CRYPTOGAMIE

Mycologie

ANCIENNE REVUE DE MYCOLOGIE

Fondée par R. Heim en 1936

Directeur scientifique: Mme J. Nicot

Secrétaire de Rédaction: M. Bruno Dennetière

Editeur: A.D.A.C. - 12 rue Buffon F-75005 Paris.

BUREAU DE RÉDACTION

Ecologie et Phytopathologie: G. Durrieu (Laboratoire Botanique et Forestier, 39 Allées

Jules Guesde, F-31062 Toulouse Cedex) - Systématique: P. Joly (Laboratoire de Cryptogamie,

Muséum National d'Histoire Naturelle, 12 rue Buffon, F-75005 Paris) - Physiologie: G.

Manachère (Laboratoire de Mycologie, Université de Lyon I, 43 bd du 11 Novembre 1918,

F-69622 Villeurbanne Cedex) - Cytologie: D. Zickler (Laboratoire de Génétique, Université Paris

Sud, Centre d'Orsay, Bât. 400, F-91405 Orsay) - Autres spécialités: M.F. Roquebert (Laboratoi-

re de Cryptogamie, Muséum National d'Histoire Naturelle, 12 rue Buffon, F-75005 Paris).

COMITÉ DE LECTURE

J. Boidin (Lyon), J. Chevaugeon (Orsay), J. Fayret (Toulouse), W. Gams (Baam), G.L.

Hennebert (Louvain-la-Neuve), Ch. Montant (Toulouse), CI. Moreau (Brest), D.N. Pegler (Kew),

B. Sutton (Kew), G. Turian (Genève).

MANUSCRITS

Les manuscrits doivent être adressés directement à un membre du Bureau de Rédaction,

choisi pour sa spécialité. Le Bureau peut demander l'avis d'un lecteur, même s'il n'appartient pas

au Comité de Lecture. Bien qu'étant une revue de langue française, les articles rédigés en anglais,

allemand, italien et espagnol sont acceptés. Les disquettes de micro-ordinateur (IBM, IBM com-

patible, et MacIntosh) sont vivement souhaitées. Les recommandations aux auteurs sont publiées

dans le fascicule 1 de chaque tome. Les auteurs recevront 25 tirés-à-part gratuits; les exemplaires

supplémentaires seront à leur charge.

TARIFS DES ABONNEMENTS Tome 15, 1994

CRYPTOGAMIE comprend trois sections: Algologie, Bryologie-Lichénologie, Mycologie.

Pour une section: France: (326 F ht) 33285 F ttc. - Étranger: 357,00 F

Pour les 3 sections: France: (918 F ht) 93728 F ttc. - Étranger: 1000,00 F

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A.D.A.C. - CRYPTOGAMIE (CCP La Source 34 764 05 S),

adressé à: A.D.A.C. 12, rue Buffon, F-75005 Paris.

CRYPTOGAMIE, Mycologie est indexé par Biological Abstracts, Current Contents,

Publications bibliographiques du CNRS (Pascal).

Source : MNHN. Paris

CRYPTOGAMIIE

MYCOLOGIE

TOME 14 FASCICULE 3 1993

CONTENTS

C. DUPRÉ, G. CHEVALIER, M. PALENZONA et E. BIOCCA -

Characterization of the соога а of several Tuber species ue

enzymatic polymorphism (in French) . ~ Ч

С. HEREDIA - Mycoflora associated with green leaves and leaf litter of

Quercus germana, Quercus sartorii and Liquidambar styraciflua in a

Mexican cloud forest a

H.A.H. HASAN and S.A. OMAR - Selective effect of organophosphate

insecticides on metabolic activities and aflatoxins шеше by two

Aspergillus spp. .

J. BOIDIN, P. LANQUETIN et G. GILLES - Contribution to the Ps

of phanerochaetoideae in France (Basidiomycotina) (in French) ...

S.K. HEMIDA, M.M.K. BAGY and A.M. KHALLIL - Utilization of

hydrocarbons by fungi .

F. KOTLABA and Z. POUZAR - Pilatoporus maroccanus sp. nov. a new

polypore of the Polyporus palustris group .. oe

K. PRZYBYL and M. MORELET - Morphological differences between

Ophiostoma piceae and O. querci, and among O. querci isolates

M. MOSTAFA, G. BARRAULT et L. ALBERTINI - Search for biological

control of barley net blotch by the preventive use of a weakly

aggressive strain of Drechslera teres. ... fag

Bibliography

163

185

195

207

215

219

229

239

Bibliothèque Centrale Muséum

Source : MNHN, Paris

3 3001 00226853 9

Cryptogamie, Mycol. 1993, 14 (4): 163-170 163

CARACTÉRISATION DES MYCORHIZES DE DIFFÉRENTS

TUBER PAR L'ÉTUDE DU POLYMORPHISME

ENZYMATIQUE

Chantal DUPRE*, Gérard CHEVALIER*, Mario PALENZONA** et Ettore BIOCCA***

* Station d'Agronomie et de Mycologie, Unité de Mycologie, LN.R.A.,

12 avenue du Brézet, 63039 Clermont-Ferrand Cedex, France.

** Istituto per le Piante da Legno e l'Ambiente (I.P.L.A.), corso Casale

476, 10132 Turin, Italie.

*** Université "La Sapienza", Istituto di Parassitologia, Rome, Italie.

RÉSUMÉ - L'étude du polymorphisme enzymatique dans les mycorhizes de différents Tuber

montre que l'activité enzymatique de la glutamate-déshydrogénase à NADP constitue un critère

sûr de différenciation. Ce critère biochimique est intéressant pour identifier le symbiote fongique,

lorsque des espèces différentes de Tuber présentent des mycorhizes morphologiquement identi-

ques (T. aestivum - T. uncinatum) ou très voisines (T. melanosporum - T. brumale).

ABSTRACT - A study of the enzymatic polymorphism in the ectomycorrhizas of several Tuber

species has shown that the enzymatic activity of the NADP - dependent GDH is a reliable criteri-

on of discrimination. This biochemical criterion is interesting for identifying the fungal symbiot,

when different Tuber species exhibit mycorrhizas with a quite similar morphology (e.g. T. aesti-

vum - T. uncinatum) or nearly so (for example T. melanosporum - T. brumale).

MOTS CLÉS : Tuber, ectomycorhizes, analyse électrophorétique, variabilité enzymatique.

INTRODUCTION

L'analyse électrophorétique de certaines protéines à fonction enzymatique peut

s'avérer un outil intéressant pour différencier les espèces fongiques, qu'il s'agisse de

Tuber (Palenzona et al., 1988) ou d'autres genres (Yoon et al., 1990; Perreau et al.,

1992).

Dans un travail précédent, Dupré & Chevalier (1991) ont démontré que la

composition protéinique des mycéliums de Tuber en culture pure ou en association

avec le noisetier (Corylus avellana L.) s'avérait un critère hautement spécifique en

taxonomie; toutefois, la technique de l'électrophorèse des protéines totales n'a pas per-

mis de mettre en évidence des groupes de polypeptides fongiques communs au

mycélium en culture et au mycélium associé à la racine.

Le polymorphisme enzymatique s'est également révélé un critère d'une haute

spécificité. Palenzona et al. (1988), puis Pacioni & Pomponi (1989) ont montré qu'il

était possible d'utiliser les systèmes "gène-enzyme" pour différencier les espèces de

L DU

d Source : MNHN. Paris

164 C. DUPRE, G. CHEVALIER, M. PALENZONA et E. BIOCCA

Tuber à partir des ascocarpes. Dupré et al. (1992) ont appliqué la même méthode à

l'étude des mycéliums en culture et prouvé qu'avec les systèmes enzymatiques utilisés

(MDH, IDH, 6 PGDH, SOD, GOT, PGM, MPI et PGI), les patterns obtenus étaient

identiques à ceux des ascocarpes; par contre, il ne leur a pas été possible de mettre en

évidence les isoenzymes du champignon à l'état symbiotique.

Des essais ultérieurs avec les systèmes GDH à NAD, ACP et estérases ont

donné des résultats, soit négatifs (GDH à NAD), soit difficiles à interpréter, par suite

du manque de netteté des bandes (ACP et estérases).

Finalement, grâce à l'utilisation du système GDH à NADP, qui avait donné

des résultats intéressants sur épicéa mycorhizé par Hebeloma sp. (Dell et al., 1989),

nous avons pu “marquer” notre champignon en association avec la racine.

L'objectif de ce travail est de décrire la technique qui a permis de caractériser

les mycorhizes de Tuber avec ce système et de montrer son intérêt en systématique et

comme outil de contrôle de la mycorhization.

MATÉRIEL ET MÉTHODE

1/ Matériel végétal

L'inoculation et l'élevage de plantules de Corylus avellana L., ainsi que les

prélévements de mycorhizes ont été effectués selon les techniques décrites par Dupré

& Chevalier (1991).

2/ Matériel fongique

Six espèces de Tuber ont été étudiées, représentées par vingt deux individus:

T. aestivum Vitt. (Truffe d'été), une truffe, provenant de Provence (région d'Aix en

Provence); T. albidum Pico ("Blanquette"), quatre truffes, provenant de Toscane

(région de Grosseto, Italie); T. brumale Vitt., trois truffes, provenant du Périgord

(région de Bergerac); T. melanosporum Vitt. (T. du Périgord), sept truffes provenant

du Périgord (région de Bergerac, cinq truffes), des Marches (région de Fabriano, Italie,

une truffe) et de Provence (région des Baux de Provence, une truffe); T. rufum Pico

("nez de chien"), une truffe provenant d'Auvergne (région de Clermont-Ferrand); T.

uncinatum Ch. (Truffe de Bourgogne), six truffes provenant de Lorraine (région de

Commercy, une truffe) et de Bourgogne (région de Tonnerre, cinq truffes).

Les prélèvements de gléba ont été faits sur des ascocarpes frais ou congelés

conservés à -80°C, après congélation dans l'azote liquide.

Les cultures mycéliennes ont été réalisées selon la méthode décrite par Dupré

& Chevalier (1991).

3/ Extraction des protéines

Dans le cas des cultures mycéliennes et des ascocarpes, l'extraction des

protéines est effectuée à partir de 350 à 400 mg de matériel fongique (Dupré et al.,

1992); dans le cas des mycorhizes, à partir de 150 à 200 apex mycorhizés. Les

mycorhizes sont conservées, après nettoyage, 24 heures dans 1 ml d'eau désionisée

stérile à 4°C. Durant ce temps, nous avons remarqué un léger développement dans

l'eau du mycélium frangeant des mycorhizes. Ceci nous a permis d'augmenter sensi-

blement la quantité de mycélium par rapport au matériel végétal.

Source : MNHN, Paris

POLYMORPHISME ENZYMATIQUE CHEZ LES TRUFFES 165

Les mycorhizes sont récupérées sur papier filtre Whatman puis déposées dans

un mortier. Elles sont broyées dans de l'azote liquide en présence de PVP (polyclar,

10% et PVP 40, 2%) et de sable de Biot. On ajoute 500 pl de solution d'extraction

(Chalot et al., 1989): Tris-HCI, 50 mM (pH 8); glycérol, 10%; béta mercaptoéthanol,

14 mM (1pl/ml); glutamate, 10 mM; MgSO,, 10 mM; EDTA, 2 mM; PMSF, 1mM.

Le dosage de la quantité de protéines est réalisé à l'aide du réactif préconisé par

Biorad d'après la technique de Bradford (1976). Après une centrifugation à 10 000 g

pendant 2 minutes, on récupère le sumageant contenant les protéines. Les extraits sont

conservés dans des tubes cryogéniques à l'ultracongélateur à -80°C ou dans l'azote li-

quide.

4/ Electrophorèse

L'électrophorèse monodimensionelle en système discontinu, sur gels uniformes

de polyacrylamide, en conditions non dénaturantes, est réalisée verticalement en

minicuve "Mini Protean Il" Biorad. Les dimensions des gels sont de: 8 x 7,3 x 0,075

cm.

Le gel de séparation est coulé sur une hauteur de 5,5 cm.

- Composition du gel à 6% de polyacrylamide (Botton et Chalot, 1991): Solu-

tion A (acrylamide, 30 g; bisacrylamide, 0,8 g; eau permutée, qsp 100 ml), 2,0 ml;

Tris 1M (pH 8,8), 3,5 ml; ammonium persulfate 1,5%, 0,5 ml; TEMED, 10 jl; eau

permutée, 3,8 ml.

- Composition du gel de concentration à 1,596 de polyacrylamide: Solution B

(acrylamide, 10,0 р; bisacrylamide, 2,5 g; eau permutée, qsp 100 ml), 1,2 ml; Tris IM

(pH 6,8), 0,5 ml; ammonium persulfate, 0,2 ml; eau permutée, 2,1 ml.

Après polymérisation du gel de séparation, le gel de concentration est coulé et

un peigne de 10 puits destinés à contenir les dépóts protéiques y est inséré. Avec une

microseringue, on dépose 30 il d'extrait contenant de 9 à 12 ig de protéines dans cha-

cun des 10 puits. Le tampon de migration électrophorétique en conditions non

dénaturantes a la composition suivante: Tris, 2 g; glycine, 9,6 g; eau permutée, qsp 1

litre.

L'électrophorèse se déroule à voltage constant (180 volts) pendant 50 minutes

à 4°C.

5/ Révélation enzymatique

La solution de révélation de la glutamate déshydrogénase à NADP est la sui-

vante:

Tampon Tris-HCI (pH 8), 40 ml; L glutamate, 224 mg; NBT, 32 mg; PMS, 56

mg; NADP, 15 mg (Blumenthal & Smith, 1973).

Le gel immergé dans la solution de révélation est placé dans une étuve à 37°C

pendant 45 minutes à 1 heure. Des taches bleues apparaissent; elles correspondent à la

formation d'un précipité de formazan. Une autre série de taches claires apparaissent

également; il s'agit d'une réaction SOD (superoxyde-dismutase) fréquente dans les co-

lorations utilisant le "système tétrazolium".

Dès l'apparition des taches bleues, on rince à l'eau permutée et on fixe la colo-

ration. Composition du fixateur: acide acétique, 100 ml; glycérol, 100 ml; eau

permutée, qsp 1 litre.

Source : MNHN, Paris

166 C. DUPRE, G. CHEVALIER, M. PALENZONA et E. BIOCCA.

RÉSULTATS

1/ Polymorphisme enzymatique dans les ascocarpes, les cultures mycéliennes et les

mycorhizes de T. melanosporum et T. uncinatum.

Les profils présentés sur la figure 1 (provenant chacun d'individus différents)

montrent qu'au sein d'une même espèce, la mobilité électrophorétique de la GDH à

NADP est identique; il en est de même pour celle de la SOD; par contre, entre

espèces, le polymorphisme est suffisant pour permettre une différenciation nette.

Nous n'avons pas observé de bande dans la piste (T) correspondant aux racines

non mycorhizées.

T. melanosporum T. uncinatum

Fig. 1 - Zymogrammes de la GDH à NADP et de la SOD dans les ascocarpes, les cultures

mycéliennes et les mycorhizes de T. melanosporum et T. uncinatum (T. melanosporum:

1, ascocarpe, Provence; 2, mycélium en culture, Marches; 3, mycorhizes sur C. avellana,

Périgord - T. uncinatum: 4, ascocampe, Lorraine; 5, mycélium, Bourgogne; 6,

mycorhizes, Bourgogne; T, racine témoin non mycorhizée).

Fig. 1 - Electrophoretic patterns for NADP-GDH and SOD in ascocarps, mycelial cultures and

mycorrhizas of T. melanosporum and T. uncinatum (T. melanosporum: 1, ascocarp,

Provence; 2, mycelial culture, Marches; 3, C. avellana mycorrhizas, Perigord - T.

uncinatum: 4, ascocarp, Lorraine; 5, mycelium, Burgundy; 6, mycorrhizas, Burgundy; T,

non mycorrhized root).

Source : MNHN. Paris

POLYMORPHISME ENZYMATIQUE CHEZ LES TRUFFES 167

2/ Polymorphisme enzymatique dans les mycorhizes de différentes espèces de

Tuber avec Corylus avellana.

Les profils des figures 2 et 3 (provenant, comme ceux de la figure 1, d'indivi-

dus différents) confirment la possibilité de différencier les espèces entre elles, alors

que, dans une même espèce, les distances de migration des taches montrent une remar-

quable homogénéité. Nous avons calculé, pour la GDH à NADP, les moyennes des

Rf pour corriger les effets de différences dues à la lecture sur plusieurs gels. Les

moyennes ont été effectuées de la facon suivante:

Rf= 3(Rfc) + aRt + 3(Rfm)

avec: Rfc = valeur correspondant à la bande révélant la GDH à NADP pour les cultu-

res mycéliennes; Rfa = idem pour les ascocarpes; Rfm — idem pour les mycorhizes; 3

et 9 = nombre de répétitions.

Les Rf des bandes révélant la GDH à NADP, pour les espèces de Tuber

représentées sur la figure 2, ont les valeurs suivantes:

T.uncinatum brumale melanosporum albidum

Fig. 2 - Zymogrammes de la GDH & NADP dans les mycorhizes de quatre espèces de Tuber avec

C. avellana (1 et 2: T. uncinatum, Bourgogne; 3 et 4: T. brumale, Périgord; 5 et 6: T.

melanosporum, Périgord: 7 et 8: T. albidum, Toscane).

Fig. 2 - Electrophoretic pattems for NADP-GDH in mycorrhizas of four Tuber species with C.

avellana (1 and 2: T. uncinatum, Burgundy; 3 and 4: T. brumale, Perigord; 5 and 6: T.

melanosporum, Perigord; 7 and 8: T. albidum, Tuscany).

Source : MNHN. Paris

168 C. DUPRE, G. CHEVALIER, M. PALENZONA et E. BIOCCA

i 1 2 3 4 5 6 7 8

T.alb alb mel unc aes bru mel ruf

Fig. 5 - Zymogrammes de la GDH à NADP dans les mycorhizes de six espèces de Tuber avec C.

avellana (1 et 2: T. albidum, Toscane; 3: T. melanosporum, Périgord; 4: T. uncinatum,

Bourgogne; 5: T. aestivum, Provence; 6: T. brumale, Périgord; 7: T. melanosporum,

Périgord; 8: T. rufum, Auvergne).

Fig. 3 - Electrophoretic patterns for NADP-GDH in mycorrhizas of six Tuber species with C.

avellana (1 and 2: T. albidum, Tuscany; 3: T. melanosporum, Perigord; 4: T. uncinatum,

Burgundy; 5: T. aestivum, Provence; 6: T. brumale, Perigord; 7: T. melanosporum.

Perigord; 8: T. rufum, Auvergne).

T. uncinatum, 0,271; T. brumale, 0,410; T. melanosporum, 0,471; T. albidum,

0,433.

Certaines espèces proches dans la systématique, telles T. uncinatum et T.

aestivum ont une bande majeure semblable (fig. 3). T. uncinatum possède une bande

fine supplémentaire (visible sur la fig. 2); chez T. melanosporum et T. brumale, les dis-

tances de migration de la GDH à NADP sont voisines, mais celles de la SOD sont

beaucoup plus discriminantes. Les distances de migration de la GDH à NADP chez

ces deux dernières espèces sont également voisines de celles observées chez T.

albidum, espèce pourtant éloignée sur le plan taxonomique.

DISCUSSION ET CONCLUSION

Parmi les 12 systèmes enzymatiques étudiés, seule la GDH-NADP a permis de

mettre en évidence de manière constante une activité enzymatique à partir des

mycorhizes de Tuber; la SOD a donné des résultats plus irréguliers.

Source : MNHN, Paris

POLYMORPHISME ENZYMATIQUE CHEZ LES TRUFFES 169

Le rôle clé de la GDH dans l'assimilation de l'azote ammoniacal dans les

mycorhizes d'épicéa a été clairement mis en évidence par Dell et al. (1989). Ces au-

teurs ont démontré que, dans des extraits bruts de mycorhizes d'Hebeloma sp. sur

épicéa (Picea excelsa L.) de deux ans, 85% de l'activité totale de la GDH sont dus à la

GDH à NADP du champignon; au contraire, la GDH fongique est fortement réprimée

in vitro dans les mycorhizes du hêtre (Fagus sylvatica L.) avec Hebeloma

crustuliniforme (Bull. ex St Amans) et Paxillus involutus (Batsch ex Fr) Fr. La

présence de GDH à NADP dans les extraits de mycorhizes d'épicéa suggère que

l'ammonium absorbé par les mycorhizes est d'abord assimilé par la GDH à NADP

dans les tissus de l'hôte pour produire du glutamate qui pourrait par la suite être

catalysé par la glutamine-synthétase (GS) du champignon, avant d'être transporté com-

me glutamine vers les cellules de la plante.

Chez les Tuber, les profils obtenus avec les ascocarpes, les cultures

mycéliennes et les mycorhizes donnent la même réponse, pour une espèce de Tuber

donnée.

Les résultats obtenus dans cette étude confirment, mais complètent également

ceux publiés en 1992 par Dupré et al; en effet, jusqu'ici, la caractérisation des

mycorhizes ne pouvait être obtenue que par une voie indirecte consistant à réaliser

l'électrophorése des isoenzymes sur les cultures de mycélium isolé à partir des

mycorhizes; dans le travail présenté ici, l'analyse est effectuée directement sur les

mycorhizes, ce qui simplifie fortement la technique.

La forte affinité entre les profils électrophorétiques de T. aestivum et T.

uncinatum confirme les résultats obtenus en 1992 par Gandeboeuf, dans une étude

menée sur la différenciation des deux taxons par l'analyse des isoenzymes des

ascocarpes et des cultures mycéliennes.

L'analyse électrophorétique des isoenzymes présentes dans les mycorhizes des

Tuber fournit donc un outil extrêmement intéressant de contrôle biochimique de la

mycorhization des plants, lorsqu'une forte convergence de la morphologie des

mycorhizes rend difficile l'identification du symbiote fongique par les méthodes classi-

ques: c'est le cas pour T. aestivum - T. uncinatum et T. albidum - T. magnatum. Ces

deux derniers Tuber font actuellement l'objet d'une recherche spécifique, en collabo-

ration avec le Département de Génétique et Biologie moléculaire de l'Université "La

Sapienza" de Rome.

REMERCIEMENTS

Ce travail a bénéficié d'une subvention européenne dans le cadre du Plan d'intégration

méditerranéen et du projet "Relance de la trufficulture en Aquitaine",

BIBLIOGRAPHIE

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Source : MNHN, Paris

Cryptogamie, Mycol. 1993, 14 (3): 171-183 171

MYCOFLORA ASSOCIATED WITH GREEN LEAVES AND

LEAF LITTER OF QUERCUS GERMANA, QUERCUS SARTORII

AND LIQUIDAMBAR STYRACIFLUA

IN A MEXICAN CLOUD FOREST

Gabriela HEREDIA

Instituto de Ecología, Apartado Postal 63, 91000 Xalapa, Ver. México

ABSTRACT - The mycoflora of green leaves and leaf litter of Quercus germana, Q. sartorii and

Liquidambar styraciflua was studied by damp chambers, isolations from surface-sterilized and

washed leaf fragments. The three types of leaves shared a high fungal species percentage. Domi-

nant species on green leaves were different from those on leaf litter. On green leaves, Pestalo-

tiopsis maculans was the most frequently recorded species from the three leaf specimens. In de-

caying litter most of the fungi were sporadic and had low frequency of occurrence. Only the

fungi Beltrania rhombica, Codinaea assamica, Chalara alabamensis, Cryptophiale kakombensis,

Cylindrocladium scoparium, Ellisiopsis gallesia and Subulispora procurvata were detected

throughout the decomposition process. Beltrania rhombica was the dominant fungus on Q. germa-

na and Q. sartorii leaf litter and C. scoparium on L. styraciflua leaf litter. The general pattern of

succession scheme was similar to that reported from leaves of other species of deciduous trees.

The leaf litter fungi were characteristic of tropical ecosystems.

RÉSUMÉ - La mycoflore des feuilles vertes et de la litière de Quercus germana, Quercus sartorii

et Liquidambar styraciflua a été étudiée à l'aide de chambres humides, et isolée des feuilles après

stérilisation de la surface et lavages sériés de fragments. Les 3 sortes de feuilles partagent un

grand pourcentage d'espèces fongiques. Les espèces dominantes sur les feuilles vertes sont

différentes de celles de la litière. Sur les feuilles vertes, l'espèce la plus abondante est

Pestalotiopsis maculans. Dans la litière en décomposition, la plupart des champignons sont spo-

radiques et peu abondants. Seules les espèces Beltrania rhombica, Chalara alabamensis,

Codinaea assamica, Cryptophiale kakombensis, Cylindrocladium scoparium, Ellisiopsis gallesiae

et Subulispora procurvata sont observées tout au long du processus de décomposition. Beltrania

rhombica est le champignons le plus abondant sur la litière de Q. germana et Q. sartorii et C.

scoparium sur celle de L. styraciflua. Le schéma général de succession des espèces est semblable

à celui des feuilles d'arbres décidues. Les champignons de ces litières sont caractéristiques

d'écosystèmes tropicaux.

KEY WORDS : Mycoflora, leaves, litter, Quercus germana, Q. sartorii, Liquidambar styraci-

flua, Mexico.

INTRODUCTION

Due to their saprophytic ability, fungal communities play an important role in

the decomposition of plant and animal residues and therefore in the release of nutrients

(Harley, 1971). In forests, leaves are the major components of litter (Jensen, 1974).

Source : MNHN, Paris

172 G. HEREDIA

Long before leaves fall, the process of decay begins. Green leaves surfaces

form suitable substrates for different kinds of saprophytic and parasitic fungi. When

leaf abscission takes place and during leaf decomposition above the soil surface, one

group of fungi may be replaced by another group. The sequential appearance of fungal

species on plant residues is considered as a fungal succession. This phenomenon has

been widely studied on many different substrates.

A detailed review of the studies dealing with fungal successions on leaf litter

was published by Hudson (1968). Most work has been focused on temperate tree

leaves like oak, birch, hazel, ash (Hering, 1965), beech (Hogg & Hudson, 1966) and

poplar (Visser & Parkinson, 1975).

Little is known about the mycoflora and successional patterns on tropical plant

residues. Hudson (1962) studied fungal succession on ageing leaves of sugar cane and

Meredith (1962) isolated fungi on banana leaves. For wild tropical species, Kiffer et

al. (1981) described the fungal succession throughout the decomposition of leaf litter

of Euperia falcata in French Guyana and Rambelli et al. (1983) published an extensive

Study on the leaf litter fungi from a tropical rain forest in the South Western Ivory

Coast.

In Mexico no studies on the green leaves and leaf litter mycoflora have so far

been carried out. The cloud forest is interesting to be studied. The mixture of tropical

and temperate tree species and the high accumulation of leaf litter make this kind of

forest suitable for studies dealing with leaf litter fungi.

The aims of this work were: (a) to determine the mycoflora on green and de-

caying leaves of three dominant tree species (Liquidambar styraciflua L., Quercus sar-

torii Liemb., and Quercus germana Cham. et Schlecht) in a Mexican cloud forest, (b)

to assess the frequency of the dominant fungal species in the leaf litter during decom-

Position, (c) to describe the fungal succession occurring during the decay of the leaf

litter.

STUDY AREA

The study was performed in a cloud forest located within the "El Cielo" Bio-

sphere Reserve in Northeastern Mexico. A detailed description of the site is given by

Sosa (1987). The sampling area is at an altitude of 1200 m. The annual mean temper-

ature is 13.8°C being highest in May (34.4°C) and lowest in January and February

(-2.2°C), with a total annual rain-fall of 2522 mm. (Fig. 1) (Puig & Bracho, 1987).

Forest structure has been studied by Puig et al. (1987). Liquidambar styraci-

flua L., Quercus sartorii Liemb., Quercus germana Cham. et Schlecht and Clethra

pringlei S. Watson are the dominant trees. Understorey includes ferns, mosses, hepat-

ics and selaginellas.

Bracho & Puig (1987) studied litter production in several areas of the cloud

forest. Litterfall biomass was estimated at 7.3 ton/ha/year, 5.6 ton/ha/year (76.7%) be-

ing composed of leaves. The Species with the greatest contributions were the decidu-

ous trees Q. sartorii, Q. germana and L. styraciflua. These authors reported two peaks

of leaf fall, in January and November, but leaf fall may occur throughout the year due

to frequent winds in this area. The litter layer on soil is 5 to 10 cm depth.

Source : MNHN, Paris

MYCOFLORA OF QUERCUS 173

30 700

РЕ 600

500

E E

Е аоо Е

5 15 5

o 300 &

Е т

F 10) ~

200

5 100

шчо

J F M A M J J*A*S*O*N*D*

Months

— Mean Temp. Rain fall

Fig. 1 - Mean monthly temperature and rainfall in study area. * Sample dates.

Fig. 1 - Moyenne mensuelle des températures et des précipitations de l'aire d'étude. * Date

d'échantillonnage.

MATERIAL AND METHODS

Collection of leaf litter.

In July freshly fallen leaves of Q. germana, Q. sartorii and L. styraciflua were

collected from the ground. Leaves were placed in litter bags (20 x 25 cm, 3 mm mesh)

(Bocock & Gilbert, 1957). Each bag contained 20 leaves. For each type of leaf 30 lit-

ter bags were made up. The bags were deposited within three plots on top of the na-

tural litter cover. Sampling dates were 30 Aug., 7 Oct., 28 Oct., 29 Nov., and 22 Dec.

At each collection-date, two randomly choosen bags of each species were collected

from each plot (six replicates). Samples were placed separately in sterile polyethylene

bags and stored at 5°C before processing.

Leaf disks were punched from each leaf with a sterile cork borer of 5 mm

diam. One half of each batch of disks was used for isolation in culture medium and

the remainder was used for damp-chamber incubations.

Source : MNHN, Paris

174 G. HEREDIA

Isolation in culture medium.

The isolations were carried out by means of serially washing of previously

surface-sterilized leaf disks. This method was used to isolate fungi growing in the leaf

tissues. Leaf disks were surface sterilized in sodium hypoclorite for 1 min and then

washed 10 times with sterile water for 1 min. Between washings, the vials were com-

pletely drained. For each sample, 50 leaf disks were transferred to 10 Petri dishes con-

taining potato-dextrose-agar (PDA) with 0.03 gr streptomycin (Ulloa & Hanlin, 1978).

Plates were incubated at 25°C and examined after 8 days. Representative iso-

lations of fungal colonies were made for further identification.

Damp chamber incubation.

For each sample, 50 disks were distributed in 5 damp chambers. The chambers

are sterile Petri dishes with filter papers, which were kept moistened by additions of

sterilized water every 3-5 days. Incubation was at 25°C for 30 days. Microscopic ex-

amination was made by using pieces of double-adhesive tape (Langvard, 1980). Tapes

were stained with lactophenol-cotton blue.

At the initiation of the study (in July), living green leaves were collected from

the three tree species studied. Mycological observations were made by the same meth-

ods described for the leaf litter. For each tree species 500 leaves were collected, from

which 250 disks were incubated in damp chambers and 200 were used for fungal iso-

lations.

For each fungal species growing in damp-chambers and on PDA medium, the

percentage frequency of occurrence defined as the number of leaf-disks on which fun-

gus occurred / total number of disks plated x 100 was recorded.

Means of the percentage of occurrence for each fungus were calculated from

the six replicates. The Mann-Whitney and Kruskall Wallis tests were applied to test

for the significance of variation among sampling dates (Zar, 1974). The Sorensen In-

dex was used to compare the similarity of the mycoflora composition of the three leaf

species (Brower & Zar, 1977).

Isolates were identified by means of standard mycological methods (Barron

1968; Carmichael et al., 1980; Ellis, 1971, 1976; Glawe & Crane, 1987; Morgan-Jones

& Ingram, 1976; Nag Raj & Kendrick, 1975; Nag Raj 1985; Nawawi & Kuthubu-

theen, 1987; Pirozynski, 1963; Rifai, 1969).

RESULTS

Table 1 shows the fungal species observed in damp chambers and isolated by

serial washing. More species were detected by damp chambers than by cultural iso-

lations. The percentage frequency of occurrence of the most representative. fungal spe-

cies for the three kinds of leaves studied are shown in Tables 3, 4 and 5.

Green leaves mycoflora.

The three types of leaves had many common fungal species (Table 2). Most of

the species observed on green leaves disappeared in the leaf litter during the early

stages of decomposition. Only the fungi Beltrania rhombica and Pestalotiopsis macu-

lans were detected on green leaves as well as on leaves in early and late stages of de-

cay.

Source : MNHN, Paris

MYCOFLORA OF QUERCUS 175

Titernaria alternata [Tt] YeissTer

A, tenvissiaa (Kunze ex Pers.) Wiltshire

Aspergillus fumigatus Pres.

Aspergillus niger van Tieghen

Neltrania querna Harknes

Beltrania rhosbica 0. Pentig

Cercospora sp.

Curvularia lunata (Vakter) Beetijn

Cplindrocladiun scopariua Morgan

Cladosporium cladosporioides (Fresen. ] de Vries

C. herbarum (Pers.) Link ex S.F, Gray

Codinaea assamica (Agn.| Hughes et Kendrick

Codinaea siaplex Hughes et Kendrick

Cryptophiale kakcabensis Piroryrski

Chaetomium globosuz Kunze: Fr

Chalara alabamensis Morgan-Jones et Ingram

Chalara urceolata ag Baj et Kendrick

Hctrlella ellisospora (1,5. |

Dendrosporiua lobatua (Plakidas et Bagerton}

Dicrosporiun heptasporue {Garoy. | Danon

Dipocladiella sealaroides Arnaud

Drechslera bavaiiensis Subran et Sain

Hlisiopsis gallesias Batista et Nascimento

Epicoccua purpurascens Ehrenb

Fosarius spp.

ИШЕ]

Idriella Junata Nelson et Vilbele

Nenisporopsis theobronse Hughes

Nonochaetia sp

igrospora sphaerica (Sacc.| Masson

Nucor hienlis Vehner

Olpitrichua macrosporum Atkinson

Penicillius spp

Pestalotiopsis saculans |Cia.] Hughes

Phialocephala sp

n sp

Fithoayces chartarus (Berk. et Curt.) Ellis

Mhinocladiella 4

Stachybotrys atra Corda

Subulispora procucvata tubaki

otraploa aristata Berk et Br

trichoderaa viride Pers

fripospermus ayrti (Lind.) Bughes

friscelosporiun rerrucosus Vavavi & Kuth

Tubakia dryina (Sace.) Sutton

Terticilliu spp

A= Moist chamber (chambre humide) B= Washed disks (disques lavés)

* present; - absent

Table 1 - Fungal species present on green leaves and leaf litter of Quercus germana (Q. g).

Quercus sartorii (Q. s.) and Liquidambar styraciflua (L. s.).

Tableau 1 - Champignons présents sur les feuilles vertes et la litière de Quercus germana (Q. g.),

Quercus sartorii (Q. s.) et Liquidambar styraciflua (L. s.).

The most frequently recorded species on green leaves were P. maculans on Q.

germana and L. styraciflua, and Tubakia dryina on Q. sartorii in damp chambers. In

cultural isolations, P. maculans was the fungus with the highest percentage of occur-

Source : MNHN, Paris

176 G. HEREDIA

rence for the three leaf species. The fungi restricted to green leaves were Olpitrichum

macrosporum on Q. germana, Rhinocladiella sp. on Q. sartorii, and L. styraciflua and

Tripospermium myrti on leaves of the three species.

Leaf litter mycoflora.

As with the green leaf mycoflora, a high percentage of shared species was ob-

served on leaves of the three tree species (Table 2). Throughout the decomposition pe-

riod, only a few species were present at all samplings. These species exhibited sharp

changes in their frequency of occurrence from one date to the other.

Q. germana leaves suffered the least changes during decay, although leaves

became progressively darker in color. After 104 days, many leaves showed few chang-

es in shape, at the end of the study 60% of the samples were fragmented.

The fungi most frequently recorded on Q. germana fresh fallen leaves were B.

rhombica and S. procurvata (Table 3). No significant difference was found in their fre-

quency of occurrence (P= 0.388 Mann-Whitney U). On subsequent samplings, the

fungus B. rhombica became the dominant species. Significative differences in its fre-

quency of occurrence were found as decomposition advanced (P= 0.012 Kruskal-Wal-

lis).

Q. sartorii leaves turned dark in very early decomposition stages and by the

end of the study all leaves were fragmented. In Table 4 data of the mycoflora on Q.

sartorii are presented. Like in Q. germana, on fresh fallen leaves and in early decom-

position stages, B. rhombica was the most frequently recorded species.

In later samplings besides B. rhombica, the fungi E. gallesiae and Ch. alabam-

ensis were the most prominent species. After 74 days there were no significant differ-

ences between B. rhombica and E. gallesiae (P= 0.500 Mann-Whitney U). At 102 days

even though Ch. alabamensis showed higher percentages than B. rhombica, no signif-

icant difference was found in their frequency of occurrence (P= 0.196 Mann-Whitney

U). During late stages of decay (134 and 157 days) B. rhombica was the dominant

species again.

L. styraciflua leaves were the most susceptible to decay. The leaves darkened

rapidly and most of the leaf material had disappeared by the end of the study. The

dominant fungus on L. styraciflua was C. scoparium (Table 5). In intermediate decay

Stages, some species of Fusarium were observed. During late stages of decay, an in-

crease in Trichoderma viride was observed on the isolation plates.

Tree leaf species Green leaves Leaf litter

Q. germana vs Q. sartorii 89% 86%

Q. germana vs L. styraciflua 75% 728

I. styraciflua vs Q. sartorii 652 739

Table 2 - Similarity among the mycoflora of Quercus germana, Quercus sartorii and Liquidam-

bar styraciflua green leaves and leaf litter, according to the Sorensen Index.

Tableau 2 - Similarité de la mycoflore entre feuilles vertes et de litière de Quercus germana,

Quercus sartorii et Liquidambar styraciflua selon l'indice de Sorensen.

Source : MNHN, Paris

MYCOFLORA OF QUERCUS 177

SPECIES TIME (Days)

74 102

Alternaria spp

Beltrania rhombica

Cladosporium spp

Codinaea assamica

Cylindr. scoparium

Crypt. kakombensis

Chala. alabamensis

Ellisio. gallesiae

Epic. purpurascens

Fusarium spp

Mucor hiemalis

Penicillium spp

Pestalot. maculans

Sub. procurvata

Trichoderma viride

Tubakia dryina

Verticillium sp

* Fresh fallen leaves

* Feuilles récemment toubées

Table 3 - Percentage frequency of observed fungi in moist chambers (A) and isolated from disin-

fected-washed fragments (B) from green leaves and leaf litter of Quercus germana. Va-

lues are the average of six replicates. Only those species occurring with a frequency

higher than 596 have been listed.

Tableau 3 - Pourcentage de fréquence des champignons observés dans les chambres humides (A)

et isolés des fragments désinfectés-lavés (B) des feuilles vertes et de la litière de Quer-

cus germana. Les valeurs sont la moyenne de 6 répétitions. Seules les espèces ayant

une fréquence supérieure à 5% sont présentées.

SPECIES TIME (Days)

74 102

Alternaria spp

Beltrania rhombica

Cladosporium spp

Codinaea assamica

Crypt. kakombensis

Cylindr. scoparium

Chala. alabamensis

Ellisio. gallesiae

Fusarium spp

Mucor hiemalis

Pestalot. maculans

Penicillium spp

Sub. procurvata

Trichoderma viride

Tubakia dryina

* Fresh fallen leaves

* Feuilles récemment tombées

Table 4 - Percentage frequency of observed fungi in moist chambers (A) and isolated from disin-

fected-washed fragments (B) from green leaves and leaf litter of Quercus sartorii. Val-

ues are the average of six replicates. Only those species occurring with a frequency

higher than 5% have been listed.

Tableau 4 - Pourcentage de fréquence des champignons observés dans les chambres humides (A)

et isolés des fragments désinfectés-lavés (B) des feuilles vertes et de la litière de Quer-

cus sartorii. Les valeurs sont la moyenne de 6 répétitions. Seules les espèces ayant une

fréquence supérieure à 5% sont présentées.

Source : MNHN, Paris

178 G. HEREDIA

SPECIES

Beltrania rhombica

Cladosporium spp

Codinaea assamica

Cylidro. scoparium

Chala. alabamensis

Ellisio. gallesise

Epic. purpurascens

Fusarium spp

Penicilliul

Pestalot.

Sub. procurvata

Trichoderma viride

Verticillium sp

* Fresh fallen leaves

* Feuilles récemment tombées

Table 5 - Percentage frequency of observed fungi in moist chambers (A) and isolated from disin-

fected-washed fragments (B) from green leaves and leaf litter of Liquidambar styraci-

flua. Values are the average of six replicates. Only those species occurring with a fre-

quency higher than 5% have been listed

Tableau 5 - Pourcentage de fréquence des champignons observés dans les chambres humides (A)

ct isolés des fragments désinfectés-lavés (B) des feuilles vertes et de la litière de Liqui-

dambar styraciflua. Les valeurs sont la moyenne de 6 répétitions. Seules les espèces ay-

ant une fréquence supérieure à 5% sont présentées.

DISCUSSION

The importance of using complementary techniques in mycological studies has

been pointed out by Dickinson (1971). In spite of the limitations of the two methods

employed in this study, they provided enough information to compare the mycoflora

between green leaves and leaf litter and to detect changes in the fungal species in-

volved in the decomposition of the three leaf species.

Very few species observed in damp chambers were isolated by the washing

and plating technique. This could be due to the difficulty of these fungi to compete

with the fast-growing species when plated on synthetic media.

The fungi observed on sterilized surface washed disks may be considered as

internal tissue colonizers involved in the. depletion of the substrate. The frequent ocur-

rence of Trichoderma viride on plates could be related to the low number of species

Observed on the cultural isolations. This fungus covered the whole surface of some

plates, preventing the growth of other species.

Examination of green leaves revealed the species capable of surviving on leaf

litter. The fungi Alternaria spp., Cladosporium spp. and E. purpurascens were found

on green leaves and litter in the early stages of decay. These species are common leaf-

inhabitants and have been reported in the phylloplane of a wide range of plants. Be-

Cause of their frequency on senescent leaves and relatively undecayed plant debris,

these species are considered as common. primary saprophytes (Hudson, 1968).

Source : MNHN, Paris

MYCOFLORA OF QUERCUS 179

Pestalotiopsis maculans was one of the few fungi found on green leaves and

during all stages of litter decay. This fungus presented a high frequency occurrence on

both green leaves and fresh fallen leaves. Pestalotiopsis spp. have been reported as

early colonizers on the leaf litter of Nothofagus truncata (Ruscoe, 1971), on Quercus

phillyraeoides and Castanopsis cuspidata (Tubaki & Yokoyama, 1971). Pestalotiopsis

spp. are known plant parasites on numerous species of higher plants (Guba, 1961). Its

presence, even in low percentages, on well decayed leaves demontrates its ability to

survive on dead material.

The litter mycoflora on leaves of the three tree species was characterized by

many fungi that appeared sporadically and with low frequency. Only a few species

were constant throughout the decomposition process. A similar observation was made

by Watson et al. (1974) on loblolly pine and hardwood leaf litter.

According to the Sorensen Index of similarity, the three kinds of leaves shared

a high percentage of species. However, the frequency of occurrence of various fungi

were different on the three types of leaves. On Q. germana and Q. sartorii, the domi-

nant species was B. rhombica. By contrast, on L. styraciflua leaves, B. rhombica dis-

appeared rapidly during the early stages of decay. The dominant species on L. styraci-

flua was C. scoparium. These results suggest a selective effect of the host leaves on

the fungal flora. The chemical composition on leaf tissues may have important effects

on fungi development (Swift, 1976).

Although B. rhombica was found on green leaves and fresh fallen leaves, this

species appeared to prefer senescent and well-decayed leaves. Similar results were ob-

tained by Padney (1990) on guava leaves. On wild plants Kiffer et al. (1981) and Ram-

belli et al. (1983) reported B. rhombica as a dominant fungus on leaf litter of tropical

plants.

The presence of C. scoparium as the most abundant fungus on L. styraciflua

leaf litter and the frequent detection of Verticillium spp. and Fusarium spp. may be re-

lated to the more rapid decay of this litter type. The genera Verticillium and Fusarium

include some soft rot species, while C. scoparium has been reported as a phytopatho-

gen causing leaf blight and damping-off on seedlings of ornamental plants (Westcott,

1960) and root decline of Abies, Acacia and Liquidambar hosts (Farr et al., 1989).

Ch. alabamensis, E. gallesiae, C. assamica, C. kakombensis and S. procurvata

appeared regularly enough to be considered leaf litter-inhabiting fungi. All these fungi

have a tropical and subtropical distribution (Ellis, 1971; Ellis, 1976; Rambelli et al.,

1983).

The variation in the frequency of fungal species during the litter decompos-

ition did not appear to be related to climatic conditions. The constant shedding of

leaves along the year and the continuous canopy cover of the forest besides an almost

constant mean temperature in this forest (Fig. 1), may retard evaporation from the

deeper litter layers. Consequently, it is possible that the microclimate created in the

leaf litter layer reduce the effect of weather changes on litter mycoflora. Other factors

such as antagonism, competition, predation and chemical changes on the substrate

must play an important role in determining the changes on the abundance of the fungal

species.

Most of the species observed in this study were fungi imperfecti, especially

dematiaceous forms. Hering (1965) and Rambelli et al. (1983) have pointed out the

presence of dark mycelium species on leaf litter. Rambelli et al. (1983) concluded

that a higher frequency of pigmented species exists on leaf litter than in soil. The ad-

vantages of fungal pigmented structures on leaves have been discussed by Diem

Source : MNHN, Paris

Primary saprophytes

(green & fresh fallen leaves)

Secondary saprophytes

(leaf litter)

Alternaria alternata

Alternaria tenuissima

Cladosporium cladosporioides

Cladosporium herbarum

Curvularia lunata

Epicoccum purpurascens

decomposition progress

early middle advanced

Leaf litter fungi

Beltrania rhombica!

Codinaea assamica

Cryptophiale kakombensis

Cylindrocladium scopari

Chalara alabamensis

Ellisiopsis gallesiae

Pestalotiopsis maculans

Subulispora procurvata

Olpitrichum macrosporum

Pestalotiopsis maculans

Rhinocladiella sp

Tubakia dryina

Soil fungi

Fusarium spp

Penicillium spp

Trichoderma viride

Mucor hiemalis

Verticillium sp

Table 6 - General fungal succession pattern on Quercus germana, Q. sartorit and Liquidambar

styraciflua leaves.

! Only on Q. germana and Q. sartorii.? Only on L. styraciflua.

Tableau 6 - Modele général de la succession fongique pendant la décomposition des feuilles de

Quercus gremana, Q. sartorii et Liquidambar styraciflua.

! Seulement sur Q. germana et Q. sartorii.? Seulement sur L. styraciflua.

(1971). The thicker hyphal walls make them more resistant to bacterial lysis and

depredation.

On the other hand the fungal potential for leaf component utilization, must in-

fluence the occurrence of certain species. White et al. (1948) reported many dark-pig-

mented fungi able to break down cellulose. Kjoller & Struwe (1980) isolated micro-

fungi on decomposing red alder (Alnus glutinosa) leaves and tested their ability to

grow on different substrates. They found that the dematiaceous Phoma spp. and Cla-

dosporium spp. had high potentials for cellulose and starch utilization. These results

suggest that the high frequency of dematiaceous species on leaf litter could be related

to their ability to decompose leaf litter material. Unfortunately, the physiology of most

fungi associated with the leaf litter is unknown.

A scheme of the fungal succession is presented in table 6. In general, the my-

coflora succession pattern on the three leaves studied is like that mentioned by Hudson

(1968) on deciduous leaves. As most of the leaf litter fungal successions described,

Deuteromycetes species were observed since early decomposition stages, in contrast,

Zygomycetes species were infrequent and apppeared on late decay stages. This gives

support to Webster's observations (1957) that Mucorales play little if any part in the

decomposition of plant remains above the soil.

Source : MNHN, Paris

MYCOFLORA OF QUERCUS 181

Regarding Basidiomycetes, mycelia with clamp connections were occassionaly

observed on damp chambers. The absence of Basidiomycetes in the isolation media

may be due to their low capacity to grow on synthetic media.

Fungal species reported on leaf litter from temperate and tropical forests are

the same as those observed on cloud forest leaf litter mycoflora on fresh fallen leaves

and late decay. Nevertheless throughout the decomposition and on advanced decay

stages there is a group of leaf litter-inhabiting fungi characteristic of tropical forests

plant remains.

Acknowledgments. - I am grateful to D. Parkinson and S. Visser for helpful comments on the

manuscript. I also thank V. J. Sosa for his valuable assistance throughout the study and I. Barois

for French translation.

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SELECTIVE EFFECT OF ORGANOPHOSPHATE

INSECTICIDES ON METABOLIC ACTIVITIES AND

AFLATOXINS BIOSYNTHESIS BY TWO ASPERGILLUS SPP.

H.A.H. HASAN and S.A. OMAR

Botany Department, Faculty of Science, Assiut University, Assiut,

Egypt.

ABSTRACT - In liquid cultures treated with three organophosphate insecticides (Dimethoate,

Malathion, and Selecron) at rates 10, 50, 100, 250 and 500 mg/L active ingredient, mycelial pro-

duction by Aspergillus flavus IMI 89717 was significantly promoted with most treatments and in-

hibited only at 500 mg/L level. Mycelial dry weight of A. parasiticus var. globosus IMI 120920

was significantly delayed by all used doses. Respiration of A. flavus was decreased at the higher

rates of Dimethoate and Malathion but the effect of Selecron was unclear. CO; production by A.

parasiticus was promoted in all cases, The pattern for depletion of total fatty acids with Mala-

thion was similar to that for aflatoxins while an inverse relationship was recorded between fatty

acids and aflatoxins biosynthesis with Dimethoate and Selecron by both toxigenic aspergilli. On

sorghum treated with the three insecticides, the highest application rate (5000 mg/kg) suppressed

the production of aflatoxins B}, B}, G} and G; by the two tested aspergilli.

RÉSUMÉ - En milieu liquide, l'ajout de trois insecticides organophosphorés (Dimethoate,

Malathion, Selectron), aux concentrations de 10, 50, 100, 250 et 500 mg/l augmente la croissance

mycélienne d'Aspergillus flavus IMI 89717 pour la plupart des concentrations et n'inhibe la crois-

sance qu'à partir de 500mg/l. La croissance mycélienne d'Aspergillus parasiticus var. globosus

est par contre inhibée aux doses d'insecticides utilisées. L'activité respiratoire d'Aspergillus flavus

diminue aux doses élevées de Dimethoate et de Malathion, alors que l'action du Selectron est

moins nette. La production de CO, par Aspergillus parasiticus est stimulée dans tous les cas. En

présence de Malathion, les taux d'acides gras et d'aflatoxines des deux espèces étudiées dimi-

nuent, contrairement à ce qui a été observé en présence de Dimethoate ou de Selectron, où leurs

variations sont inverses. Sur le Sorgho, le traitement par les trois insecticides aux concentrations

de 5000 mg/kg inhibe la production d'aflatoxines Bj, Bz, G; et G pour les deux Aspergillus

étudiés.

KEY WORDS : aflatoxins, fatty acids, insecticides, respiration.

INTRODUCTION

In warm and tropical countries, stored grain insects such as Sitophilus increase

the moisture of the grains and can thus initiate hot spots. Many storage fungi including

Aspergillus spp. have been isolated from stored grain insects, thus proving that insects

act as vectors for the fungi (Wallace, 1973). Aflatoxins are a group of highly toxic

secondary metabolites produced by the fungi, Aspergillus flavus and A. parasiticus in

Source : MNHN, Paris

186 H.A.H. HASAN and S.A. OMAR

corn, cotton seed, peanuts and other commodities in the field and storage. Aside from

their much feared carcinogenic potential, aflatoxins cause serious economic loss to the

nation's agriculture every year.

Organophosphate insecticides are one of the most important groups of modern

pesticides that are usually used in agricultural practice, to resist the harmful insects

that attack crops, due to their high insecticidal activity, the broad spectrum and rapid

action on pests, and to their decomposition with formation of products non toxic to

human and animals (Gruzdyev et al., 1983).

In past reviews it was found that organophosphate insecticides strongly inhibit-

ed aflatoxin production by Aspergillus spp. (Rao & Harein, 1972, 1973; Hsieh, 1973;

Schroeder et al., 1974; Draughon & Ayres, 1978, 1979, 1981; Draughon et al., 1983).

On the other hand, Draughon (1983) found that some organophosphate insecticides

such as Dursban and Nellite, increased aflatoxin production by A. flavus in liquid me-

dium. Also, she warned that certain insecticides could stimulate growth and aflatoxin

production by Aspergillus spp. on crops. Also respiration and mycelial growth of fungi

was found to be affected by insecticides application (Anderson, 1978).

Our purpose was to determine the effects of three extensively used organo-

phosphate insecticides on growth, respiration and synthesis of fatty acids in liquid me-

dium by toxigenic moulds. Also, their effect on aflatoxins production in liquid medium

and on natural substrate (sorghum grains), was investigated.

MATERIALS AND METHODS

Microorganisms:

Aspergillus flavus IMI 89717 and A. parasiticus var. globosus IMI 120920

were used throughout this study. The two moulds were maintained on potato dextrose

agar (PDA) slants.

Medium:

To measure aflatoxin production, fatty acids synthesis, growth and CO, evolu-

tion, Czapek's Dox medium was used. Aflatoxin production was also carried out on

sorghum grains.

Insecticides:

Three organophosphate insecticides were used in this investigation, Dime-

thoate [0,0-dimethyl s-(2-(methylamino)-2-oxoethyl) phosphorodithioate], Kafr El-Za-

yat; Malathion [0,0- dimethyl -s -(1,2-dicarbethoxyethyl) phosphorodithioate], El-Naser

Chemicals Co. and Selecron [0-(4-bromo-2-chloro-phenyl) 0-ethyl S-n-propyl

phosphorothioate], Ciba Geigy.

Procedure:

The Dox medium was dispended in 250 ml Erlenmeyer conical flasks with

50ml in each, flasks were autoclaved at 121°C for 15 min. Insecticides were sterilized

through membrane filter and added to cooled autoclaved media to give concentration

of 10, 50, 100, 250 and 500 mg/L active ingredient. Flasks used as blanks received

sterilized water equivalent to volumes of insecticides used. After gentil shaken, control

and treated flasks were inoculated with lml of spore suspension of 7 days old agar

slant.

Source : MNHN, Paris

ORGANOPHOSPHATE INSECTICIDES AND AFLATOXINS 187

Lots of 50g of sorghum grains were sterilized by shaking in 5% NaOCI sol-

ution for 5 min and rinsing in three changes of sterile distilled water. Thereafter, the

samples were placed in sterile polyethylene bags and thoroughly mixed with different

doses of the insecticides. Each bag was inoculated by 1 ml of a heavy spore suspen-

sion. Sterile distilled water was added to raise the moisture content of the grains to

25%. The liquid and sorghum grains cultures were incubated at 28°C for 7 and 14

days, respectively, before measuring fungal activities.

Mycelial growth determination:

Mycelia of 7 days old cultures were harvested by filtration through Whatman

filter paper n° 1 under lower pressure vacuum then dried at 80°C till constant dry

weight.

Measuring of mycelial respiration:

The modified substrate-induced respiration technique (Cheng & Coleman,

1989) was used for measuring mycelial respiration. Two conical flasks for control and

treatments, containing 7 days old cultures, were flushed with continuous CO,-free air.

The CO, evolved from the cultures was carried by the air current to the final CO, trap

(50ml of 0.5 M NaOH). After 10 hours exposure, the final traps were removed and

mixed with excess of BaCl, solution to precipitate carbonate. The NaOH in the final

trap is then titrated with 0.25 M HCI using phenolphthalein as an indicator.

Aflatoxin analysis:

For this purpose cultures (filtrate + mycelium) and sorghum grains cultures of

7 and 14 days old, respectively, were extracted with 100 ml chloroform. The extract

was then evaporated till dryness on a rotary evaporator. Aflatoxin residue was dis-

solved in chloroform and separated by thin-layer chromatography on Silica Gel

60-coated plates, using chloroform-acetone (9:1) as the developing solvent. The spots

of aflatoxins B,, B,, G, and G; were removed from the plate, eluted with methanol

and estimated spectrophotometrically (Nabney & Nesbitt, 1965). Aflatoxins B, and B;

were estimated together as aflatoxin B, and G, and G, as aflatoxin G, using extinction

coefficients for aflatoxins B, and G,, respectively.

Fatty acids determination:

The total fatty acids were determined by the phosphovanillin method of

Zóllner & Kirsch (1962).

RESULTS AND DISCUSSION

Regarding to results presented in table 1, mycelial growth and mycelial respi-

ration of the two tested moulds showed different responses to insecticides application.

Mycelial biomass of A. flavus was significantly increased with most doses of

Dimethoate, Malathion and Selecron whereas the highest dose (500 mg/L) has inhibi-

tory effect. In case of A. parasiticus, the mycelial dry weight was significantly de-

creased, compared with the control, with all used doses of insecticides and the inhibi-

tion was more pronounced in case of Selecron than Dimethoate and Malathion. The

selective effect of organophosphate insecticides on growth of fungi was discussed be-

fore by some authors. Cowley & Lichtenstein (1970) reported that Phorate at 1 and 2

mg/L stimulated the growth of A. fumigatus. Also, Hasan (1988) found that Actellic

Source : MNHN, Paris

188 H.A.H. HASAN and S.A. OMAR

А. flavus A. parasitivus

organophosphate Conen

insecticides (mg a.i./L)? Dry wt co, Dry wt со,

evolution evolution

о 250 48.0 424 24.9

10 296 70.4 318 33.2

50 292 48.0 334 31.6

Dinethoate 100 278° 30.4" 254° $1.6"

250 зоо” 30.4° 2807 41.1°

500 150* 35.2" 224° 26.4"

10 314” 48.0 зов” 55.5"

50 326° 54.6 348" 99.3"

Malathion 100 312" 61.2" 286" Sr

250 280° 39.47 330° 94.5"

500 242 29.5" 328° 36.6"

10 344* 61.2" 266" 75.8"

50 278 48.0 265 166.0°

Selecron 100 268° 48.0 244° 161.3°

250 232 59.3" 216 55.5"

500 200 52.8 172° 50,2"

Table 1: Effect of organophosphate insecticides on mycelial growth (mp/50ml medium) and CO;

evolution (mg/g dry wt/24h) of A. flavus IMI 89717 and A. parasiticus var. globosus IMI

120920.

* Means significant difference compared to the control at 596 level.

proved to be promotive to the mycelial growth of Curvularia lunata at 10. mg/L. In-

creasing growth of fungi in cultures treated with insecticides was regarded as a result

of their ability to degrade insecticides (Anderson & Lichtenstein, 1972). On the other

hand, the adverse effect of insecticides on growth of fungi was documented. In this re-

spect, Cunninghamella echinulata was completely eliminated by 32.7 mg/L Curacron

(Abdel-Kader et al, 1981). Also, Abdel-Kader et al. (1984) studied the effect of in-

corporation of Phosphamidon into Czapek's liquid media on the growth of fungi. They

reported that the three used doses (1,4 and 8 mg/L) inhibited the growth of Penicillium

corylophilum. Other results came in agreement with our finding. They were obtained

by Abdel-Mallek (1984) and Shonquir (1989). El-Abyad et al. (1988) referred to the

inhibition of growth of two Fusarium wilt fungi due to decrease in sugar uptake.

Source : MNHN, Paris

189

ORGANOPHOSPHATE INSECTICIDES AND AFLATOXINS

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Source : MNHN, Paris

190 H.A.H. HASAN and S.A. OMAR

Mycelial respiration of A. parasiticus occurs in opposite manner to mycelial

dry weight but respiration of A. flavus was inhibited with the higher rates of Dimet-

hoate and Malathion whereas slightly influenced by Selecron. Disturbance of respira-

tion under stress conditions appear to be a general phenomenon. However, insecticides

seem likely stimulate respiration (Anderson, 1978). Increasing rate of respiration by

toxicants was recorded by McCallan et al. (1954). O; uptake by A. fumigatus, Cunnin-

ghamella echinulata and P. funiculosum was stimulated by the organophosphate insec-

ticide Dimethoate when applied at rate of 13.5 and 67.5 mg/L (Shonquir, 1989). In re-

cent investigation, Abdel-Basset et al. (1992) reported that respiration of three

mesophilic fungi was fluctuated by the insecticide Selecron but they found that the in-

crease in CO, evolution was more pronounced. The increase in respiration rate by tox-

icants may possibly be due to increase in membrane permeability to substrate as indi-

cated by Kurtz et al. (1982). Another explanation for increasing rate of respiration is

the stimulation of metabolic activity as well as uncoupling of oxidative phosphoryla-

tion (Anderson, 1978). On the other hand, inhibition of respiration by pesticides appli-

cation could be due to inhibition of oxidative phosphorylation and ATPase activity as

concluded by Tam & Trevors (1981).

The effect of selected organophosphate insecticides on total fatty acids con-

tents and aflatoxins production by the two toxigenic moulds in liquid medium was var-

iable (Table 2). Fatty acids synthesis by the two fungi was delayed with Malathion.

Kutzner & Buchenauer (1986) have shown that the Triazole fungicides treatment

caused an appreciable reduction in mycelial triglyceride contents of Fusarium monili-

forme. On the other hand, Dimethoate and Selecron caused an increase in fatty acids

content of A. flavus and A. parasiticus. These results agree with that reported by De-

troy & Hesseltine (1969). Also Weete & Wise (1987) found that treatment of A.

ochraceus with Triazoles caused accumulation of free fatty acids and increased linoleic

acid.

Production of aflatoxins B,, By, G, and G, in liquid medium was inhibited by

the three insecticides at 250 and 500 mg/L levels and the inhibition was more pro-

nounced with Selecron followed by Malathion and Dimethoate (Table 2). Toxins pro-

duction by A. flavus was promoted with 100 mg/L Dimethoate. The stimulatory effect

on toxins accumulation in case of A. parasiticus was confined to 50 and 100 mg/L

Malathion. Induction of aflatoxin synthesis has been observed perviously in cultures of

A. flavus treated by the organophosphate insecticides Dursban and Nellite (Draughon,

1983). On the other hand, the higher concentration (500 mg/L) of Dimethoate signif-

icantly inhibited aflatoxins B, and B; by 70% and G, and G, by 40% in A. flavus and

all aflatoxins by 40% in A. parasiticus. Also, production of aflatoxins B,, B;, G, and

G, in both aspergilli was significantly inhibited at 250 mg/L of Malathion. Increasing

the concentration of Malathion to 500 mg/L increased inhibition of aflatoxins pro-

duction. Also, all aflatoxins were inhibited by all Selecron concentrations, which re-

presents the most effective insecticide. The inhibition of aflatoxins synthesis by orga-

nophosphate insecticides was reported before by Draughon & Ayres (1978, 1979,

1981). They found that Naled, Diazinon, Dyfonate and Malathion significantly inhib-

ited aflatoxin production at 100 mg/L. Also, Malathion inhibited production of citrinin

and patulin by 96 and 42%, respectively.

The pattern for depletion of total fatty acids with Malathion was similar to that

for aflatoxins, but an inverse relationship was recorded with Dimethoate and Selecron

in both toxigenic aspergilli. Several authors recorded a relationship between lipid me-

tabolism and aflatoxins biosynthesis. Detroy & Hesseltine (1969) reported an inverse

relationship between fatty acids and aflatoxin formation. Shih & Marth (1974), on the

other hand, found that the pattern for formation and depletion of total lipids was simi-

Source : MNHN, Paris

ORGANOPHOSPHATE INSECTICIDES AND AFLATOXINS 191

organoph- conen A, flavus A. parasiticus

osphate — (mg a.i./kg)

insecticides afla- Inhib- Afla- Inhib- Afla- Inhib- Afla- Inhib-

toxin ition toxin ition toxin ition toxin ition

8,58, * сы, % вив, +

o 430 - 230 = 680 = 350 =

Dimethoate 1000 810° - 650° = 750° = 490° =

5000 220° 48.8 115° 50.0 205° 69.9 58° 83.4

Malathion 1000 420 2.3 320 =- 540 20.6 230° 34.3

5000 280° 34.9 95° 58.7 270° 60.3 110° 68.6

Selecron 1000 640° - 420° = 340° 50.0 170° 51.4

5000. 330° 23:3 155° 92.6 130° 30.9 -907 74.3

Table 3: Effect of organophosphate insecticides on aflatoxin production (ug/kg grains) by A. fla-

vus IMI 89717 and A. parasiticus var. globosus IMI 120920 on sorghum grains.

* Means significant difference compared to the control at 5% level. a.i. = active ingredient in-

secticide.

lar to that for aflatoxins, whereas acetate was the common precursor for both aflatox-

ins and lipid synthesis. Also, Rao & Harein (1973) explained the inhibition of aflatox-

in biosynthesis due to interference with the acetate-malonate pathway which seems

likely to be a common route in the biosynthesis of secondary metabolites of fungi.

Influence of insecticides on aflatoxin production by the the toxigenic aspergilli

was also carried out on sorghum grains at 1000 and 5000 mg active ingredient /kg (ta-

ble 3). The low dose of application induced promotive effect on the synthesis of afla-

toxin especially by A. flavus. Stimulation of aflatoxin formation was previously re-

согдед when some pesticides were used for prevention of these toxins (Draughon,

1983; Badii & Moss, 1988; Hasan, 1991). However, the high application rate (5000

mg/kg) inhibited aflatoxin B, and B; by 23.3-48.896 and G, and G; by 32.6-58.796 in

А. flavus. Also inhibited aflatoxin B, and B, by 60.3-80.9% and G, and G, by

68.6-83.4% in A. parasiticus. In this respect Draughon et al. (1983) found that Naled

(organophosphate) at 100 ppm inhibited aflatoxin production in culture medium, but

did not affectively reduce aflatoxin production when applied to com. However Rao &

Harein (1972, 1973) and Shroeder et al. (1974) reported that Dichlorvos (organophosp-

hate) at 20 ppm inhibited aflatoxin production in rice, corn, wheat and peanuts. Fur-

ther work is needed to determine the activity of moder pesticides against different

mycotoxin production in foods, feeds or other materials.

Source : MNHN, Paris

192 H.A.H. HASAN and S.A. OMAR

CONCLUSION

It is worth mentioning that the organophosphate insecticides promotive the

synthesis of aflatoxin by A. flavus or/and A. parasiticus at 100 mg/L in liquid medium

and 1000 mg/kg on sorghum grains. However, they restricted toxin production at 250

and 500 mg/L in liquid medium and 5000 mg/kg on sorghum grains. Selecron had

most pronounced effect than Dimethoate and Malathion. Our finding is helpful for pre-

vention purpose of seed stocks for contamination by aflatoxigenic moulds if the insec-

ticides are used in sufficient rates.

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CONTRIBUTION А ГА CONNAISSANCE DES

PHANEROCHAETOIDEAE DE FRANCE (BASIDIOMYCOTINA)

Jacques BOIDIN*, Paule LANQUETIN** et Gérard GILLES***

* 17 rue Duguesclin, 69006 Lyon.

** Laboratoire de Mycologie, Université Claude Bernard,

43 Bd du 11 novembre 1918, 69622 Villeurbanne Cédex.

*** 109 rue des Rosiers, 40400 Tartas.

RÉSUMÉ - Sont décrits Phanerochaete binucleospordida n. sp., proche de Ph. sordida, mais aux

spores binucléées et au basidiome devenant orangé en herbier, Ph. tamariciphila n. sp., proche de

Ph, jose-ferreirae, mais cystidié et connu seulement sur Tamarix spp., et Scopuloides leprosa

(Bourd. & Galz.) nov. comb. Caractères culturaux des 2 derniers.

ABSTRACT - Here we have described Phanerochaete binucleospordida n. sp., close to Ph. sordi-

da but with binucleated spores and with a basidioma becoming orange in herbarium, Ph. tamari-

ciphila n. sp., close to Ph. jose-ferreirae but cystidiated, and Scopuloides leprosa (Bourd. &

Galz.) nov. comb., a species with a holocoenocytic but bipolar behaviour,

Cette mise au point porte sur 3 espèces couramment récoltées en France, mais

qui ne peuvent être reconnues dans les travaux traitant du genre Phanerochaete Karst.

(Eriksson et al., 1978; Burdsall, 1985) et des genres voisins: Scopuloides (Massee) v.

Höhn. & Litsch. et Phlebiopsis Jülich, que Burdsall considère comme des sous-genres

de Phanerochaete.

Т - PHANEROCHAETE BINUCLEOSPORDIDA nov. sp.

Jacens, tenuis, adhaerens e cinerascenti alba, in sicco autem e aurantiaco

transiens, margine nulla vel paulo evoluta, pruinosa. Subiculum hyalinum ex hyphis

erectis, laxis, x 5-8-(11) um, pariete crasso, efibulatis. Hyphae superae resinoideis

depositis vestitae. Hymenium densum, in sicco aurantiacum, hyphis regularibus, maxi-

me ramosae, efibulatis. Cystidia 60-100 x 6,5-9 um, subcylindrica, obtusa, pariete

incrassato praeter summum, resinoideis depositis vestita. Basidia claviformia, 25-32 x

5-6,5 um. Sporae cylindricae minime depressae, 5,5-7,5 х 2,5-3,5 um, binucleatae,

leves, haud amyloideae. Holotypus LY 11985.

Le nom choisi est une contraction de binucleospora-sordida.

Etalé, membraneux subcéracé, assez mince, blanc sale (Munsell 2,5 Y 8/2),

grisâtre (5 Y 8/2, 8/3), crème alutacé (2,5 Y 8/3) à chamois clair (8/4); marge

atténuée, étroite, poudreuse. En herbier, membranule lisse saumon jaunátre (7,5 YR

8/6 ou salmon buff Ridgway, 8/8 ou 7/6 et méme fauve 7/10) à saumon (5 YR 6/6) ou

Source : MNHN, Paris

196 J. BOIDIN, P. LANQUETIN et G. GILLES

Planche I - 1: Phanerochaete binucleospordida, LY 11.985, holotype (Rouge Congo). 2:

Phanerochaete tamariciphila: a, LY 15329, holotype; b, spores de 11.035; c, de 14928;

d, hyphes basales de 10,699, (Phloxine/KOH); e, hyphes vésiculeuses en culture (LY

13816).

abricot (7/8), parfois un peu fendillée, avec bordure étroite, amincie, plus pale ou un

peu plus large et poudreuse.

Source : MNHN. Paris

PHANEROCHAETOIDEAE DE FRANCE 197

Coupe haute de 130-250-(300) jm montrant un contexte hyalin et un

hyménium jaune orangé. Contexte assez lâche, hyalin, fait d'hyphes dirigées en tous

sens, distinctes, x 5-8-(11) um, à boucles trés rares et paroi parfois mince, plus sou-

vent ferme à nettement épaissie (x 1-1,2 tm dans le Congo ammoniacal, mais pouvant

atteindre 2 et méme 3 Jim dans KOH); leurs articles sont plurinucléés. Sous-hyménium

dense, aux hyphes x 3-5 jm, à paroi ferme, souvent porteuses de dépóts résinoides

peu à peu dissous dans les milieux basiques; leurs articles sont binucléés. Cystides

nombreuses, 60-80-100-(130) x 6,5-9 um, un peu plus larges à mi-hauteur, à paroi

épaissie (1-1,2 um) sauf vers le sommet obtus; elles peuvent émerger de 50 рт et sont

couvertes de dépôts résinoïdes non cristallisés. Basides claviformes, 25-32 x 5-6,5 um

à 4 stérigmates, à base étroite, x 3-3,2 um, sans boucle. Spores cylindriques de face,

faiblement déprimées de profil, 5,5-7,5 x 2,5-3,5-(3,8) um, lisses non amyloïdes,

binucléées; le rapport longueur/épaisseur est de l'ordre de 2 à 2,2.

Récoltes: LY 11.985, sur Fagus silvatica, bois de Sansanet, altitude 1350m

(Pyrénées atlantiques), 20 juillet 1986, G.G.580, HOLOTYPE; 11.981, 11.983 et

11986, même support et lieu; 10928, sur Castanea, Carcen-Ponson (Landes), 16 février

1985, G.G.442; 10943, sur Platanus acerifolia, id., 22 février 1985, G.G.450; 10953,

sur Quercus pedunculata, Pontonx-sur-Adour (Landes) ler mars 1985, G.G.461;

10961, sur Salix atrocinerea, Lesgor (Landes), 3 mars 1985, G.G.467; 11880, sur

Quercus pedunculata, Carcen-Ponson (Landes) 4 mars 1986; 12.042, sur Salix

atrocinerea, Pontonx-sur-Adour (Landes), 6 septembre 1986; 12094, sur Salix, Oloron-

Ste-Marie (Pyrénées atlantiques), 5 oct. 1986, С.С. 645. A ces récoltes sur feuillus,

on peut sans doute ajouter quelques récoltes sur conifères, à la couleur saumonée

moins intense: LY 1577, sur Abies alba, Tarare (Rhône), 6 juin 1954; 10161, sur

conifère, Doucy (Savoie), 22 août 1983; 10.180, sur Picea abies, La Jairaz, St. Bon

(Savoie), 24 août 1983.

La marge brève et peu différenciée, non fibrilleuse et toujours sans cordonnet,

et les hyphes du subiculum subarticulées, à paroi épaisse, mènent dans les clés de di-

verses flores à Ph. sordida; mais nos récoltes diffèrent par leurs spores binucléées, et

la franche couleur saumonnée ou orangée prise par les basidiomes en herbier, couleur

vraisemblablement dûe à l'oxydation des dépôts résinoïdes du sous-hyménium et de

l'hyménium. Nous n'avons pas remarqué de basidiomes orangés en herbier parmi les

vrais Ph. sordida à spores uninucléées. Par contre, cette couleur orangée est signalée

par Bourdot & Galzin (1928), Eriksson et al. (1978) pour des récoltes de P. velutina,

et par ces derniers pour Ph. laevis. Ph. velutina a des cystides plus fortes, x 10-15 um,

lourdement incrustées, visibles sous la loupe, d'où l'aspect velouté des hyphes

inférieures à paroi peu épaisse, plus larges, jusqu'à 10 jm, souvent engaînées de cris-

taux; de plus la couleur du basidiome en herbier est plutôt alutacée (10 YR 84 à

Isabelle (7,5 YR 7/6) que franchement orangée. La belle couleur orangée peut, par

contre, se trouver chez Phanerochaete laevis, mais celui-ci a une marge développée,

fibrilleuse ou parfois rhizomorphique, des cystides plus grêles, un contexte développé

d'hyphes horizontales serrées, à paroi mince ou submince, des spores uninucléées.

Les spores binucléées ne sont pas exceptionnelles dans le genre Phanerochaete

sensu stricto, quand les spores sont relativement larges: cas de Ph. martelliana (=

macrospora), tuberculata, ou longues: Ph. tamariciphila (voir ci-après); c'est aussi le

cas de Ph. crassa (Lév.) Burds. (ancien Lopharia) et des Phlebiopsis gigantea et

roumeguerei aux spores cependant petites.

Source : MNHN, Paris

198 J. BOIDIN, P. LANQUETIN et G. GILLES

II - PHANEROCHAETE TAMARICIPHILA nov. sp.

= Peniophora cremea (Bres.) Sacc. & Syd. var. tamaricis Bourd. & Galz., Hymén.

France 304, 1928 (vu type in PC, sur Tamarix gallica, plage d'Hyères (Var), leg. A. de

Crozals n°65, 29-01-1926, herb. Bourdot 40.330)

Jacens, tenuis, levis, cinerascens deinde gilva vel argillacea; in sicco

adhaerens, gilva ad salmoneam, margine angusta, attenuata, pallidiore. Subiculum ex

hyphis laxis, pariete firmo, efibulatis. Subhymenium densum. — Leptocystidia

subcylindrica, 45-(75) x 4-(7) Qm, paulum emergentia, pariete tenui, parvis

resinoideisque depositis vestita. Basidia anguste claviformia, 22-28-(34) x 5,5-6,5 шт,

4-sterigmatibus. Sporae subcylindricae vel suballantoideae, 6,5-11,5 x 2,8-

interdum paulo latiores in dimidio superiore, pariete tenui, levi, haud amyloideo,

binucleatae. In Тататсе sp. in atlanticis et mediterraneis littoribus. Holotypus LY

15329.

Etalé, mince, adhérent, poruleux puis continu, membraneux fragile, blanc pur,

puis subcéracé tendre, grisátre (5 Y 8,5/2) ou plus jaunátre (8/3), beige (10 YR 7/3 et

méme 6/3) ou plus rosé (5 YR 7/3) ou, parfois, argillacé (2,5 Y 7/4). En herbier, étalé

adhérent, membraneux lisse sur bois écorcé, beige (10 YR 7,5/3), plus rosátre (7,5 YR

8,5/4 à 7/4), parfois isabelle (7,5 YR 7/5) ou méme saumon (5 YR 7/6 à 5 YR 6,5/8);

marge étroite, poruleuse, plus pâle; au centre l'hyménium est souvent craquelé ou

morcelé laissant voir le subiculum pâle.

Coupe haute de 150-200 jtm, mais elle atteint parfois 450 jtm d'épaisseur lors-

qu'elle montre 2 ou parfois 3 étages hyméniens successifs séparés chacun par une zone

lâche. Contexte lâche: sur quelques hyphes horizontales se dressent des hyphes dis-

tinctes, lachement emmélées, régulières, x 3-5-(7) um, ramifiées à angle droit ou très

ouvert, sans aucune boucle; la paroi est un peu ferme, environ 0,5 um, mais peut at-

teindre 0,8-(1) um sur les premières hyphes accolées au support. Sous-hyménium de-

venant très dense, fait d'hyphes à paroi mince, souvent ramifiées qui peuvent être

piquetées de petits dépôts résinoïdes. Hyménium haut de 70-80 jim, dense, parfois jau-

ne dans l'eau; il est fait de basides étroitement claviformes, 22-28-(34) x 5,5-6,5 рт à

4 stérigmates. Cystides espacées, peu différenciées, subcylindriques, 45-55-(75) x

4-6,5-(7) uum, à paroi mince, nues ou avec léger dépôt résinoïde jaunâtre vite dissous

dans KOH, ou parfois quelques petites plaques cristallines; elles émergent de 15-30

lum. Spores cylindriques de face, un peu déprimées de profil à suballantoides, à som-

met parfois un peu plus large, (6,5)-7-10-(11,5) x 2,8-4 jtm, lisses, non amyloides ni

cyanophiles, binucléées. ( x = 7,10 а 8,75 х 3,17 à 3,56 um).

Récoltes: toutes sur Tamarix spp. en bord de mer, sur branches basses mortes

en place ou sur branches au sol, plus étendu sur bois écorcé; LY 15329 HOLOTYPE,

et 15330, Anglet (Pyrénées atlantiques), 28 octobre 1992; 6982 et 6985, St.

Brévin-l'Océan (Loire atlantique), 4 août 1972; 6988, id., 7 août 1972; 7005 et 7009,

id., 22 aoüt 1972; 10698, 10699, et 10701, entre Fréjus et St. Aygulf (Var), 15 novem-

bre 1984; 10721 et 10724, id., 17 novembre 1984; 11.035, plage de Lagénèse, Carnac

(Morbihan), 30 juillet 1985; 11.773, Bouin (Vendée), 9 octobre 1985; 13.813, Loctudy

(Finistère), 16 aoüt 1989; 13.816 et 13.817, Larvor plage (Finistère), 19 août 1989;

13.820, 13.821 et 13.821bis, id., 22 août 1989; 14928, Plage d'Agosta (Corse du Sud),

26 octobre 1991; 14.946, 14949 et 14970, id., 28 octobre 1991; 15.002 et 15005, Pla-

ge de Marina Viva, Porticcio (Corse du Sud), 2 novembre 1991; 15348 et 15349, La

Barre, Anglet (Pyrénées atlantiques), ler novembre 1992.

H.H. Burdsall (1985) dans sa monographie internationale du genre

Phanerochaete, synonymise le Peniophore cremea var. tamaricis Bourd. & Galz. 1928

Source : MNHN, Paris

PHANEROCHAETOIDEAE DE FRANCE 199

avec le Ph. jose-ferreirae (Reid) Reid décrit du Portugal sur support non précisé. Placé

d'abord dans le genre Corticium (Reid, 1965) il est dit par tous ceux qui l'ont décrit

ultérieurement "sans cystides": voir par ex. Eriksson, Hjortstam & Ryvarden 1981, p.

1077 et fig. 550, Burdsall 1985, p. 88 et fig. 26 qui le place pour cela dans le sous-

genre Phanericium Parm., Blanco & al. (1989), ou encore Parmasto (1967) pour

Phanerochaete pallida considéré comme synonyme. Bourdot et Galzin, par contre,

écrivent: "cystides très rares, 45x6 um, ordinairement peu différenciées". C'est ce que

nous avons observé aisément sur toutes nos récoltes faites sur tamaris. Notre champi-

gnon des tamaris diffère donc de Ph. jose-ferreirae essentiellement par ses petites

cystides, car structure, couleurs, forme et taille des spores correspondent bien; on ai-

merait savoir si les spores de Ph. jose-ferreirae sont, elles aussi, binucléées. Nous ne

savons pas, par contre, s'ils diffèrent par leur écologie, car le support du type portugais

n'est pas indiqué; les autres récoltes connues ont été faites sur Olea europea, Juglans

manshurica, Quercus ilex, Alnus, Betula, Salix, Arbutus unedo,... Celles de Ph.

tamariciphila ont toutes été faites sur des tamaris en bordure de mer que ce soit en

Corse, dans le Var, les Pyrénées atlantiques, la Vendée, le Morbihan ou le Finistère. Si

les cystides sont évidentes lors des études du matériel frais, elles sont moins aisément

détectées sur spécimens d'herbier; nous les avons cependant très bien vues sur le

Peniophora cremea var. tamaricis de l'herbier Bourdot (in PC), mais nous n'avons pu

en voir sur le type, plus récent, du Corticium jose-ferreirae (in K).

C'est pour ne pas limiter au petit et unique spécimen de l'herbier Bourdot, ri-

che en spores étrangères, le type de ce que nous considérons comme une espèce, que

nous proposons le nouveau nom de tamariciphila; cette espéce sera ainsi représentée

par un holotype et les nombreux paratypes signalés plus haut. La parenté du Ph. jose-

ferreirae acystidié est plus étroite avec Ph. tamariciphila qu'avec les autres Ph.

subgen. Phanericium, ce qui nous fait douter du bien fondé de ce sous-genre.

Une autre espèce aux spores suballantoïdes d'assez grande taille est Ph.

cacaina (Bourd. & Galz.) Burds. & Gilberts. récoltée uniquement sur conifères en

France et en Arizona; cette espèce possède des cystides plus fortes et des hyphes

inférieures à paroi épaissie; selon Bourdot & Galzin ses spores peuvent atteindre 14 x

5 jm, et le basidiome est brun chocolat.

Si la plupart des Phanerochaete montrent sur leurs hyphes les plus larges quel-

ques boucles parfois opposées ou méme verticillées, la littérature ne signale aucune

boucle chez Ph. jose-ferreirae, ni chez Ph. cacaina; Ph. tamariciphila n'en montre pas

non plus, ce qui est confirmé par l'étude des cultures (voir ci-après). Toutefois, selon

Nakasone (1990), les cultures du Ph. jose-ferreirae américain montrent de "rare single

clamps".

Caractéres culturaux de Phanerohaete tamariciphila:

Monospermes: hyphes sans boucles aux articles à (2)-3 à 8 noyaux comme le

polysperme; l'espèce est donc présumé homothalle".

Polyspermes (LY 13816, 14928, 15002):

Croissance: moyenne, boîtes couvertes entre 3 et 4 semaines.

Aspect: marge régulière; à 6 semaines le mycélium aérien est pratiquement

nul, la surface est mate, la culture un peu opaque et hyaline; toutefois certaines cultu-

res montrent une bande blanche plus dense ou une zone âgée testacé pâle (5 YR 6/6)

et une bouture rouge brique (2,5 YR 5/6) (cas de 14928 et 15002). A 4 mois, ces

cultures sont acajou (10 R 4/6, 4/8) en totalité, ou seulement sur la moitié âgée.

Source : MNHN, Paris

200 J. BOIDIN, P. LANQUETIN et G. GILLES

Microscopie:

Mycélium superficiel: hyphes irrégulières, x (1,5)-2-4,5-(6) um sans boucles, à

paroi mince ou localement irrégulièrement épaissie; elles présentent de nombreux

élargissements, x 6-8 lim, des vésicules chlamydosporoïdes x 10-15 jim à paroi mince,

mais parfois épaisse де 0,5-1,5 рт; еПеѕ sont particulièrement nombreuses chez 13816

où elles atteignent 20 pm.

Mycélium submergé: identique mais sans grosses vésicules.

Cytologie: hyphes sans boucles, aux articles plurinucléés à (2)-4 à 8 noyaux;

des séries d'articles à (2)-4-5 ou 6 noyaux.

Oxydases: ac. gallique: -, 0

p-crésol: -

CODE (selon Nobles (1965) complété par Nakasone (1990)):

1-6-26-(32)-(34)-36-40-44-54-(57)-66 faible.

Si la plupart des Phanerochaete cultivés ont montré des boucles parfois

opposées ou verticillées sur leurs hyphes les plus larges, et des articles terminaux ri-

ches en noyaux, nous ne connaissons pas, malheureusement, le comportement

nucléaire des quelques espèces totalement sans boucles en culture signalées par K.K.

Nakasone (1990): Ph. allantospora, chrysosporium et magnoliae, et ne pouvons savoir

si le très petit nombre de noyaux des articles mycéliens de notre Ph. tamariciphila

représente un caractère original et atypique dans ce genre.

III - SCOPULOIDES LEPROSA (Bourd. & Galz.) nov. comb.

Peniophora leprosa Bourd. & Galz., Hymén. France, 312, 1928. (vu type in PC).

Phanerochaete leprosa (Bourd. & Galz.) Jülich, Persoonia 10: 334, 1979.

Peniophora radicata (P. Henn.) v. Hóhn. & Litsch. subsp. leprosa Bourd. & Galz.

Bull. Soc. Mycol. France, 27: 394, 1912. (1913)

Etalé, membranuleux subcéracé tendre, facilement détachable sous l'aiguille,

jaunátre, alutacé (10 YR 8/3 à 8/6), chamois (7/6), plus grisâtre si imbu (7/2) et même

parfois bistre pâle (7,5 YR 5/2), à surface souvent irrégulière, granuleuse sous la loupe

et nettement sétuleuse; marge brusque et concolore, ou amincie et plus pâle, parfois

fibrilleuse ou même avec jeunes cordonnets ramifiés. En lumière réfléchie au grossis-

sement x 100, on aperçoit de nombreuses cystides ruguleuses, parfois fasciculées, et

d'autres, espacées, souvent situées au sommet des légers reliefs, porteuses d'un globule

brillant.

En herbier, adhérent, à surface souvent bosselée, parfois un peu subodontioïde,

alutacé pâle (10 YR 8/3, 8/4) à beige chamois rosé (9 YR 7/4) souvent fendillée, par-

fois profondément crevassée; il est alors fragile sous le rasoir, facilement pulvérulent;

marge hérissée ou hirsute sous la loupe; elle peut montrer de longs cordons blancs ou

alutacé pâle, épais de 250-500 um; assez souvent absents de la marge, ces cordonnets

sont visibles dans le bois ou à proximité du basidiome.

Coupe haute de 100-300 um mais pouvant atteindre 1mm. A la marge on ne

voit que des hyphes incrustées, x 4-6 um, à aspect cystidiforme, souvent fourchues,

sans contexte; les hyphes génératrices, à cloisons simples, x 3-5-(9) um, à paroi mince

ne sont visibles que dans le bois. Au centre on distingue parfois un très faible contexte

horizontal, 20 um p. ex., fait d'hyphes comprimées ou collapsées; souvent, tout appa-

тай vertical dès la base; c'est un hyménium crassescent fait d'hyphes étroites, x 2-3

Hm, sans boucles, serrées et peu distinctes; s'y mêlent d'innombrables lamprocystides

Source : MNHN, Paris

PHANEROCHAETOIDEAE DE FRANCE 201

Planche II - Scopuloides leprosa (Bourd. & Galz.) Boid. , Lang. & Gilles: Quelques cystides

obtuses à partie émergente sans cristaux: a-LY 14.599, b, 11.907. Fragment d'hyménium

avec cystide fusiforme banale (c) et deux cystides débarrassées de leurs cristaux

(14.599). Une hyphe cystidiforme fourchue près de la marge (e, 11907). Et f, spores de

13.685

Source : MNHN, Paris

202 J. BOIDIN, P. LANQUETIN et G. GILLES

fusiformes à paroi épaisse, trés incrustées, 50-100 x (5)-8-14 tm vers la base, puis

progressivement rétrécies, subaigués; beaucoup sont totalement immerses, d'autres

émergent peu, d'autres enfin émergent de 30 et même 60 jim; les plus différenciées

sont nettement renflées vers la base et à paroi épaisse de 2 à 3 рт, пе laissant ensuite

qu'un canalicule étroit dans la partie conique qui est lourdement incrustée; elles sont

parfois groupées en faisceaux. Les cystides d'un deuxième type, plus dispersées que

les précédentes, sont cylindriques obtuses, longues de (30)-75-130 jim, et peuvent

émerger jusqu'à 90 jim, ce qui les rend très visibles; la partie émergente est parfois

élargie, spatulée, x 7-9-11 tm au sommet, nue ou finement engainée d'un mince dépôt;

la partie immerse, large де 8-11-(15) рт а une paroi un peu épaissie et avec une gaine

de cristaux; leur contenu est homogène ou s'est rétracté laissant 1 à 5 cloisons de re-

trait. Basides étroitement claviformes, 25-32-(45) x 5-6-(7) iim, sans boucles, avec 4.

stérigmates longs de 5-7 jtm, au contenu riche en gouttes réfringentes. Spores petites,

ellipsoides à subovoides, 3,75-5-(6) x 2-3 um, uni- ou biguttulées, uninucléées, à paroi

lisse, non amyloide. x = 4,25 + 0,23 x 2,67 + 0,16 um pour LY 13182; 4,34 + 0,27 x

2,79 + 0,21 pour 13685.

Les cordonnets sont constitués d'hyphes parallèles, x 3,5-10 um, à paroi le

plus souvent mince mais parfois épaisse de 1-1,5 um, aux articles longs avec boucles

éparses, parfois opposées sur les hyphes de 9-10 um; l'extérieur des cordons est cou-

vert d'hyphes longuement incrustées, x 3,5-6 um, branchues, cystidiformes à extrémité

rétrécie. Récoltes: nombreuses, toujours au sol, sur bois plus ou moins enfoui. Nous

la connaissons de l'Ain, du Rhône, de Savoie, Haute-Savoie, des Yvelines (legit M.

Duverger, et R. Hentic), du Var, de la Haute-Garonne, des Landes et des Pyrénées at-

lantiques. Les supports sont variés: Robinia, Ulmus, Populus, Alnus, Salix cinerea et

babylonica, Buxus, Clematis, Prunus laurocerasus, mais aussi sur bambous

(Phyllostachis sp., leg. F. Candoussau); rencontré une fois sur Pinus en Savoie. Nous

l'avons recue récemment de Suisse italienne, sur PAyllostachis (leg. E. Zenone).

Le type récolté sur Fagus silvatica sur le Larzac (Aveyron), par A. Galzin (n°

3527) le 9 mai 1908, numéro 5637 de l'herbier Bourdot est semblable à nos récoltes. Il

peut paraître étonnant que les cystides cylindriques, obtuses ou même spatulées, très

émergentes n'aient pas été signalées jusqu'ici. Bourdot & Galzin (1928) parlent toute-

fois de cystides "émergentes des deux tiers" sans préciser leur forme. Ces cystides

sont plus difficiles à déceler sur matériel d'herbier que sur le frais, car la partie

émergente, à paroi mince, s'affaisse ou se collapse aisément. Après étude attentive, en

milieu basique, on peut apercevoir quelques cystides cylindriques typiques sur le type

vieux de près de 85 ans.

Caractères culturaux de Scopuloides leprosa:

Monospermes: les 2 monospermes 508 (Boidin 1958, p. 136) et les 14

monospermes de LY 15399, étudiés sur lame gélosée sont dépourvus de boucles

vraies; on peut parfois observer de rares tentatives, ou même des formations évoquant

une boucle. Les articles renferment 5 à 18 noyaux sauf le terminal qui en contient de

20 à 50. Les croisements 508 x 15399 donnent naissance à un mycélium à boucles

nombreuses, mais inconstantes, ce qui révèle l'hétérothallie de cette espèce

holocénocytique (voir ci-après).

Recherche de la polarité: les 14 haplontes LY 15399 ont été appariés 2 à 2. A

quinze jours, les boîtes ont deux aspects différents: soit une bande apparement vide de

mycélium à la ligne de contact (notées V), soit elles montrent un faisceau de

mycélium aérien lâche aux deux extrémités de la ligne de contact (notées F); seules 4

confrontations ne peuvent être classées dans l'une ou l'autre de ces catégories. Après

un mois, toutes les boîtes notées F montrent un mycélium riche en boucles, alors qu'il

Source : MNHN, Paris

PHANEROCHAETOIDEAE DE FRANCE 203

n'y en a aucune dans les boîtes notées V. Dans les confrontations positives, toutefois,

les boucles peuvent être localement rares, mais l'on peut voir cependant des hyphes x

3-4 jm montrant plusieurs cloisons successives bouclées. Dans les confrontations

négatives, on peut, comme avec les cultures monospermes observer quelques tentatives

de boucles, ou méme des formations rappelant de vraies boucles. Aprés étude atten-

tives, on ne peut hésiter à distinguer les résultats positifs et négatifs, et l'ensemble des

observations mène à un tableau de bipolarité, sans déficiences ni anomalies:

Al: 1-2-3-8-9

A2: 4-5-6-7-10-11-12-13-14

Un certain nombre de germinations prélevées ne s'étant pas développées cette

bipolarité serait, sans doute, à confirmer avec un plus grand nombre de monospermes.

A notre connaissance, cette hétérothallie démontrée par l'apparition des boucles (et non

seulement par l'aspect macroscopique des confrontations) est exceptionnelle chez les

espèces holocénocytiques, et confirme l'autonomie de Sc. leprosa par rapport aux au-

tres Phanerochaetoideae.

Polyspermes (LY 508-13685-15238-15399):

Croissance: moyenne à rapide.

Aspect: marge régulière. À six semaines, mycélium appliqué, bas dans la par-

tie moyenne de la culture qui a l'aspect d'un verre blanc opaque. Dans la partie jeune,

maigre mycélium aérien élevé, blanchâtre à légèrement et localement saumon jaunâtre

(7,5 YR 8/6). A la périphérie, le mycélium aérien grimpe contre le verre où parfois il

tend à former des cordonnets.

Revers: totalement blanchi. Odeur: nulle ou très faible.

Microscopie:

Mycélium aérien: hyphes x 2-7-(8) um, régulières, à paroi mince et boucles

inconstantes, toujours simples, présentes sur les hyphes étroites comme sur les hyphes

larges; les boucles sont nombreuses quand le mycélium aérien est bien développé,

mais assez rares dans les zônes où il est pauvre, et alors plus faciles à observer sur des

hyphes de 3-4 um. Deux types d'éléments cystidiformes sont observés: des éléments

au sommet large de 6-10-(13) рт, de longueur variable, (25)-60-130-(200), et ne me-

surant que 2-3-(4) um de largeur à leur naissance; le sommet peut porter un dépôt

réfringent résinoïde; les autres éléments cystidiformes ont un sommet effilé, mesurent

85-160 x 2,5-5-(7) lim avec les cristaux qui les recouvrent; ils sont simples ou, plus

souvent, fourchus une fois, ou plus rarement 2 ou 3 fois; leur paroi est mince à net-

tement épaissie. Le mycélium aérien des cordonnets vus contre le verre est formé

d'hyphes parallèles, serrées, riches en boucles.

Mycélium submergé: hyphes moins régulières, x 2-6,5-(7) um, à boucles plus

rares, à paroi mince ou parfois épaisse jusqu'à 1 prm sur les plus larges.

Cytologie: hyphes à boucles inconstantes mais nombreuses; les articles

contiennent 4-10-(14) noyaux sauf les terminaux qui en montrent 18 à 54.

Oxydases: ac. gallique: ++++(+), 0 gaiacol: +++++, 0

p.-crésol: - tyrosine: -, 20 mm.

CODE: 2a-3i-13-21-32-36-40-43 ou 44-54-59-66

Scopuloides leprosa est bien caractérisé, en culture, par ses 2 types de cystides

et par son hétérothallie bipolaire.

Source : MNHN, Paris

204 J. BOIDIN, P. LANQUETIN et G. GILLES

Planche III - Scopuloides leprosa: culture polysperme de LY 15399: 1- jeunes éléments capités

et hyphes cystidiformes observés sur lame gélosée; m- éléments capités qui peuvent por-

ter des dépôts observés à la marge; N- élément cystidié et élément capité sur milieu de

Nobles à 6 semaines.

Origine des récoltes citées: LY 508, sous une souche de feuillu,

Couzon-au-Mont-d'Or (Rhóne), 30 avril 1950; 13182, sur feuillu, Signes (Var), 18 no-

vembre 1987; 13685, sur Robinia, St. Bernard (Ain), 20 mars 1989; 15238, id., 25

septembre 1992; 15399, id., 9 janvier 1993.

Dans sa monographie de 1985, H.H. Burdsall synonymise cette espèce à

Phanerochaete velutina (DC: Fr.) Karst., mais ajoute: "the variability encountered in P.

velutina suggests that more than one taxon is present among the specimens examined".

Il s'agit d'une espèce particulière par ses deux types de cystides, caractère relevé par

Burdsall chez le Ph. luteo-aurantiaca (Wakef.) Burds. de Nouvelle Zélande, mais ce

dernier n'a pas les cystides obtuses et nues de grande taille de notre espèce. On trouve,

par contre, des cystides de deux types, les unes fusiformes, les autres cylindriques au

Source : MNHN, Paris

PHANEROCHAETOIDEAE DE FRANCE 205

sommet des aiguillons chez Scopuloides hydnoides (Cooke & Mass.) Hjortst. & Ryv.

(que Burdsall synonymise à P. rimosa (Cooke) Burds., ce que refusent Eriksson et al.

(1984)). Le subiculum nul ou très peu développé de notre espèce nous la fait mettre

auprès de cette dernière dans le genre Scopuloides, où nous placerons aussi Ph.

ravenelii.

Clé des Scopuloides d'Europe:

1- Un seul type de cystides; basidiome lisse, souvent épais; spores cylindriques par-

fois un peu déprimées, binucléées, 4-5 x 2,5-3 lim (= Pen. roumeguerei (Bres.)) ...

icopuloides ravenelii (Cooke) nov. comb.*

1- DUE types de cystides; spores uninucléées. “2

2- Spores allantoides, 3,5-4-(5) х 1,8-2,2 jim; basidiome odontioide ....

Scopuloides hydnoides (Cooke & Mass.) Hjortst. & Куу.

2- с ellipsoides, 4-5-(6) x 2-3 pm; basidiome sublisse à faible tendance

subodontioide; souvent des cordonnets; à la marge hyphes incrustées ramifiées

Scopuloides leprosa (Bourd. & Galz.)

REMERCIEMENTS

Nos remerciements s'adressent à Madame F. Candoussau, à MM. B. Duhem, M

Duverger et R. Hentic pour l'envoi de récoltes intéressantes, ainsi qu'à J.-CI. Léger pour les

diagnoses latines. Nous remercions aussi le laboratoire de Cryptogamie du Muséum National

d'Histoire Naturelle de Paris et l'herbier de Kew pour le prêt de spécimens types

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Source : MNHN, Paris

Cryptogamie, Mycol. 1993, 14 (3): 207-213 207

UTILIZATION OF HYDROCARBONS BY FUNGI

S.K. HEMIDA, M.M.K. BAGY and A.M. KHALLIL

Botany Department, Faculty of Science, Assiut University, Assiut,

Egypt.

ABSTRACT ~ Utilization of benzene, kerosene and solar by fungi has been studied during 60

days period when incorporated in soil. The results of hydrocarbon-treated soils at two doses (5%

and 40%) on glucose-agar (1%) with or without 1% hydrocarbon were nearly similar, Thirty spe-

cies of fungi and one variety belonging to 14 genera were isolated from hydrocarbon free soil (11

genera, 24 species and 1 variety), benzene-(5 genera, 12 species and 1 variety), kerosene-(7 gen-

era and 17 species) and solar-treated soils (8 genera, 19 species and 1 variety) on glucose-agar.

Amorphotheca resinae, Aspergillus flavus, A, fumigatus, A. niger, A. terreus, Emericella nidulans,

Fusarium solani, Penicillium funiculosum, Rhizopus stolonifer and Trichoderma harzianum were

the most prevalent species of one or more hydrocarbons. The results obtained showed there are

no hydrocarbon utilizing fungi characteristic of benzene, kerosene and solar.

RÉSUMÉ - L'utilisation par des champignons, de benzène, de kérosène ou de solar, incorporés

dans le sol, a été étudiée sur une période de 60 jours. Les résultats obtenus sont sensiblement les

mêmes, quand les sols sont traités par 5% ou 40% d'hydrocarbures et les isolements réalisés sur

glucose-Agar (1%), complété ou non par 1% d'hydrocarbure, Au total, 30 espèces et 1 variété,

appartenant à 14 genres ont été isolées du sol sans hydrocarbure (11 genres, 24 espèces, 1

variété), du sol traité par le benzène (5 genres, 12 espèces, 1 variété), du sol traité par le kérosène

(7 genres, 17 espèces) et du sol traité par le solar (8 genres, 19 espèces, 1 variété). Amorphotheca

resinae, Aspergillus flavus, A. fumigatus, A. niger, A. terreus, Emericella nidulans, Fusarium

solani, Penicillium funiculosum, Rhizopus stolonifer et Trichoderma harzianum sont les espèces

les plus couramment isolées sur un où plusieurs des hydrocarbures étudiés. Aucune des espèces

isolées n'est spécifique du benzène, du kérosène ou du solar.

INTRODUCTION

Microorganisms play an important role in natural removal of petroleum hydro-

carbons from contaminated ecosystems. Fungi capable of metabolizing hydrocarbons

are limited, with most reported to occur whithin the orders, Mucorales (Zygomycetes)

and Moniliales (Hyphomycetes) (Nyns et al., 1968; Walker et al, 1976). Thus the

ability of fungi and yeasts to utilize pure aliphatic hydrocarbon (n-alkanes) as sole car-

bon and energy sources is a well-documented phenomenon reviewed by Klug & Mar-

kovetz (1971). The fate of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) has received at-

tention recently since benzo (a) pyrene and similar compounds were shown to be

toxic, carcinogenic and/or mutagenic. Fungi have been shown to oxidize PAH in a

manner similar to that found in mammals (Cerniglia, 1981).

In Egypt, Hemida (1991) isolated several fungal species from oil-polluted soils

collected from different gas stops. Recently, Bagy et al. (1992) reported on naphthal-

ene-anthracene utilizing microorganisms (bacteria and fungi). The present investigation

Source : MNHN, Paris

208 S.K. HEMIDA, M.M.K. BAGY and A.M. KHALLIL

was undertaken to study utilization of 3 hydrocarbons (benzene, kerosene and solar)

by füngi.

MATERIALS AND METHODS

Hydrocarbon-treated soil

Clay soil collected from the University farm was used in this study. 500 g ali-

quot of air-dry sieved soil was placed in a polyethylene bag and thoroughly mixed

with commercial benzene or kerosene or solar. The water content of the soil was ad-

justed to 28% W.H.C.. Each hydrocarbon was added to soil in two doses (5% and

40%). The treatments were set up in duplicates in addition to the control (untreated

soil). They were then incubated at 28°C (+ 2°C) for 60 days. After 7, 30 and 60 days,

soil samples were taken and assayed for their fungal counts.

Determination of hydrocarbon utilizing fungi

Each hydrocarbon-treated soil was analysed for its fungal population using the

dilution plate method (Johnson & Curl, 1972) on glucose-Czapek's agar (10 g/L) with

or without 1% of hydrocarbon. Rose bengal (66 ppm) was employed as a bacteriostat-

ic agent. Incorporation of rose bengal in the soil dilution plate has also the advantage

of restricting the size of spreading colonies of fungi and therefore, large numbers of

fungal colonies appear on the plate. Five plates were used for each treatment and the

control and they were incubated at 28°C (+ 2°C), for 7-1Sdays, during which the de-

veloping fungi were examined, identified and counted.

The following references were used for the identification of fungal genera and

species; Raper & Thom (1949), Raper & Fennell (1965), Rifai (1969), Booth (1977)

and Bomsch et al. (1980).

RESULTS AND DISCUSSION

Fungi recovered from hydrocarbon free soil

Twenty-four fungal species and one variety belonging to 11 genera were re-

covered from untreated soil (hydrocarbon free) on glucose-Czapek's agar (Tab. 1). The

total count of fungi after 7 days was higher than the initial count and then the count

decreased after incubation for 30 and 60 days. This means that, some fungi could in-

crease their numbers in soil deprived from any additive organic substrate. It is possible

that these fungi could utilize remains of available food-materials or could benefit from

the secondary activities in soil. Amorphotheca resinae, Aspergillus carneus, Mucor cir-

cinelloides, Myrothecium verrucaria, Penicillium steckii and Scopulariopsis candida

were completely absent in the control samples. However, these fungal species were

isolated from hydrocarbon-treated soils.

Fungi recovered from benzene-treated soil

The mycological analysis of benzene-treated soil revealed the isolation of 12

fungal species and one variety belonging to 5 genera on glucose-agar (Tab. 1). These

numbers are considerably lower than those obtained from untreated soil (24 species

and 1 variety, 11 genera). Moreover, the total count of fungi was consistently lowered

than the control one at both doses used after all the experimental periods. The re-

duction in the fungal count could be attributed to the toxic effect of benzene on soil

Source : MNHN, Paris

209

UTILIZATION OF HYDROCARBONS BY FUNGI

2080 18 тойо з,уойег0-ә5оопЗ uo лоз 10 ouaso1oy 1 ouozuoq qr parean mos ur sarzods resun jo (rios Sur aod poreqnope») siunoo pmo],

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Source : MNHN. Paris

210 S.K. HEMIDA, M.M.K. BAGY and A.M. KHALLIL

fungi. The above results were obtained on both glucose- and benzene- Czapek's agar

(Tables 1, 2).

Six species and one variety of Aspergillus were isolated, these were A. flavus

(at 40% after 7 days only), A. flavus var. columnaris (at 5% and 40% after 60 and 7

days, respectively), A. fumigatus (at 5% after 30 days and at 40% after 30 and 60

days), A. japonicus (at 5% after 60 days only), A. niger (at 5% after 7, 30 days and at

40% after 7 days), A. terreus (at 5% and 40% after 7, 60 days and 7 days, respective-

ly) and A. ustus (at 5% after 60 days only). Penicillium funiculosum, P. islandicum and

P. oxalicum were recovered at low and high doses after 7 days only. Emericella nidu-

lans, Scopulariopsis candida and Trichoderma harzianum were isolated at 40% after 7

days. Fedorak & Westlake (1986) reported that isolates of Paecilomyces, Verticillium,

Beauveria and Penicillium species were tested for ability to metabolize a variety of n-

alkylbenzenes. Growth on dodecylbenzene yielded benzoic and phenylacetic acids as

transient intermediates, and these acids supported growth of the isolates. Ratledge

(1984) mentioned that microorganisms, i.e. bacteria, yeasts and moulds, can grow on a

wide variety of hydrocarbons as sole sources of carbon and energy. They can partially

oxidize an even greater range of such compounds. Also, he reported that, the list of

compounds attacked is extensive and includes straight and branched chain alkanes,

alkene, alicyclic, heterocyclic and aromatic hydrocarbons.

Fungi recovered from kerosene-treated soil

A total of 7 genera and 17 species were isolated from kerosene-treated soil on

glucose-agar (Tab. 1). These numbers were higher than those obtained from benzene-

treated soil. Also, the total count of fungi were regularly declined at both doses and

with the lengthening of the experimental period, and the lowest count was estimated at

40% after 60 days.

Amorphotheca (= Cladosporium) resinae was isolated mostly from kerosene-

treated soil at 40% after 30 and 60 days on both media (Tables 1, 2). In addition, it

was isolated at 5% after 30 days on glucose-agar supplemented with 1% kerosene.

The highest counts (10 and 12 colonies) of A. resinae were estimated at 40% after 30

days on glucose- and 1% kerosene-glucose-agar, respectively. Cabral (1980) reported

that it was possible to verify the presence of Cladosporium resinae f. avellaneum as

the principal contaminant in Jet fuel (Kerosene) from storage tanks, hose tips and air-

craft integral fuel tanks. May & Neihof (1981) stated that, one of the most prevalent

and troublesome contaminants found associated with fuels in contact with either fresh-

water or seawater is C. resinae. Smucker & Cooney (1981) studied the growth of C.

resinae on glucose and then transfered to medium with glucose or with kerosene as

the sole carbon source. Carson & Cooney (1988) observed that cells of C. resinae

form greater numbers of microbodies when grown on n-alkanes than when grown on

glucose. In this study, Aspergillus flavus, A. niger, A. terreus, Emericella nidulans, Mu-

cor hiemalis, M. racemosus, Penicillium chrysogenum, Rhizopus stolonifer and Tricho-

derma harzianum were decreased at both doses of kerosene but with variable degrees.

However, A. alutaceus, A. carneus, A. fumigatus, F. solani and P. funiculosum were

promoted at some treatments (Tab. 1). Bemmann & Voigt (1980) isolated thermophilic

n-alkane assimilating hyphae fungi and strains of Aspergillus fumigatus and Mucor lu-

sitanicus selected from physiological investigation. Hussein & Abdel-Gawad (1983)

studied the protease and amylase activities of the marine fungus A. flavus grown on

glucose, methanol, kerosene or sodium formate as the sole carbon source. Bemmann et

al. (1978) studied the cultivation of A. niger in n-alkanes.

Source : MNHN, Paris

211

UTILIZATION OF HYDROCARBONS BY FUNGI

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Source : MNHN, Paris

212 S.K. HEMIDA, M.M.K. BAGY and A.M. KHALLIL

Fungi recovered from solar-treated soil

The number of genera and species obtained from solar-treated soil (8 genera,

19 species and 1 variety) was markedly higher than that obtained from benzene or ker-

osene-treated soils on glucose-agar. (Tab. 1). The total fungal count was regularly de-

pressed than the control one at both doses after all the experimental periods. This is

probably due to the toxic effect of solar. Aspergillus (6 species and 1 variety), Emeri-

cella (1 species), Fusarium (3 species), Mucor (2 species), Myrothecium (1 species),

Penicillium (4 species), Rhizopus (1 species) and Trichoderma (1 species) were recov-

ered from solar-treated soils at both doses (Tab. 1). On solar-Czapek's agar, Amor-

photheca resinae was isolated at 4096 after 30 and 60 days from solar-treated soil

(Tab. 2). Hettige & Sheridan (1984) reported that, 12 monthly samples of diesel fuel

from two bulk storage tanks were examined for the presence of fungal contamination

during 1982-1983. They isolated over 25 fungal species of which Cladosporium resi-

nae was the predominant fungus occurring in 98% of the samples followed by Penicil-

lium spp. (93%). Davies & Westlake (1979) reported that oil-utilizing fungi were iso-

lated from both oil-polluted and uncontaminated northern canadian soils using

stationary enrichment technique. Twenty-eight out of the 34 fungi of types isolated

were capable of growing on a variety of crude oils. The most frequently isolated spe-

cies produced abundant small conidia, e.g. Penicillium and Verticillium spp. and are

typical of genera which would normally be expected to grow on soil dilution plates.

They also stated that 40 fungal types or strains have been shown to grow on whole

crude oils. These included Torulopsis sp., Beauveria bassiana, Chrysosporium sp.,

Paecilomyces sp., Penicillium spp., Trichoderma viride, Verticillium spp., Acremonium

sp., Aspergillus niger, А. ochraceus, A. versicolor and Cladosporium spp. However, the

role that fungi play in the decomposition of oil in soil is unknown (Davies & West-

lake, 1979). Mycelial organisms can penetrate insoluble substances such as oil and this

increases the surface area available for bacterial attack, On the other hand, the studies

of Walker & Colwell (1974 a, b) and Walker et al. (1975) showed that although bac-

teria initiated the degradation of a synthetic petroleum mixture, twice as much was de-

graded when bacteria, fungi and yeast were present. This synergism between microor-

ganisms could result in an increase in the rate and amount of oil degraded than would

be achieved individually. In Egypt, most of the preceding genera and species were iso-

lated previously from oil polluted soils (Hemida, 1991; Bagy, 1992) and from na-

phthalene-anthracene utilizing microorganisms (Bagy et al., 1992).

In conclusion, the preceding results revealed that, numerous fungal species are

able to utilize benzene or kerosene or solar. There are no hydrocarbon utilizing fungi

characteristics of benzene, kersosene and solar.

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Source : MNHN, Paris

Source : MNHN. Paris

Cryptogamie, Mycol. 1993, 14 (3): 215-218 215

PILATOPORUS MAROCCANUS SP. NOV. A NEW POLYPORE

OF THE POLYPORUS PALUSTRIS GROUP

Frantisek KOTLABA and Zdenek POUZAR®)

(1) Na Petrinach 10, 162 00 Praha 6, Czech Republic.

(2) Srbska 2, 160 00 Praha 6, Czech Republic.

ABSTRACT - Pilatoporus maroccanus Kotl. et Pouz., growing on living trunk of Cupressus sem-

pervirens, is described as a new species from Morocco. Three new combinations in the genus Pi-

latoporus are proposed.

RÉSUMÉ - Les auteurs ont décrit l'espèce nouvelle Pilatoporus maroccanus trouvée au Maroc

sur le tronc vivant de Cuperssus sempervirens. Ils ont proposé trois combinaisons nouvelles au

genre Pilatoporus.

KEY WORDS : Aphyllophorales, polypores, Pilatoporus.

INTRODUCTION

During a touristic trip to Morocco in April 1992, the first author found an in-

teresting polypore on the base of a live trunk of Cupressus sempervirens in Central

(Moyen) Atlas Moutains which appeared to be a new, undescribed species, belonging

to the genus Pilatoporus Kotl. et Pouz. 1990.

DESCRIPTION

Pilatoporus maroccanus Kotlaba et Pouzar, sp. nov. (Fig. 1, 2).

Carposomata annua, in juvenilibus elastice carnosa, in statu siccato suberose

dura, lateraliter pileata (unguliformia), 4,5-5,5cm lata (radius 2-2,3cm) et 4,0-5,5cm

crassa, in sectione triangularia, superficie irregulariter et leviter tuberculata, haud zo-

nata (solum propius marginem leviter zonata), adpresse dense velutina, prope margi-

nem usque glabrata, sordide straminea, prope marginem ochraceo-brunneolutea et in

propria margine brunnea. Caro in sectione eburnea (unico cum zona grisea), sat crassa

(ad basim usque ad 20mm), marginem versus abrupte attenuata, fibrillosa, sapore in-

cuspicuo; tubuli pallide eburnei, non stratosi vel unistratosi, usque ad 1,8cm longi, os-

tiolis distincte griseis (sicut ostiolis distincte griseis (sicut ostiola tubulorum Bjerkand-

erae adustae vel Trametis suaveolentis maturae), poris angulato-rotundatis, sat magnis

(1-3 per Imm), dissepimentis crassis.

Source : MNHN, Paris

F. KOTLABA and Z. POUZAR

гаером ‘a Áq oyd (X60 - C "ET

= D 't661 ATLI ‘099010 фром '(s24 JO nos) ouexj jo quou uryo[-g :suaz142dus snss24dn;) ш) "znog 19 "noy smup2204Du sn10dom[I4 :c:

IN. Paris

Sou

PILATOPORUS MAROCCANUS SP. NOV. 217

Systema hypharum tramae trimiticum: hyphae generativae tramae tubulorum

tenuitunicatae, ramificatae, conspicue fibulatae, 2,5-3,0um crassae (in trama pilei

crassiores, 2,8-4,5\un); hyphae ligativae tubulorum crassetunicatae, anguste canalicu-

latae, frequenter ramificatae, non fibuligerae, 2-Зит crassae (in trama pilei 1,5um

crassae); hyphae skeleticae tubulorum haud ramificatae, plerumque crassitunicatae us-

que subobliteratae (cum canaliculo peranusto), nonnullae tenuiter tunicatae, 2-5um

crassae, in trama pilei crassitunicatae, 4-6um crassae.

Basidia clavata, 27-34 x 5,7-7,0,um, tetrasterigmatica, sterigmatibus usque ad

Sum longis; cystidiola absunt. Sporae 7,0-9,3 x 2,5-3,5um, cylindrico-ellipsoideae nec

non amyloideae, indextrinoideae, acyanophilae.

Putrefacio ligni brunnea.

Holotypus: Montes Atlas Medius, circa 8-10 km sept. versus Ifrane (meridio

versus Fes), Marocco sept; ad basim trunci vivi Cupressi sempervirentis apud viam,

17.1V.1992, leg. F. Kotlaba, det. F. Kotlaba et Z. Pouzar (PRM 842893).

Carpophores annual, pileate, sessile, bracket-like, soft when young, corky hard

when dried, 2-2.3cm wide, 4.5-5.5cm long and 4-5.5cm high, surface of the pileus ir-

regularly faintly tuberculate, finely velutinate, margin glabrous, dirty straw-yellow;

tubes pale ivory, up to 1.8cm long, pores distinctly grey (as Bjerkandera adusta or in

mature Trametes suaveolens), angular-rounded, 1-3 per mm; context in section ivory

with a single grey zone, fibrillose, of indistinct taste.

Hyphal system trimitic: generative hyphae ramified, 2.5-4.54m wide, promi-

nently clamped, thin-walled, hyaline; ligative (binding) hyphae richly ramified,

1.5-3um wide, thick-walled, not septate; skeletal hyphae unramified, 2-64m wide,

mostly thick-walled, inamyloid, indextrinoid and acyanophilous.

Basidia tetrasterigmatic, clavate, 27-34 x 5.7-7j1m; cystidioles absent. Spores

7-9.3 х 2.5-3.5um, cylindric-ellipsoid or almost short-cylindric, sometimes slightly fu-

siform, thin-walled, with a smooth, inamyloid, indextrinoid and acyanophilous wall.

Type of rot brown.

Holotype: North Morocco, Moyen Atlas Mts, near the road about 8-10 km

north of Ifrane (south of Fes), in lower part of the trunk of a living tree of Cupressus

sempervirens, 17.1V.1992, leg. F. Kotlaba, det. F. Kotlaba and Z. Pouzar (PRM

842893).

DISCUSSION

This newly described polypore belongs to the group of closely related species

around Polyporus palustris Berk. et Curt., the type of the genus Pilatoporus Kotl. et

Pouz. (see Kotlaba & Pouzar, 1990). This group of polypores is sometimes classified

either within the genus Tyromyces P. Karts. or the genus Fomitopsis P. Karst. Pilato-

porus maroccanus parasitized a living cypress, a treee species which hosts a very few

polypores or other macromycetes.

The most closely related species to Pilatoporus maroccanus seems to be Pila-

toporus ibericus (Melo et Ryv.) Kotlaba et Pouzar, comb. nov. (basionymum Fomi-

topsis iberica Melo et Ryvarden, Bol, Soc. Brot., Lisboa, ser. 2, 62: 228, 1989), de-

scribed recently from Portugal (Melo & Ryvarden, 1989). It differs from Pilatoporus

maroccanus in having white to yellowish pores which are smaller (3-4 per mm) and

slightly shorter spores, 6-8 (-8.5)itm long, whilst the host trees are different.

Source : MNHN, Paris

218 F. KOTLABA and Z. POUZAR

The other species, which also belong to the genus Pilatoporus, viz. Pilatopo-

rus meliae (Underw.) Kotlaba et Pouzar, comb. nov. (basionymum Polyporus meliae

Underwood, Bull. Torrey Bot. Club, New York, 24: 85, 1897) and Pilatoporus nivosus

(Berk.) Kotlaba et Pouzar, comb. nov. (basionymum Polyporus nivosus Berkeley,

Journ. Bot. red. Hooker, London, 1: 196, 1856) differ, according to Gilbertson & Ry-

varden (1986), both in their very small pores (5-8 per mm) and somewhat narrower

spores (2-3um). The last species belonging here is Pilatoporus epileucinus (Pilat ex Pi-

lat) Kotl. et Pouz., which differs in its very small pores (4-5 per mm) and very narrow

spores (1.5-2.5 um).

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Brot., ser. 2, 62: 227-230.

Source : MNHN, Paris

Cryptogamie, Mycol. 1993, 14 (3): 219-228 219

MORPHOLOGICAL DIFFERENCES BETWEEN OPHIOSTOMA

PICEAE AND O. QUERCI, AND AMONG O. QUERCI

ISOLATES

Krystyna PRZYBYL* and Michel MORELET**

* Institute of Dendrology, Polish Academy of Sciences, 62-035 Komik,

Poland.

** Laboratoire de Pathologie Forestière, INRA Nancy,

54280 Champenoux, France.

ABSTRACT - Ophiostoma querci differs statistically from O. piceae in lengths of synnematal

conidiogenous cells, perithecial neck, ostiolar hyphae. Also the differences in synnemata hight,

ascocarp base diameter, ascospores shape and in the germination rate of synnematal conidia on

SNA at 25°C were found, Differences in colony morphology, synnematal production and length

of the Sporothrix primary conidia among O. querci isolates are also presented. The atypical strain

88A from Poland (only in anamorphic condition but compatible with the mating type A of O.

querci) could be a new variety of this species.

RESUME - Cette étude montre qu'il est possible de distinguer par des critères morphologiques

les deux espèces jumelles Ophiostoma querci et Ophiostoma piceae. Elle a porté sur 14 souches

monospores d'origines variées (10 O. querci dont les 2 géniteurs A et B du néotype de O. querci,

et 4 O. piceae). L'incompatibilité sexuelle de ces 2 espèces, la première inféodée aux Feuillus, la

seconde aux Conifères a été vérifiée. Puis des différences significatives ont été relevées aux ni-

veaux de la longueur des cellules conidiogènes des corémies (plus longues chez O. querci); - de

la longueur du col des périthèces (plus long chez О. querci); - de la longueur des soies ostiolaires

(plus longues chez O. piceae). Des différences existent aussi en ce qui concerne la hauteur des

corémies, le type de germination des conidies de ces dernières sur milieu SNA à 25°C, le

diamètre des ascocarpes et la forme des ascospores. L'étude comparative des anamorphes de О.

querci révèle une bonne homogénéité au niveau des caractères culturaux, de la production des

corémies et de la taille des ramoconidies du stade Sporothrix, excepté pour la souche 88A d'origi-

ne polonaise. Celle-ci appartient à l'espèce O. querci puisque son croisement avec le géniteur A

de O. querci est fertile, mais pourrait constituer une variété morphologique de cette espèce, du

fait de ses caractéristiques qui la rapprochent du Hyalodendron roboris de Georgescu et al.

KEY WORDS : Ophiostoma piceae, Ophiostoma querci, Quercus spp., Oak, in vitro study.

I. INTRODUCTION

Ophiostoma piceae (Münch) H. et P. Sydow has been considered for a long

time (Hunt, 1956, sub. nom. Ceratocystis piceae (Münch) Bakshi) as a fungus inhabit-

ant of both hardwoods and conifers. Among its synonyms is Ophiostoma querci

(Georg.) Nannf. (sub. nom. Ceratostomella querci Georgevitch) described from oak.

This point of view was shared till recently by Upadhyay (1981) and Przybyl & de

Hoog (1989).

Source : MNHN, Paris

220 K. PRZYBYL and M. MORELET

Separation of these two taxa was proposed by Brasier & Kirk (1989) and Bra-

sier & Webber (1990). The first mentioned of the above authors discovered that О. pi-

ceae isolates from hardwoods and conifers are reproductively incompatible, and al-

though "morphologically similar, may be sibling species of Ophiostoma". The former

authors concluded: "the name O. querci may need to be re-established for the hard-

wood taxon".

As no authentic material was available for O. querci, Morelet (1992) proposed

for it a neotype from oak, allowing the application of this name to hardwood taxon.

He also suggested a complementary morphological study between O. piceae and O.

querci.

Furthermore, a strain of Sporothrix (88A) was isolated from a Quercus robur

trunk in the Krotoszyn Forest District in Poland (Przybyl, in print), similar in the mor-

phology of primary conidia to those of Hyalodendron roboris Georgescu and Teodoru

(anamorph of O. roboris).

The aim of our work was to find morphological differences between O. piceae

and O. querci and also to identify the taxonomic position of 88A strain.

II. MATERIAL AND METHODS

The 14 strains selected for experiments are listed in Table 1, and the following

studies were carried out:

Colonies characters

The fungi were grown in Petri dishes with MA 3% (Malt agar Difco, pH 5.6)

at 25°C in darkness. The radial growth of mycelium and colony characters of all stud-

ied strains were noted after 10 days, in 6 replications.

Anamorph characters

1. Synnemata

For examination of synnematal conidiogenous cells the isolates were grown in

Petri dishes with BWA (Beer Wort Agar) at 25°C in darkness and examined after 10-

15 days;

For measurements of synnemata height and of conidia length from synnemata,

the isolates were grown in Petri dishes with MA at 25°C and synnemata were sampled

after 10-15 days.

For the purpose of observation of their germination rate, drops of synnematous

conidia suspension of O. querci and O. piceae were transferred separately onto SNA

medium (Nirenberg, 1976) and incubated at 25°C in darkness.

2. Sporothrix primary conidia

The isolates were grown in Petri dishes with MA at 25°C in darkness and stu-

died over 10-15 days. For the measurement of primary conidia the scant mycelium

was taken when two colony types (scant and floccose) occurred.

Source : MNHN, Paris

0.91

10А5

88A

180.69 CBS

195A

244A

276

318

336

468

469

OPHIOSTOMA PICEAE AND O. QUERCI

Nogent sur

Vernisson, France

Blois, France

Krotoszyn, Poland

Northern Ireland

Krotoszyn, Poland

Sulechow, Poland

Tuliszkow, Poland

Mysliborz, Poland

Czechoslovakia

о.

mating type A

of neotype

о.

mating type B

of neotype

о.

querci

. querci

. piceae

. querci

. piceae

Table 1. Details of Ophiostoma querci and O. piceae studied.

Strains from Czechoslovakia and from CBS (the Netherlands) were send to K. Przybyl by J.

Franknechtova in year 1991 and S. de Hoog in year 1988 respectively. The other strains were

isolated and recognized by the authors in own laboratories.

Les isolats de Tchécoslovaquie et du C.B.S. ont été envoyés respectivement en 1991 par J. Frank-

nechtova et en 1988 par S. de Hoog. Les autres ont été isolés et identifiés par les auteurs.

Quercus petraea

Q. petraea

Q. robur

Picea sitchensis

. robur

. rubra

. robur

Pinus sylvestris

Picea abies

221

Source : MNHN, Paris

222 K. PRZYBYL and M. MORELET

3. Measurements

Fifty measurements of the length of both the synnematal conidiogenous cells

and Sporothrix primary conidia were made for each isolate growing in the conditions

mentioned above. Pairwise comparisons of length means of synnematal conidiogenous

cells were carried out with the LSD analysis of variance and in the case of Sporothrix

primary conidia the Newman-Keuls method was used.

Teleomorph characters

Neck and ostiolar hyphae were examined from the perithecia produced on oak

sapwood in using general method of mating reactions (Morelet, 1992).

1. Mating reactions

Crosses (with 3 replications of each) were carried out in the following combi-

nations:

- between types À x B of O. querci isolates,

- between types À x B of O. piceae isolates

- between 88A and O. querci isolates,

- between 88A and O. piceae isolates.

2. Ascocarps

For examination 10 perithecia were taken from each replication (30 for each

combination) of O. querci and O. piceae isolates 15 days after pairing. Lengths of per-

ithecial neck and ostiolar hyphae were measured and statistically analysed with the

Newman-Keuls method.

Also the drop of ascospores, collected from perithecia formed as a result of

positive mating reaction, between 88A and O. querci isolate, was transferred onto MA

(pH 5.6) and incubated for the first 10 days at 25°C in darkness and then at room tem-

perature in light. Moreover, single - ascospore cultures were made using strongly di-

luted spore suspensions and taking each ascospore under lens microscope.

III. RESULTS

Colony morphology

Colonies attained over 10 days a diameter of 55-67 mm (an average of 64

mm) for O. querci, of 67-78 mm (an average of 72 mm) for О. piceae. Aerial myceli-

um was scant - floccose usually growing in sectors, whitish grey for O. querci isolates,

felted white for 88A, felted, grey for O. piceae. Reverses were pale brownish in O.

querci and O. piceae but uncoloured in 88A. Synnemata were produced abundantly all

over the colonies or in the concentric zones of O. querci, frequently or abundantly

over the colonies or in a broad band near the colony of O. piceae, whereas they were

absent in the colony of 88A. Significant is the fact, that the synnemata in 88A cultures

did not arise during 2 months of observations on MA at 25°C but were easily found

on sapwood samples 2 weeks after inoculation.

Anamorphs characters

1. Synnemata

Lengths of branched and unbranched synnemata were between (130-) 350-500

(-600) um for O. querci whereas for O. piceae between 200-700 (-800) uim.

Source : MNHN, Paris

OPHIOSTOMA PICEAE AND O. QUERCI 223

Lengths of conidiogenous cells of synnemata ranged between 8.3 - 16.6 шп

for all isolates of O. querci and 8.3 - 13.4 um for isolates of O. piceae. Length means,

of O. querci and O. piceae ranged for all studied isolates between 13.3 - 14.2 ит and

10.1 - 10.9 um respectively. The values of length means of O. querci and O. piceae

isolates were significantly different with a confidence level of œ = 0.05 in LSD analy-

sis (Table 2).

In regard to the germination of synnematal conidia, various sizes of conidia

resembling yeast-form cells, oblong to globose both in О. querci and O. piceae oc-

curred on SNA at 25°C, after 24 hours. Differences between them in the germination

rate of conidia were observed in 3 days. In O. querci well developed germinated tubes

were found, whereas in O. piceae only initial germinations of conidia were observed.

Table 2. Pairwise comparisons of length means (um) of synnemata conidiogenous cells.

Tableau 2. Comparaison de moyennes deux à deux des cellules conidiogènes du stade Graphium

(longueur en um).

* The data with common letters do not differ significantly (a= 0.05) with using the LSD method.

Les données affectées d'une même lettre ne diffèrent pas significativement au seuil de 5% (test

LSD).

** 88А - The measurements of synnemata conidiogenous cells on sapwood samples 1

Les synnema utilisés pour les mesures des cellules conidiogènes ont été prélevés sur milieu

gélosé sauf dans le cas de 88A où ils l'ont été sur aubier de chêne.

Source : MNHN, Paris

224 K. PRZYBYL and M. MORELET

Isolates

Table 3. Length of primary conidia (um).

Tableau 3. Longueur des ramoconidies (1m).

“Data with common letters do not differ significantly ( = 0.01) with using Newman-Keuls

method.

Les données affectées d'une même lettre ne diffèrent pas significativement au seuil de 1% (Test

de Newman-Keuls).

Source : MNHN, Paris

OPHIOSTOMA PICEAE AND O. QUERCI 225

2. Sporothrix primary conidia

Primary conidia formed by sympodial growth on the apical part of the coni-

diogenous cells were hyaline, thin - and smooth walled, clavate, 0-2 septate for all stu-

died isolates of O. querci (except 88A with 4% of 3-septate primary conidia) and 0-2

for O. piceae. Length of primary conidia ranged from 6.6 - 26.6 um for the 8 O. quer-

ci isolates, (6.6-39.6 jim for 88A) and 6.6 - 28.2 рт for O. piceae. Maximal means

length among all studied isolates reached 15.4 ит for O. querci and 15.8 [im for O.

piceae. Isolate 88A with maximal mean length 25.6 jim differed statistically from O.

querci and O. piceae values with confidence level of « = 0.01 in the Newman-Keuls

method (Table 3).

Teleomorph characters

1. Mating reactions

Positive mating reactions were observed only:

- between compatibility types of O. querci isolates

- between compatibility types of O. querci isolates and 88A

- between compatibility types of O. piceae isolates.

2. Ascocarps

Ascocarp bases for O. querci and O. piceae were between 90-160 (-190) um

and 100-180 (-200) pim respectively.

O. querci and O. piceae differed considerably in their length averages of both

neck and ostiolar hyphae:

tistically larger than for O. piceae, where the average value amounted to 1092 um and

maximal value to 1600 um. On the other hand the ostiolar hyphae length of O. querci,

about 15 in number, was significantly smaller than for O. piceae about 25 in number.

In the case of O. querci the ostiolar hyphae length was noted up to 36 um (average

value 21 jum) whereas in O. piceae it was up to 55 jtm (average number 38 рт - Ta-

ble 4).

Ascospores ranged (3.5-) 2.5 x 1.5 um both for O. querci (allantoid in side

view) and O. piceae (reniform in side view).

Ascospores from perithecia which were formed in cross 88A x O. querci were

fertile. Indeed perithecia of F2 filial generation were obtained.

IV. CONCLUSIONS

Differences between O. querci and O. piceae

O. querci differs statistically from O. piceae in lengths of synnematal conid-

iogenous cells (longer in O. querci), perithecium neck (longer in O. querci) and ostio-

lar hyphae (longer in O. piceae).

Differences between 88A and O. querci isolates.

Isolate 88A differs from O. querci isolates in colony morphology (scant, floc-

cose for 8 isolates, against felty for 88A), synnemata formation (they were absent dur-

ing 2 months of observation in 88A) and length of Sporothrix primary conidia. In the

case of 88A the length of primary conidia ranged between 6.64-39.64 pm (mean value

Source : MNHN, Paris

226 K. PRZYBYL and M. MORELET

Mating Neck length Ostiolar

reactions (um) hyphae lenght (ym)

О. querci

0.2x 276

0.2 x 0.91

0.2 x 0.80

0.2 x 88 À

0. рісеае

180,69 х 468

180.69 х 469

180,69 х 470

Average

0. querci 1515,45 a

O. piceae 1091,65 b

Table 4. Results of mating reactions.

Tableau 4. Longueur des cols et hyphes ostiolaires des périthèces obtenus en croisements in vitro.

Average number differ significantly (o: — 0.05) with using Newman-Keuls method.

Les moyennes different significativement au seuil de 596 (Test de Newman-Keuls).

25.56) and therefore was nearby those of Hyalodendron roboris 3.5-45 um (Georgescu

et al., 1948). Noted by mentioned authors 3-septate primary conidia were also ob-

served in 88A isolate. The 88A gave fertile perithecia (with longer neck and shorter

ostiolar hyphae, see Table 4) in cross with O.2 (the mating type A of the neotype of

O. querci).

Source : MNHN, Paris

OPHIOSTOMA PICEAE AND O. QUERCI 227

Descriptions of O. querci (including its neotype) and O. piceae based on our

material

Ophiostoma querci (Georgevitch) Nannfeldt.

Synanamorphs: Graphium pirinum Goidanich

Sporothrix pirinum (Goidanich) Morelet

Colonies (55-) 57-67 mm in diam. over 10 days on MA at 25°C; aerial myce-

lium scant and floccose, whitish grey; growing in sectors; reverses pale brownish.

Synnematal unbranched and branched (130-) 350-500 (-600) um height, all over the

colony or in the concentric zones. Synnematal conidiogenous cells 8-16 um long prod-

uce slimy masses of oblong conidia (4.5-) 2.5 x 1.5 (-2.5) utm. Sporothrix primary co-

nidia 7-27 jm long, hyaline, thin - and smooth walled, clavate, 0-2 septate.

Ascocarps partly embedded in the agar medium; bases brown, globose 90-160

(-190) pum in diam.; necks dark brown at the base, lighter toward the apex, 1100-1900

[im long including ostiolar hyphae: ostiolar hyphae about 15 in number, brownish at

the base, often septate up 37 jim; ascospores allantoid in side view (3.5-) 2.5 x 1.5

um.

The atypical morph 88A (only in anamorphic condition) differs from the

above typical description in having aerial mycelium felty white, reverse uncoloured,

synnemata production very slow after 2 months of incubation, Sporothrix primary co-

nidia 0-3 septate up 40 um long. Then 88A could be considered as a new variety into

O. querci.

Ophiostoma piceae (Münch) H. & P. Sydow.

Synanamorphs: Graphium piceae (Crane & Schoknecht) Wingfield & Kendrick

Sporothrix sp.

Colonies attained a diameter of 79 mm (67-79 mm) over 10 days on MA at

25°C; aerial mycelium grey and felty, with frequent or abundant synnemata arising

over colonies or in the broad band; reverses at first white later becoming pale brown-

ish. Synnemata unbranched and branched 200-700 (-800) um height; conidiogenous

cells 8-13 tm long with slimy masses of oblong conidia (4.5-) 2.5 x 1 (-1.5) um. Spo-

rothrix primary conidia 7-28 дт long, hyaline, thin and smooth walled, clavate, 0-2

septate.

Ascocarps partly embedded in the agar medium; bases globose (sometimes el-

liptical) dark 100-180 (-220) jim in diam.; necks black at the base, becoming lighter at

the apex, 600-1600 pm long including ostiolar hyphae. Ostiolar hyphae about 25 in

number, septate up 55 jtm long; ascospores reniform in side view (3.5-) 2.5 x 1.5 um.

ACKNOWLEDGMENTS

This article is a result of an official cooperation between Pathological Laboratories of

National Institute of Agriculture LN.R.A. in Champenoux (France) and Institute of Dendrology in

Kórnik (Poland). Some part of the results was obtained in Poland and some one in France during

stay K. Przybyl in Champenoux in a framework of the cooperation. The authors thank Dr C. De-

latour for discussions and for help in some statistical calculations. Thanks also to Mme Majenski

and JE, Menard for their technical participation.

REFERENCES

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Source : MNHN, Paris

Cryptogamie, Mycol. 1993, 14 (3): 229-238 229

ESSAI DE LUTTE BIOLOGIQUE CONTRE

L'HELMINTHOSPORIOSE DE L'ORGE PAR L'UTILISATION

D'UNE SOUCHE PEU AGRESSIVE DE DRECHSLERA TERES

M. MOSTAFA, G. BARRAULT et L. ALBERTINI

Laboratoire d'Ingénierie Agronomique, Ecole Nationale Supérieure

Agronomique, 145 avenue de Muret

31076 TOULOUSE Cédex, FRANCE

RÉSUMÉ - L'utilisation préventive d'une souche peu agressive de D. teres contre une souche pa-

rasite de l'orge, montre que l'application de la suspension mycélienne ou du filtrat brut sur le

limbe foliaire provoque une réduction de l'attaque ultérieure par une souche agressive, qui se tra-

duit à la fois par une diminution du nombre de sites d'infection et une réduction de la taille des

nécroses. Le mésophylle du limbe d'orge confronté au filtrat toxique de la souche faible, et

contaminé ultérieurement par une souche agressive est peu alteré par rapport au témoin.

ABSTRACT - The preventive use of a weakly aggressive strain against D. reres, the causal

agent of barley net blotch, showed that the application of the mycelial suspension or of crude fil-

trate on the leaf lamina subsequently induced decreased attack by agressive strain, is reflected by

the decreased number of infection sites and by the decreased size of necroses. Barley lamina me-

sophyll in the presence of the toxic filtrat of the hypoagressive strain, which was followed by in-

oculation with an aggressive strain, was little allowed with respect to that of the control plants.

MOTS CLÉS : Lutte biologique, Hypoagressivité, Drechslera teres, Hordeum vulgare.

INTRODUCTION

L'emploi de produits phytosanitaires constitue une menace pour les

écosystèmes, par la pollution des eaux superficielles et souterraines. Ces produits peu-

vent également déclencher des manifestations pathologiques chez l'homme, liées d'une

part à la présence de résidus dans les denrées alimentaires, et d'autre part aux risques

inhérents à l'emploi de ces produits. Par ailleurs, l'utilisation généralisée et répétée de

ces matières actives est susceptible d'entraîner la sélection de souches résistantes

(Sheridan & Grabavac, 1985; Leroux, 1991). En outre, certains fongicides peuvent sti-

muler la croissance et la morphogenèse conidienne de certains pathogènes (Jordan &

Best, 1981).

Dans ce contexte, la lutte biologique qui repose sur plusieurs mécanismes (an-

tagonisme, compétition trophique, hyperparasitisme, et hypovirulence) peut constituer

une méthode de lutte alternative tout à fait intéressante. Chez les champignons

phytopathogènes, le phénomène d'hypovirulence a été observé chez Gaeumannomyces

&raminis oà des souches hypovirulentes sont capables d'exclure la souche pathogène

Source : MNHN, Paris

230 M. MOSTAFA, G. BARRAULT et L. ALBERTINI

virulente (Tivoli et al., 1974; Lemaire et al., 1982). Chez Endothia parasitica, parasite

du châtaignier, les souches hypovirulentes transmettent ce caractère dans les souches

virulentes (Grente & Sauret, 1969; Anagnostakis & Day, 1979; Jaynes & Elliston,

1981; Kuhlman et al., 1984). Dans le même ordre d'idées, l'action préventive d'une

souche non pathogène d'Alternaria alternata sur le tabac réduit de 60% la sévérité des

symptômes au champ (Spurr, 1977). Le trempage des boutures de patate douce dans

une suspension conidienne d'une souche hypoagressive de Fusarium oxysporum entrai-

ne une protection ultérieure de ces boutures contre les attaques consécutives à un repi-

quage dans un sol naturellement infesté par la souche pathogène (Ogawa & Komada,

1984).

Le but du présent travail est de contribuer à l'essai d'une méthode de lutte bio-

logique par l'utilisation d'une souche peu agressive contre un parasite de l'orge,

Drechslera teres (Sacc.) Shoemaker, anamorphe de Pyrenophora teres Drechs. dont le

développement en France depuis 10 ans a été spectaculaire. Cette maladie peut être

qualifiée de iatrogène dans la mesure ou l'environnement chimique stimule certaines

séquences biologiques et épidémiologiques du pathogène (Toubia-Rahme et al., 1992).

C'est actuellement une affection fongique majeure du complexe phytopathogène de

l'orge susceptible de causer des chutes de rendement tangibles. La maladie peut être

provoquée par les deux formes: D. teres. f. teres et D. teres f. maculata (Barrault,

1989).

MATÉRIEL ET MÉTHODES

1) Matériel foi

Dix souches monoconidiennes polycaryotiques et hétérocaryotiques isolées à

partir de différents cultivars provenant de diverses régions sont répertoriées sous forme

alpha-numérique:

La lettre indique la nature du facies d'origine [R= facies réticulé (Ry, Ra, Rs,

Ru, Rẹ) S= facies spot maculta (Sp, S,, Sy, Sq, уу]. Le chiffre indique le numéro de

l'isolat a l'intérieur d'un méme facies (Mostafa, 1982; Barrault, 1989).

Les souches de D. teres, ensemencées sur un milieu liquide, statique (Vg à

10%) dans des fioles d'Erlenmeyer de 250 ml, à raison de 40 ml par récipient, sont

mises à incyber à 23°C, à l'obscurité. Après 10 jours de culture, le mycélium est filtré

sur un entonnoir cylindro-cónique à plaque filtrante, en verre borosilicaté (D 2,

diamètre 70 mm) à l'intérieur duquel on place un filtre sans cendres Durieux N'III (fil-

tration rapide), et finement dispersé à l'aide d'un broyeur "Auto-Mix" (6000/mn pen-

dant 1 mn) de sorte que la concentration finale en fragment de mycélium soit de l'or-

dre de 106 раг ml.

2) Matériel végétal

Les plants d'orge (stade 3 feuilles) issus de semences d'orge (variété Thibaut)

désinfectées à l'hypochlorite de sodium (10%) puis rincées énergiquement avec l'eau

distillée, sont semées dans des bacs contenant du terreau préalablement stérilisé à la

chaleur (120°C pendant 1 heure). Le terreau est hémidifié périodiquement à l'aide

d'une solution nutritive de Knop (NaNO, lg; KNOs, 0,25g; MgSO,, 7H;O 025g;

KH,PO, 0,25g; FeCl; traces /1000 ml d'eau).

Source : MNHN, Paris

HELMINTHOSPORIOSE DE L'ORGE 231

3) Détermination du pouvoir pathogène des dix souches de D. feres

La contamination (au stade 3 feuilles) par pulvérisation foliaire est réalisée

sous la forme d'une suspension mycélienne (25 ml/bac) à laquelle on adjoint de la

gélatine (0,25%)

Les plants d'orge ainsi contaminés sont recouverts d'un sac en plastique pen-

dant 48h pour maintenir une humidité saturante favorable à la contamination et au

développement du pathogène au cours de la phase d'incubation. Les essais se déroulent

dans une serre où les paramètres climatiques sont les suivants: température= 18-20°C,

humidité relative=85-95% et intensité lumineuse 12h/j(60Wm=?).

Les essais sont réalisés en blocs randomisés avec 4 répétitions. L'analyse de

variance est fondée sur la moyenne.

4) Confrontation de la souche la moins agressive (S,)) avec la souche la plus

agressive (Rj) in vivo.

Les suspensions mycéliennes де R, et Sj; comprenant 105 fragments/ml (20

ml) ont été appliquées soit simultanément, soit successivement. L'application de Ra

étant effectuée 24 heures ou 48 heures aprés celle de S,;. Un témoin (application de la

souche R; seule) a été réalisé.

5) Etude de l'action du filtrat de la souche (50)

Le filtrat de Sy, est obtenu à partir de culture: cffectuées sur milieu Fries

(incubation pendant 10 jours à 23°C, à l'obscurité), puis filtrées stérilement sur un fil-

tre GELMAN (® = 0,2 mm). Le filtrat brut a été expérimenté après dilution avec de

l'eau distillée stérile, aux trois concentrations suivantes: 10%, 25%, et 50% du filtrat

initial. La contamination par la souche R; est faite 24 heures ou 72 heures après l'ap-

plication du filtrat.

Les plantes ayant reçu seulement la pulvérisation de fragments mycéliens de

R; (105 fragments mycéliens/ml) constituent le témoin. L'intensité de la maladie est

déterminée 10 jours après la contamination par R3.

L'intensité de l'attaque est définie d'après une échelle de notation allant de 0 à

9 (0 = absence de symptômes, 1= < 2,5%; 2= 2,5% - 5%; 3= 5% - 10%; 4= 10% -

20%; 5= 20% - 30%; 6= 30% - 40%; 0% - 50%; 8= 50% - 75%; 9= > 75%) de

surface foliaire malade (nécrose + chlorose).

6) Anatomie foliaire

Les coupes (20 à 40 jum) réalisées à partir de fragments foliaires sains

(témoin) et malades, sont obtenues au moyen d'un microtome à main. Les différentes

coupes d'une série ont été réparties en 3 lots, le premier lot de coupes étant coloré

pendant 5 mn. par le bleu coton-acétique (bleu coton C4B 5 g, acide acétique

cristallisé 5g, eau distillée 100 ml), le second lot pendant 15 mn. par le bleu de

résorcine à 1% dans l'éthanol à 95°: 0,1 ml + eau distillée (25 ml), le troisième lot

pendant 30 min. par le rouge de Ruthénium (0,2% en solution aqueuse à pH 10).

Les coupes sont montées entre lame et lamelle dans une goutte de glycérine

diluée au 1/2 dans du Deplex (milieu permettant le montage permanent des

préparations sans déshydratation préalable).

Source : MNHN, Paris

232 M. MOSTAFA, G. BARRAULT et L. ALBERTINI

RÉSULTATS

Détermination du pouvoir pathogène des dix souches de D. teres

L'examen de la Fig. 1 montre que quelle que soit la feuille considérée, la sou-

che So apparait étre la moins agressive (l'intensité de la maladie est égale à 6 sur la

ère feuille, et 2,1 sur la 2ème feuille). R; est en revanche la plus agressive (8,9 sur la

1ère feuille, et 4,8 sur la 2ème feuille).

Confrontation de la souche la moins agressive (Sjo) avec la souche la plus

agressive (R;)

* confrontation directe (mycélium)

Les résultats de la figure 2 montrent que si la souche So est appliquée

préventivement (48 h avant la contamination par la souche R;) l'attaque sur les lère et

Deme feuilles est fortement diminuée par rapport à celle consécutive à une application

Simultanée Sio + Rẹ. Une application de Rs, 24h aprés celle de Sio, provoque sur la

2ème feuille une attaque dont l'intensité est intermédiaire entre les deux essais précités.

* confrontation indirecte (filtrat)

En complément de ces observations, il nous a paru intéressant d'étudier l'effet

de différentes dilutions du filtrat de la souche Sy sur l'intensité de l'attaque de plantes

d'orge, par la souche hyperagressive R3.

M: ére feuile [ 2 ème feuille

ab a ab ab a ab

9 22 gí be x - z4 =4 a

В a

8 pai

< 6

3 5 a

3 c n r <

4 Vary

а T

> be} E а с а be a bc E

R1 R2 R3 R4 RS 56 57 58 59 510

Fig. 1 - Agressivité de 10 souches de D. teres appréciée par le niveau de gravité des symptômes

observés sur orge (var. Thibaut).

Fig. 1 - Effect of ten D. teres strains on the incidence of barley (var. Thibaut) net blotch

Les moyennes suivies de la même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5%

(Test de Newman - Keuls)

Source : MNHN, Paris

HELMINTHOSPORIOSE DE L'ORGE 233

W jérefeuile | 1 2 ème feuille

L'INTENSITE DE LA MALADIE

A B C D

Fig. 2 - Agressivité de la souche R; de D. teres sur orge (var. Thibaut) en présence de la souche

Sj, inoculée en méme temps, 24h et 48h après

Fig. 2 - Aggressivity of barley (cv Thibaut) net blotch strain R; in the presence of strain Sjo

inoculated simultaneously or subsequently.

Les moyennes suivies de la méme lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 596

(Test de Newman - Keuls).

R; et Sj9 simultanée

Sio suivi de R3 24h après

Sio suivi de R; 48h après

Témoin R; seul

unum

Le filtrat de Si à 5096, est phytotoxique, il entraine l'apparition de nécroses

sur les feuilles. Les filtrats dilués à 1096 et 2596 ne sont pas phytotoxiques; ces der-

niers, appliqués 72h avant la contamination par R;, réduisent très nettement la sévérité

de l'attaque par R;, sur la 2ème feuille (Tableau 1).

Anatomie foliaire (Planche 1)

Témoin R; (Photo 2)

Les cellules du parenchyme chlorophyllien ont subi dans la zone nécrotique

d'importantes altérations qui se traduisent par un brunissement et un affaissement cel-

lulaire: il en résulte une réduction de l'épaisseur de la zone altérée par rapport au

VHN. Paris

234

M. MOSTAFA, G. BARRAULT et L. ALBERTINI

Source : MNHN, Paris

HELMINTHOSPORIOSE DE L'ORGE 235

témoin. La paroi des cellules du parenchyme chlorophyllien perd de son intégrité, on

voit apparaitre des lacunes parfois assez grandes, qui jouxtent les faisceaux

vasculaires. Alors que la paroi pecto-cellulosique des cellules de la gaine externe des

faisceaux vasculaires se lyse fréquemment en désolidarisant ainsi les faisceaux du reste

du limbe, les cellules de la gaine interne (à paroi subérifiée) et les éléments des fais-

ceaux vasculaires (notamment du xyléme) conservent une structure pseudo-normale.

Filtrat toxique appliqué 72h avant la contamination par R, (Photo 3).

Par rapport au témoin R; (Photo 2), les cellules des mésophylles et les cellules

de la gaine périvasculaire externe restent quasi intactes, si ce n'est la présence de quel-

ques lacunes de faible taille.

DISCUSSION

Dans la recherche de souches de faible agressivité de D. teres pouvant jouer

un rôle dans le contrôle biologique du parasite, la souche peu agressive de D. feres

(Sio) en tant que telle ou par l'intermédiaire de son filtrat de culture peut entraîner une

réduction du taux d'infection par une souche hyperagressive R;. Un certain délai est

nécessaire entre la préinoculation par Si, et l'inoculation par R; pour permettre au

phénomène de "prémunition" de s'exprimer (72h.) Matta (1966) et Littlefield (1969)

ont obtenu une prémunition, respectivement contre la fusariose de la tomate et la

rouille du lin, qui se maintient tout au long de la vie de la plante. Mas (1967), indique

que l'effet de la pré-inoculation par la souche hypovirulente peut se traduire aussi par

un retard dans l'apparition de la maladie.

Dans le cas de la préinoculation de l'orge avec le filtrat toxique de la souche

Sio on remarque que ce filtrat toxique confère au mésophylle du limbe une

"résistance" relative à l'attaque de la souche R; de D. feres. Cette observation nous

permet d'émettre l'hypothèse selon laquelle la souche S;, pourrait induire, chez l'hôte,

la production de substances de défense qui entraveraient le développement du

pathogène R, dans l'hôte en limitant ainsi la taille de la lésion produite par R}. L'en-

semble des travaux sur les phytotoxines de D. teres montrent qu'il existe deux toxines

thermostables (A et B) pour les deux formes (R et S) non spécifiques, dialysables et

de faibles poids moléculaires; elles réagissent positivement à la ninhydrine et sont

apparentées à des peptides (Smedegard-Petersen, 1977). Les toxines A et B ont été

isolées à partir de feuilles malades (et jamais dans les feuilles saines) à une concen-

tration très variable (allant de l'état de traces à de très fortes concentrations); cette

Planche 1 - Modifications anatomiques induites par D. teres souche (R3) sur le limbe d'orge seul

(2); ou "préinoculé" 72h auparavant par le filtrat de Sọ à 50% (3).

Plate 1 - Responses of barley leaf tissue infected with D. teres strain R; (2) preinoculated 72h

earlier with S; filtrate.

1) Coupe transversale dans une feuille d'orge: - épiderme supérieur (ES) - épiderme inférieur

(EI) - mésophylle (MES) - gaine périvasculaire externe (PVE).

2) Coupe transversale dans une feuille d'orge infectée par D. teres souche R3. On observe une

lyse cellulaire entraînant la formation de lacunes dans le mésophylle et une altération des cellules

de la gaine périvasculaire externe.

3) Coupe transversale dans une feuille d'orge infectée par la souche Rs et. préinoculée 72h aupa-

ravant par le filtrat de Sjq & 50%, On observe quelques altérations formant de petites lacunes

dans le mésophylle (3).

Source : MNHN. Paris

236 M. MOSTAFA, G. BARRAULT et L. ALBERTINI

application % séverité

préventive du | Concentration de feuilles del'attaque

filtrat de S40 malades | sur la 277

feuille

1096 59,9 ab 5,86 ab

24 heures 2596 63,3 ab 5,52 аЬ

10% 49,9 bc 4,86 bc

2596 334 с 3,98 cd

72 heures

Temoin 79,2 a 6,22 a

Tableau 1 - Agressivité de D. feres (R3) sur plantules d'orge (Var. Thibaut) stade 3 feuilles,

prétraitées par le filtrat brut toxique dilué de la souche So.

Table 1 - Effect of preventive applications of strain So filtrates on the reduction of leaf lesion by

D. teres strain Rs.

- Essai effectué en serre: Lumière: 12h/j. T^: 15-18*C, avec 4 répétitions de 10 plantes réparties

en pots en polychlorure de vinyl. Observations effectuées 15j après la dernière application de R3.

Contamination artificielle: 10° fragments/ml.

- La sévérité de l'attaque est fondée sur la moyenne des notations réalisées sur la 2ème feuille

d'après une échelle de notation de 0 à 9.

- Les données sont transformées en arc sinus (90)!

- (*) Les valeurs accompagnées de la même lettre ne sont pas significativement différentes au

seuil de 5% (Test de Newman - Keuls).

variabilité étant due vraisemblablement à la dégradation des toxines durant le

développement de la maladie (Barrault, 1989)

D'après les travaux de Barrault (1989) sur le pouvoir "nécrogène" des filtrats

de différentes souches de D. teres, on peut penser que le filtrat toxique de la souche

Sio de l'hôte peut induire la formation de "substances" dont l'interférence avec une

éventuelle liaison toxines-récepteur(s) membranaire(s) pourrait aboutir à l'absence de

Source : MNHN, Paris

HELMINTHOSPORIOSE DE L'ORGE 237

réponse de l'hôte vis-à-vis du complexe toxique du pathogène. On peut envisager

également que ces substances puissent agir directement sur le complexe toxique de R3,

en le détoxifiant.

Nous avons montré que l'emploi d'une souche hypoagressive ou du filtrat toxi-

que provenant de celle-ci réduit significativement la sévérité de la maladie sur le limbe

foliaire.

La méthode de lutte biologique par application d'antagonistes fongiques et/ou

bactériens et/ou de souches hypoagressives doit être prise en compte dans une сотро-

sante de lutte intégrée. Elle devrait pouvoir judicieusement compléter l'action d'une lut-

te chimique, alors plus modérée, et de façons culturales idoines, susceptibles de

réduire la pression d'inoculum du pathogène sans gêner (ou mieux exacerber) le

développement des antagonistes et/ou des souches hypoagressives appliquées.

BIBLIOGRAPHIE

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régissant le contrôle biologique des agents phytopathologiques Cryptogamie, Mycol. 12:

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graminus Sacc. par souches peu agressives du même parasite. Ann. Phytopathol. 6:

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Source : MNHN. Paris

Cryptogamie, Mycol, 1993, 14 (3): 239 239

ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE

MOSER M. & JULICH W., unter yon FURRER-ZIOGAS C., 1993 - Farbatlas der

Basidiomyceten. Colour Atlas of Basiomycetes, 11. Stuttgart, Gustav Fischer

Verlag, 13 diagnoses de genres, 60 pl. phot. col. ISBN 3-437-30733-9. ISSN

0177-9508.

Toujours selon les critères de présentation qui lui sont propres, l'Atlas en cou-

leurs des Basidiomycètes poursuit sa publication commencée en 1985. Dans cette

onzième livraison sont proposées, en allemand mais avec traduction en anglais,

français et italien, les diagnoses des genres de Tricholomatales et Agaricales:

Mniopetalum, Nyctalis, Panellus, Phaeocollybia, Pholiotina, Pluteus, Porpoloma,

Psathyrella, Resupinatus, Rickenella, Rozites, Strobilurus et Tricholomopsis.

On y trouve par ailleurs la reproduction photographique en couleurs de

basidiocarpes d'espèces appartenant aux genres précédents aussi bien que choisies par-

mi d'autres tels que Marasmius, Mycena, Phyllotus, Russula et Tulostoma.

Les photographies, pour la plupart, restituent fidèlement les caractéristiques

des basidiocarpes dont des spécimens jeunes ou en coupe sont joints aux exemplaires

développés. Elles seront donc d'une certaine utilité pour les identifications qui devront

évidemment être précisées à l'aide de la description des espèces. Enfin, des index

récapitulatifs permettent d'estimer l'importance déjà atteinte pat cet Atlas.

J. Perreau

Source : MNHN, Paris

Commission paritaire 16-1-1986.- N* 58611 - Dépôt légal 3° trimestre 1993 Imprimerie Е. Paillart

Sortie des presses le 30 septembre 1993 - Imprimé en France

Éditeur : A.D.A.C. (Association des Amis des Cryptogames)

Président : R. Baudoin ; Secrétaire : D. Lamy

Trésorier : J. Dupont ; Directeur de la publication : H. Causse

Source : MNHN, Paris

CRYPTOGAMIE

Diffusion de CRYPTOGAMIE

LE PÉRIODIQUE FRANÇAIS

CONSACRÉ A LA CRYPTOGAMIE

CRYPTOGAMIE est un périodique édité

par l'A.D.A.C. (Association des Amis des

Cryptogames), dont le siège est au Labo-

ratoire de Cryptogamie du Muséum Na-

tional d'Histoire Naturelle. Les cher-

cheurs de tous pays y publient leurs

travaux en français, allemand, anglais, es-

pagnol et italien, aprés accord des

Comités de Lecture constitués de

spécialistes de réputation internationale.

CRYPTOGAMIE propose trois sections:

Cryptogamie, Algologie

Cryptogamie, Mycologie

Cryptogamie, Bryologie-Lichénologie

Chaque section publie 4 numéros par an

(rage: 450 exemplaires).

THE FRENCH JOURNAL

DEVOTED TO CRYPTOGAMY

CRYPTOGAMIE is а periodical

published by A.D.A.C. (Association des

Amis des Cryptogames), settled at Labo-

ratoire de Cryptogamie, Muséum National

d'Histoire Naturelle. Research workers

from the whole world publish their papers

in French, German, English, Spanish and

Italian, after acceptation by a selection

commettee that comprises experts of inter-

national renown.

CRYPTOGAMIE offers to its subscribers

three sections:

Cryptogamie, Algologie

Cryptogamie, Mycologié

Cryptogamie, Bryologie-Lichénologie

Each section publishes 4 numbers a year

(printing: 450 ex.).

El Europe frique O Australie

Amérique Asie

Ма А m

Origine des 453 articles publiés de 1986 à 1991

E Europe

Amérique

Répartition des articles publiés de 1986 à 1991 selon la langue

Francais EB Espagnol italien

B angas C Allemand

Source : MNHN, Paris

SOMMAIRE

C. DUPRÉ, G. CHEVALIER, M. PALENZONA ct E. BIOCCA -

Caractérisation des mycorhizes de différents Tuber par l'étude du du

polymorphisme enzymatique

G. HEREDIA - Mycoflora associated with green leaves and leaf litter of

Quercus germana, Quercus sartorit and Liquidambar styraciflua in a

Mexican cloud forest...

H.A.H. HASAN and S.A. OMAR - Selective effect of organophosphate

insecticides on ав activities and aflatoxins biosynthesis. D two.

Aspergillus spp. ..

J. BOIDIN, P. LANQUETIN et G. GILLES - Contribution à la connaissance

des Phanerochaetoidea de France (Basidiomycotina) .

SK. HEMIDA, MMXK. BAGY and AM. KHALLIL = Union of.

hydrocarbons by fungi ....

F. KOTLABA and Z. POUZAR - a QE SAR nov. a new

polypore of the Polyporus palustris group ..

K. PRZYBYL and M. MORELET - poor diese die

Ophiostoma piceae and O. querci, and among O. querci isolates „s

M. MOSTAFA, G. BARRAULT et L. ALBERTINI - Essai de lutte biologique

contre I'helminthosporiose de l'orge par l'utilisation d'une souche peu.

agressive de Drechslera teres..

Analyse bibliographique .......

Cryptogamie, Mycol. 1993, 14 (3): 163-240.

215

219

229