CRXPTOGAMIE

Mycologie

ANCIENNE REVUE DE MYCOLOGIE

Fondée par R. Heim en 1936

Directeur scientifique: Mme J. Nicot

Secrétaire de Rédaction: M. Bruno Dennetière

Editeur: A.D.A.C. - 12 rue Buffon F-75005 Paris

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Écologie et Phytopathologie: G. Durrieu (Laboratoire Botanique et Forestier, 39 Allées Jules

Guesdes, F-31062 Toulouse Cedex) - Systématique: P. Joly (Laboratoire de Cryptogamie, Muséum

National d'Histoire Naturelle, 12 rue Buffon, F-75005 Paris) - Physiologie: G. Manachère

(Laboratoire de Mycologie, Université de Lyon I. 43 bd du 11 Novembre 1918, F-69622

Villeurbanne Cedex) - Cytologie: D. Zickler (Laboratoire de Génétique, Université Paris Sud, Centre

d'Orsay, Bât 400, F-91405 Orsay) - Autres spécialités: M.F. Roquebert (Laboratoire de

Cryptogamie, Muséum National d'Histoire Naturelle, 12 rue Buffon, F-75005 Paris)

COMITÉ DE LECTURE

J. Boidin (Lyon), J. Chevaugeon (Orsay), J. Fayret (Toulouse), W. Gams (Baam), G.L. Hennebert

(Louvain-la-Neuve), Ch. Montant (Toulouse), CI. Moreau (Brest), D.N. Pegler (Kew), B. Sutton

(Kew), G. Turian (Genève).

MANUSCRITS

Les manuscrits doivent étre adressés directement à un membre du Bureau de Rédaction, choisi pour

sa spécialité. Le Bureau peut demander l'avis d’un lecteur même s'il n'appartient pas au Comité de

Lecture. Bien qu'étant une revue de langue française, les articles rédigés en anglais, allemand, italien

et espagnol sont acceptés. Les disquettes de micro-ordinateurs (IBM, IBM compatible et MacIntosh)

sont vivement souhaitées. Les recommandations aux auteurs sont publiées dans le fascicule 1 de

chaque tome. Les auteurs recevront 25 tirés-à-part gratuits; les exemplaires supplémentaires seront à

leur charge

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CRYPTOGAMIE comprend trois sections: Algologie, Bryologie-Lichénologie, Mycologie.

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CRYPTOGAMIE, Mycologie est indexé par Biological Abstracts, Current Contents, Geo Abstracts,

GEOBASE, Publications bibliographiques du CNRS (Pascal)

Source : MNHN, Paris

CRVPTOGAMIE

MVCOLOGIE

TOME 15 FASCICULE 3 1994

CONTENTS

G. MORENO, F. ESTEVE-RAVENTÓS y A. ORTEGA - Mycological study in

the Natural Park of the Alcornocales (Andalucía, Spain). I. Agaricales. .

153

M.H. MOUBASHER and M. EMAN MOSTAFA - Nutritional and

environmental factors affecting glycerol production by Aspergillus wentii

IMI 023010. nes 175

L. KHABAR, L. NAJIM, M.C. JANEX-FAVRE et A. PARGUEX-LEDUC - The

ascocarpe of Terfezia leonis Tul. (Discomycetes, Tuberales) ............- 187

D.B. OLUFOLAJI - Cultural condition for growth and sporulation of

Colletotrichum falcatum (sugarcane red-rot fungus) MET 207

Bibliography nomm at RP U 219

Bibliothèque Centrale Muséum

| BIBL, DU

\ PARIS

\ 3 3001 00226857 0

Source : MNHN, Paris

Source : MNHN. Paris

Cryptogamie, Mycol. 1994, 15 (3): 153-174. 153

ESTUDIOS MICOLÓGICOS EN EL PARQUE NATURAL

DE LOS ALCORNOCALES (ANDALUCIA, ESPANA).

I. AGARICALES

G. MORENO’, F. ESTEVE-RAVENTÓS' y A. ORTEGA?

' Dpto. Biología Vegetal, Univ. Alcalá de Henares,

28871 Alcalá de Henares, Madrid.

* Dpto. Biología Vegetal, Facultad de Ciencias Biológicas,

Univ. Granada, Granada.

RESUMEN - Se aportan los primeros resultados de los hongos Agaricales s. lato, mayormente

recogidos en bosques de Quercus suber en el Parque Natural de los Alcomocales (Andalucía,

España). Resaltamos los siguientes táxones raros o nuevos para España peninsular: Gymnopilus

suberis, Hebeloma danicum, H. mesophaeum var. pallidum, H. sacchariolens var. pallidoluctuosum,

Lactarius luteolus, Pluteus plautus, Russula bresadoliana, R. fragrantissima, R. graveolens var.

megacantha, R. graveolens Var. purpurata.

Se realiza un estudio al M.E.B. de la ornamentación esporal de los táxones más interesantes.

ABSTRACT - This work includes the first results about the Agaricales s. laro collected mostly in

Quercus suber forest in the Natural Park of the Alcornocales (Andalucía, Spain) The most

outstanding taxa are: Hebeloma danicum, H. sacchariolens var. pallidoluctuosum, H. mesophaeum

var. pallidum, H. sacchariolens var, pallidoluctuosum, Lactarius luteolus, Pluteus plautus, Russula

bresadoliana, R. fragrantissima, R. graveolens var. megacantha, R. graveolens var. purpurata.

‘A microscopical study under the S.E.M. of the spore ornamentation of the most interesting

taxa is given.

KEY WORDS - Agaricales s. lato, taxonomy, chorology, ecology, Natural Park of the Alcornocales,

Cadiz, Spain.

INTRODUCCION

En esta aportación, encuadrada dentro del Proyecto de Investigación PB90-

0986, referente a los hongos del Parque Natural de los Alcornocales (Andalucía) se han

estudiado principalmente las recolecciones de Agaricales s. lato recogidas en el otoño

de 1992.

Este trabajo lo consideramos complementario a los realizados en Extremadura

por Moreno & Esteve-Raventós (1988) y Moreno et al. (1990), y tiene como misión

catalogar y describir los hongos mediterráneos que fructifican en bosque o matorral

Source : MNHN, Paris

154

G. MORENO, F. ESTEVE-RAVENTOS v A. ORTEGA

Source : MNHN, Paris

AGARICALES EN ANDALUCÍA, ESPANA 155

mediterráneo, principalmente de Quercus ilex subsp. ballota, Q. suber, Alnus glutinosa,

Arbutus unedo y Cistus sps.

Estos estudios taxonómicos los podemos comparar a corto plazo con los

obtenidos en el Parque Natural de Monfragüe y los que estamos realizando actualmente

en Villuercas (Cáceres). Sus resultados contribuirán a conocer mejor la micoflora

mediterránea espanola (ecología, corología y fenología) y su relación con el medio

ambiente.

En general el material estudiado fructifica en áreas mediterráneas españolas, y

aparece poco citado en la bibliografía. Es difícil precisar a veces su corología por las

diferentes confusiones taxonómicas existentes, como sucede por ejemplo en algunos

táxones del género Russula.

El material objeto de estudio se encuentra depositado en los herbarios del

Departamento de Biología Vegetal de la Universidad de Alcalá de Henares (AH) y en el

Dpto. de Biología Vegetal de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Granada

(GDAC).

Las preparaciones para su estudio microscópico han sido realizadas con

hidróxido amónico al 10% o rojo congo amoniacal. Las microfotografías al

microscopio óptico han sido realizadas en un fotomicroscopio Nikon modelo Optiphot,

con sistema de fotografía automático incorporado, utilizando generalmente contraste de

fases. Las fotografías al microscopio electrónico de barrido fueron realizadas con un

microscopio Zeiss modelo 950.

CATÁLOGO MICOLÓGICO

Entoloma bloxamii (Berk. & Broome) Sacc., Syll. Fung. 5: 684. 1887.

= E. madidum (Fr.) Gillet, Hymènomycetes: 399. 1874.

Gregario y poco frecuente en pradera de alcornocal (Quercus suber), Crta. Alcalá de los

Gazules a Pto. Galis (Cádiz), 14.XI.1992, leg. L.Alcoba, A. Ortega & G. Moreno, AH 16599.

Observaciones: Especie bien caracterizada por su porte medio a grande con

tonos azulados en el sombrero y pie. Aparece descrita e iconografiada recientemente en

la obra de Noordeloos (1992).

En la Península Ibérica se conoce del norte (desde Galicia a Cataluña), siendo

más esporádico en Andalucía (Ortega, 1991). Aparece también citado de las Islas

Canarias.

Flammulaster carpophilus (Fr.) Earle, Bull. New York. Bot. Gard. 5: 435. 1909.

Gregario y frecuente en humus de alcornocal (Quercus suber), Crta. de Los Barrios a Alcalá

de los Gazules (Cádiz), 12.X1.1992, leg. L Alcoba, A. Ortega & G. Moreno, AH 16600.

Fig. 1. - Gymnopilus suberis (Maire) Singer, (AH 16566). a-c: queilocistidios. d: basidios fibulados.

e-i: esporas y detalle de la ornamentación en distintas etapas de maduración esporal.

Source : MNHN. Paris

156 G. MORENO, F. ESTEVE-RAVENTOS y A. ORTEGA

Observaciones: Especie humícola muy frecuente en áreas mediterráneas.

Seguimos el concepto de Vellinga (1986), quien admite diversas variedades segün la

morfología esporal y tipos de queilocistidios. Nuestras recolecciones se corresponden

con la variedad carpophilus.

Poco citado en la bibliografía espanola, posiblemente por su pequefio tamano.

Gymnopilus suberis (Maire) Singer, Lilloa 22: 561 (1949) 1951. (Fig.1)

Fasciculado a aislado y poco frecuente, en tronco de Quercus suber, Cra. de Los Barrios a

Alcalá de los Gazules (Cádiz), 12.X1.1992, leg. L. Alcoba, A. Ortega y G. Moreno, AH 16566.

Observaciones: Las colecciones estudiadas son muy variables en tamaño;

aparecen carpóforos pequeños de 3-4 cm de diám., junto con otros mayores de 5-10 cm

de diám., presentan el sombrero con pequeñas o grandes escamas oscuras y un anillo

cortiniforme en la parte superior del pie. Estas variaciones en el tamaño del

basidiocarpo, escamas y coloración en el sombrero han sido también descritas por

Malengon & Bertault (1970) del norte de Africa.

La arista presenta queilocistidios capitados caracteristicos, las esporas son

elipsoidales a amigdaliformes, de 7-8 x 4-4,5 pm, de color ferruginoso con

ornamentación esporal verrugosa. Al M.E.B. la ornamentación cubre como una túnica

la espora, y ésta se va rompiendo, quedando verrugas planas a redondeadas segün el

estadío de maduración esporal (Fig 1 f-i). Los basidios son tetraspóricos y fibulados.

Robich (1989), aporta una excelente fotografía a color y una descripción

personal de esta especie, recogida en rama de alcornoque en Cataluña.

En España se conoce de Cataluña (Maire, 1937), Extremadura (Moreno & al.,

1982) y Andalucía (Ortega & Buendia, 1986).

Hebeloma danicum Gröger, Z. Mykol. 53:53.1987. (Fig.2)

Rara en humus de Alnus glutinosa, Cria. de Alcalá de los Gazules a Pto. de Galis (Cádiz),

14.X1.1992, leg. L. Alcoba, A. Ortega & G. Moreno, AH 16598.

Fig. 2. - Hebeloma danicum Gröger, (AH 16598). a-b: queilocistidios. c: esporas.

Source : MNHN, Paris

AGARICALES EN ANDALUCÍA, ESPANA 157

Observaciones: Entre los táxones radicantes pertenecientes a la sección

Denudata (Fr.) Sacc., Hebeloma danicum se caracteriza por sus esporas con ápice

truncado y perisporio algo suelto, así como por sus cistidios cilíndricos, de pequeño

tamaño. El biótipo radicante y su ecología parecen ser los únicos caracteres netos que

permiten su separación de H. anthracophilum. Aunque no existen citas previas de H.

danicum como tal en la Península Ibérica, podría pensarse que este taxon ha podido ser

confundido con H. birrus, muy próximo, si no coespecífico, que ha sido registrado en

alguna ocasión (e.g. Guinea, 1929), en la Península Ibérica.

Hebeloma mesophaeum var. lacteum Vesterh., Nordic J. Bot. 9: 299.1989. (Fig.3)

=H. pallidum Malengon, Flore des champignons superieurs du Maroc 1: 452. 1970 non

P. Kumm., Führ. Pilzk.: 80.1871.

- H. malengonii Bellá & Lanzoni, Centr. Stud. Fl. Mediterranea 7: 5. 1989.

En humus de Quercus suber, Cra. de Los Barrios a Facinas (Cádiz), 15-XI-1984, leg. A.

Ortega & A. G. Buendía, GDAC 24471. Frecuente en humus de Quercus suber y Q. canariensis,

Cra. de Pto. Galis a Jimena de la Frontera (Cádiz), 13-Xl-1992, leg. L.Alcoba, A. Ortega £ G

Moreno, AH 16597

Observaciones: Nuestro material se corresponde con la descripción de

Malengon & Bertault (1970) y Bellá & Lanzoni (1989). Por razones nomenclaturales, el

epíteto pallidum no puede ser utilizado para este taxon, el cual, por otra parte, no

presenta diferencias a nivel microscópico con Hebeloma mesophaeum. El material tipo

de Malencon ha sido estudiado por el especialista danés Vesterholt (1989), quien lo ha

propuesto con el nuevo epíteto lacteum a nivel de variedad. A pesar de no estar de

acuerdo con la elección de este epíteto (colores blancos lácteos no son los más

frecuentes, sino tonos ocres pálidos en el centro del sombrero y márgenes de color

blanquecino), el tratamiento a nivel de variedad obliga al uso del mismo. H.

mesophaeum var. lacteum parece un taxon ampliamente difundido en los bosques

caducifolios termófilos de la cuenca mediterránea (ecótipo), siendo el color del

sombrero el carácter que sostiene su rango de variedad. La distribución, al estar

presente de modo esporádico en el norte de Europa, no parece apoyar su tratamiento a

nivel de subespecie, al menos por el momento.

Una fotografía ilustrativa de este taxon puede consultarse en Ortega (1992:

182).

Hebeloma sacchariolens var. pallidoluctuosum (Gróger & Zschiesch.) Quadr.,

Mycotaxon 30: 309. 1987. (Fig.4)

= H. pallidoluctuosum Gréger & Zschiesch., Wiss. Z. Fiedrich-Schiller-Univ. Jena,

Math.-Naturwiss. Reihe. 33: 815. 1984.

= H. latifolium Gróger & Zschiesch., Z. Mykol 47(2): 198. 1981, non H. latifolium P.

Karst., 1898.

=H. sacchariolens s. Bres., Icon. Mycol. 15, tab. 719. 1930.

Frecuente de modo gregario a fasciculado en humus de Quercus suber, Ubrique (Cádiz),

10.XIL.1990. leg. A. Ortega & F. Esteve-Raventós, GDAC 36191. En Quercus suber, Crta. de Los

Barrios a Alcalá de los Gazules (Cádiz), 12.X1.1992, leg. L. Alcoba, A. Ortega £ G. Moreno, AH.

16596.

Source : MNHN, Paris

158 G. MORENO, F. ESTEVE-RAVENTOS v A. ORTEGA

Fig. 3. - Hebeloma mesophaeum var. lacteum Vesterh., (AH 16597). a-f: queilocistidios.g-h: esporas.

Observaciones: Las diferencias de orden macroscópico entre Hebeloma

sacchariolens y H. pallidoluctuosum no parecen ser consistentes, aunque las

dimensiones de los queilocistidios sí permiten separar ambos táxones, el primero

presentando largos pelos capitados de hasta 90 um, y el segundo pelos más o menos

Source : MNHN, Paris

AGARICALES EN ANDALUCÍA, ESPANA 159

Fig. 4. - Hebeloma sacchariolens var. pallidoluctuosum (Gróger 8: Zschiesch.) Quadr., (AH 16596).

a-e: queilocistidios. f-h: esporas.

lageniformes de hasta 50 um . Según Quadraccia (1987), la variedad pallidoluctuosum

tiene un carácter menos higrófilo, siendo frecuente en Italia en los bosques caducifolios

meso y termófilos. En la Península Ibérica esta variedad no había sido registrada hasta

la fecha, pero las numerosas citas de H. sacchariolens representan sin duda en ciertos

casos este taxon. No obstante, Vesterholt (1994) aún reconoce la autonomía de

Hebeloma pallidoluctuosum, basándose en caracteres del perisporio esporal.

Source - MNHN, Paris

160 G. MORENO, F. ESTEVE-RAVENTOS v A. ORTEGA

Hygrophorus discoxanthus (Fr.) Rea in A.H. $m. & Rea, Trans. Brit. Mycol. Soc. 3:

45. 1907.

=H. chrysaspis Métrod, Rev. Mycol. 3: 153. 1938.

Rara en humus de Quercus suber, Cra. de Los Barrios a Alcalá de los Gazules (Cádiz),

12.X1.1992, leg. L. Alcoba, A. Ortega & G. Moreno, AH 16602.

Observaciones: Se trata de una especie a menudo confundida y diversamente

interpretada, sobre todo con los táxones Hygrophorus cossus e H. eburneus. No

obstante, un carácter muy típico de esta especie es el progresivo color pardo-anaranjado

que se manifiesta claramente en herbario, así como las terminaciones claviformes de

las hifas de la ixocutis del píleo. Comparte una ecología similar a la de H. eburneus, de

preferencia en bosques de Fagaceae, donde establece ectomicorrizas tanto en suelos

calcáreos como silíceos. En la Penísula Ibérica ha sido citada de Andalucia, Cataluña,

País Vasco y Madrid.

Lactarius luteolus Peck, Bull. Torrey Bot. Club 23: 412. 1896. (Fig.5)

= L. kuehnerianus Malençon, Bull. Soc. Linn. Lyon (núm. spèc.) 43: 245 1974.

Muy rara en humus de Quercus suber, Crta. de Los Barrios a Facinas (Cádiz), 2.XI1.1988,

leg. A. Ortega, GDAC 31383

Observaciones: Se caracteriza por el color blanquecino a grisáceo de su cuerpo

fructifero, porte macizo, látex abundante de color blanquecino que se vuelve pardo

manchando las láminas y por fructificar en alcornocales. La espora al M.E.B. posee una

ornamentación formada por verrugas cónicas, que a veces se unen en crestas e incluso

forman algún retículo, pero nunca una red completa.

Malengon (1974), lo propone como una especie nueva para la ciencia, con el

nombre de Lactarius kuehnerianus, e indica su presencia en el norte de Africa (Argelia

y Marruecos) y España (Barcelona). Una excelente fotografía y descripción ha sido

realizada por Marchand (1980).

En España aparece muy poco citada (sólo Cataluña y Andalucía), siendo una

especie de aparición rara y en escaso número de fructificaciones.

Lactarius quietus Fr., Epicr.: 343. 1838.

Rara en humus de Quercus suber, Crta. de Ubrique al Pto. de Galis (Cadiz), 12.X1.1989, leg.

A. Ortega & R. Galén, GDAC 36186. En humus de Quercus suber, Crta. de Alcalá de los Gazules a

Pto. Galis (Cádiz), 14.X1.1992, leg. L.Alcoba, A. Ortega & G. Moreno, AH 16603

Observaciones: Lactarius quietus se caracteriza por las coloraciones pardo

rojizas en todo el cuerpo fructífero., el sombrero débilmente zonado, látex abundante de

color blanquecino y olor característico.

Especie poco conocida en áreas mediterráneas del sur de España, pero

abundante en el norte de la Península.

Pluteus nanus (Pers. : Fr.) P. Kumm., Führ. Pilzk.: 98. 1871.

Aislado en restos leñosos (rama) de Quercus suber, Crta. de Los Barrios a Alcalá de los

Gazules (Cadiz), 12.X1.1992, leg. L. Alcoba,A. Ortega & G. Moreno, AH 16605.

Source : MNHN, Paris

AGARICALES EN ANDALUCIA, ESPANA 161

Fig. 5. - Lactarius luteolus Peck, (GDAC 31383). a-b: ornamentación esporal.

Observaciones: Especie caracterizada por su pequeño porte, pie blanquecino

sin caulocistidios y pileipellis formada por células claviformes con pigmento vacuolar

pardo y otras lageniformes más escasas. Seguimos para esta especie el concepto amplio

de Vellinga (1990).

Especie frecuente pero que aparece poco citada (solo Cataluña y Navarra),

posiblemente por su pequeño tamaño.

Pluteus plautus (Weinm.) Gillet, Hyménomycetes : 394. 1874. (Fig.6)

Dos ejemplares en tronco de alcornoque (Quercus suber), Crta. de Alcalá de los Gazules a

Pto. Galis (Cádiz), 14.X1.1992, leg. L. Alcoba, A. Ortega & G. Moreno, AH 16595.

Observaciones: Nuestros ejemplares poseen un sombrero de 5 cm de diám., de

color pardo oscuro, con venas y pequeños gránulos a la lupa en el centro del sombrero.

Las láminas son libres y rosadas. El pie es cilíndrico, de 4-4,5 x 0,5 cm, híspido y

estriado longitudinalmente, y muestra un color anaranjado pajizo. Pileipellis en

tricodermis, formada por células cilíndricas con contenido vacuolar pardo. Esporas

ovales de 6,5-8 x 5,5-6 um. Basidios tetraspóricos. Queilocistidios volviendo la arista

estéril, claviformes a lageniformes. Pleurocistidios de morfología muy variable,

fusiformes, lageniformes, a veces con un apéndice apical.

Vellinga (1990), considera que Pluteus plautus es una especie muy variable y

dificil de diferenciar de otras próximas, razón por la que propone una larga lista de

sinónimos para este taxon.

Como Pluteus plautus es la primera vez que se menciona esta especie en

Espafia.

Source : MNHN, Paris

G. MORENO, F. ESTEVE-RAVENTOS v A. ORTEGA

162

- Pluteus plautus (Weinm.) Gillet, (AH. 16595). a: queilocistidios. b-e: pleurocistidios. f:

Fig. 6.

esporas.

Source : MNHN. Paris

AGARICALES EN ANDALUCIA, ESPANA 163

Russula amoenicolor Romagn., Bull. Soc. Linn. Lvon 31: 172. 1962.

Rara en humus de Quercus suber, Crta. de Los Barrios a Facinas (Cádiz), 10.X1.1989, leg.

A. Ortega & R. Galán, GDAC 32294. En humus de Quercus suber, Crta. de Alcalá de los Gazules a

Pto. Galis (Cádiz), 14.XI.1992, leg. L. Alcoba, A. Ortega & G. Moreno, AH 16606.

Observaciones: Nuestra recolección coincide con la descripción de Romagnesi

(1967); el sombrero posee coloraciones violáceas, verdosas y amarillentas mezcladas.

La cutícula se resquebraja con facilidad y aparece la carne de color blanquecino.

Esporada crema. Pileipellis mostrando pelos cistidiformes fusiformes a lageniformes,

sin células basales globosas a subglobosas. Esporas reticuladas, con ornamentación bien

marcada. Cistidios faciales muy abundantes, similares a los pelos epicuticulares.

Russula bresadoliana Singer, Beih. Bot. Centralbl.49: 265.1932. (Fig.7)

. maculata var. bresadoliana (Singer) Romagn., Les Russules: 875. 1967.

. globispora (J. Blum) Bon, s. auct.

Poco frecuente en humus de Quercus suber, Crta. de Los Barros a Facinas (Cádiz),

10.X1.1989, leg. A. Ortega & R. Galán, GDAC 32294. En humus de Quercus suber, Cna. de Los

Barrios a Alcalá de los Gazules (Cadiz), 12.X1.1992, leg. L. Alcoba , A. Ortega & G. Moreno, AH

16594. En humus de Quercus suber y Q. canariensis, Cria. de Pto. Galis a Jimena de la Frontera

(Cádiz), 13.X1.1992, leg. L. Alcoba, A. Ortega & G. Moreno, AH 16592 y 16593.

Observaciones: Nuestras recolecciones se caracterizan por su sombrero de

dimensiones medias a grandes (3-10 cm de diám.), con coloraciones variables, rojizas

amarillentas a violáceas o púrpuras . Láminas apretadas con lamélulas, de color crema a

amarillo ocráceo. Esporada ocre amarillenta. Pie de longitud variable, blanquecino, que

toma coloraciones anaranjado amarillentas en la base y con la manipulación. Carne

blanquecina de sabor dulce. Pileipellis con abundantes dermatocistidios, de 6-8 um de

anchura, septados, que reaccionan con SV e hifas cilindricas, hialinas, flexuosas, de 2-3

um de ancho. Esporas ovales a subglobosas, muy grandes para el género, variando

según la maduracion del carpóforo, de (9-)10-13 x 8-11 pm, incluyendo la

ornamentación, que alcanza hasta 1 um de longitud. La ornamentación es bien visible al

microscopio óptico y se confirma al M.E.B; está formada por espinas o verrugas

cónicas, que a veces se unen en pequeñas crestas irregulares, con placa suprahilar bien

marcada y amiloide.

Nuestros ejemplares coinciden con la descripción de Romagnesi (1967) para

Russula maculata var. bresadoliana; sin embargo, preferimos aceptar en este trabajo el

rango de especie y no de variedad, por el sabor dulce de la carne y el gran tamaño

esporal.

Es muy posible que Russula globispora, al principio considerada por Blum

(1962) como variedad de R. maculata, sea sinónima de R. bresadoliana, como ya

supone Romagnesi (loc. cit.).

Russula decipiens (Singer) Kühner & Romagn. ex Svrcek, Ceská Mykol. 21: 228

1967.

Rara en humus de Quercus suber, Crta. de Jimena de la Frontera al Pto. de

Galis (Cádiz), 11.X1.1989, leg. A. Ortega € R. Galán, GDAC 32287. En humus de

Source : MNHN, Paris

164 G. MORENO, F. ESTEVE-RAVENTOS v A. ORTEGA

Fig. 7. - Russula bresadoliana Singer, (AH 16592). a-d: ornamentación esporal.

Quercus suber, Crta. de Alcalá de Los Gazules a Pto. Galis (Cádiz), 14.X1.1992, leg. L.

Alcoba, A. Ortega & G. Moreno, AH 16607.

Observaciones: Russula decipiens pertenece a la sección Urentinae (Maire) Jul.

Scháff., y se caracteriza por su sombrero de color rojizo con el centro crema o

amarillento, pie blanquecino, cilíndrico, y came picante. La pileipellis posee

abundantes dermatocistidios. Esporas ovales de 9-10 x 7,5-8,5 jm, con verrugas,

crestas y finas líneas de conexión.

Source : MNHN, Paris

AGARICALES EN ANDALUCIA, ESPANA 165

Russula emetica var. silvestris Singer, Beih. Bot. Centralbl. 49: 305. 1932.

Poco frecuente en humus de Quercus suber, Crta. de Los Barrios a Alcalá de los Gazules

(Cádiz), 12.X1.1992, leg. L. Alcoba, A. Ortega & G. Moreno, AH 16008. /bidem, Crta. de Pto. Galis a

Jimena de la Frontera (Cádiz), 13.X1.1992, AH 16609.

Observaciones: Presenta pequeños cuerpos fructíferos, frágiles, con sombrero

de 2-5 cm de diám., pie blanco sin tonos rosados, muy frágil, láminas blancas.

Esporada blanca. Carne blanca que en la desecación amarillea ligeramente, de sabor

picante. Pileipellis con abundantes pileocistidios, tabicados, de ápice obtuso, x 7-8 um

de ancho. Esporas ovales de 7-9 x 6-7 um, espinoso-verrugosas, con finas líneas de

conexión que le confieren un aspecto subreticulado, con placa suprahilar bien marcada.

Russula emetica var. silvestris es próxima a R. luteotacta Rea, pero esta última

toma coloraciones amarillentas sobre todo en el pie al rozamiento y las esporas poseen

verrugas sin apenas líneas de conexión.

Russula mairei Singer, es una especie muy parecida macroscópicamente y

aparece en la bibliografía ligada exclusivamente a bosques de Fagus; sin embargo, las

diferencias microscópicas con este taxon son muy subjetivas.

Russula foetens Pers. : Fr., Epicr.: 359. 1838.

Poco frecuente en humus de Quercus suber, Crta. del Pto. de Galis a Jimena de la Frontera

(Cádiz), 16.X1.1986, leg. A. Ortega & A. G. Buendía, GDAC 38073. En humus de Quercus suber,

Cra. de Los Barrios a Alcalá de los Gazules (Cádiz), 12.X1.1992, leg. L. Alcoba, A. Ortega & G.

Moreno, AH 16610.

Observaciones: Nuestra recolección coincide con la descripción de Romagnesi

(1967), su carne no reacciona con Na OH 10% y KOH 10%. Las esporas son muy

espinosas, alcanzando las espinas hasta 1 um de longitud.

Russula fragilis (Pers. : Fr. ) Fr., Epicr.: 359. 1838.

En humus de Quercus suber, Cortes de la Frontera (Málaga), 15.X1.1987, leg. A. Ortega,

GDAC 32300. Rara en humus de Quercus suber y Alnus glutinosa, Crta. de Alcalá de los Gazules a

Pto. Galis (Cádiz), 14.X1.1992, leg. L. Alcoba, A. Ortega & G. Moreno, AH 16611

Observaciones: Nuestra recolección coincide con la descripción de Romagnesi

(1967), y se reconoce fácilmente por su pequeño porte, sombrero con coloraciones

variadas (vinosas, púrpuras, verdosas, con el centro mas oscuro), láminas blanquecinas,

sabor muy picante, pileipellis con pileocistidios tabicados abundantes y esporas con

retículo completo.

Russula fragrantissima Romagn., Les Russules : 350. 1967. (Fig. 8)

Rara en humus de Quercus suber y Q. canariensis, Crta, de Pto. Galis a Jimena de la

Frontera (Cádiz), 13.X1.1992, leg. L. Alcoba, A. Ortega & G. Moreno, AH 16584

Observaciones: Nuestra recolección presenta sombreros de color ocráceo a

pardo oscuro, con margen acanalado. Láminas apretadas de color crema con máculas

pardo rojizas y arista parda, que en la desecación se vuelven pardas. Esporada crema.

Source : MNHN, Paris

166 G. MORENO, F. ESTEVE-RAVENTOS v A. ORTEGA

Fig. 8.- Russula fragrantissima Romagn., (AH 16584). a-d: ornamentación esporal.

Pie blanquecino con máculas pardas, en la desecación toma coloraciones pardas

inferiormente. Carne blanca de sabor débilmente picante, sobre todo en las láminas.

Pileipellis en tricodermis con pileocistidios de morfología variable, cilíndricos a

fusiformes que reaccionan de forma inconstante con SV. Espora ovales, de 8-10 x 6-8

um, con ornamentación formada por verrugas cortas con líneas de conexión que a veces.

forman un retículo completo.

Descripciones selectas de esta especie podemos encontarlas en las publicaciones

de Romagnesi (1967) y Shaffer (1972).

Source : MNHN, Paris

AGARICALES EN ANDALUCIA, ESPANA 167

Una especie próxima que ha ocasionado problemas nomenclaturales es Russula

grata Britzelm. (= R. laurocerasi Melzer; R. foetens var. laurocerasi (Melzer) Singer y

posiblemente R. fragrans Romagn.); no obstante, se diferencia claramente por su

ornamentación esporal con alas o crestas muy marcadas, de hasta 2 um de alto. Estas

conclusiones han sido aceptadas por Knudsen & Stordal (1992).

Fig. 9. - Russula graveolens var. megacantha (Romagn. ex ) Bon, (AH 16591). a-d: ornamentación

esporal.

Source : MNHN, Paris

168 G. MORENO, F. ESTEVE-RAVENTOS y A. ORTEGA

Russula graveolens var. megacantha (Romagn. ex ) Bon, Doc. Mycol. 69: 36. 1987.

(Fig. 9)

Poco frecuente en humus de Quercus suber ssp. ballota, Cria. de Pto. de Galis a Jimena de

la Frontera (Cádiz), 13.X1.1992, leg. L. Alcoba, A. Ortega & G. Moreno, AH 16591

Observaciones: Nuestra recolección es semejante macroscópicamente a la

mostrada por Marchand (1977; lám. 479), que representa Russula graveolens s. stric.;

destacamos los tonos vinosos de la cutícula, púrpura negruzca en el centro. Láminas de

color crema, volviéndose pardas en la madurez o con la desecación. Pie blanquecino,

que se vuelve pardo con la manipulación o en la madurez. La carne con SO4 Fe toma

coloración verde, reacción que caracteriza a la sección Xerampelinae (Sing.) Jul.

Schäff.

La pileipellis en tricodermis, presenta pileocistidios cilindricos escasos y con

reacción débil con SV. Las esporas son ovales, de 10-11 x 7-8 um, con marcadas

espinas de hasta 0,7 um de longitud y placa suprahilar bien neta.

Russula graveolens var. graveolens, presenta esporas con ornamentación menos

marcada, formada por verrugas o pequeñas espinas con escasas líneas de conexión.

Russula graveolens var. purpurata (Crawshay) Killerm., Denkschr. Regensburg Bot.

Ges. 20: 17. 1936. (Fig. 10)

En humus de Quercus suber, Crta. de Los Barrios a Facinas (Cádiz), 14.X11.1990, leg. A.

Onega & F. Esteve-Raventós, GDAC 36189. Rara en humus de Quercus suber y Q. canariensis,

Cra. de Pto. de Galis a Jimena de la Frontera (Cadiz), 13.X1.1992, leg. L. Alcoba, A. Ortega & G.

Moreno, AH 16588.

Observaciones: Nuestra recolección (cuatro carpóforos), coincide con la

descripción de Romagnesi (1967), el sombrero mide 4-6 cm de diám., presenta

coloraciones rojizo púrpuras, y púrpura negruzcas en el centro. El pie es cilíndrico, de

3-4,5 x 1-1,2 cm, de color blanco y débilmente rosado hacia la base. Láminas de color

crema. La carne, láminas y pie toman coloraciones pardas en la madurez y con la

desecación. Olor fuerte a mariscos cocidos. La carne con SO, Fe toma coloración

verdosa característica, Pileipellis en tricodermis, con pileocistidios escasos y poco

coloreados en SV. Esporas ovales, de 9-11 x 7-8 um, con fuertes espinas de hasta 1 um

de longitud, con placa suprahilar bien marcada.

Es posible que Russula graveolens var. purpurata y la var. megacantha sean

simples ecótipos de una especie variable, R. graveolens, pero preferimos separar

nuestras recolecciones hasta que esta suposición sea confirmada.

Russula grisea Fr., Epicr.: 361. 1838. (Fig. 11)

Rara en humus de Quercus suber, Crta. de Los Barrios a Alcalá de los Gazules (Cádiz),

12.X1.1992, leg. L. Alcoba, A. Ortega & G. Moreno, AH 16587.

Observaciones: Nuestra recolección posee el sombrero con coloraciones grises,

azuladas y verdosas, con máculas púrpuras o pardas, el pie blanco y las láminas

blanquecinas que se anastomosan en la unión al pie. La esporada es crema pálido.

Source : MNHN, Paris

AGARICALES EN ANDALUCIA, ESPANA 169

Fig. 10. - Russula graveolens var. purpurata (Crawshay) Killerm., (AH 16588). a-d: ornamentación

esporal.

Carne blanquecina de sabor dulce. En contacto con SO, Fe 10% la carne toma

coloraciones anaranjadas. Pileipellis con pileocistidios cilíndricos a claviformes.

Esporas ovales, de 7,5-9 x 6-7 um, con pequeñas verrugas y pequeñas crestas, sin placa

suprahilar,

Source : MNHN, Paris

170 G. MORENO, F. ESTEVE-RAVENTOS y A. ORTEGA

Fig. 11. - Russula grisea Fr., (AH 16587). a-b: ornamentación esporal.

Russula parazurea Jul. Schàff., Z. Pilzk. 17: 87. 1933. (Fig.12)

En humus de Quercus suber, Cra. de Jimena de la Frontera al Pto. de Galis (Cádiz),

11.XL.1989, leg. A. Ortega & R. Galán, GDAC 32306. Rara en humus de Quercus suber y Q.

canariensis, Crta. de Pto. Galis a Jimena de la Frontera (Cádiz), 13.X1.1992, leg. L. Alcoba, A.

Ortega & G. Moreno, AH 16589.

Observaciones: Nuestra recolección posee un sombrero violáceo oscuro sin

tonos grises o verdosos; es semejante a la fotografiada por Cetto (1987:392).

Las esporas al MEB la ornamentación típica reticulada con placa suprahilar bien

neta.

Russula sororia (Fr.) Romell, Oefvers. Kongl. Vetensk.- Acad. Fórh.: 176. 1891.

Frecuente en humus de Quercus suber, Pto. de Galis (Cádiz). 1.X11.1988, leg. A. Onega €

A. G. Buendía, GDAC 32309. En humus de Quercus suber y Q. canariensis, Crta. de Pto. Galis a

Jimena de la Frontera (Cádiz), 13.X1.1992, leg. L. Alcoba, A. Ortega & G. Moreno, AH 16612.

Observaciones: Tomamos para Russula sororia un sentido amplio que incluye

R. amoenolens Romagn., por las diferencias subjetivas que a nuestro juicio separan

ambos táxones.

Russula subazurea Bon, Doc. Mycol. 17: 34. 1975.

Rara en humus de Quercus suber y Q. canariensis, Pto. Galis. a Jimena de la Frontera

(Cádiz), 13.XI.1992, leg. L. Alcoba, A. Ortega & G. Moreno, AH 16614.

Observaciones: Coincide con la descripción que realizamos de material

recogido en ecología similar en el Parque Natural de Monfragüe (Cáceres) (Moreno &

al., 1990).

Source : MNHN, Paris

AGARICALES EN ANDALUCÍA, ESPANA 171

Fig. 12. - Russula parazurea Jul. Scháff., (AH 16589). a-d: ornamentaciċn esporal.

Es una especie mediterránea que se conoce de Francia, España e Italia.

Russula vinosobrunnea (Bres.) Romagn., Les Russules: 732. 1967. (Fig.13)

Poco frecuente en humus de Quercus suber, Cra. de Los Barrios a Facinas (Cádiz),

13.XI.1986, leg. A. Ortega & A. G. Buendía, GDAC 38072. En humus de Quercus suber, Crta. de

Pto. Galis a Jimena de la Frontera (Cádiz), 13.X1.1992, leg. L. Alcoba, A. Ortega & G. Moreno, AH

16590.

Observaciones: La separación entre Russula olivacea y R. vinosobrunnea es

difícil y subjetiva. Nosotros las diferenciamos por la ornamentación esporal que en R.

vinosobrunnea presenta espinas agudas con pequeñas líneas de conexión o crestas.

Posiblemente sea mejor considerarla como una variedad de R. olivacea.

Source : MNHN, Paris

172 G. MORENO, F. ESTEVE-RAVENTOS v A. ORTEGA

Fig. 13. - Russula vinosobrunnea (Bres.) Romagn., (AH 16590). a-d: ornamentación esporal.

Russula violeipes Quél., Compt. Rend. Assoc. Franc. Avancem. Sci. 26: 450. 1897.

Rara en humus de Quercus suber, Crta. de Pto. Galis a Jimena de la Frontera (Cádiz),

13.X1.1992, leg. L. Alcoba, A. Ortega & G. Moreno, AH 16613.

Source : MNHN, Paris

AGARICALES EN ANDALUCÍA, ESPANA 173

Observaciones: Russula violeipes se caracteriza por su pileipellis en

tricodermis, con células terminales subuladas, cónicas, y células basales globosas a

anchamente elipsoidales, esporas reticuladas y abundantes cistidios himeniales

semejantes a los del píleo.

AGRADECIMIENTOS.

Expresamos nuestra gratitud a la DGICYT por la concesión del proyecto de investigación

PB90-0986, dentro del cual se enmarca este trabajo. A J. A. Pérez y A. Priego del Servicio de

Microscopía Electrónica de la Universidad de Alcalá de Henares. A Nikon Co. (Rego & Cia., S.A.,

Madrid) por sus consejos fotográficos. Al Dr. E. Horak por la revisión del manuscrito.

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NUTRITIONAL AND ENVIRONMENTAL FACTORS

AFFECTING GLYCEROL PRODUCTION

BY ASPERGILLUS WENTII IMI 023010

M.H. MOUBASHER* and M. EMAN MOSTAFA**

“Botany Department, Faculty of Science, Cairo University, Egypt.

**Botany Department, Faculty of Science, Assiut University, Egypt

ABSTRACT - Aspergillus wentii IMI 023010 successfully produced high level of glycerol on a

chemically defined liquid medium. Biosynthesis of glycerol was markedly affected by composition

of culture medium, pH and temperature as well as incubation period. Medium of the following

composition was favourable for the production of glycerol: NaCl, 150g; mannitol, 10g, NaNO,, 2g:

KH,PO,, 1g; ZnSO,, 0.22 mg; CaCl,, 0.14 mg and casamino acids, 6 g (per liter of distilled H,O)

Production of glycerol was maximum at pH 6-7 and after 15 days of incubation at 20°C.

RESUME - Aspergillus wentii IMI 023010 produit, sur milieu liquide chimiquement défini, du

glycérol en grande quantité. La biosynthèse du glycérol est affectée par la composition du milieu, le

PH, la temperature ainsi que par la durée d'incubation. La composition du milieu favorable à la

production de glycérol est: NaCl, 150 g, mannitol, 10g, NaNO,, 2g; KHPO,, 1g; ZnSO,, 0.22 mg;

CaCl,, 0.14 mg; caséine, 6 g (pour 11 d’eau distillée). La production du glycérol est maximale à pH

6.7, aprés 15 jours de culture à 20°C.

KEY-WORDS - Glycerol production, filamentous fungi, Aspergillus.

INTRODUCTION

Glycerol as a by-product in the manufacture of soap and fatty acids does not

promise its supply. Today, glycerol is typically produced chemically from petroleum

derivatives which is less expensive than processing by sugar fermentation. With the

chemical synthesis of glycerol (Neumuller, 1981), environmental problems can arise

because of possible evolution of chlorinated by-products in the course of production

process.

Recently there has been a great revival in the interest in glycerol fermentation

in the world due to rapidly diminishing petroleum reserves (Vijaikishore & Karanth,

1986). Many attempts have been made to improve biotechnological glycerol production

for commercial application with the main emphasis on high glycerol concentrations in

the product both at rapid fermentation rates and low process and energy costs (REHM,

1988).

Source : MNHN, Paris

176 M.H. MOUBASHER and M. EMAN MOSTAFA

Glycerol is formed by several yeasts at higher osmotic potential in the medium

to protect enzymes and maintain normal cell turgor (Brown et al., 1986). However,

little is known concerning glycerol production by filamentous fungi. Thus, the objective

of this investigation was designed to study glycerol production by Aspergillus wentii

IMI 023010 (known as a glycerol producer) under different environmental and cultural

conditions.

MATERIALS AND METHODS

Organism

Aspergillus wentii (IMI 023010), known as a glycerol producer was obtained

from the International Mycological Institute, Kew, Surrey, England.

Cultivation

The fungus was inoculated into autoclaved (121°C, 20 min, 15 Ib/in) 250 ml

Erlenmeyer flask containing 50 ml of the desired medium. After inoculation with 2 ml

inoculum suspension of 2 weeks old culture of the experimental organism, the flasks

were incubated at 28°C or other mentioned temperatures for 15 days without shaking.

Cultural condition

Czapek’s medium with 10 g glucose and 2 g NaNO, (per liter) as carbon and

nitrogen source, respectively and fortified by 15% NaCl was used as starting culture

medium. The effect of carbon and nitrogen sources on glycerol production were

determined by replacing glucose or NaNO, with equimolar concentrations of test

compounds. Certain metal were added as salts to the defined cultural medium at a

concentration of 25 umol/L to determine their influence on glycerol production by the

experimental organism. Aliquots of the culture medium were adjusted before

sterilization to the desired pH values using N/10 of both HCI and NaOH. All

experiments were done in triplicate and yields were reported as averages.

Glycerol analysis

Glycerol was analyzed enzymically using a commercially enzyme combination

(Boehringer, Mannheim glycerol test combination catalogue no. 148270) based on the

method of Eggstein & Kuhlmann (1974). Readings were made with a Spectronic 2000

at 340 nm. Results were recorded as | mol of glycerol per ml of culture medium.

RESULTS AND DISCUSSION

Attempts have been made to evaluate the effect of different carbon sources and

the suitable concentration of the most favourable carbon source for both supporting

fungal growth and stimulating glycerol production by Aspergillus wentii IMI 023010.

Nine different carbon sources were tested. Lactose, maltose and soluble starch

permitted weak growth and low levels of glycerol (Fig. 1). Inlow et al. (1988) reported

that glycerol production by Saccharomyces cerevisiae was significantly decreased when

Source : MNHN, Paris

PRODUCTION OF GLYCEROL BY ASPERGILLUS WENTII

(8/50 mi)

SSSSSSSSSNSSSNI

mum)

INSEW

Wt.

SON

e BH

DE BG al i

619 Pa

16 4181418

Carbon Source

EZZ Glycerol

Glycerol (umol/ml)

177

Fig. 1: Effect of different carbon sources on the growth and glycerol production by Aspergillus wentii

(IMI 023010).

Fig. 1: Effets de différentes sources carbonées sur la croissance et la production de glycérol par

Aspergillus wentii (IMI 023010).

(8/50 mi)

Wt.

-*- p

(gi)

4~ Glycerol

Glycerol (ymol/mi)

Fig. 2: Effect of different mannitol concentrations on the growth and glycerol production by

Aspergillus wentii (IMI 023010).

Fig. 2: Effets de la concentration en mannitol sur la croissance et la production de glycérol par

Aspergillus wentii (IMI 023010)

Source : MNHN. Paris

178 M.H. MOUBASHER and M. EMAN MOSTAFA

soluble starch was used instead of glucose. Fructose, mannose and sucrose supported

fungal growth, but low levels of glycerol were obtained. Galactose followed by glucose

were stimulators for both mycelial growth and glycerol production while mannitol was

superior for glycerol production by the isolate tested (Fig. 1). Maximum glycerol

synthesis was obtained at 10 g of mannitol per liter (Fig. 2). Earlier results obtained by

Onishi & Susuki (1968) showed that glucose followed by galactose gave the highest

yield of glycerol by a unidentified yeast strain isolated from soy-sauce mash and a

glucose concentration of 30% increased glycerol yield. Recently Hendriksen et al.

(1988) reported that in high osmotic cultures with both sucrose and lactose higher yield

of glycerol was obtained by Penicillium scabrosum.

The experimental organism was able to utilize a wide range of nitrogen sources

All inorganic nitrogen sources tested (except NaNO,) were utilizable and suitable for

mycelial growth. Nitrate was more suitable for production of glycerol. Sodium nitrate

proved to be more favourable than any other nitrogen sources tested for production of

glycerol by the experimental organism (Fig. 3). Increasing the nitrogen level of culture

medium induced parallel increase of mycelial growth. Glycerol synthesis by the

experimental organism reached its maximum at a concentration of 2 g of sodium nitrate

per liter (Fig. 4). These results are not in harmony with that previously obtained by

Onishi (1959). He reported that when an inorganic ammonium salt was used as nitrogen

source, the rapid decrease in the pH of the medium during the fermentation might

reduce polyols yield. On the other hand, Onishi & Susuki (1968) found that both

ammonium nitrogen (as ammonium sulfate and ammonium lactate) and amino nitrogen

(as sodium L-glutamate) were found to be available for mannitol and glycerol

production by an isolate of yeast. However, Ross & Morris (1962) working with marine

yeasts, which would probably have accumulated glycerol, found that the type of

nitrogen source used in the medium did not affect their ability to tolerate high NaCl

concentrations. Holligan & Jennings (1972) recorded high activity of the pentose

phosphate pathway and hence the amount of glycerol formed is higher on nitrate media

than on asparagine media. Recently, Luard (1985) studied the difference between

growth of four fungi on organic and inorganic nitrogen and found that greater yield of

growth and glycerol were obtained on organic nitrogen.

Variation of KH,PO, content from 0 to 2 g/l did not affect glycerol production

by the experimental organism, while the higher levels (5 and 10 g/l) reduced glycerol

accumulation (Fig. 5). These results are in harmony with results previously recorded by

Spencer & Shu (1957) and Peterson et al. (1958). They reported that the excess of

inorganic phosphate has detrimental effect upon the yield of polyalcohol in some

yeasts. However, Onishi & Susuki (1968) recorded that inorganic phosphate level did

not affect either glycerol or mannitol production by yeasts.

The pH value of the nutritive medium exerted a marked influence on glycerol

production. Using initially adjusted medium, the results (Fig. 6) revealed that mycelial

growth and glycerol biosynthesis increased gradually with the increase of pH values

reaching maxima at pH ranging from 6.0 to 7.0 for the organism tested. The growth of

fungi under conditions where water availability is a limiting factor is controlled

primarily by the water activity (a,) (Scott, 1957), although other factors such as pH of

the medium and the solutes present are also known to be influential (Pitt, 1975).

Source : MNHN, Paris

PRODUCTION OF GLYCEROL BY ASPERGILLUS WENTII 179

E E

a E

i ES

B $

a G

RCE 5 6

Nitrogen source (2g/1)

ED we ELA Giveerol

Fig. 3: Effect of different nitrogen sources on the growth and glycerol production by Aspergillus

wentii (IMI 023010).

Fig. 3: Effets de différentes sources azotées sur la croissance et la production de glycérol par

Aspergillus wentii (IMI 023010)

à 8

E 2

à A

; G

È $

A G

(2/1)

A VE A> Glycerol

Fig. 4: Effect of different NaNO, concentrations on the growth and glycerol production by

Aspergillus wentii (IMI 023010),

Fig. 4: Effets de la concentration en NaNO, sur la croissance et la production de glycérol par

Aspergillus wentii (IMI 023010).

Source : MNHN, Paris

180 M.H. MOUBASHER and M. EMAN MOSTAFA

E E

o o

i A

r^ 8

Et o

£ >

A o

(g/1)

—e— D. Wt —4-— Glycerol

Fig. 5: Effect of different concentrations of KH,PO, on the growth and glycerol production by

Aspergillus wentii (IMI 023010).

Fig. 5: Effets de la concentration en KH,PO, sur la croissance et la production de glycérol par

Aspergillus wentii (IMI 023010).

wt.

E £

3 leo À

è NE

lao 2

20 730 240 11.00

460 6

pH Value

—*- D. Wt —a— Giveerol

Fig. 6: Effect of pH on the growth and glycerol production by Aspergillus wentii (IMI 023010).

Fig. 6: Effet du pH sur la croissance et la production de glycérol par Aspergillus wentii (IMI 023010).

Source : MNHN, Paris

PRODUCTION OF GLYCEROL BY ASPERGILLUS WENTII 181

Available data are fragmentary and contradictory, Parekh & Pandey (1985) reported

that pH control did not affect glycerol production by Hansenula anomala. Hendriksen

et al. (1988) studied polyols formation by Penicillium scabrosum and reported that the

yield of mannitol was higher in cultures with neutral pH than in cultures with a slightly

acidic pH; for glycerol the reverse was the case. Also, Abdel-Hafez (1991) indicated

that maximal glycerol production by Eurotium amstelodami was attained at pH 5, at

which maximum of mycelial growth was also recorded.

Incubation temperature proved to be an important factor in glycerol synthesis.

30°C and 20°C were the optima for mycelial growth and glycerol accumulation by

Aspergillus wentii (Fig. 7). According to Spencer et al. (1957), the effects of

temperature and initial sugar concentration are interrelated. The found that the cultures

of osmophilic yeasts produce low levels of glycerol when yeast is grown at 30°C in

media of low sugar concentration. When higher concentration of carbon and nitrogen

sources were used, the maximum temperature for growth and glycerol production was

37°C. It has been previously noted that tolerance of different fungi to salt was increased

with the increase in the temperature of incubation (Gold, 1959). Recently, Abdel-Hafez

(1991) reported that the maxima of mycelial growth and glycerol production by

Eurotium amstelodami were recorded at 25°C.

Certain metals were added as salts to the defined basal culture medium in low

level (25 umol/l) to determine their influence on mycelial growth and glycerol

production by the experimental organism. Different patterns of effect were recorded

with the various ions tested. The first group of elements which caused complete

inhibition of growth and glycerol production by the experimental organism included

copper, mercury, silver, lead and cobalt (Fig. 8). The effect of heavy metals,

particularly copper and mercury on fungal cell have for long been of interest to

mycologists as a result of their value as fungicides. Ross (1975) reported that chemical

properties of metals can be related in a general way to their relative toxicities to fungi

and higher plants. The more electronegative metals such as copper, mercury and silver

have high affinities for sulphydryl, amino and imino groups which are likely to be

reactive site on many enzymes.

The second group of elements which included cadmium, lithium and

molybdenum, not only retarded mycelial growth but also restricted glycerol formation

(Fig. 8). Bowen (1966) and Ross (1975) recorded that all the divalent transition

elements as molybdenum and silver are poisonous as a result of reactivity with

enzymes. It has been also found that cadmium acts on the cell membrane causing

damage and changes in permeability (Passow et al., 1961).

The third group of elements comprised manganese and iron, both ions of these

elements increased mycelial growth but retarded glycerol production. No effect was

recorded either on mycelial growth or glycerol production by addition of nickel ions

(Fig. 8).

The fourth group of elements included zinc and calcium. Addition of ions of

these elements, individually, stimulated both mycelial growth and glycerol production

by the experimental organism (Fig. 8). Of all the trace elements zinc seems to play a

key role in the biosynthesis of many metabolites including glycerol. At least, twenty

enzymes have been found to be zinc dependent (Parisi & Vallee, 1969), which may

partly account for its key role. Bowen (1966) listed calcium as one of number of metals

Source : MNHN, Paris

182 M.H. MOUBASHER and M. EMAN MOSTAFA

(g/50 ml)

Glycerol (umol/mi)

ġja

DEWi

Temperature 'C

=e- D. Wt.

Glycerol

Fig. 7: Effect of temperature on the growth and glycerol production by Aspergillus wentii (IMI

023010).

Fig. 7: Effets de la température sur la croissance et la production de glycérol par Aspergillus wentii

(IMI 023010).

(g/50 mD

Glycerol (umol/ml)

D. Wt

Different Ions

ES D. ve FEZ Giveerol

Fig. 8: Effect of different ions on the growth and glycerol production by Aspergillus wentiż (IMI

023010).

Fig. 8: Effets de différents ions sur la croissance et la production de glycérol par Aspergillus wentii

(IMI 023010).

Source : MNHN, Paris

PRODUCTION OF GLYCEROL BY ASPERGILLUS WENTII 183

which proved to be essential for fungal growth. Leopolid & Willing (1984) found that

CaCl, between 1 and 50 pmol served partially to protect the tissue of leaf slices from

NaCl damage. Gary-Boba (1970) suggested that calcium may serve to bind

phospholipids together and this limits membrane permeability. Ca^ ions present in the

cell wall are, to large extent, responsible for its structural and mechanical properties

(Probine & Preston, 1962).

Because the C:N ratio of medium significantly affected polyalcohol production

by Pichia miso as reported by Onishi et al. (1961), the effect of peptone, yeast extract

and casamino acids concentrations on mycelial growth and glycerol formation by the

experimental organism were examined. The results obtained (Fig. 9) show that

increasing of the three nitrogen rich compounds concentrations gradually increase both

mycelial growth and glycerol production. High concentrations (6-10 g/l) of these

compounds promote growth but adversely affected accumulation of glycerol. The

highest levels of glycerol were recorded in the presence of 6 g of each compounds per

liter of medium (Fig. 9). Ina previous study, Parekh & Pandey (1985) carried out a trial

for optimization of yeast extract and corn steep liquor (CSL) as nitrogen source of

culture media for glycerol production by Hansenula anomala. They found that yeast

extract at 0.2% and CSL at 0.3% level were optima and provided roughly equivalent

amounts of nitrogen. Recently Hendriksen et al. (1988) reported that the highest

combined yield of mannitol and glycerol (65 g/l) was obtained with Penicillium

aethiopicum IBT MILA4, when grown on 150 g of sucrose and 20 g of yeast extract per

liter. However, Luard (1985) concluded that complex organic forms of nitrogen were

not necessarily the most efficacious.

The effect of different rates of aeration on mycelial growth and glycerol

formation was also studied. The results obtained (Fig. 10) show that the highest

aeration condition, with 25 ml of the medium in 500 ml Erlenmeyer flasks, gave the

best yield of glycerol. Increasing the amount of medium in 500 ml flasks gradually

decreased glycerol production and increased mycelial growth of the experimental

organism. These results are in complete harmony with that obtained by several

investigators. Quantitative studies (Spender et al., 1957) of the relationship between

glycerol production and rate of aeration showed that glycerol yield (by osmophilic

yeast) increased with the increase of aeration rate. Dukema et al. (1985) reported that

glycerol is one of the polyols that is formed rapidly by Aspergillus nidulans (=

Emericella nidulans) when this fungus is grown on glycolytic carbon sources,

especially under strong oxygenation. Effect of aeration on glycerol production by

Hansenula anomala was studied by Parekh & Pandey (1985) and showed that more

than 20-31 ml medium in 500 ml flasks decreased the productivity, suggesting the need

for vigorous aeration, Also Onishi & Susuki (1968) recorded that the highest aeration

with 30 ml and 100 ml medium in 500 ml flasks gave the best yield of mannitol and

glycerol, respectively.

The results obtained during this work propose a suitable culture medium and

some optimal conditions for production of glycerol which are practically suitable for

routine screening of glycerol-producing fungi.

Source : MNHN, Paris

184 M.H. MOUBASHER and M. EMAN MOSTAFA

ka Trabi pam)

Glycerol (rmol/mD)

8 1

Treatment (g/1)

—*— Peptone —4-— Yeast ext —*— Casamino

Fig. 9: Effect of different concentrations of peptone, yeast extract and casamino acids on glycerol

production by Aspergillus wentii (IMI 023010).

Fig. 9: Effets de différentes concentrations en peptone, extrait de levure et caséine sur la croissance et

la production de glycérol par Aspergillus wentii (IMI 023010).

3 f

S A

È $

: 5

5 >

Volume of Medium (m1/500 mi flask)

—*- D. Wt. —a— Glycerol

Fig. 10: Effect of different rates of aeration on the growth and glycerol production by Aspergillus

wentii (IMI 023010).

Fig. 10: Effets de l'aération sur la croissance et la production de glycérol par Aspergillus wentii (IMI

023010).

Source : MNHN, Paris

PRODUCTION OF GLVCEROL BV ASPERGILLUS WENTII 185

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L’ASCOCARPE DE TERFEZIA LEONIS TUL.

(DISCOMYCETES, TUBERALES)

L. KHABAR (1), L. NAJIM (1),

M.C. JANEX-FAVRE (2) et A. PARGUEY-LEDUC (2)

(1) Laboratoire de Botanique (Mycologie), Département de Biologie,

Faculté des Sciences Universit Mohammed V, B.P. 1014,

Avenue Ibn Batouta - Rabat - Maroc.

(2) Laboratoire de Biologie de la Reproduction des Végétaux (Mycologie)

Université Pierre et Marie Curie (Paris VI), 9 Quai Saint-Bernard

75252 Paris cedex 05 - France.

RÉSUMÉ La structure de l'ascocarpe hypogé, des asques et des ascospores d'une truffe des sables,

Terfezia leonis Tul., a été observée en microscopie photonique et électronique. Les caractères propres

aux Terfez ont été reconnus: péridium lisse, glèbe comprenant des nodules fertiles et des veines

stériles de texture dense, asques à huit ascospores pourvues d'une ornementation d'origine exospo-

rale et d'une endospore. Cette nouvelle étude fait ressortir l'originalité déjà soulignée de

l'organisation des ascocarpes et des asques chez les Tubérales, ce qui justifie que cet ordre soit

conservé au sein des Discomycètes.

SUMMARY - The structure of the hypogeous ascocarp, asci and ascospores of Terfezia leonis (a

sand truffle) are observed with light and electron microscopes. Generic features in Terfezia structure

are: smooth peridium, gleba composed of fertile nodules and dense sterile veins, eightspored asci,

ascospore wall endowed with an ornamentation from exosporic origin and an endospore. Genera

Terfezia and Tuber display common noticeable features justifying that the order Tuberales be main-

tained among Discomycetes.

MOTS-CLÉS - ascocarpe, asques, ascospores, ultrastructure, Tubérales, Terfezia.

Terfezia leonis est une «Truffe des sables» fréquemment récoltée au Maroc en

raison de sa valeur nuritionnelle élevée (Ashour et al., 1981 et Al-Shabibi et al. 1982).

Nous avons pensé que l'étude de cette espéce compléterait utilement celle faite aupara-

vant (Janex-Favre et Parguey-Leduc, 1985 et Janex-Favre et al., 1988) sur deux autres

espèces de Terfez (T. claveryi et T. leptoderma, seule espèce française de Terfez).

Nous avons centré nos études essentiellement sur l’ultrastructure des ascocarpes

êt des asques de façon à pouvoir situer le genre Terfez par rapport au genre Tuber et

Source : MNHN, Paris

188 L. KHABAR etal.

savoir si la position marginale des Tubérales au sein des Discomycètes était confortée

ou non par ces observations.

BIOLOGIE DE T. LEONIS

Nos échantillons proviennent de la forét de la Mamora, à l'est de Rabat. Celle-

ci couvre une surface de l'ordre de 130.000 hectares et s'étend de l'est à l'ouest sur

environ 70 kilométres et du nord au sud sur 30 kilometres. L'altitude maximale de la

forét est 280 m environ à son extrémité sud-est.

Les tubercules de Terfezia se rencontrent dans un horizon sableux humifére de

couleur grise, ne dépassant pas 25 cm de profondeur et comportant de nombreuses

racines de végétaux ligneux et herbacés. L'analyse du sol montre qu'il est constitué de

sables grossiers (dimensions situées entre 0,063 et 1 mm) et qu'il contient seulement

2,1% de calcaire.

Le climat qui régne dans les stations étudiées (données concernant la période

1983-1987) est caractérisé par une quantité de pluie annuelle normale de 544,2 mm

(pouvant atteindre 600 mm, par exemple en 1983-1984, et seulement 377,2 mm en

1986-1987). Les pluies tombent d'octobre à mai, principalement en novembre, décem-

bre et janvier. Les températures moyennes mensuelles se situent entre 12*6 (Janvier) et

2274 (août).

La formation principale végétale régnant dans les stations étudiées est une forét

de chéne-liége ou subéraie telle qu'elle a été décrite dans la flore des végétaux ligneux

de la Mamora de Metro et Sauvage (1955); l'élément arborescent dominant de cette

subéraie est le chéne-liege (Quercus suber) La strate arbustive est constituée

essentiellement de cistes (ex. Cistus crispus, C. monspeliensis, C. salvifolius...). La

strate herbacée est caractérisée le plus souvent par Helianthemum guttatum et par des

plantes bulbeuses (ex. Urginea mantina, Asphodelus microcarpus et A. aestivus).

La flore mycologique est assez riche; ainsi, à côté de T. leonis, on trouve

d'autres champignons hypogés: T. leptoderma, quelques espèces de Tuber, Delastria,

en particulier sous les pins nouvellement utilisés en reboisement.(Pinus pinaster

atlantica).

Le Terfezia leonis est en relation constante avec l' Helianthemum guttatum Mill,

avec lequel il forme une relation mycorhizienne. C'est un champignon comestible

apprécié, qui est détecté par la méthode dite «à la marque» (le sol est gonflé et fendillé

en surface, à la base de l'hélianthéme). T. leptoderma et T. leonis sont généralement

confondus: la première espèce, qui est noire, est considérée comme l'état mûr de la

seconde, blanc crème à blanc jaunâtre.

Les ascocarpes de T. leonis apparaissent dés le mois de mars et múrissent

lentement, comme ceux de T, leptoderma récoltés en France (Janex-Favre et al., 1988);

ils ne deviennent matures qu'au mois de mai.

Il faut noter que T. leonis, qui fait l'objet du travail présenté ici, a été trouvé en

dehors du Maroc par Moyen (1889) dans le sud de la France, par Chatin (18912) à

Carthage et en Lybie, par Mattirolo (1905) au centre et au sud du Portugal, et par

Langiu (1979) en Sardaigne.

Source : MNHN, Paris

L'ASCOCARPE DE TERFEZIA LEONIS 189

MATERIEL ET METHODES

Pour les études en microscopie photonique, des préparations par écrasement de

fragments d'ascocarpes ont été effectuées, dans l'eau ou dans divers colorants: rouge

neutre, bleu coton, Lugol, vert Visba, bleu BZL, encre, rouge de ruthénium. Des colo-

rations sur coupes (aprés fixation par le liquide de Westbrook -1935- et dans la

paraffine) ont, en outre, été réalisées à l'aide de l'hématoxyline ferrique et de l'éosine.

Pour les études en microscopie électronique par transmission des fragments

d'ascocarpes ont été traités par les méthodes classiques: double fixation par le glutaral-

déhyde à 6% et le tétroxyde d'osmium à 266, avec tampon de Sórensen, inclusion dans

la résine de Spurr. Les coupes, effectuées à l'aide d'un ultramicrotome Reichert

OMU 3, ont été contrastées par l'acétate d'uranyle et le citrate de plomb (18 minutes)

ou traitées par la technique de Thiéry (1967); des coupes semi-fines, colorées par la

pyronine, ont été observées au microscope photonique. Les observations en

microscopie électronique ont été faites à l'aide d'un microscope Philips 30.15 sous une

tension d'accélération de 80 KV.

Pour les études en microscopie électronique à balayage, de petits cubes

d'ascocarpes ont été fixés au permanganate de potassium 4 1% dans un tampon à pH

6,8. Plusieurs lavages à l'eau distillée ont précédé une déshydratation progressive à

l'acétone (25%, 50%, 75%, 95% et 100%). Aprés avoir été séchés par la méthode du

point critique, les échantillons sont déposés sur des supports en aluminium et métallisés

avec une fine couche d’or.

RESULTATS

1. Morphologie de l’ascocarpe

Les ascocarpes de T. leonis examinés ont de 2 à 10 cm de diamètre et pèsent de

4 à 200 g. De forme variable (subglobuleux, cordiformes, bossués - fig. 1 et 2a -) ils

sont limités par un péridium lisse, mat, blanc crémeux, tournant avec l'âge au brun

roux plus ou moins foncé. Par simple écrasement de fragments d'ascocarpes on cons-

tate que leur âge dépend surtout de leur couleur mais non de leur taille; ainsi des asco-

carpes de petite taille mais de couleur brune à marron sont parfaitement mûrs.

2. Structure de l'ascocarpe

Observé en coupe (fig. 2b) l’ascocarpe présente deux parties, le péridium, ex-

terne, et la glèbe, interne.

Le péridium, de 0,5 à 2,5 mm d'épaisseur, est formé d'un tissu paraplecten-

chymateux (fig. 3). Sa partie externe (pe), sombre, est trés compacte et dure, formée de

cellules de forme polygonale jointives. Vers l'intérieur les cellules deviennent progres-

sivement plus grandes et disjointes (pe;), il s'ensuit un aspect plus clair et une consis-

tance molle.

La glèbe, pulpeuse, contient de nombreux nodules fertiles (n), d'abord rosátres

puis devenant ochracé olivacé à marron, séparés par des interstices páles, qui sont des

Source : MNHN, Paris

190 L. KHABAR etal.

Fig. 1 et 2: Morphologie et structure générale de l'ascocarpe de T. leonis. Fig. 1: divers aspects

morphologiques d'ascocarpes. Fig. 2: un ascocarpe en vue externe (a) et en coupe longitudinale (b).

Fig. 1 and 2: Morphology and gross structure of ascocarp in T. leonis. Fig. 1: various morphological

features of ascocarps. Fig. 2: the ascocarp, external view (a) and longisection (b). x 1

veines stériles (vs). Anatomiquement indifférenciées (Trappe, 1971), elles sont consti-

tuées de cellules polygonales jointives à contenu cellulaire peu dense.

Source : MNHN, Paris

L'ASCOCARPE DE TERFEZIA LEONIS 191

per

pea

GAS

U 2s

Fig. 3: Structure de l'ascocarpe de 7. leonis. Peridium pe, + pe, et glèbe avec veine stérile vs et

nodule fertile n. Coloration: hématoxyline ferrique et éosine. Echelle; 50 jum.

Fig. 3: Ascocarp structure in T. leonis. Peridium pe, * pe, and gleba with sterile vein vs and fertile

nodule n. Stains: ferric hematoxylin and eosine. Scale: 50 pm.

Source : MNHN, Paris

192 L. KHABAR etal.

Les asques sont enrobés dans un «tissu» interascal hétérogène (fig. 4), formé de

cellules polygonales étroitement juxtaposées de deux types. Les unes représentent

l'appareil sporophytique (sp) producteur des asques (as). Il s'agit de files de cellules

généralement terminées par un asque et contenant de nombreuses petites vacuoles et

des granulations cytoplasmiques denses. Les autres éléments du tissu interascal forment

un tissu de soutien stérile (sf): ce sont des cellules très grandes et trés vacuolisées.

Les observations en microscopie photonique ont permis de suivre l'évolution

des asques (fig. 5).

Fig. 4: Structure de la glébe de T. leonis. Asques as à différents stades de développement et tissu

interascal comprenant des cellules de l'appareil sporophytique sp et des cellules stériles sr Coupe

semi-fine colorée par la pyronine. Echelle: 10 um.

Fig. 4: Gleba structure in T. leonis. Asci as at various developmental stages and interascal tissue

consisting of sporophytic cells sp and sterile cells st. Semithin section coloured with pyronine. Scale:

10 um.

Source : MNHN, Paris

L'ASCOCARPE DE TERFEZIA LEONIS 193

Fig. 5: Evolution des asques de T. leonis (voir le texte). Montage dans l'eau (a, b, g, k, m) ou avec

coloration: rouge neutre (c, d, i), bleu BZL (e, f, j), lugol (h, I), rouge de ruthénium (n). Echelle: 20

um.

Fig. 5: Ascus development in T. leonis (see in text). Water mounting (a, b, g, k, m) or with staining:

neutral red (c, d, i), BZL blue (e, f, j), lugol (h, 1), ruthenium red (n). Scale: 20 jum.

Source : MNHN, Paris

194 L. KHABAR et al.

Le jeune asque, sous lequel est généralement encore visible la file de cellules

sporophytiques, a d'abord une forme allongée (fig. 5a et e) puis il devient globuleux

(fig. 5 b et f). Il contient de nombreuses petites vacuoles tassées les unes contre les

autres et les globules lipidiques (fig. 5 a, b, e, f). Dans chacune des vacuoles peut appa-

raitre un précipité chromophile (fig. 5 d).

Au cours du développement de l'asque, une enveloppe s'individualise à son

sommet (fig. 5 g), séparant la partie basale, de plus en plus riche en glycogène, de la

partie sommitale qui contient les autres constituants, C’est dans cette dernière que se

différencient les ascospores (fig. 5 h), d’où le nom de sac postsporal donné à

l'enveloppe. Progressivement, le volume de la région contenant les ascocpores en voie

de maturation (fig. 5, i, j, k) s'accroît. Par la suite le contenu de l’asque se réorganise

de sorte que dans l'asque sub-adulte les ascospores se localisent au centre et le glyco-

gène en périphérie (fig. 5 1). Celui-ci disparaît progressivement ainsi que le sac post-

sporal (fig. 5 m, n), ce qui permet la dispersion des ascospores dans tout le volume de

l'asque adulte.

Le développement de l'asque est ainsi, comme chez toutes les Tubérales, mar-

qué par un changement dans la polarité des constituants: ceux-ci sont répartis d’abord

en deux zones superposées, puis en deux zones concentriques.

Dans la paroi ascale la coloration au rouge de ruthénium (fig. 5 n) fait apparai-

tre deux couches: une couche interne trés colorée, et donc riche en pectines, et une

couche externe peu colorable par ce colorant, mais retenant par contre à peu prés tous

les autres colorants employés, ce qui indique une nature complexe.

Le nombre des ascospores est classiquement de 8 dans chaque asque, ce qui

distingue les Terfezia de la plupart des Tuber, chez lesquels le nombre d’ascospores

varie de 1 à 8. Les jeunes ascospores de T. leonis sont entourées par une paroi hyaline

assez épaisse et régulière (fig. 6 a); celle-ci fait place progressivement à une paroi

formée de deux parties: une partie interne, claire et régulière, et une partie externe,

sombre et ornementée qu'entoure transitoirement une périspore claire (fig. 6 b).

L'ornementation est constituée de verrues, d’abord en forme de cône surbaissé (fig. 6

b) puis devenant progressivement plus longues et sub-cylindriques (fig. 6 c), et parfois

terminées par une zone plus claire (fig. 6 d). L'ornementation ainsi réalisée est égale-

ment bien visible en microscopie électronique à balayage: au stade photographié,

l’ascospore est totalement recouverte de verrues encore courtes et tronquées (fig. 6 e).

Les ascospores contiennent différentes inclusions, notamment de petites vacuo-

les (fig. 5 iet 6 a) et de petits globules lipidiques (fig. 5 j); ceux-ci se réunissent en une

gouttelette unique (fig. 5 j, k et 6 a, b, c), qui est probablement la «goutte oléagineuse»

mentionnée par Bataille (1921) chez les Truffes.

3. Etude ultrastructurale de la glèbe

Les nodules fertiles de la glèbe sont constitués par les asques et le «tissu» inter-

ascal, formé de cellules de l'appareil sporophytique et de cellules stériles à rôle de

soutien. Toutes ces cellules sont polygonales et étroitement appliquées les unes contre

les autres, formant un système compact dépourvu de méats.

Source : MNHN, Paris

L'ASCOCARPE DE TERFEZIA LEONIS 195

Fig. 6: Evolution des ascospores de T. leonis (voir le texte). Microscopie photonique, montage dans

l'eau (a et d) ou avec coloration: rouge de ruthénium (b), bleu coton (c). Microscopie électronique à

balayage (e). Echelle: 10 um.

Fig. 6: Ascospore development in T. leonis (see in text). Light microscope, water mounting (a and d)

Or with staining: ruthenium red (b), coton blue (c). Scanning electron microscope (e). Scale: 10 jum.

Source : MNHN, Paris

196

L. KHABAR etal.

Source : MNHN, Paris

L'ASCOCARPE DE TERFEZIA LEONIS 197

a) les éléments interascaux (fig. 7)

Les cellules stériles du tissu interascal (sf) apparaissent claires aux électrons du

fait qu'elles contiennent de nombreuses et parfois trés volumineuses vacuoles et peu de

glycogéne. Elles sont pourvues de plusieurs noyaux, petits et souvent situés en péri-

phérie. Elles peuvent communiquer entre elles par un pore septal, obturé par une for-

mation discoide (fig. 8), légerement épaissie au centre et présentant une alternance de

bandes sombres et claires. Les septums entre cellule stérile et cellule de l'appareil

sporophytique présentent en outre, du cóté de la cellule stérile (fig. 9) une lame sombre

épaisse rattachée aux bords du pore. Des corps cristalloïdes opaques sont visibles à

proximité des septums.

Les cellules de l'appareil sporophytique (sp), de taille moyenne, ont un contenu

beaucoup plus dense aux électrons comportant du glycogène, régulièrement réparti dans

le cytoplasme, et des globules lipidiques, intercalés avec des vacuoles petites, nom-

breuses et claires.

b) les asques

Le plus jeune asque observé en microscopie électronique (fig. 10) montre la

polarité déjà visible en microscopie photonique. La volumineuse partie basale est tota-

lement occupée par du glycogène (gl). Dans la partie sommitale sont visibles deux

noyaux (n), des vacuoles (v) de taille variable, des précipités globuleux fortement con-

trastés, probablement lipidiques, et des mitochondries.

C'est dans cette zone sommitale que se déroule l'ascosporogénése chez les

Tuber (Janex-Favre, 1977; Parguey-Leduc & Janex-Favre, 1977 a et b, 1981; Janex-

Favre & Parguey-Leduc, 1976, 1980, 1983, 1988; Parguey-Leduc et al., 1987a), mais

nous n'avons pas pu malheureusement l'observer chez T. leonis.

Dans l'asque sub-adulte, la délimitation, déjà observée en microscopie photoni-

que, entre la zone périphérique riche en glycogène et la zone centrale contenant les

ascospores, est très nette (fig. 11, flèche).

c) les ascospores

Les observations ont porté essentiellement sur l’évolution de leur paroi.

Au plus jeune stade observé (fig. 12 et 20 A), seule la paroi primaire est consti-

tuée, d'épaisseur régulière et légèrement opaque aux électrons. Ensuite se forme la

paroi secondaire avec successivement de l'intérieur vers l'extérieur (fig. 13 et 20 B):

l'épispore (ep), épaisse, relativement opaque aux ċlectrons; l'exospore (ex), sous forme

d'une couche pelucheuse; la périspore (pe), irréguliérement boursouflée et contenant

des précipités floconneux, et enfin l'ectospore (ec) fine. Très rapidement la périspore

(pe) se dilate considérablement (fig. 11, 14 et 20 C).

Fig. 7-9: Ultrastructure du tissu interascal de T. leonis. Fig. 7: les deux types d'éléments du tissu

interascal. sr: cellule stérile; sp: cellule de l'appareil sporophytique; fig. 8 et 9: détails de septums.

Contraste par l'acétate d'uranyle et le citrate de plomb. Echelle: 2 um (fig. 7), 0,5 um (fig. 8 et 9).

Fig. 7-9: Ultrastructure of interascal tissue in T. leonis. Fig. 7: both types of elements. st: sterile cell;

sp: sporophytic cell. Fig. 8 and 9: details of septa. Contrast: uranyl acetate and lead citrate. Scale

2um (fig. 7), 0,5 um (fig. 8 and 9).

Source : MNHN, Paris

198 L. KHABAR etal.

Ensuite l’exospore se complique et se subdivise en deux parties (fig. 15 à 17):

une partie basale, mince, régulière, totalement opaque aux électrons, et une partie su-

périeure, qui forme l'ornementation. Celle-ci apparait d'abord sous forme de protubé-

rances en forme de dôme, de texture arachnoïde, coiffées par des croûtes opaques dis-

continues (fig. 15 et 20 D). Ces protubérances, confluentes à la base, s'accentuent

progressivement tandis que les croûtes s'étendent à leur surface, jusqu'à former une

couche continue uniforme (fig. 16, 17 et 20E). Puis les protubérances exosporales

deviennent trés saillantes, et constituent des verrues tronconiques. A leur extrémités la

croûte opaque, qui s'est fragmentée et épaissie irrégulièrement (fig. 18 et 20 F), cesse

finalement d'étre distincte, par suite de l'opacification progressive de l'ensemble des

verrues (fig. 19 et 20 G). L'ornementation caractéristique de l'espéce, qui forme en

coupe une roue crantée, est alors réalisée.

Fig. 10 et 11: Ultastructure des asques de 7. leonis. Fig. 10: asque jeune avec stratification superpo-

sée de ses constituants. gl: glycogène, n: noyau, v: vacuole. Fig. 11: asque sub-adulte. La fleche

montre la délimitation entre la zone périphérique et la zone centrale qui contient les ascospores (pe:

périspore de l'une d'elles). Contraste par l'acétate d'uranyle et le citrate de plomb. Echelle: 2 um.

Fig. 10 and 11; Ascus ultrastructure in T. leonis. Fig. 10: young ascus, with internal components

distributed in two superimposed layers. gl: glycogen, n: nucleus, v: vacuole. Fig. 11: subadult ascus.

Arrow points to the limit between peripheral and central zones (pe: perispore of an ascospore located

in the central zone). Contrast: uranyl acetate and lead citrate, Scale: 2 um.

Fig. 12-14: Evolution ultrastructurale de la paroi des ascospores de T. leonis. Fig. 12: paroi primaire.

Fig. 13: paroi secondaire comprenant de l'intérieur vers l'extérieur l'épispore ep, l'exospore ex, la

périspore pe et l'ectospore ec. Fig, 14:paroi avec périspore pe trés développée. Contraste par l'acétate

d'uranyle et le citrate de plomb. Echelle: 1 pm (fig. 12), 0,5 um (fig. 13), 2 um (fig. 14).

Fig. 12-14: Ultrastructural development of ascospore wall in T. leonis. Fig. 12: primary wall. Fig. 13

secondary wall. From interior to exterior: ep, epispore; ex, exospore: pe, perispore and ec, ectospore.

Fig. 14: ascospore wall with inflated perispore pe. Contrast: uranyl acetate and lead citrate. Scale: 1

um (Fig. 12), 0,5 um (fig. 13), 2 um (fig. 14)

Fig. 15-17: Evolution ultrastructurale de la paroi des ascospores de T. leonis (suite). Complexité

croissante de l'exospore, qui produit l'ornementation. Contraste par l'acétate d’uranyle et le citrate de

plomb (fig. 15 et 16) et test de Thiéry (fig. 17). Echelle: 0,25 um (fig. 15), 0,5 um (fig. 16 et 17)

Fig, 15-17: Ultrastructural development of ascospore wall in 7: /eonis (continued). Exospore deve-

lopment produces the ornamentation. Contrast: uranyl acetate and lead citrate (fig. 15 and 16);

Thiery's test (fig. 17). Scale: 0,25 ym (fig. 15), 0,5 um (fig. 16 and 17).

Fig. 18 et 19: Evolution ultrastructurale de la paroi des ascospores de T. leonis (fin). Réalisation de

l'omementation caractéristique en roue crantée. Contraste par l'acétate d'uranyle et le citrate de

plomb. Echelle: 1 um (fig. 18), 0,5 um (fig. 19).

Fig. 18 and 19: Ultrastructural development of ascospore de T. leonis (the end). Specific ornamenta-

tion reproducing in section a cogged wheel. Contrast: uranyl acetate and lead citrate. Scale: 1 um

(fig. 18), 0,5 um (fig. 19)

Source : MNHN, Paris

L'ASCOCARPE DE TERFEZIA LEONIS 199

Source : MNHN, Paris

L. KHABAR etal,

200

Source : MNHN. Paris

L'ASCOCARPE DE TERFEZIA LEONIS 201

Source : MNHN. Paris

202 L. KHABAR et al.

Source : MNHN, Paris

L'ASCOCARPE DE TERFEZIA LEONIS 203

as mn

E fap y E

GER NET NS S 20

Fig. 20: A à G, évolution de la paroi ascosporale de T. leonis. Schémas récapitulatifs. ec: ectospore,

en: endospore, ep, épispore, ex: exospore, pe: périspore, pp: paroi primaire.

Fig. 20: A to G, ascospore wall development in T. leonis. Diagrams. ec: ectospore, en: endospore, ep:

epispore, ex: exospore, pe: perispore, pp: primary wall.

Les autres parties de la paroi ascosporale évoluent également. L’ectospore,

mince, entrafnée par l'allongement des verrues, tend à se déchirer entre celles-ci, pour

finalement ne coiffer que leur extrémité. Corrélativement, une endospore (en) régulière,

mince, apparaît à la base de l'épispore, mais sa distinction s'atténue au stade adulte du

fait qu'une fine stratification, avec alternance irréguliére de couches claires et opaques,

apparaît dans l'épispore.

DISCUSSION ET CONCLUSION

L'étude que nous avons rapportée montre que l'ascospore hypogé de 7. leonis

comporte, comme ceux de T. leptoderma (Janex-Favre et al., 1988) et des divers Tuber,

Source : MNHN. Paris

204 L. KHABAR et al.

un péridium et une glébe; ces deux parties fondamentales présentent toutefois des ca-

ractéres différents dans les deux genres. Ainsi, le péridium est lisse chez les Terfezia,

tandis qu'il peut étre écailleux chez les Tuber, en particulier 7. melanosporum. Dans la

glébe des Terfezia les asques et le tissu interascal forment des nodules que sépare un

réseau stérile formé de cellules polygonales étroitement accolées. Ainsi organisé, ce

réseau dense ne constitue pas un systéme de veines stériles aussi caractérisé que chez

les Tuber. Ces dernières sont en effet nettement individualisées dans la glébe du fait

qu'elles sont bordées par une palissade dense de paraphyses. Les Tuber présentent ainsi

un hyménium dissocié (paraphyses dans les veines stériles et asques dans les veines

fertiles) alors que les Terfezia, dépourvues de paraphyses n'ont pas d'hyménium. Quant

au tissu interascal de T. leonis, il présente, comme celui de T. leptoderma, une texture

dense, ce qui le distingue de celui des Tuber, qui est formé d'un enchevétrement de

files cellulaires distinctes (Parguey-Leduc et al., 1987 b, 1988, 1989, 1990).

Les asques de T. leonis évoluent globalement comme ceux de T. claveryi

(Janex-Favre & Parguey-Leduc, 1985) et de T. leptoderma (Janex-Favre et al., 1988)

d'une part, et ceux des Tuber d'autre part. D'abord de forme allongée, à un stade très

jeune, ils deviennent rapidement globuleux. Ils montrent une polarité dans la répartition

de leurs constituants, qui se modifie au cours du développement. Dans l'asque jeune, il

y a superposition de deux zones: une zone sporogène, au sommet, et au-dessous une

zone contenant des réserves. Par la suite ces deux zones deviennent concentriques: celle

contenant les ascospores se situe au centre de l'asque et celle qui renferme le glycogène

en périphérie.

Les asques contiennent huit ascospores chez les Terfezia, alors que chez les

Tuber, le nombre d'ascospores varie de un à huit. Dans les deux genres la paroi as-

cosporale est complexe et ornementée, mais des différences existent, concernant

l'origine de l'ornementation et l'existence d'une endospore. Ainsi l'ornementation de la

paroi des ascospores adultes de T. leonis, qui ne correspond pas, comme le suggérait

Malengon (1973), à des craquelures prismatiques de la périspore, est constituée en

réalité de protubérances exosporales qui conférent aux ascospores, vues en coupe, la

forme d'une roue crantée. Chez les Tuber, selon les espéces, l'ornementation de la

paroi ascosporale peut également dériver de l'exospore (cas de T. aestivum et T. mela-

nosporum, Janex-Favre & Parguey-Leduc, 1983), ou étre formée par la périspore. Une

endospore se différencie chez T. leonis, comme chez T. claveryi, sans toutefois demeu-

rer aussi distincte au stade final. Chez T. leptoderma et les Tuber, par contre, elle ne se

forme pas.

En conclusion, cette étude montre que les caractéres fondamentaux

d'organisation de l'ascocarpe et des asques de T. leonis sont proches de ceux des autres

Terfez déjà étudiés mais également, malgré certaines différences mineures, de ceux des

Tuber. Ces caractères étant tout à fait originaux par rapport à ceux des autres Discomy-

cètes, cela justifie que les genres Terfezia et Tuber soient réunis dans l'ordre des Tubé-

rales. Le fait que quelques caractères se retrouvent chez les Pézizales, en particulier les

formations septales des hyphes stériles (Schrantz, 1970; Curry & Kimbrough, 1983;

Kimbrough & Curry, 1986 a et b) permet toutefois de penser que ces deux ordres de

Discomycétes ont pu dériver d’un ancétre commun.

Source : MNHN, Paris

L'ASCOCARPE DE TERFEZIA LEONIS 205

Remerciements

Nous remercions amicalement pour leur aide technique: M. AVNAIM, J. BIDOUX, C.

FOURNIGAULT, T. JALANTI, N. JAMPSIN et H. KHABAR.

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CULTURAL CONDITION FOR GROWTH AND SPORULATION

OF COLLETOTRICHUM FALCATUM

(SUGARCANE RED-ROT FUNGUS)

D.B. OLUFOLAJI

Department of Crop Production, Federal University of Technology,

P.M.B 740, Akure, NIGERIA.

ABSTRACT - Temperature, culture media, nitrogen sources, and inoculation methods were

evaluated for their effects on sporulation and growth of the sugarcane red-rot pathogen. When agar

media were inoculated with mycelial disks, sporulation was optimum at 15 to 27°C. The optimum

range expanded to 30°C in cultures on sugarcane stalk extract agar but showed a narrow peak at 27°C

when agar media were inoculated directly with spore suspensions. Sugarcane stalk extract agar

supported better sporulation than PDA, NA, WA, or any other agar media, Furthermore L-glutamic

acid was the best organic nitrogen source for sporulation. Agar cultures incubated at 10°C, reduced

the viability of conidia. Longevity of Colletotrichum falcatum spores in vitro was better on sugarcane

stalk extract agar than on PDA. However, mycelial dry weight growth was better with organic than

with inorganic nitrogen sources.

RÉSUMÉ - Les effets de la température, de la composition du milieu de culture, de la source azotée

et des méthodes d'ensemencement sur la croissance du champignon agent de la "pourriture rouge" de

la canne à sucre ont été déterminés. Quand la culture est inoculée avec un disque mycélien, la

production de spores est optimale entre 15 et 27°C. Cette gamme est étendue à 30°C pour les cultures

Sur extrait de canne à sucre gélosé mais elle devient très étroite autour de 27°C, si l'inoculation est

effectuée avec une suspension de spores. La production de spores est meilleure sur un milieu à base

de canne à sucre que sur PDA., NA., WA. ou n! importe quel autre milieu solide. En outre, l'acide L-

glutamique est la meilleure source d'azote inorganique. L'incubation A 10” C de cultures gélosées

diminue la viabilité des conidies, La longévité des spores de Colletotrichum falcatum in vitro est plus

importante si elles ont été produites sur extrait de canne à sucre gélosé que sur PDA. Toutefois, le

poids de mycélium sec obtenu est plus élevé sur sources azotées organiques que sur azote

inorganique.

MOTS-CLÉS - Colletotrichum falcatum, Physallospora tucumanensis, sugarcane red-rot.

INTRODUCTION

Sugarcane red-rot caused by Colletrotrichum falcatum Went is prevalent in the

major sugarcane areas of the world, and causes considerable damage to the crop both in

cooler and warmer climates (Dickson, 1956).

Source : MNHN, Paris

208 D.B. OLUFOLAJI

The fungus exists in two forms; the teleomorph is the Ascomycete,

Physallospora tucumanensis Speg. and produce ascospores while the anamorph known

as Colletotrichum falcatum Went. belongs to the Fungi Imperfecti and produces conidia

freely (Carvayal & Edgerton, 1944; Dickson, 1956). However, the imperfect stage

which produces only conidia is observed in this study. After infection of the leaf

midribs, its spores develop mycelium which grows into the leaf tissue, penetrates and

secrets toxins which disintegrates the host cells and aid establishment of the fungus.

Thereafter, reproduction and production of spores take place. Ascospores are only

produced under special and limited conditions while conidia are produced most of the

time and under any condition, (Cavayal & Edgerton, 1944; Frohlich & Rodewald

1970).

Red-rot disease causes dry and wilted leaves, reduces sugarcane stands in a

plantation and also reduces the sugarcane stands availability in the sugarcane due to

sucrose inversion (Dickson, 1956; Frohlich & Rodewald, 1970).

Several studies on the disease have been focused on controlled measures such as

selection and use of resistant varieties (Sattar et. al., 1982, Steib & Chilton, 1951).

Informations on cultural conditions which promote growth and sporulation which could

be a prerequisite for future studies have not been reported in any recent work on C.

falcatum.

The present paper reports on an investigation on the optimum temperature,

appropriate media, method of cultivation and nitrogen sources for growth and

sporulation of the sugarcane red-rot pathogen.

MATERIALS AND METHODS

The isolates used in this study were obtained from a diseased sugarcane stem

from the experimental site of the Nigerian Sugar Company Estate, Bacita, Nigeria. Its

pathogenicity was confirmed by tests on healthy sugarcane plants in the greenhouse and

laboratory. The fungal stock culture were maintained on potato dextrose agar (PDA).

The solid media used for the investigations were PDA, water agar (WA), sugarcane

stalk extract agar (SSEA), cornmeal agar (CMA), malt extract agar (MEA), nutrient

agar (NA), yeast extract agar (YEA), dextrose agar (DA) and potato agar (PA). Media

were prepared according to manufacturers guidelines, except SSEA which contained

10g of sugarcane pulp and 20g of agar in 1 litre of solution. The media were sterilized

by autoclaving at 1.1kg/cm* (121°C) for 15 min. and 15ml were dispensed into 9cm

Petri dishes.

The basal liquid medium for the nitrogen nutrition study was the one used by

Kurtz & Fergus (1964) and Oritsejafor (1986) and consists of MgSO,.7H,O, 0.5g;

KH,PO,, 1.0g; thiamin, 0.1mg; biotin, 0.005mg; Fe, 0.2mg; Zn, 0.2mg; and Mn, 0.2mg.

in a quantity to yield an amount of nitrogen equal to that of 2g of asparagine per litre.

For organic nitrogen media the carbon supplement sources of the medium were added

to provide a total of 4g of carbon per litre (glucose carbon plus the amount of carbon

added in the organic nitrogen compound).

All components of the medium except the nitrogen sources were combined at

twice the desired final concentration, dispensed in 25ml parts in 250ml Erlenmeyer

Source : MNHN, Paris

GROWTH AND SPORULATION OF COLLETOTRICHUM FALCATUM 209

flasks and sterilized by autoclaving. 25 ml of the nitrogen solution at twice the desired

final concentration were sterilized separately in test tubes, cooled and asceptically

added to the cooled medium. Urea solutions were sterilized by seive filtration. All

solutions were adjusted to the required pH by added sterile 0.1N HCl or 0.1N NaOH.

Media were inoculated either with mycelial disks or with spore suspension.

Mycelial disk inoculations were made by using 6-mm diameter disks cut with a sterile

No. 34 cork borer from 4-day old cultures of the fungus on PDA. For experiments

involving solid media the disks were placed at the centre of the agar plates, otherwise

with liquid culture, disks were dropped into the flasks.

With spore suspension inoculations, 0.1ml of spore suspension (5,000

conidia/ml) was spread over the surface of the Petri dish agar medium. All cultures

were incubated for 7 days at each 3° intervals from 3 to 33°C. In the nitrogen studies,

shaked and stationary liquid cultures were compared for growth and sporulation at

27°C. The shaked cultures were placed in a shaker incubator at 27°C at 80 rpm.

Treatments were replicated four times and nitrogen free control media were included.

Conidia were collected from the solid media by pouring 10ml of distilled water

over the fungal colony, allowing it to stand for about 1 min. Spores were dislodged with

sterile camel's-hair brush and the water suspension was shaken and sieved through

double layers of cheese cloth to remove agar and mycelia debris. A haematocytometer

was used to count the conidia. Mycelia from liquid cultures was carefully removed

from the flasks and placed in clean Petri dishes containing 10m! of distilled water. The

mycelium was rinsed three times with distilled water and collected on a previously

dried filter paper and dried overnight at 80°C and weighed. The pH of the filtrates was

determined with a Beckman pH meter

The longevity of Colletotrichum conidia was determined by placing sporulating

cultures maintained on PDA and SSEA in storage at 10°C, Each month for 12 months,

samples of conidia were removed, washed, and germinated in water on microscope

slides at 27°C and about 100% RH.

Sporulation was also studied on sugarcane pulp. A spore suspension 10,000

conidia/ml was spread on the pulp surface and incubated at 27°C and 100% RH, for one

week. Then the surface was washed under running tap water and brushed with a sterile

camels' hair brush to remove conidia and leave only the mycelium embedded within the

pulp tissues. The pulp was incubated for another week under the same conditions, and

then examined for the presence and amount of sporulation.

Data analysis:

Duncan's Multiple Range Test (Little & Hill, 1975). This test is most widely

used when several multiple range tests are available. It gives protection against making

mistakes inherent in the indiscriminate use of the L.S.D. tests.

Here it is used for making all possible comparison among the fungus yields

under various nitrogen sources. The test however involves the calculation of shortest

significant differences (SSD) for all possible relative positions between treatment

mean in ascending arrays, using the formular below, and starting from analysis of

variance under completely randomised design.

Source : MNHN, Paris

210 D.B. OLUFOLAJI

a) LSD. ¿== t = obtained from studentised factor table.

b) Calculation of SSD for relative position in the array of means. Using significant

studentised factor from studentised table. Value of R, is read at 5% level of significant

from the table and the value is used for the equation:-

SSD = R(LSD). *SSD = Duncan Multiple Range

Values which could be used to separate the

treatment means.

RESULTS

Effects of temperature on sporulation

Temperatures from 15 to 27°C supported the production of large number of

conidia when mycelial disks were plated on PDA (fig. 1). There was no significant

difference in sporulation within these temperatures but sporulation was significantly

lower below 12 or above 30°C. There was no growth or sporulation at 30°C but a slight

one was obtained at 6°C. This pattern of temperature effects was similar on all the

tested media. When cultures were inoculated with conidia, sporulation increased greatly

from 15 to 27°C, and decreased from 27 to 33°C (Fig. 2). Sporulation was not observed

8 |

a |

os |

Sec

8234

ox |

ag |

EUM

529

Ba |

z 14

0 E

3 6 9. 12 15 18 21 24 27 30 33

Temperature °C

Fig. 1: Sporulation of cultures of Colletotrichum falcatum grown from mycelial agar disks, placed on

sugarcane stalk extract agar and incubated at various temperatures for 7 days

Source : MNHN, Paris

GROWTH AND SPORULATION OF COLLETOTRICHUM FALCATUM 211

Number of spores/ml of spore

suspension x10.000

0 ———

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33:

Temperature °C

Fig. 2: Sporulation of cultures of Collerotrichum falcatum grown from spores sown on sugarcane

stalk extract agar and incubated at different temperatures for 7 days.

from 3 to 9°C, while the greatest amount of conidia was produced at 27°C at about

43,000 conidia per millilitre of distilled water. The amount of conidia produced at this

temperature was significantly greater than for other temperatures.

It was also observed that a large amount of sporulation occurred at 9, 12 and

336,

Effect of medium on sporulation

When agar cultures were initiated with mycelial disks and incubated at 18°C for

7 days, C. falcatum produced the greatest amount of spores on SSEA (Fig. 3). Spore

production on SSEA was about twice that on NA, YEA, CDA, CMA and PA. The

proportions produced on PDA, MEA and WA as compared with SSEA were

approximately 0.75, 0.75 and 0.25 respectively. Furthermore, the mycelium was denser

on SSEA than on any other medium.

On the agar media inoculated with spores, and incubated at 27'C the sporulation

pattern differed from that on media inoculated with mycelial disks. SSEA medium

surpassed all others in promoting sporulation but there was lesser sporulation generally

than on media inoculated with mycelium (Fig. 3 and 4). Sporulation on SSEA was

twice as much as that on NA, YEA, CMA and PA. Sporulation on PDA, MEA, CDA

and WA as compared to SSEA was 0.80, 0.75, 0.20 and 0.15 respectively (Fig. 4).

On nearly all the media inoculated with mycelial cultures were able to produce

viable spores earlier and in larger quantity than spores inoculated on (Fig. 5). L-

glutamic acid supported significantly greater sporulation than other sources (Table 1).

This was followed closely by DL-aspartic acid for the first 30 days of growth. Glycine,

Source : MNHN, Paris

D.B. OLUFOLAJI

OL Se^ Hd renu

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Source : MNHN, Paris

GROWTH AND SPORULATION OF COLLETOTRICHUM FALCATUM 213

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TESTS

ss |

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852)

EET

SSEA PDA NA CDA CMA

Agar Media

Fig. 3: Sporulation of cultures of Colletotrichum falcatum when mycelial disks were plated on

different agar media and incubated at 10°C for 7 days. 1 = Least significant difference (P = 0.05).

2 5

2 5]

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$8 4|

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28 34

8 5

5 824

3 à

i | ER

o L1

SSEA PDA CDA

Fig. 4: Sporulation of cultures of Colletotrichum falcatum when spores were sown on different agar

media and incubated at 27'C for 7 days. I = Least significant difference (P = 0.05)

'ce : MNHN, Paris

214 D.B. OLUFOLAJI

91 mycelia

% Viable Spores x10

veu

10 12 14 16

Days after inoculation

Fig. 5: Viable spores produced by Colletotrichum falcatum in cultures formed by spores and mycelial

seeding methods I = Least significant difference (P = 0.05)

asparagine and DL-isoleucine also supported a considerable amount of sporulation

(Table 1). The organic nitrogen group was significantly better than the inorganic group

for sporulation.

Effect of culture age on spore viability

When sporulating cultures were maintained on PDA test tube slants at 10°C

there wan no significant decrease in viability during the first 3 months of storage (Fig.

6).

Months 4 to 6 were not significantly different from each other but showed

decreased viability, when compared to the first 3 months. There was a further decrease

in viability from the 7th to the 10th month, and no conidia viable at the 11th or 12th

month.

On the other hand, when cultures were stored on SSEA test tube slants the

percentage of viable conidia decreased significantly only from the 4th to the 9th month,

with slightly more decrease till 12 months (Fig. 7). Generally viability was greater on

SSEA than PDA cultures.

Growth on various nitrogen sources

The shaked and stationary cultures did not give significant different results.

Thus, means of the two treatments were combined for the presentation in Table 1.

Growth of C. falcatum was better in the organic than inorganic nitrogen sources, with

asparagine significantly leading all other sources. In all the inorganic nitrogen group

Source : MNHN, Paris

GROWTH AND SPORULATION OF COLLETOTRICHUM FALCATUM 21

| |

E aa

1 2 3 4 s 6 7 8

Culture Age (months)

% Germination X 10

Fig. 6: Germination of spores harvested at monthly intervals from cultures of Colletotrichum

falcatum stored on potato dextrose agar at 10°C. I= Least significant difference (P = 0.05).

10 4

xX 74

2 6]

$ 4|

$ 34

ie MAA"

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Culture Age (months)

Fig. 7: Germination of spores harvested at monthly intervals from cultures of Colletotrichum

falcatum stored on sugarcane stalk extract agar at 10°C. I Least significant difference (P = 0.05).

Dry wt. of mycelium (mg)

X 100

216 D.B. OLUFOLAJI

(NaNO,) and NH,SO,) supported the least growth. Autolysis and loss in mycelial dry

weight started earlier with NaNo, (after 15 days) than in asparagine or NaNO, (after 25

days) (Fig. 8). Throughout the experiments, cultures on asparagine had the greatest

amount of growth (Fig. 8).

Nitrogen sources influenced the final pH of the medium. The pH of the

asparagine medium rose from 4.6 to 8.2 at the end of the experiment while that of

NaNo, rose from 5.6 to 6.5. The control flask had scanty growth and it's pH decreased

from 6.6 to 5.2.

3:51

25 | —— asparagine

A —a— NaNO2

| —— NaNO3

1,5

0 S 10 15 20 26 30

Days of growth

Fig. 8: Mycelium produced by Colletotrichum falcatum in liquid culture containing asparagine,

NaNO, and NaNO,, as sources of nitrogen. I= Least significant difference (P = 0.05).

DISCUSSION

As reported on some other fungi, production of spores of C. falcatum could be

carried out on media inoculated with either mycelial or conidia. Olufolaji (1984)

demonstrated this with Curvularia pallescens Boed. There are crossed influences of

temperature on method of inoculation. Higher temperatures tolerance was noted in

cultures started from conidia than in those started from mycelium. This seems to agree

with the findings of Olufolaji (1984) for C. palescens. There is the possibility that

conidia need higher temperature than mycelium for initiating germination and growth,

before the sporulation can take place. In the already available mycelium, elongation

would only be needed and this requires lesser temperature and energy (Singh & Wood,

1956; Chi & Hanson, 1964; Olufolaji 1984; and Oritsejafor, 1986).

There was also an interaction of medium and inoculation method upon

sporulation. Nutrient rich media support sporulation differentiv in different methods of

Source : MNHN, Paris

GROWTH AND SPORULATION OF COLLETOTRICHUM FALCATUM 217

initiating cultures. However SSEA seemed to favour sporulation by either method of

inoculation. Olufolaji (1984) and Chi & Hanson (1964) had opposing results with C.

pallescens and Fusarium spp respectively, Chi & Hanson (1964) and Oritsejafor

(1986), observed that sporulation of Fusarium cultures initiated with conidia needed

more nutrients than those initiated with mycelial disc. Also, in C. falcatum nutrient rich

media were needed for sporulation more in one inoculation method than the other. It

thus became evident that mycelial initiated cultures sporulated earlier than conidia

initiated ones, this is because in mycelium, it only requires production of conidiophore

before conidia production, while conidia will need a lot of nutrient and energy for

germination to hyphae, to mycelium, before conidiophore prior sporulation.

The finding that L-glutamic acid was a superior organic source of nitrogen, and

that among inorganic sources NaNO, was best, agrees with those reported for several

imperfect fungi (Olufolaji, 1984; Tandon & Chandra, 1990). Sporulation on sugarcane

pulp was equivalent to conidia initiation through the mycelium planting method, since

the washed pulp contained initially mycelium but no conidia in its tissues. In agreement

with this, the temperature conditions that favoured sporulation by the mycelium

planting method also promoted that by washed sugarcane pulp. Conidia regularly lost

their viability during ageing in culture, as it had been shown for C. pallescens

(Olufolaji, 1984). However, unlike C. pallescens, some of the conidia of C. falcatum

were still viable after 12 months of storage at 10°C. This could be due to more food

reserve in the conidia (Carvayal & Edgerton, 1944) in contrast to those of C. pallescens

and Fusarium spp. (Olufolaji, 1984; Chi & Hanson, 1964). It was evident that SSEA

medium promoted the lowest maintenance of spore of C. falcatum culture.

Collectotrichum falcatum was able to grow very well on many organic and

inorganic nitrogen sources. This may afford it a capability of surviving well on a wide

variety of substrates as it is the case for many fungi (Chi & Hanson 1964; Olufolaji,

1984; Oritsejafor, 1986; Pfender & Wootka, 1987). The optimum nitrogen source for C.

falcatum growth is asparagine but this is usually not the one preferred by most parasitic

fungi, otherwise L-leuchine and Urea, which are poor sources of nitrogen for most

fungi, also gave poor growth in this study. However, NaNO, which supported greatest

growth in the inorganic nitrogen sources is among the best sources for most fungi

(Cochrane 1958; Kurtz & Fergus 1964; Olufolaji 1984; Oritsejafor, 1986, Tardon &

Chandra, 1990).

REFERENCES

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Phytopathology 34: 206-213.

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sporulation of Fusarium spp from clover. Phytopathology 54: 1053-1058.

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DICKSON J. G., 1956. - Diseases of Field Crops: McGraw Hill Co. London. Pp. 216-218.

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California, Davis U.S.A. Pp. 50-51.

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temperature and nitrogen sources. Phytopathology 74: 260-263

ORITSEJAFOR 1.J., 1986 - Carbon and nitrogen nutrition in relation to growth and sporulation of

Fusarium oxysporum. Trans. Brit. Mycol. Soc. 87 (4): 519-624.

PFENDER W.F. and WOOTKA S.L, 1987 - Production of Psendothecia and ascospores by

Pyrenophora triticirepentis in response to macro-nutrients concentration. Phytopathology

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SATTAR M.A., RAMAKISHNA RAO P. and NAGESWARA RAO P., 1982 - Screening sugarcane

clones for resistance to red-rot disease. Sugarcane Path. Newsletter 28: 11-14.

SINGH R.K. and WOOD R.S K,, 1956 - Studies in the physiology of parasitism. The production and

properties of pectic enzymes secreted by Fusarium moniliforme sheldon Ann. Bot. 20: 89-

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STEIB RJ. and CHILTON S.J.P., 1951 - Infection of sugarcane stalks by the red-rot fungus

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TANDON R.N. and CHANDRA R.P., 1990 - Nutritional factors affecting imperfect fungi. National

Acad. of Sci. India 61 (B): 391-398

Source : MNHN, Paris

Cryptogamie, Mycol. 1994, 15 (3): 219-221 219

ANALYSES BIBLIOGRAPHIQUES

ZHAO JI-DING et ZHANG XIAO-QING, 1992 - The Polypores of China. J. Cramer,

Bibliotheca mycologica, t. 145, 524 pp., 318 figures au trait.

Cet ouvrage présente 356 espèces ou variétés de champignons, réparties sur 76

genres, que les auteurs ont observées en Chine. Aprés une introduction consacrée à des

généralités sur les Polypores (p. 9-16) se trouve une liste alphabétique des

champignons, par genres et espèces (p. 17-27). Le corps de l'ouvrage proprement dit

offre ensuite des clés qui conduisent aux genres (p. 29-39), suivies des descriptions des.

genres (avec éventuellement des clés des espèces), des espèces et des variétés (p. 40-

506), dans le même ordre alphabétique que la liste précédente qui apparaît alors

superflue. Ces descriptions sont en général accompagnées chacune d'un dessin

d'hyphes de la trame et de basidiospores, si besoin est de cystides ou de soies.

L'ouvrage s'achéve avec une liste des Polypores de Taiwan (p. 507-510), reprise de

Z.C. Chen (Taiwania, 21: 129-132, 1976), une bibliographie (p. 511-516) et un index.

Contrairement à ce que suggére sa présentation, cet ouvrage semble étre

difficilement utilisable comme outil de détermination. Les clés, d'abord, offrent des

choix qui ne sont pas clairs si l’on ne connaît pas a priori le groupe auquel appartient le

champignon que l'on a entre les mains: «basidiocarpes à caractères macroscopiques

particuliers versus basidiocarpes à caractères microscopiques particuliers»,

«hyménophore irrégulier versus hyménophore régulier à assez régulier», «basidiospores

ornementées versus basidiospores lisses ou ornementées», etc. D'autre part, les auteurs

ont délibérément privilégié le critċre des structures de la trame (Introduction, p. 9-10),

en omettant systématiquement les caractéristiques taxonomiquement fiables des

basidiospores: réactions au Melzer, épaisseur des parois, etc. Les mensurations des

basidiospores elles-mémes sont données avec des dispersions qui les rendent souvent

peu utilisables, Est-il, par exemple, raisonnable d'utiliser le critère de taille des

basidiospores, comme cela est précisé implicitement (clé des espèces de Lenzites, p.

252), puis explicitement (Remarks, p. 257), pour différencier Lenzites acuta et L.

Japonica en donnant des mensurations respectives de 5-7,5 x 1,5-3 um et 5-7,5 x 2-2,5

um ?

Ces réserves faites, il s'agit d'un ouvrage qui a le mérite de présenter le premier

document synthétique consacré aux Polypores (Ganodermataceae exclues) de la flore de

Chine, pour lesquels on ne disposait jusqu'à présent, outre des articles originaux, que

de compilations consacrées à ces champignons dans des ouvrages mycologiques

généraux (S.C. Teng, 1939 et 1963; F.L. Tai, 1979). Et ce n'est pas une simple reprise

de ces éléments, mais le fruit d’études originales réalisées sur des échantillons récoltés

par les auteurs eux-mêmes ou leurs collaborateurs (Préface, p. 7). On peut alors

seulement regretter qu'ils n'aient pas relevé les identités précises des bois attaqués.

P. Joly

Source : MNHN, Paris

220 ANALYSES BIBLIOGRAPHIQUES

GINNS J. & LEFEBVRE M.N.L., 1993 - Lignicolous Corticioid Fungi (Basidio-

mycotina) of North America. Systematics, Distribution and Ecology. U.S.A.,

Minnesota, St, Paul, APS Press, Mycologie Memoir n° 19, V + 247 p. LS.B.N. 0-89054-

155-8

L'ouvrage est constitué par l'inventaire annoté des champignons

Basidiomycétes d'Amérique du Nord dont les fructifications, à surface soit lisse, soit

denticulée ou diversement plissée-alvéolée - bref, d'aspect corticioide -, poussent

étalées sur le bois. Il s'agit donc, comme le souligne d'ailleurs l'introduction, d'un

ensemble vaste et hétérogéne, tant d'un point de vue taxinomique que sous l'angle

écologique: 1163 espèce qui se répartissent dans 21 ordres et 54 familles ont en effet

été recensées, la plupart vivant en saprophytes, certaines étant parasites et quelques-

unes mycorrhiziennes. L'étude des très nombreuses récoltes a conduit les auteurs à

proposer 27 combinaisons nouvelles et un seul nouveau taxon de rang spécifique,

Tremella diaporthicola.

La liste des taxons examinés est présentée selon l'ordre alphabétique des genres

et, dans ces derniers, des espéces. Pour chacune de celles-ci se trouvent mentionnés

nom, auteurs, date et référence du basionyme, le ou les synonymes éventuellement, la

distribution géographique au Canada et aux U.S.A., les noms des essences hótes, les

caractères culturaux et les renvois à une bibliographie particulièrement abondante.

Toutes les explications concernant ces différents sujets sont détaillées dans la première

partie du livre qui est complété par deux index mettant en évidence les noms des

téléomorphes.

Ce travail apporte une contribution riche d'informations à la connaissance des

champignons lignicoles et sera un document de valeur pour l'analyse comparative avec

les flores fongiques similaires d’autres continents.

J. Perreau

SINGH K., FRISVAD J.C., THRANE U. and MATHUR S.B., 1991 - An illustrated

Manual on Identification of some Seed-borne Aspergillus, Fusarium and

Penicillium and their Mycotaxins. Ed. Jordbrugsforlaget, Frederiksbreg, Denmark,

133 pages.

L'identification traditionnelle morphologique et culturale des Aspergillus,

Fusarium et Penicillium est souvent l'objet d'incertitudes à cause de la variabilité des

souches en culture, méme sur milieux standardisés et des changements nomenclaturaux,

justifiés mais souvent difficiles à suivre par les non spécialistes.

Ce manuel présente la grande originalité d'adjoindre aux critéres traditionnels,

ceux qui concernent la production de mycotoxines (élément important dans le cas de

contamination des grains) et autres métabolites secondaires. Leur détection est

effectuée par une méthode trés simple de chromatographie en couche mince effectuée

directement à partir de petits fragments de culture, qui est exposée de facon claire et

fort démonstrative dans la première partie de l'ouvrage. Des tables de références des

caractéristiques des 74 mycotoxines testées, obtenues par chromato- et spectrographie,

Source : MNHN, Paris

ANALVSES BIBLIOGRAPHIQUES 221

sont proposées pour permettre l'identification des métabolites susceptibles d'étre

rencontrés et, par suite, celle des champignons correspondants.

Dans la deuxième partie de l'ouvrage, les espèces (15 Aspergillus, 9 Fusarium,

18 Penicillium) sont décrites sommairement de façon plus classique: caractères

culturaux, morphologie des appareil conidiens (et sexués) et, bien sûr, mycotoxines

caractéristiques. Ces descriptions sont accompagnées de schémas et de photographies

en couleur des cultures et des préparations microscopiques de qualité inégale ne

correspondant méme, parfois, ni à la réalité des observations ni aux descriptions.

Une bibliographie bien documentée et critique termine l'ouvrage.

En résumé le grand intérét de ce manuel et son originalité résident dans

l'approche métabolique pratique de l'identification des Aspergillus, Fusarium et

Penicillium. Il sera certainement trés utile aux microbiologistes, phytopathologistes et

méme aux taxonomistes auxquels il apporte une méthode simple et des données

complémentaires utilisables dans l'identification.

M.F. Roquebert

BIBL. DU

MUSÉUM

PARIS

* Source : MNHN. Paris

merie F. Paillart

58611 - Dépôt légal 3* trimestre 1994 - Im

le 30 septembre 1994- Imprimé en Fran

Éditeur : A.D.A.C. (Association des Amis des Cryptogames)

Président : D. Lamy: Secrétaire : B. Dennetiére

Trésorier : E. Bury: Directeur de la publication : H. Causse

Commission paritaire 16-1-1986

Sortie des pres

Source : MNHN. Paris

CRYPTOGAMIE

Diffusion de CRYPTOGAMIE

LE PERIODIQUE FRANGAIS

CONSACRE A LA CRYPTOGAMIE

CRYPTOGAMIE est un périodique édité

par l'A.D.A.C. (Association des Amis des

Cryptogames), dont le siège est au Labo-

ratoire de Cryptogamie du Muséum Na-

tional d'Histoire Naturelle. Les cher-

cheurs de tous pays y publient leurs

travaux en francais, allemand, anglais, es-

pagnol et italien, aprés accord des

Comités de Lecture constitués de

spécialistes de réputation internationale.

CRYPTOGAMIE propose trois sections:

Cryptogamie, Algologi

Cryptogamie, Mycologie

Cryptogamie, Bryologie-Lichénologie

Chaque section publie 4 numéros par an

(tirage: 450 exemplaires).

THE FRENCH JOURNAL

DEVOTED TO CRYPTOGAMY

CRYPTOGAMIE is a periodical

published by A.D.A.C. (Association des

Amis des Cryptogames), settled at Labo-

ratoire de Cryptogamie, Muséum National

d'Histoire Naturelle. Research workers

from the whole world publish their papers

in French, German, English, Spanish and

Italian, after acceptation by a selection

commettee that comprises experts of inter-

national renown.

CRYPTOGAMIE offers to its subscribers

three sections:

Cryptogamie, Algologie

Cryptogamie, Mycologie

Cryptogamie, Bryologie-Lichénologie

Each section publishes 4 numbers a year

(printing: 450 ex.).

Eltuope Marie C Australie |

Amérique LE Asie

Origine des 453 articles publiés de 1986 à 1991

Europe

Amérique

Afrique

Basie

Répartition des articles publiés de 1986 à 1991 selon la langue

ES francais GH Espagnol Ml italien

A Angas C Atemana

Source : MNHN, Paris