèces de Poissons considérées, les rapports respectifs des coefficients

, tg 2 tg 4

de sédimentation de et de —— sont sensiblement identiques et égaux aux valeurs

TG 4 TG 2

correspondantes déterminées chez les Reptiles et les Mammifères. Ceci suggère que le mod e

de polymérisation des chaînes peptidiques de la sous-unité au polymère de la thyroglobu¬

line est vraisemblablement identique dans toute la série des Vertébrés,

Ces différences spécifiques entre les coefficients de sédimentation des thyroglobuline»

natives sont indépendantes de leur taux d'iodation et suggèrent donc que ces protéines

ne sont pas identiques dans la série des Vertébrés, comme semble le montrer l’analyse de

la composition en acides aminés des diverses thyroglobulines étudiées.

Des données immunochimiques relativement anciennes avaient suggéré l’existence de

différences dans la structure de la thyroglobuline de diverses espèces de Mammifères. Ces

thyroglobulines présentaient entre elles un degré plus ou moins élevé de parenté antigénique

selon les relations phylogéniques des espèces cotisidérées (Hektoen et al., 1927 ; Adant

et Spehl, 1934 ; Stoici xc.ru et Heidelberger, 1937 ; Y agi et Kodama, 1955). En effet,

les propriétés antigéniques des thyroglobulines de Mouton et de Bœuf, de Porc et de Cheval

sont très voisines, niais bien différentes de celles de la thyroglobuline humaine. Récemment,

HoshinO et Li (1970) ont constaté aussi l’existence de relations antigèniques plus étroites

entre les thyroglobulines de l’Homme et du Singe, mais beaucoup plus faibles entre la thy¬

roglobuline humaine et celles du Rat, du Porc et. de la Baleine.

Au cours de ces dernières années, Pierce (1965), Rolland et al. (1966), Spiro (1970),

Hoshino et Ui (1970) ont analysé les compositions en acides aminés de quelques thyroglo¬

bulines mammalienncs. Ces auteurs constatent qu’elles présentent un plus ou moins grand

degré de similitude dans leur composition. Ainsi, celle de la thyroglobuline humaine est

quasi identique à celle du Singe (Hoshino et Ui, 1970), mais sensiblement différente de

celles des animaux de bétail, des Rongeurs (Rolland et al., 1966) et de la Baleine (Hoshino

et Ui, 1970).

Très peu de travaux ont concerné les thyroglobulines de Vertébrés non rnammaliens.

Cependant, Hektoen (1927), Vagi et Kodama (1955), Hoshino et Ui (1970) ont observé

une absence totale de (i réactions croisées » entre les thyroglobulines de Vertébrés apparte¬

nant à des classes différentes. Les thyroglobulines de Mammifères, d’Oiseaux (Poulet),

d’Amphibiens (Xenopus laevis) semblent ne présenter aucune parenté antigénique entre

elles et avoir des compositions en acides aminés assez différentes (Hoshino et Ui, 1970).

L’analyse de la composition en acides aminés des thyroglobulines de divers Poissons

et d’un Reptile a permis de constater que la thyroglobuline présente une composition

globale similaire dans l’ensemble de la série des Vertébrés Gnathostomes (tahl. XXIII).

Cependant un examen plus minutieux des données obtenues (tabl. XXI et XXIII) inet

ANDRÉE BRISSON

en évidence l’existence de variations très significatives des teneurs en de nombreux acides

aminés : basiques (Lys, Arg), acides (Asp) et hydrophobes (Pro, Ala, Ile, Leu, Phe).

L’analyse de variance des résultats obtenus pour les thyroglobulines des cinq Poissons

étudiés et celle de Bœuf semblait montrer que les compositions de ces protéines étaient

d’autant plus différentes que les thyroglobulines considérées présentaient des coefficients

de sédimentation plus éloignés (tabl. XXI).

Toutefois, la confrontation des données obtenues pour les diverses espèces animales

représentant les différentes classes de Vertébrés Gnathostomes montre qu’un degré de

similitude remarquable est observé entre la thyroglobuline de Protoptère (22,5 S) et celles

de Xenopus, du Python et des Oiseaux, dont les coefficients de sédimentation sont voisins

de 19 S. Il est donc clair que l’importance des variations dans les compositions en acides

aminés des thyroglobulines n’est pas directement liée aux écarts existant entre les coeffi¬

cients de sédimentation de ces protéines.

En revanche, si nous considérons l’arbre phylétique des Vertébrés (fig. 38), il apparaît

nettement que ces variations sont en rapport avec les relations phylétiques des espèces

étudiées. Les formes rangées sous le nom de Poissons appartiennent en fait à trois séries

évolutives indépendantes : les Êlasmobranches (Cliondrichthyens), les Actinoptérygiens

(Téléostéens) et les « Choaniehthyens » dont les Oiseaux et les Mammifères sont les branches

terminales.

\W/

TELEOSTEENS

( Truite. Saumon, An g uille )

WlSltlIlS

\ \

OISEAUX MAMMIFERES ,

I Poulet. Gan Boeuf, Hrniimt )

REPTILES

( Pjltoij )

•s

[MOKIIIXS

moi i ins /

\\ /

J AMPHIBIENS (Xenopus)

CROSSOPTt RYfiltNS

^.OIPNEUSTES IPfiopM)

ACTINOPTERYGIENS CHOANICHIVENS

CHONDRICHTHYENS (tasetti)

GNATHOSTOMES

Fig. 38. — Arbre phylétique simplifié des Vertébrés Gnathos¬

tomes. D’après Grasse, 1958.

L’évolution de la structure des protéines dans l’arbre phylogénétique des Vertébrés

(Acher. 1967) a été étudiée pour diverses molécules de faible poids moléculaire (hormones

neurohypophysaires, cytochromes, hémoglobines, insulines) dont les structures primaires

ont pu être déterminées. Il semble que les mécanismes de duplication et de substitution

sont essentiels daus l’évolution des protéines, en donnant naissance à diverses lignées évo¬

lutives à partir d’une molécule ancestrale. Dans chaque cas étudié, la structure primaire

varie dans l’échelle zoologique des Vertébrés, mais à l’homologie de fonction correspond

une homologie de structure. Il apparaît que la longueur des chaînes peptidiques constitue

le caractère le plus stable et que la fréquence des substitutions est plus élevée dans certaines

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

positions des chaînes. Par exemple, l’insuline de divers Téléostéens est composée de 51

résidus comme celle des Mammifères, mais alors que les structures primaires de cette pro¬

téine sont très similaires dans chacun de ces groupes zoologiques, les insulines des Téléos¬

téens diffèrent nettement de celles des Mammifères par leur séquence en acides aminés

(Ryle et al., 1955 ; Brown et al., 1955 ; Grant et Reid, 1968 ; Neuman et Humbel, 1969 ;

Neuman et al., 1969).

Le tableau XXIII montre que les thyroglobulines des diverses espèces de Vertébrés

étudiées se répartissent d’après leur composition en acides aminés en trois principaux grou¬

pes : les Téléostéens, les Mammifères et les autres Vertébrés. On peut envisager que la com¬

position de la thyroglobuline a varié indépendamment dans les lignées des Actinoptéry-

giens et des Mammifères tandis qu’elle serait restée plus proche de la composition d’une

molécule ancestrale dans les lignées des Chondriehthyens et des « Choanichthyens » jusqu’aux

Reptiles et Oiseaux.

Pour cette protéine, on note que la teneur en Mis est identique chez le Reptile, les

Oiseaux et les Mammifères et que sa teneur en Arg chez les Oiseaux est intermédiaire entre

celles des divers « Choanichthyens » et des Mammifères.

Il est intéressant de constater que les teneurs en Arg et Lys varient, considérablement

mais inversement dans les diverses thyroglobulines étudiées (tabl. XX) car les substitutions

de résidus appartenant à un même groupe chimique, dites « conservatrices », sont assez fré¬

quentes (Acheb, 1967). Il en résulte que la somme des acides aminés basiques dans les thy¬

roglobulines des diverses espèces étudiées varie peu.

De même, malgré l’existence de variations HS des teneurs en de nombreux acides

aminés hydrophobes, le rapport de l’hydrophobicité moyenne/fraction des résidus ionisés

(H0/FCh) est sensiblement constant pour les diverses thyroglobulines étudiées. Pour des

molécules aussi volumineuses que la thyroglobuline, il est vraisemblable qu’à des compo¬

sitions centésimales similaires peuvent correspondre des enchaînements en acides aminés

variables, susceptibles de déterminer des conformations assez différentes. Mais il est aussi

permis de supposer que les structures primaires des thyroglobulines de Protoptère, de Rous¬

sette, de XenopuH et du Python, dont les compositions présentent un degré de similitude

élevé, sont les plus voisines.

S’il en est ainsi, comment peut-on alors expliquer que les coefficients de sédimentation

des thyroglobulines de cet Amphibien et de ce Reptile soient très inférieurs à ceux des

thyroglobulines de ces deux Poissons ?

Une influence de la fraction glucidique, qui représente environ 8 % du poids molécu¬

laire de la thyroglobuline ne peut être exclue. L’addition des sucres est séquentielle et

postérieure à la synthèse du squelette peptidique de la thyroglobuline. Des variations spé¬

cifiques importantes dans la composition de cette copule glucidique seraient susceptibles

de modifier la conformation de cette protéine.

D’un autre côté, le. fait que le volume spécifique partiel et le rapport H0/FCh des

diverses thyroglobulines étudiées soient très peu différents suggère, d’après Welscher

(1969), que la conformation générale de cette protéine est très similaire dans la série des

Vertébrés. Dans ce cas, l’hypothèse d’une variation du poids moléculaire peut être envisagée

favorablement..

Si le volume spécifique partiel et la forme des thyroglobulines ne varient pas selon

l’espèce, on peut calculer (voir Techniques) selon Svedberg et Pedersen (1962) les poids

ANDRÉE BRISSON

moléculaires approximatifs des thyroglobulines de Poissons à partir de leurs coefficients

de sédimentation et de la niasse moléculaire (670 000) de la thyroglobuline de Bœuf (19 S).

Un poids moléculaire de 860 000 est obtenu pour la thyroglobuline de Protoptère

et de 600 000 pour celle des Salmonidés, Une détermination du poids moléculaire par ultra¬

centrifugation analytique et équilibre de sédimentation serait nécessaire pour confirmer

ou infirmer ces valeurs.

Le problème du nombre et de la taille des chaînes peptidiques constituant les thyro¬

globulines mammaliennes n’est pas encore résolu (Bornet, 1971). La masse moléculaire

des composés obtenus après réduction des ponts disulfures et alkylation de la thyroglobu¬

line est de 165 000 (de Crombrugghe et al., 1966), de 135 000 (Piehce et al., 1965), de 80 000

(Lissitzky et al., 1968) ou de 20 000 et 35 000 (Ciiarlwood et al., 1970),

L’hypothèse d’un poids moléculaire de 860 000 pour la TG 2 du Protoptère conduit

à supposer qu’elle serait composée d’un nombre plus élevé de chaînes sous-unitaires.

Certains résultats expérimentaux suggèrent l’existence de deux types, oc et [3, de sous-

unités monomériques dans la thyroglobuline des Mammifères (de Crombrugghe, 1968).

Dans le cas où ces sous-unités présenteraient des compositions différentes, il faudrait sup¬

poser également que la proportion des sous-unités a et p reste la même dans la thyroglobu¬

line du Protoptère et celles de l’Àmphibien et du Reptile, puisque la composition globale

est similaire.

Dans l’état actuel des connaissances sur la structure de la thyroglobuline, qui reste

un problème essentiel à résoudre, il est prématuré d’émettre des hypothèses plus avancées.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

CONCLUSIONS GÉNÉRALES

L’identité des hormones thyroïdiennes dans les différentes classes des Vertébrés posait

le problème de l’homologie des protéines thyroïdiennes, support de l’iodation et au sein

desquelles s’effectuent les divers mécanismes impliqués dans la biogenèse hormonale.

Nous avons abordé ce problème par l'étude comparative des caractères physico-chi¬

miques, des processus de biosynthèse et d’iodation des protéines thyroïdiennes chez divers

Vertébrés inférieurs et chez les Mammifères. Nos résultats sont en accord avec l’hypothèse

de l’homologie de ces protéines dans la série des Vertébrés, tout en mettant en évidence

l’existence de certaines différences spécifiques entre elles.

1. L’ultracentrifugation en gradient linéaire de saccharose des extraits thyroïdiens

de diverses espèces appartenant à des classes de Vertébrés différentes (Cyclostomes, Chon-

drichthyens, Osteiehthyens, Reptiles) sépare plusieurs fractions protéiques iodées nommées

TG 1( TG 2 , TG 4 et TG e par ordre croissant de coefficient de sédimentation (S) qui corres¬

pondent respectivement aux protéines thyroglobuliniques des Mammifères 12 S, 19 S,

27 S et 32 S.

La thyroglobuline TG 2 ~ 19 S représente le principal constituant protéique dans la

thyroïde de tous les Vertébrés, à l’exception des Cyclostomes où elle n’est décelée qu’après

marquage par l’iode radioactif. Une signification physiologique précise ne peut être attri¬

buée aux proportions relatives de ces diverses fractions protéiques. La présence de la pro¬

téine TGj ~ 12 S ne constitue pas par elle-même un critère d'intensité du fonctionnement

thyroïdien et ne correspond pas nécessairement à un degré d’évolution des espèces, en dépit

du fait qu’elle soit le composé majeur dans la thyroïde des Cyclostomes, Vertébrés les plus

primitifs. Dans l’état actuel de nos connaissances, cette protéine semble être un produit

de dissociation de la thyroglobuline, dont la stabilité peut varier selon l’espèce en fonction

de certains caractères structuraux et selon la teneur en iode de cette protéine.

Chez les divers Poissons considérés, espèces dulçaquicoles, marines ou amphihalines,

la thyroglobuline et le polymère TG 4 atteignent des taux d’iodation élevés, sensiblement

égaux 1 %), donc supérieurs à ceux généralement rapportés pour les thyroglobulines

mammaliennes.

2. Les processus d’halogénation des protéines thyroïdiennes de différents Poissons

ont été analysés par double marquage in vivo des animaux par l’iode radioactif ( 131 I et

125 I) et grâce aux dosages de protéines et de 127 I réalisés dans chaque fraction des gradients.

Chez toutes les espèces étudiées, l’hétérogénéité d’iodation des molécules constituant

la thyroglobuline TG 2 et le polymère TG 4 a pu ainsi être directement mise en évidence.

La cinétique d’iodation des protéines thyroïdiennes montre que l’ensemble des molé¬

cules thyroglobuliniques participe au métabolisme de l’iode, mais aussi que la vitesse d’incor¬

poration de l’halogène diminue des protéines de plus faible (TG 2 ) au plus fort poids molé¬

culaire (TG 4 ), et dans chaque protéine en fonction du degré d’iodation des molécules.

ANDRÉE BRXSSON

Nos résultats suggèrent que le processus d’halogénation des protéines thyroïdiennes

est continu et progressif depuis leur biosynthèse jusqu’à leur hydrolyse. En accord avec

les données obtenues par d’autres auteurs chez les Mammifères, l’halogénation de la thyro¬

globuline des Poissons est concomitante de modifications de certaines de ses propriétés

physico-chimiques, tel que l’accroissement du coefficient de sédimentation et de la stabilité

de la Structure quaternaire des molécules, testée par addition de dodccyl sulfate de sodium

aux extraits thyroïdiens.

Ces résultats nous ont conduite à envisager l’existence de deux groupes de molécules

dans la thyroglobuline constituant deux compartiments iodés C t et C 2 dans lesquels l’halo¬

gène se renouvellerait à des vitesses différentes :

— C 2 correspondrait aux molécules les plus lentes, les moins iodées, plus récemment

synthétisées, aisément dissociables par le dodécyl sulfate de sodium, et qui fixent intensé¬

ment l’iode radioactif.

— C 2 représentant environ 80 % de la thyroglobuline, serait composé des molécules

les plus rapides et riches en iode, non dissociables et fixant moins intensément l’halogène.

L'importance relative de ces deux compartiments est susceptible de varier avec l’état

d’activité de la glande.

L’évolution en fonction du temps de marquage de la radioactivité spécifique et de la

dissociabilité des molécules de thyroglobuline suggère que le compartiment G, est le pré¬

curseur, au moins pro parte, du compartiment C 2 . La vitesse de renouvellement de l’iode

dans le polymère TG 4 est également hétérogène et incite à penser que cette protéine résulte

de la polymérisation de molécules originaires de C t et C 2 .

Ces résultats s’insèrent bien dans le cadre d’une hétérogénéité fonctionnelle de la glande

thyroïde qui a été mise en évidence chez le Rat par des études autoradiographiques et par

des cinétiques de sécrétion de l’iode thyroïdien. Une partie des molécules de thyroglobuline

néosynthétisées, de RAS élevée (Cj), pourraient être hydrolysées rapidement ct à proximité

du ou des sites d’iodation, tandis que les autres continueraient à s’halogéner progressivement

et s’accumuleraient dans la lumière colloïdale. ; elles pourraient ainsi atteindre des taux

d’iodation élevés et. une structure quaternaire plus stable (C 2 ), avant d’être hydrolysées

à leur tour et de libérer les hormones thyroïdiennes, après un temps plus ou moins long

de stockage dans les vésicules colloïdes.

3. Un autre aspect fondamental de l’activité thyroïdienne, la biosynthèse des protéines

thyroïdiennes, a été étudié in vitro chez divers Vertébrés inférieurs. Chez ces derniers,

comme chez les Mammifères, la synthèse de ces protéines est indépendante de l’iodation.

fje spectre d’ultracentrifugation de ces protéines, marquées par la tyrosine tritiée

(3-8 S, ~ 12 S, ~ 19 S) est similaire de celui des protéines synthétisées dans la thyroïde

des Mammifères. Pour chaque espèce de Poisson étudiée, la thyroglobuline néosynthétisée,

non iodée, présente un coefficient de sédimentation inférieur de 1 S environ à celui de la

thyroglobuline native correspondante.

La température jouant un rôle important sur l’activité thyroïdienne chez les Poïki-

lothermes, l'influence de la température d’incubation sur la biosynthèse de la thyroglo¬

buline a été étudiée.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

L’accroissement de la température d’incubation exerce une action positive sur les

processus de biosynthèse de la thyroglobuline jusqu’à une température limite supérieure,

qui varie selon les espèces considérées.

La capacité de biosynthèse protéique des thyroïdes des Poissons et des Mammifères

varie différemment en fonction de la température. D’une part, une synthèse de thyroglo¬

buline est mise en évidence à 5°C après 6 h d’incubation chez les divers Poissons étudiés,

mais ne l’est pas chez les Mammifères même après 48 h d’incubation. D’autre part, les tem¬

pératures optimales de synthèse de la thyroglobuline chez les Téléostéens sont bien infé¬

rieures à 38°C, température de biogenèse de cette protéine dans la thyroïde des Mammi¬

fères, et semblent varier en relation avec la zone de tolérance thermique des espèces.

Avec toutes les réserves qui s’imposent lorsqu’il s’agit de transposer les données obte¬

nues in vitro aux phénomènes in vivo, on peut émettre l’hypothèse que les processus enzy¬

matiques, impliqués dans la biogenèse de la thyroglobuline, présentent une certaine adapta¬

tion thermique selon les espèces et leurs biotopes.

4. Si l’organisation moléculaire des iodoprotéines thyroïdiennes est similaire dans la

série des Vertébrés, diverses données montrent que ces protéines homologues ne sont pas

identiques et présentent une certaine spécificité zoologique.

Des différences interspécifiques significatives sont mises en évidence entre les coeffi¬

cients de sédimentation des protéines thyroïdiennes des divers Poissons étudiés. Les valeurs

extrêmes obtenues pour la thyroglobuline sont de 17,7 S (Truite, Saumon) et de 22,5 S

(Protoptère).

Des variations de la conformation en relation avec le degré d’iodation ou la structure

de la thyroglobuline pouvaient être envisagées pour interpréter ces différences interspéci¬

fiques de coefficient de sédimentation.

Nous avons montré que ces dernières sont indépendantes du taux d’iodation des thy-

roglobulines.

D’un autre côté, l’analyse de la composition en acides aminés des thyroglobulines

de Poissons (Saumon, Truite, Anguille, Protoptère, Roussette) et d’un Reptile (Python)

permet de constater que les teneurs en de nombreux acides aminés varient significativement

selon l’espèce. Nos données ont été comparées à celles obtenues par divers auteurs, à partir

de thyroglobulines d’autres classes de Vertébrés (Amphibiens, Oiseaux et Mammifères)

et dont les coefficients de sédimentation sont voisins de 19 S.

Il apparaît alors que les différences interspécifiques de coefficient de sédimentation

ne sont pas liées à l’importance des variations de la composition globale en acides aminés

de ces protéines.

En revanche, certaines analogies entre les compositions en acides aminés des diffé¬

rentes thyroglobulines considérées sont observées et semblent être en rapport avec les

relations phylétiques des espèces étudiées.

Un grand degré de similitude est observé entre les thyroglobulines des trois Téléostéens

étudiés et entre les thyroglobulines de la Roussette et du Protoptère. Les compositions

de ces dernières sont proches de celles des Amphibiens, Reptiles et Oiseaux, mais diffèrent

nettement de celles des Téléostéens et des Mammifères.

Ainsi, la composition de la thyroglobuline aurait varié indépendamment dans les

lignées des Actinoptérygiens (Saumon, Truite, Anguille) et des Mammifères, tandis qu’elle

ANDRÉE BRISSON

serait restée plus proche de celle d’une thyroglobuline hypothétique ancestrale chez les

Chondrichthyens (Roussette), les Dipneustes (Protoptère), les Amphibiens, les Reptiles et

les Oiseaux.

Remerciements

Je tiens à exprimer mes très vifs remerciements :

à Monsieur le Professeur Fontaine, Membre de l’Institut, qui m’a proposé le sujet de cette

thèse ;

à Messieurs les Professeurs Jost, Jard et Nunez qui m’ont fait le grand honneur de faire

partie du jury ;

à Monsieur Lachiver, Maître de Recherche au CNRS, qui m’a initiée à la recherche et m’a

guidée jusqu’au terme de ce travail ; qu’il soit assuré de ma profonde reconnaissance ;

à Mademoiselle Boulu qui a fait preuve d’une grande compétence technique et d’un dévoue¬

ment constant.

Je dédie ce travail, en témoignage d’affection et de gratitude à mes parents.

BIOSYNTHÈSE ET IODATION DES PROTÉINES THYROÏDIENNES

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Achevé d’imprimer le 30 mars 1974.

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