CRYPTOGAMIE

Mycologie

ANCIENNE REVUE DE MYCOLOGIE

Fondée par R. Heim en 1936

Directeur scientifique: Mme J. Nicot

Secrétaire de Rédaction: M. Bruno Dennetière

Editeur: A.D.A.C. - 12 rue Buffon F-75005 Paris

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Guesdes, F-31062 Toulouse Cedex) - Systématique: P. Joly (Laboratoire de Cryptogamie, Muséum

National d'Histoire Naturelle, 12 rue Buffon, F-75005 Paris) - Physiologie: G. Manachére

(Laboratoire de Mycologie, Université de Lyon I, 43 bd du 11 Novembre 1918, F-69622

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d'Orsay, Bat. 400, F-91405 Orsay) - Autres spécialités: M.F. Roqueber (Laboratoire de

Cryptogamie, Muséum National d' Histoire Naturelle, 12 rue Buffon, F-75005 Paris)

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MANUSCRITS

Les manuscrits doivent étre adressés directement à un membre du Bureau de Rédaction, choisi pour

sa spécialité, Le Bureau peut demander l'avis d'un lecteur méme s'il n'appartient pas au Comité de

Lecture, Bien qu'étant une revue de langue francaise, les articles rédigés en anglais, allemand, italien

et espagnol sont acceptés. Les disquettes de micro-ordinateurs (IBM, IBM compatible et MacIntosh)

sont vivement souhaitées. Les recommandations aux auteurs sont publiées dans le fascicule | de

chaque tome. Les auteurs recevront 25 tirés-à-part gratuits: les exemplaires supplémentaires seront à

leur charge.

TARIFS DES ABONNEMENTS Tome 16, 1995

CRYPTOGAMIE comprend trois sections: Algologie, Bryologie-Lichénologie, Mycologie.

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CRYPTOGAMIE, Mycologie est indexé par Biological Abstracts, Current Contents, Geo Abstracts,

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Source : MNHN, Paris

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Société Francaise de Microbiologie

28, rue du Docteur Roux - 75724 Paris Cedex 15

AS 68.81.79

Section

de Mycologie

Réseau de Mycologie

COLLOQUE

DES 26 ET 27 JANVIER 1995

Espace République

Montpellier

Re o . sa

iii

Tous les articles de ce fascicule sont issus des communi-

cations présentées au colloque organisé conjointement par la

Société Frangaise de Microbiologie, section Mycologie, et

par le Réseau de Mycologie.

Ces articles sont publiés avec Ia caution scientifique des organisateurs du colloque.

Source : MNHN, Paris

Cryptogamie, Mycol. 1995, 16 (1): 1-26 1

MYCOLOGIE TRADITIONNELLE ET NOUVELLES

TECHNOLOGIES:

QUELLE TAXONOMIE POUR DEMAIN ?

Régis COURTECUISSE

Département de Botanique

ulté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques.

B.P. 83 F. 59006 Lille Cedex

RÉSUMÉ - L'auteur dégage les tendances actuelles de la recherche mycologique, en taxonomie,

systématique et phylogénie. Les techniques "traditionnelles" semblent en nette régression par rapport

aux méthodes dérivées de la biologie moléculaire, dont l'apport est certes indéniable mais dont les

limites sont encore assez mal cernées. D'autre part, l'état actuel des connaissances taxonomiques du

règne fongique est encore trés rudimentaire et le contexte écologique est très inquiétant, De ce fait, il

est nécessaire d'accélérer les études descriptives sur le terrain avant que les espèces encore inconnues

ne soient définitivement perdues, spécialement en milieu tropical. L'argument purement scientifique

de connaissance de la biodiversité peut être complété par plusieurs exemples d'applications

{protection des espèces et des écosystèmes qui passe par une connaissance fonctionnelle, mais aussi

taxonomique; utilisation des champignons en tant qu'alliés dans différents domaines: bio-indication,

pharmacologie, lutte biologique, bio-technologies, etc.). La nécessité vitale d'une collaboration

équilibrée entre tendances "traditionnelles" et "modernes" de la mycologie est mise en évidence.

SUMMARY - The author considers the present trends in mycological research, especially dealing

with taxonomy, systematics and phylogeny. "Traditional" methods seem clearly regressing if compa-

red with molecular methodologies, which contribution is undeniable but which limits are still rather

poorly known. On the other hand, the present taxonomical knowledge of the fungal kingdom is very

weak and the ecological context very disquieting. Therefore, it is necessary to develop descriptive

studies in the field, before the unknown species become vanished, especially in The Tropics. The

purely scientifical argument concerning the basic knowledge of biodiversity can be strengthened

with some applied examples (conservation of species and ecosystems bound to a functional but also

taxonomical knowledge; uses of fungi as allies in different topics -bio-indication, pharmacology,

biological control, bio-technologies, etc.). The necessity for a balanced co-operation between

“traditional” and "modern" trends of mycology is strongly emphasized.

KEY-WORDS - Mycology, macromorphology, micromorphology, ultrastructure, chemotaxonomy,

biological species, molecular taxonomy, systematics, phylogeny.

Source : MNHN, Paris

R. COURTECUISSE

INTRODUCTION

Cette réflexion sur les tendances actuelles de la recherche en biologie, principa-

lement dans les domaines taxonomique et systématique, ne prétend pas révéler de

problèmes inédits. Il s'agit surtout d'attirer à nouveau l'attention de la communauté

scientifique sur un danger qui la menace de plus en plus gravement (en effet, l'argu-

mentaire mycologique, dû à ma propre spécialité, pourrait être étendu à toutes les

disciplines de la botanique, de la zoologie et de la microbiologie au sens large). D'au-

tres avant moi ont tiré la même sonnette d'alarme. Il s'agit bien en effet de s'alarmer de

la disparition progressive de la taxonomie descriptive face à ce que j'appellerai le "raz-

de-marée moléculaire". Loin de moi, bien sûr, l'idée stupide de renier l'intérêt considé-

rable des résultats apportés par ces techniques. Il s'agira plutôt d'un plaidoyer en faveur

du maintien d'un équilibre judicieux entre les tendances traditionnelles et modernes de

la mycologie.

LES DIFFÉRENTES DISCIPLINES DE LA MYCOLOGIE.

APERÇU HISTORIQUE:

Les premiers mycologues étaient, vers la fin du 18ème et au début du 19ème

siècle, des naturalistes polyvalents, essentiellement descripteurs. L'état des connaissan-

ces et des techniques de l'époque leur donnait seulement accès aux caractères morpho-

logiques, visibles directement, ce qui les a conduit à ranger ensemble des champignons

totalement étrangers. Par exemple, les actuels Gasteromycetideae et les Myxomycètes,

étaient réunis sous le nom de Myxogastres, sur la base de la forme plus ou moins sphé-

rique de beaucoup de ces espèces. Le grand genre Boletus concernait toutes les espèces

présentant une surface fertile ouverte à l'extérieur par des pores (actuels bolets et poly-

pores, ces deux termes dans leur sens morphologique encore très large).

Le développement de la microscopie a permis la découverte des différents types

de cellules reproductrices et de distinguer plus ou moins clairement les grands groupes

actuels, par exemple, les Asco- des Basidiomycétes. En effet, certains types morpholo-

giques communs aux deux coupures -comme le type clavarioide rencontré chez certains

Xylaria, les Geoglossum (Asco) et les "clavaires" (Basidio)- procuraient des sources

d'erreur de classement.

La structure anatomique des différentes parties des sporophores a également

donné lieu à des éclaicissements décisifs. Le suisse Vincent Fayod, par exemple, a mis

en évidence l'intérét des structures des revétements chez les champignons agaricoides.

Certains taxons actuels sont en partie définis de cette facon, comme les Bolbitiaceae

(Cortinariales), à revêtement piléique hyméniforme.

Des systèmes de classification se basant sur l'observation microscopique dé-

taillée, en fonction des moyens de l'époque, furent proposés dès la fin du 19ème siècle,

par exemple, pour les Basidiomycotina, par Fayod (1889) et Patouillard (1887, 1900).

Certains points de ces classifications historiques sont d'ailleurs encore admis actuelle-

ment.

La curiosité des anciens mycologues, tout en continuant à susciter la description

de nouvelles espéces (domaine de la taxonomie), s'est ensuite rapidement orientée vers

Source : MNHN, Paris

MYCOLOGIE TRADITIONNELLE ET NOUVELLES TECHNOLOGIES 3

la compréhension du fonctionnement de l'organisme fongique (biologie). L'établisse-

ment d'un système de classification (systématique) et d'un schéma théorique de filiation

des différents groupes reconnus (phylogénie) bénéficièrent également de l'intégration

progressive des nouvelles données biologiques et d'une sophistication croissante des

techniques

Je limiterai donc ce propos à ces quelques domaines précis, laissant de côté

d'autres disciplines comme la mycologie médicale, la physiologie et l'éco-physiologie,

l'écologie et la synécologie (étude des communautés fongiques, biologie des popula-

tions, etc.), la phytopathologie, le domaine des mycorhizes, et bien d'autres.

MYCOLOGIE TAXONOMIQUE, SYSTÉMATIQUE ET PHYLOGÉNIQUE:

Introduction

Le stimulus qui m'a poussé à cette réflexion est une impression empirique,

ressentie au dernier congrès mondial de Vancouver (IMCS). Sans vouloir en faire une

analyse statistique précise, j'ai été fortement impressionné par le fait que les communi-

cations "moléculaires" ont largement dominé les différents séminaires et séances de

posters, phénomène particulièrement frappant pour quelqu'un qui avait également par-

ticipé au précédent congrés mondial, à Regensburg en 1990 (IMC4). Cet intervalle de 4

années a été suffisant pour que le rythme de production des "moléculaires" (si l'on veut

bien me permettre ce raccourci) s'emballe littéralement, évidence dont l'ampleur peut

étre sous-estimée si l'on se contente de feuilleter, au laboratoire, la littérature purement

mycologique. En effet, beaucoup de travaux de ce type sont publiés dans des périodi-

ques traitant de microbiologie, de génétique, de biologie moléculaire, de biochimie, etc.

(voir bibliographie).

En tant que mycologue "de terrain", je ne peux rester insensible à cet état de

fait: nous assistons, à mon sens, à un dérapage non contrólé des tendances de la recher-

che, privilégiant de nouvelles technologies, certes flamboyantes, mais au détriment

d'une tradition, dont les acquis se sont tranquillement accumulés depuis les origines de

la mycologie et surtout, dont les potentialités sont encore considérables.

Mycologie traditionnelle:

Taxonomie "classique"

Je regroupe ici toutes les études descriptives considérant les caractéres de ter-

rain (macroscopie, écologie, chorologie, etc.) et les caractères de laboratoire d'observa-

tion morphologique (microscopie optique et à balayage -SEM) ou nécessitant des ma-

nipulations relativement simples (cultures, etc.).

D'abord purement morphologiques, ces travaux ont abouti à une foule d'études

descriptives et à de grandes monographies classiques. Parmi les plus récentes, citons

Antonin & Noordeloos (1993), Brandrud er al. (1990, 1992, 1994), Hansen & Knudsen

(1992), Maas Geesteranus (1992), Noordeloos (1992), Pegler er al. (1993), Ryvarden &

Gilbertson (1993, 1994), Watling & Gregory (1993), etc.

Source : MNHN, Paris

4 R. COURTECUISSE

Des investigations de plus en plus fines ont permis d'intégrer de nouveaux ca-

ractéres à ces études taxonomiques. Néanmoins, la morphologie reste importante dans

les études récentes, méme pour certains champignons "inférieurs" ou Ascomycotina

(Benny, 1994; Hanlin, 1994; Pitt, 1994; Samson, 1994; Seifert & Okada, 1990; etc.).

L'étude détaillée, morphologique ou fonctionnelle, des cellules a également été

déterminante dans certains groupes (Buyck, 1990; Kost, 1990; Oberwinkler, 1982;

Póder, 1990; Triebel & Baral, 1993; VanBrummelen, 1994; etc.). Par exemple, Baral

(1992, 1993) réhabilite la microscopie "vitale" et démontre que l'observation minu-

tieuse du contenu des cellules vivantes peut jouer un róle taxonomique non négligeable.

Petrini & Petrini (1990) d'autre part, distinguent deux espèces très proches de Roselli-

nia par l'étude détaillée des tailles sporales.

L'étude des structures se montre également fructueuse, par exemple chez les

Basidiomycotina, avec les considérations sur le "mitisme" (monomitisme, dimitisme,

trimitisme), le sarcodimitisme (Redhead, 1987), la présence d'acrophysalides (Bas,

1990).

Les mécanismes ontogéniques ont également aidé les systématiciens (Reijnders,

1963, 1990; Reijnders & Stalpers, 1992).

L'intégration de toutes ces considérations raxonomiques aboutit à des travaux

d'ordre systématique, voire phylogénique (par exemple, Halling, 1994; Hiratsuka, 1990;

Krug, 1994; Laessoe, 1990; Letrouit er al., 1993; Moravec, 1990; Moss & Jones, 1993;

Pegler, 1994; Schumacher, 1990a; Senn-Irlet, 1990; etc.) ou inventorial, c'est à dire

visant à évaluer la biodiversité de certains secteurs géographiques ou de certains mi-

lieux (Courtecuisse, 1990, 1992; Franco-Molano, 1994; Heredia er al., 1994; Huhndorf,

1994; Iturriaga,1994; McKenzie & Hyde, 1994; Mueller, 1994; Ovrebo, 1994a, 1994b;

Ryvarden, 1994a; VanderGucht, 1990, 1994; Wu & Mueller, 1994; Zhuang & Korf,

1990: etc.).

Cette mycologie "classique" appelle quelques remarques générales:

a) Ce domaine est riche en travaux de mycologues amateurs. C'est un fait

historique: des noms illustres de la mycologie sont ceux de pharmaciens, médecins,

ecclésiastiques, etc. Cette tendance est toujours vivace et des revues d'excellent niveau,

parfois de diffusion internationale, sont animées par des mycologues non professionnels

(par exemple Documents Mycologiques, Rivista di Micologia, Zeitschrift für

Mykologie, etc.). Leur contenu reste largement descriptif et proche de l'esprit de la

mycologie "de terrain". De ce fait, les mycologues "de terrain", acteurs indispensables

des étapes fondamentales de la mycologie, ne percoivent pas toujours nettement

l'évolution actuelle de leur discipline.

b) Des concepts taxonomiques diamétralement opposés existent. La notion

d'espèce fait depuis toujours l'objet d'un débat passionné. Certains adoptent un concept

spécifique très large, synonymisant de nombreux binômes alors que d'autres préfèrent

une définition très étroite de l'espèce, créant de nouveaux taxons à un rythme parfois

inquiétant. Les "conflits" entre auteurs appartenant à des "écoles" opposées sont parfois

épiques et illustrent ce propos. Face à ces difficultés et à cette hétérogénéité, il est

permis de rêver à un compromis universel, enfin admis par tous.

c) Il est évident que les moyens d'investigations classiques connaissent des

limites. Certains groupes restent extrèmement difficiles avec ces seuls moyens. C'est le

Source : MNHN, Paris

MYCOLOGIE TRADITIONNELLE ET NOUVELLES TECHNOLOGIES 5

cas, entre autres, des Endogonaceae, où la classification est basée essentiellement sur

les caractères des spores, peu nombreux (Dalpé, 1994), de certains Coelomycetes (Van

der Aa et al., 1990), des Ganoderma (Ryvarden, 1994b), etc. D'autre part, on a pu

mettre en doute (Huhtinen, 1993) la pertinence des observations de certains

mycologues, ou au moins souligner l'hétérogénéité de niveau des publications, rendant

difficile l'exploitation des données de la littérature. La faiblesse des illustrations est

parfois également préjudiciable à l'interprétation de travaux par ailleurs très importants.

Sexualité. Espèces biologiques:

Les cultures, au delà de leur rôle taxonomique immédiat (aspect, vitesse de

croissance, réactions aux variations de conditions, etc.), ont permis d'étudier les polari-

tés, dites "sexuelles", des champignons. Depuis les pionniers (Bensaude, 1918 et Van-

dendries, 1923), de nombreux chercheurs ont développé ce thème et on a proposé une

définition "biologique" de l'espèce qui postule, grosso modo, que des récoltes

"incompatibles" ne peuvent être conspécifiques alors (ше des souches

"intercompatibles" appartiennent à une seule et même espèce.

En ce qui concerne les Basidiomycotina, ce concept d'espéce biologique a été

largement utilisé pour les Phragmobasidiomycétes et les Aphyllophoromycetideae

(Boidin, 1977, 1986, 1995; Boidin & Lanquetin, 1965, etc.) et certains Agaricomyceti-

deae comme les Coprinus (Lange, 1952, Kemp, 1975, etc.), les Armillaria (par exem-

ple, Korhonen, 1978, Volk et al, 1994) et plus récemment beaucoup d'autres genres

(Petersen, 1994a, 1994b, etc.).

Ces travaux et les connaissances qui en découlent, ont permis de résoudre cer-

tains problémes taxonomiques et systématiques. Par exemple, la comparaison de récol-

tes éloignées (allopatriques) attribuées à un méme taxon ont permis de confirmer ou

d'infirmer, selon ce principe, leur conspécificité.

Mais cette définition biologique, apparemment universelle, se heurte pourtant à

certains écueils, dont le principal est certainement le fait que les spores de peu d'espè-

ces acceptent de germer en culture. Les mycéliums nécessaires à la confrontation ne

sont pas toujours obtenus, limitant par là méme la portée pratique de ce postulat.

Chimitaxonomie:

Les chimiotaxonomistes postulent que l'évolution a pu conserver, au fil des

étapes phylogéniques, des "traceurs" chimiques de parenté. Partant de cette idée, on a

tenté de rapprocher certaines espèces apparemment très dissemblables sur la base de la

présence de molécules communes.

La nature chimique des molécules étudiées est très variée, de même que les

techniques employées, Les progrès chromatographiques ont permis, entre autres, d'affi-

ner ces études. Dans certains cas, l'association de méthodes taxonomiques diverses (par

exemple morphologiques) et chimiques peut faciliter la détermination d'espèces appar-

tenant à des groupes difficiles. Citons, parmi d'innombrables exemples potentiels,

quelques références: Andary er al. (1988, 1990, 1992) pour les polyols et amino-acides

des Boletales, Besl (1990) pour les métabolites secondaires du méme groupe; Edwards

(1994) pour des lactones, quinones et acides chez les Xylaria, Whalley & Edwards

(1994) pour les métabolites secondaires des Xylariaceae; Kreisel & Schubert (1994) et

Source : MNHN, Paris

6 R. COURTECUISSE

Kuraishi et al. (1985) pour les ubiquinones; Bérubé & Dessureault (1990), Gottlieb &

al (1994), Hughes & Petersen (1994), Morrison et al. (1985), pour les iso-enzymes, etc.

Bien que trés performante dans certains cas, cette discipline posséde également

des limites. J'en citerai deux exemples.

L'ordre des Boletales, caractérisé par la présence d'acides pulviniques ou inter-

médiaires métaboliques (tyrosine, atromentine, etc.), a fait l'objet d'élargissements à

différents taxons lamellés (Paxillaceae, Gomphidiaceae en particulier), gastéroides

(sécotioides comme les Rhizopogon, Chamonixia, etc.) ou encore corticioides (les

Coniophora, que l'on interpréte -Besl, 1990- comme étant proches de l'origine phylogé-

nétique de l'ordre). La parenté des espèces lamellées est compréhensible, également sur

la base d'autres caractères (structure, spores, etc.). Les formes sécotioïdes sont fré-

quemment affines à des taxons lamellés ou bolétoides (voir par exemple, Thiers, 1984).

Mais la parenté d'espèces corticioïdes doit être considérée avec prudence si elle n'est

avancée que sur un argumentaire chimique. On peut en effet trouver des cas manifestes

de convergence chimique. Qui songerait, par exemple, à ranger dans une même série

phylogénique Amanita phalloides, Lepiota helveola, Galerina marginata et Pholiotina

filaris, pourtant toutes pourvues d'amanitines ?

D'autre part, la chimie est importante dans le genre Cortinarius (s.l.), réputé à

juste titre très difficile. Les analyses pigmentaires ont amené certains chercheurs à

synonymiser certaines espèces, jusque là distinguées macroscopiquement (voir Hgiland,

1983). Est-il raisonnable de privilégier à ce point une technique chromatographique

alors que nos sens perçoivent une différence et semblent, en l'occurence, supérieurs à la

machine ?

Stades imparfaits

Le cycle de vie de certains champignons voit alterner différentes phases, mito-

tiques ou asexuées (anamorphes) et méiotiques ou sexualisées (téléomorphes). Une des

conséquence est que l'on tend à ne plus séparer aussi nettement, dans les classifications,

les champignons "imparfaits" des champignons "supérieurs" (Reynolds, 1993). Les

anamorphes sont d'autre part importants pour déterminer les affinités phylogéniques.

Ces études concernent essentiellement les Ascomycotina (par exemple Crous & Wing-

field, 1993 pour les genres Calonectria et Nectria, Lodha & Mathur, 1994 pour divers

phytopathogenes et Rogers, 1990 pour les Xylaria) et les Basidiomycotina inférieurs

(par exemple Bandoni, 1994 et Oberwinkler, 1987 en ce qui concerne les Hétérobasi-

diomycètes dimorphiques à stade levure). Elles peuvent, dans certains cas et souvent

associées à des techniques moléculaires, préciser l'attribution systématique d'espèces

problématiques (par exemple, Ando er al., 1994, qui transférent Mixia osmundae des

Asco- aux Basidiomycétes).

Mais les phases mitotiques se rencontrent essentiellement chez des champi-

gnons relativement "inférieurs" et sont trés rares chez les Homobasidiomycétes. Encore

assez répandues chez les Aphyllophoromycetideae, elles deviennent exceptionnelles

chez les Agaricomycetideae. De ce fait, la portée de l'étude des stades imparfaits, bien

que trés importante pour les groupes concernés, ne saurait étre générale.

Source : MNHN, Paris

MYCOLOGIE TRADITIONNELLE ET NOUVELLES TECHNOLOGIES 7

Ultrastructure

Le microscope électronique à transmission (TEM) permet de mettre en évidence

l'ultrastructure des cellules, des organites et l'arrangement macromoléculaire des struc-

tures. Depuis Girbardt (1958), pionnier en la matiére, on a beaucoup étudié la structure

des parois (hyphes, spores, etc., voir par exemple Bellemére & Melendez-Howell,

1993; Clémençon, 1970; Perreau, 1967; Verkley, 1993, etc.). On s'est ensuite tourné

vers les perforations inter-cellulaires, caractéristiques selon le groupe considéré. Ces

techniques ont permis, parfois en association avec d'autres, de rectifier des attributions

systématiques de taxons problématiques (Ando er al., 1994) et. de réviser certains points

de la classification ou des parentés phylogéniques. Certains travaux sont importants

dans ce domaine: Khan & Kimbrough (1982), Kimbrough (1990, 1993), Moore (1971,

1978, 1994), Moore & McAlear (1962), Oberwinkler (1990), Patton & Marchant

(1978), Thielke (1972), etc.

Des améliorations techniques laissent espérer ici de nouveaux développements

(Müller et al., 1994).

Mycologie moléculaire, informatique et hypothèses alternatives:

Biologie moléculaire:

La découverte des acides nucléiques remonte à 1868 (Mischler), celle de la

double hélice du DNA à 1953 (Watson & Crick). Dérivant de ces découvertes, la bio-

logie moléculaire, qui vise à expliquer tous les phénomènes biologiques à l'échelle des

molécules, a révolutionné la plupart des branches de la biologie. On assiste, depuis

quelques années, à un développement vertigineux des travaux de cet ordre dans les

domaines qui nous intéressent, taxonomie, systématique et phylogénie.

Ses principes et techniques sont actuellement bien connus (voir deLey et al.,

1970, White et al. 1990) et il existe des travaux de synthése sur leurs applications dans

le domaine de la mycologie (par exemple, Bruns er al., 1991; Metzenberg, 1991).

A l'aide de différentes techniques, il s'agit de déterminer la composition et les

séquences nucléotidique des DNA et RNA. Ces acides nucléiques peuvent étre d'origi-

nes diverses, essentiellement ribosomique (nombreux travaux), nucléaire (voir Bruns er

al., 1992) ou mitochondrial (voir Bruns et al., 1988; Bruns & Palmer, 1989; Hibbett,

1992:535; Taylor, 1986).

Divers fragments d'acides nucléiques sont employés: On a d'abord utilisé le 5S

rRNA (par exemple, Huysmans et al., 1983, qui montrent le caractère polyphylétique

du régne fongique; Walker & Doolittle, 1982 qui établissent la corrélation entre des

séquences similaires et la présence d'un "dolipore septum"; etc.). Ce RNA est actuelle-

ment abandonné pour les reconstructions phylogéniques (Hibbet, 1992:542). Les 18S et

25S rRNA l'ont ensuite remplacé (voir par exemple, Baharaeen & Vishniac, 1984 pour

le 258 et pour le 18S, Berbee & Taylor, 1992, 1993; Gargas, 1992; Saenz et al., 1994,

qui établissent que les Erysiphales ne sont ni des Pyrénomycétes, ni des Plectomycètes,

classes entre lesquelles on hésitait pour ranger ces champignons !). On utilise égale-

ment le 17S rRNA, pour étudier les relations entre les grands groupes d'organismes

vivants (des exemples de travaux concernant les micromycétes sont donnés par Hibbett,

1992:543 et Hendricks et al., 1991. Pour les Basidiomycétes supérieurs, voir Bruns er

Source : MNHN, Paris

8 R. COURTECUISSE

al., 1989; Bruns et al., 1990 pour les Boletales et Hibbett, 1991 pour le genre Lentinus)

et parfois le 16S rRNA ou le 5.8S rRNA. Le DNA fait également l'objet de séquen-

çage. Voir par exemple Hibbett & Vilgalys (1991) et Vilgalys & Hester (1990).

Les méthodes de choix pour déterminer ces séquences nucléotidiques sont ba-

sées sur l'utilisation des enzymes de restriction (surtout RFLP, restriction fragment

length polymorphism). Le DNA est digéré par ces enzymes et les profils électrophoré-

tiques des fragments sont utilisés pour étudier le degré de relation entre espèces étu-

diées. Les séquences sont également obtenues, en routine, par PCR (Polymerase Chain

Reaction, voir Innis et al., 1990). Un des nombreux intérêts de cette méthode est d'être

applicable aux spécimens d'herbier (Bruns er al, 1990), aux spores isolées (Lee &

Taylor, 1990) et méme aux espéces éteintes, voire aux fossiles (Golenberg er al,

1990)! On peut en trouver une description et l'analyse des applications de ces

techniques dans certains travaux (par exemple Bruns et al, 1991). Mais certains

problèmes d'interprétation des résultats existent (voir Hibbett 1992:539).

De nombreux exemples de RFLP portent sur des Micromycéte et les premieres

références traitent de Fungi Imperfecti ou de levures (Kozlowski & Stepien, 1982;

McArthur & Clark-Walker, 1983). De trés nombreuses publications concernent égale-

ment les macromycètes, par exemple les Sclerotinia (Kohn et al., 1988), Laccaria

(Gardes et al., 1990), Agaricus (Castle et al, 1987), Agrocybe (Rehner & Ammirati,

1987), divers (Rogers et al., 1989), etc.

Des développements plus récents introduisent l'étude de nouveaux fragments

nucléiques, plus informatifs sur le plan taxonomique (ITS: Internal Transcribed Spacer)

ou de nouvelles techniques (par exemple dérivée de la PCR comme le RAPD: Random

Amplified Polymorph DNA; voir par exemple Moens & Van Vaerenbergh, 1995).

Applications de la biologie moléculaire

a) En taxonomie:

Des techniques d'hybridation d'acides nucléiques (hybridation génomique) sont

utiles pour démontrer la parenté proche ou la conspécificité d'espèces (voir par exemple

Kurtzmann et al., 1979). Les aspects techniques sont détaillés par De Ley et al., 1970.

Elles ont été utilisées sur les champignons filamenteux et autres champignons

"inférieurs" (voir par exemple, Guého er al., 1985; Vilgalys, 1988) et sur les champi-

gnons supérieurs (par exemple, Horgen et al., 1984; Jahncke & Bahnweg, 1986).

Une aide très importante au diagnostic spécifique est également possible. Grâce

aux méthodes de PCR, on peut se servir des acides nucléiques comme moyen de dé-

termination, pour certains micromycètes, mais aussi pour les Basidiomycètes, en cul-

ture, sur des mycorhizes stériles, etc. Cette aide est particulièrement bien venue dans le

cas de groupes très difficiles, lorsque les autres caractères disponibles sont trop peu

nombreux, Citons quelques exemple pour les spores d'endomycorhizes (Cummings &

Wood, 1989), les ectomycorhizes (Gardes et al., 1991), le stade levure de Basidiomycè-

tes (Fell, 1994), les Armillaria (Anderson et al., 1987, 1989; Jahncke et al., 1987;

Smith & Anderson, 1989), les Phellinus (Dreisbach & Hansen, 1994; Hansen et al.,

1994), les Ganoderma (Hseu et al., 1994; Hseu & Wang, 1990), les Strophariaceae

(Jahncke, 1984). Dans cet esprit, certains chercheurs associent des méthodes

"classiques" et les techniques moléculaires pour affiner les résultats. Voir par exemple

Source : MNHN. Paris

MYCOLOGIE TRADITIONNELLE ET NOUVELLES TECHNOLOGIES 9

Crous (1994) -pour les Cylindrocladium-, Khashnobish & Shearer (1994) -pour

Leptosphaeria et Phaeosphaeria-, Liu et al. (1994) -pour Dermocybe.

b) En systématique et en phylogénie:

La comparaison des données séquentielles et de toutes les informations géno-

miques obtenues par les techniques évoquées ci-dessus permet d'établir les liens de

parenté entre espéces ou les enchainements phylogéniques.

Certains auteurs énoncent les implications théoriques de ces méthodes phylo-

géniques (Felsenstein, 1988; Mishler er al., 1988; Swofford & Olsen, 1990).

D'autres démontrent que certaines hypothèses phylogéniques admises sur la

base des données de la mycologie "traditionnelle" ne résistent pas à une analyse molé-

culaire. C'est le cas, par exemple, de Kwok er al. (1986), qui établissent la non-parenté

entre Laboulbéniales et algues rouges, hypothèse popularisée par Chadefaud et évoquée

plus récemment, par exemple, par Demoulin (1975, 1985). Blackwell (1994) rappelle

également les hypothèses phylogéniques, parfois plus que séculaires, récemment infir-

mées par les données moléculaires. D'autre part, la théorie de l'horloge moléculaire

permet de dater les principaux événements survenus au cours des temps géologiques

(voir par exemple, Berbee & Taylor, 1994).

A l'inverse, certains constatent l'identité des résultats phénotypiques et génoty-

piques, par exemple dans un groupe de Penicillium (Taylor & LoBuglio, 1994) ou

entérinent les suppositions de mycologues morphologistes, par exemple dans les Bole-

tales sécotioides et bolétoides: Baura et al., 1991 établissent la parenté phylogénique

entre Gastroboletus laricinus (sécotioide) et Suillus grevillei (bolétoide); Bruns et al.,

1989 font de méme pour le couple Rhizopogon (gastéroides)/Suillus (bolétoides). D'au-

tres exemples concernent par exemple le couple Lentinus/Polyporaceae (Hibbett &

Vilgalys, 1991).

Citons encore quelques exemples assez généraux: Berbee & Taylor (1993a),

Blackwell & Spatafora (1993), Blanz (1990b), Brygoo (1990), Eriksson (1994), Gargas

et al, (1994), Kohn (1990), Reynolds & Taylor (1993), Rogers et al. (1990), Swann &

Taylor (1994) et quelques cas plus précis pour les Hyphomycetes (Spatafora et al.,

1994), Trichoderma (Mills & Muthumeenakshi, 1994), Fusarium (O'Donell, 1994),

Penicillium (Choi et al., 1994; Peterson, 1994), Zygomycotina (O'Donell & Cigelnik,

1994), Entomophthorales (Nagahama et al., 1994), Glomales (Simon, 1994), dermato-

phytes (Leclerc et al., 1993), Erysiphales (Saenz et al., 1994a., 1994b), Morchella

(Buscot, 1994), Clavicipitales/Hypocreales (Spatafora & Blackwell, 1993), Meliolales

(Saca? & Taylor, 1994), Ophiostomatales (Spatafora & Blackwell, 1994; Viljoen et al.,

1994), Heterobasidiomycétes (Blanz, 1990a), Exobasidium (Blanz & Dôring, 1994),

Polyporaceae (Goncalves et al., 1990; Hibbett, 1994), Ganoderma (Moncalvo et al.,

1994a, 1994b), Cytidiella (Nakasone, 1994), Peniophora (Halienberg et al, 1994),

Boletales (Bruns & Szaro, 1990), Lentinus (Hibbett, 1990), Agaricales (Rehner et al.,

1990), Collybia dryophila (Bulat & Alekhina, 1994), Agaricus bisporus (Bunyard et al.,

1994), Coprinus (Hopple, 1990), etc.

Des travaux phylogéniques intègrent également les données de la mycologie

traditionnelles et les résultats moléculaires. Voir par exemple Lutzoni & Vilgalys

(1994), Tehler (1994).

Source : MNHN, Paris

10 R. COURTECUISSE

Informatique

Les possibilités de gestion simultanée d'un grand nombre d'informations et

l'apparente objectivité de l'ordinateur ont poussé les systématiciens à s'intéresser assez

tôt à cet outil prometteur. Les méthodes d'analyse informatique se sont rapidement

développées et l'étude de ce sujet nécessite de solides bases mathématiques. En effet,

des notions fondamentales entrent en jeu, de même que toutes les subtilités de la statis-

tique. D'abord utilisés à des fins taxonomiques (voir par exemple Jardine & Sibson,

1971; Sneath & Sokal, 1973), les ordinateurs ont ensuite participé à l'analyse de don-

nées très variées. De nouveaux concepts ont été appliqués à des fins systématiques et

phylogéniques et de très nombreux travaux font actuellement appel à la cladistique (une

revue consacrée à cette discipline a même été fondée en 1985: Cladistics), à la parsi-

monie, etc. Des logiciels récents sont destinés à des études purement phylogéniques

(Felsenstein, 1991; Swofford, 1992).

Il est indéniable que l'informatique permet de surmonter certaines limites ana-

lytiques de nos propres possibilités humaines. Mais un des problèmes résiduels est lié

au fait que c'est l'homme qui rentre ses données dans la machine, conférant un poids,

une valeur relative 4 chaque caractére envisagé. Tous les théoriciens s'accordent sur

cette difficulté, et les travaux consacrés à l'interprétation mathématique et statistique

des résultats obtenus pas ces méthodes sont nombreux (voir Hibbett, 1992, qui donne

de nombreuses références à ce sujet). Les principaux problèmes consistent à choisir les

caractères utilisés (morphologiques, chimiques, moléculaires, etc.) et à leur conférer un

poids relatif compatible avec un traitement statistique satisfaisant.

Quoiqu'il en soit, nombreux sont les mycologues utilisant l'analyse cladistique

pour réviser leurs positions systématiques ou phylogéniques. Certains préconisent

même cette analyse avant toute description de nouveaux taxons, au moins au rang

supraspécifique (Parmasto, 1994). Parmi les monographies récentes, beaucoup présen-

tent un chapitre "cladistique". Pour les travaux récents, surtout issus des derniers con-

grès mondiaux, citons Baroni (1990, 1994), Langer E. (1994), Langer G. (1994), Schu-

macher (1990b), Tehler (1993), Thrane (1994), Vilgalys (1986).

Limites de ces méthodes:

Comme les méthodes traditionnelles, les techniques moléculaires et informati-

ques appellent également des réserves. Elles sont encore récentes, surtout dans les

domaines de la taxonomie, de la systématique et de la phylogénie et leurs limites sont

encore incomplètement perçues.

Un des principaux écueils vient de la sensibilité croissante des méthodes utili-

sées. Les risques de contamination par du matériel nucléique étranger en sont accrus

(voir par exemple Hillis & Huelsenbeck, 1992). De plus, les résultats acquis par les

chercheurs ne sont pas facilement comparables avec ceux de leurs prédécesseurs, méme

récents, en raison des progrés extremement rapides des connaissances et des techniques

(Hibbett, 1992:534, 538).

D'autre part, les techniques moléculaires utilisent généralement du matériel

provenant de peu d'individus et traitent de peu d'espèces, tenant donc très peu compte

des facteurs de variab intra-spécifique (voir par exemple, Hillis, 1987), Or il existe

une certaine hétérogénéité intra-spécifique (mise en évidence par RFLP: voir par

Source : MNHN, Paris

MYCOLOGIE TRADITIONNELLE ET NOUVELLES TECHNOLOGIES П

exemple Cassidy er al., 1984; Gowan & Vilgalys, 1991; Loftus et al., 1988; Specht et

al., 1984; Wu et al., 1983) et il faut savoir que le niveau de variation peut étre différent

d'un taxon à l'autre (Hibbett, 1992). Par exemple, Taylor et al. (1990) montrent que le

niveau de variation entre espèces du genre Laccaria est comparable à celui que l'on

peut évaluer entre les genres de Sordariaceae.

La connaissance des séquences nucléotidiques ne semble donc pas constituer la

"pierre de Rosette" de la mycologie (Rotschild et al., 1986; voir aussi Donoghue &

Sanderson, 1991; Smith, 1989), comme on l'a peut-être trop vite cru.

Des phénoménes de convergence séquentielle peuvent également exister,

comme dans toute étude comparative (Brygoo, 1993). D'autres écueils potentiels, plus

techniques, sont encore exposés par Hibbett (1992:543, sqq.).

De plus, j'ai évoqué plus haut les dangers d'une analyse informatique basée sur

des données partielles, ou pire, partiales.

Quelques techniques alternatives:

Ce tour d'horizon des méthodes disponibles dans le domaine de la mycologie n'a

pas la prétention d'être exhaustif. Mais je ne le terminerai pas sans évoquer deux as-

pects de ces alternatives.

L'une concerne les concepts. L'imagination et la pertinence de certains scientifi-

ques tendent à renouveler les idées classiquement admises. Par exemple, le débat tradi-

tionnel sur le concept d'espèce s'enrichit périodiquement de nouvelles idées. Aux con-

cepts phénétique, biologique, écologique, phylogénique, global pré-éxistants, Frisvad

(1994) ajoute le concept "phylogénético-écologique".

L'autre concerne des techniques non encore évoquées ci-dessus. A titre

d'exemple, je citerai l'utilisation de la fluorescence en microscopie qui peut se révéler

trés prometteuse (voir par exemple Minter, 1990; Romero & Carmaran, 1990) et de

l'immunologie, dont les applications taxonomiques, systématiques et phylogéniques

sont également importantes (voir par exemple, Lung et al., 1985; Novak & Kohn, 1990;

Ping et al., 1994).

CONCLUSION

Le but de toutes ces études est de comprendre l'organisation des étres vivants,

en l'occurence ici du règne fongique. En résumant, il s'agit de décrire les espèces exis-

tantes (toutes, si possible), de les ranger dans une classification (aussi naturelle que

possible) et de retracer (aussi fidèlement que possible) l'histoire de l'évolution et des

enchaînements des groupes les uns avec les autres au cours des temps géologiques.

Si les différentes méthodes énumérées présentent toutes des limites ou des

inconvénients, toutes peuvent apporter des éléments de solution, replacer des pièces du

puzzle gigantesque que nous révons de reconstituer un jour.

Dans le domaine de la phylogénie, le séquençage semble être particulièrement

utile. Mais il est souhaitable d'aboutir à un consensus technique (Adams, 1972), visant

à établir des hypothèses indépendantes par des méthodes moléculaires et non-molécu-

laires puis établir une hypothèse unique, Mais il est alors difficile de trouver l'équilibre

Source : MNHN, Paris

12 R. COURTECUISSE

dans la pondération entre caractéres moléculaires et non-moléculaires, qui n'ont pas

forcément la méme signification phylogénique. La solution à ce débat mathématique

serait de comparer les études indépendantes (moléculaires et traditionnelles) et combi-

nées. On trouve pour le moment peu d'exemples de ce consensus "idéal" (voir Hibbett,

1991; Tehler, 1988).

Quoiqu'il en soit, la nécessité de comparer les résultats de plusieurs méthodes,

clamée par les biologistes moléculaires eux-mêmes, justifie la poursuite des travaux de

mycologie traditionnelle.

Mais il y a bien plus !

Le contexte écologique actuel est particulièrement dramatique, chacun le sait.

La déforestation fait rage dans les pays tropicaux et les pays "développés" voient fleurir

les listes rouges d'espèces menacées, signe de l'inquiétude grandissante et justifiée des

naturalistes. Certains évaluent à plusieurs dizaines le nombre d'espèces vivantes qui

s'éteignent chaque jour. Et comme le clame un slogan américain: "Extinction is for-

ever".

Qu'y perdons-nous en réalité ? J'y vois essentiellement trois points:

1- L'homme a la possibilité intellectuelle, sinon le devoir moral, d'inventorier

les espèces qui peuplent notre planète, Or, certaines évaluations postulent que moins de

5% des espèces de micro-organismes (les champignons étant inclus dans cette

catégorie) sont connues (Colwell & Hawksworth, 1991).

Face à cette double réalité (perte effrénée d'espèces et lacunes immenses dans

notre connaissance), il est clair que la priorité absolue est la suivante: le monde de la

biologie doit s'efforcer de récolter, récolter et encore récolter, décrire, décrire et en-

core décrire, photographier, dessiner, mettre en culture, mettre en herbier \a plus

grande quantité de matériel possible tant qu'il en est encore temps. Cette urgence, réelle

dans les pays tempérés, est extrèmement pressante dans les pays tropicaux où les con-

naissances sont moindres et où les dégradations de l'environnement sont encore plus

importantes.

Cela relève typiquement du domaine de la taxonomie traditionnelle. Cette pré-

occupation existe dans beaucoup de pays, mais elle est trop peu encouragée, trop peu

financée officiellement. Certes, des programmes spécifiques sont en cours dans plu-

sieurs pays (voir par exemple Courtecuisse, 1991 pour la France), mais beaucoup sont

encore dépourvus de véritable volonté de recherche dans ce domaine et ce type de

programme reste souvent peu "aidé".

Faute d'encourager et de réaliser de toute urgence ces travaux de taxonomie

descriptive, nous perdons, avec toutes ces pièces qui disparaissent, toute chance de

comprendre un jour le puzzle de l'évolution (fongique, mais aussi de tous les êtres

vivants). La biologie moléculaire s'engage donc dans une impasse si les programmes

concertés de la recherche scientifique ne donnent pas les moyens aux naturalistes de

poursuivre les inventaires, de compléter le puzzle, de renouveler le matériel qui sera

ensuite utile aux biologistes.

2- On parle beaucoup de protection de la nature, de gestion et de restauration

des milieux naturels. Mais peut-on protéger ce qu'on ne connait pas ? Certes les travaux

de mycologie fondamentale et appliquée apportent des données essentielles sur le fonc-

tionnement écologique des milieux naturels. Mais ce fonctionnement ne concerne que

Source : MNHN, Paris

MYCOLOGIE TRADITIONNELLE ET NOUVELLES TECHNOLOGIES 13

les espèces connues. Comment tenir compte de ce qu'on ignore ? Comment comprendre

dans toute sa complexité un systéme dont on ne connait qu'une petite partie ? Comment

protéger et éventuellement restaurer un milieu encore si mystérieux ?

3- Enfin, d'un point de vue plus anthropocentrique, les étres vivants qui nous

entourent sont une source inépuisable de ressources, d'énergie, de thérapeutiques.

Depuis la nuit des temps, les hommes emploient animaux, végétaux, champignons,

pour se nourrir, se chauffer, se soigner, sans parler des aspects technologiques. L'ethno-

botanique et l'ethnopharmacologie sont certes en plein renouveau. Il est temps, en effet,

de retrouver ces usages traditionnels avant que la connaissance ne s'en éteigne et que

les peuples qui les utilisent ne soient contaminés par notre civilisation et perdent

contact avec leurs propres racines. Mais les taxonomistes sont toujours moins

nombreux (dont toujours plus débordés !) et pour exploiter efficacement le matériel

récolté par les ethnologues, il faut des déterminateurs.

La découverte de nouveaux médicaments naturels frappe l'esprit d'un public

avide de santé et de confort. Mais les champignons peuvent également nous servir

d'auxiliaires dans de nombreux domaines, lutte biologique, bio-indication (voir De-

nayer, 1994) ou encore biotechnologies (voir par exemple Dowd, 1992; Lemke, 1994,

etc.; de nombreux exemples concernent l'industrie de la pâte à papier, les hémisynthè-

ses chimiques, les bio-transformations et bio-conversions de molécules, la détoxifica-

tion de l'environnement -par les hydrocarbures, les matières plastiques, etc.) et une

foule d'autres domaines. Laisser s'éteindre tant de richesse et de potentialités relève de

l'inconscience, voire du suicide à long terme.

La taxonomie traditionnelle et descritive peut donc fournir des pistes au adeptes

de recherches biologiques plus approfondies et moléculaires. Les biologistes moléculai-

res eux-même clament cette nécessité. Citons par exemple Hopple & Vilgalys

(1994):"The best hypothesis does have the added utility, however, in suggesting rela-

tionships which may be investigated with additional data or taxa in further studies." Le

probléme évoqué n'est pas lié aux chercheurs, mais aux grands axes des politiques de

la recherche, aux options choisies à l'échelon des ministères et des grandes institu-

tions. Les comportement des chercheurs suivent simplement et naturellement les modes

politiques pour des raisons de financements.

Or, le "moléculaire" ne peut pas remplacer le "traditionnel". Les résultats des

deux méthodes sont parfois identiques ou compatibles (voir Taylor & LoBuglio, 1993;

Hibbett, 1994; etc.). Dans d'autres cas, ils s'opposent ou se complètent; ils excitent alors

l'imagination des chercheurs et génèrent de nouvelles solutions aux problèmes posés.

Dans le domaine de la phylogénie qui est typique, nous disposons théorique-

ment de trois types d'outils: la paléontologie, les comparaisons anatomiques et morpho-

logiques (anatomie comparée des zoologistes) et les données moléculaires. La mycolo-

gie est très pauvre en fossiles. Si les études descriptives classiques devaient s'éteindre

un jour, l'avenir de la phylogénie serait entièrement livré aux spéculations moléculaires.

А quelles hypothèses alternatives les biologistes opposeront-ils leurs conclusions si les

Systématiciens morphologistes étaient rangés au placard au titre de fossiles vivants ? Le

temps n'est pas encore venu de tout miser sur le moléculaire.

Pourtant, il n'existe plus actuellement, en France au moins (la situation est

malheureusement comparable dans de nombreux pays), de structure d'enseignement de

Source : MNHN, Paris

14 R. COURTECUISSE

la taxonomie classique ni des méthodes de travail dans ce domaine. Or, un détermina-

teur ne se forme pas aussi rapidement qu'un biologiste ou qu'un informaticien. Cela met

en jeu trop d'expérience, trop de "vécu", trop d'impalpable, aspects peut-être subjectifs

donc criticables, mais tellement efficaces face à une récolte problématique !

Si la mycologie traditionnelle s'éteint, qui fournira aux biologistes moléculaires

de nouvelles espèces à étudier ? Qui déterminera le matériel dont on voudra séquencer

les nucléotides ? (voir Singer, 1994). Qui sera capable de gérer et de valoriser, sur le

plan taxonomique entre autres, les collections historiques ? A-t-on le droit d'hypothé-

quer ainsi le travail de tous nos grands prédécesseurs ?

Les amateurs, bien sür, peuvent jouer un róle, le niveau scientifique de certains

étant trés élevé, Mais les scientifiques ont besoin d'explorer la biodiversité à l'échelle

mondiale et, encore une fois, d'étudier de toute urgence les milieux tropicaux. Le be-

soin de taxonomistes professionnels reste une nécessité.

Que l'essor des nouvelles technologies joue le rôle de catalyseur et fasse pren-

dre conscience à tous les mycologues du très haut niveau scientifique où s'est hissée

leur science et les stimule serait très positif. Que cet essor contribue à phagocyter les

disciplines traditionnelles et à anéantir les immenses possibilités qu'elles offrent

encore serait dramatique pour nous tous.

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QUEL STATUT POUR LES CHAMPIGNONS ?

Guy DURRIEU

Laboratoire botanique et forestier.

Université Paul Sabatier, Toulouse

RÉSUMÉ - L'inclusion des champignons dans le régne végétal tel quil a été défini par Linné a

souvent été plus où moins controversée jusqu'à aboutir à la proposition par Whittaker en 1969 d'un

règne des "fungi". Si les champignons sont incontestablement polyphylétiques, leur phylogénie a

donné lieu à des interprétations trés divergentes en méme temps quils étaient distribués entre

plusieurs règnes dont les limites sont devenues assez floues Actuellement, à partir d'un grand

nombre de données cytologiques, ultrastucturales, phytochimiques, moléculaires … il semble

possible de définir au moins trois grands phylums issus de lignées ancestrales bien distinctes de

protistes. On peut leur donner le rang de divisions (ou embranchements) comprenant les principales

sous-divisions ou classes suivantes:

Myxomycota: Myxomycetes, Plasmodiophoromycetes ?

Oomycota (ou Pseudomycota): Oomycètes, Hyphochytridiomycètes. Ils auraient une origine

commune avec des algues du "règne" des Chromista,

Eumycota: Chytridiomycotina, Zygomycotina, Ascomycotina et Basidiomycotina. Les "vrais"

champignons dériveraient d'une souche de protiste commune aux Choanoflagellés et aux animaux

Cependant l'étude d'un plus grand nombre d'organismes est encore nécessaire pour

confirmer ces points de vues d'autant que la position de certains groupes tels les Labyrinthulo-

mycètes ou les Plasmodiophoromycetes n'est pas bien établie. Pour des raisons de commodité, il a

été proposé de conserver le terme général de champignon (Union of fungi, Barr 1992) pour désigner

l'ensemble de ces organismes mais sans lui attacher une signification taxonomique particulière

ABSTRACT - What statute for fungi. Inclusion of the fungi in the plant kingdom as established by

Linnaeus has often be a matter of contest until Whittaker proposed a kingdom of fungi in 1969. If

fungi are undoubtly polyphyletic, their phylogeny has been interpreted in many different ways,

while they were distributed between several kingdoms, the limit of which are not always clearly

defined, To day, by combination of a lot of cytological, ultrastructural, phytochemical and molecular

data it looks possible to distinguish at least 3 main phyla issued from distinct protistean lineages.

They can be considered as divisions (or embranchments) including the following subdivisions or

classes,

Myxomycota: Myxomycetes, Plasmodiophoromycetes?

Oomycota (or Pseudomycota): Oomycetes, Hyphochytridiomycetes of a probably common origine

with the algae of the kingdom Chromista.

Eumycota: Chytridiomycotina, Zygomycotina, Ascomycotina and Basidiomycotina, the "true" fungi

may originate from the same protist root that Choanoflagellate and animals. Meanwhile,

comparative studies of a greater number of organisms is absolutely necessary to confirm more

accurately phylogenic position of the different phyla, still very unclear for some of them zs

Plasmodiophoromycetes or Labyrinthulomycetes, For a matter of convenience the term of

"champignon" corresponding to the proposed "union of fungi" (Barr 1992) should be conserved for

the whole of these organisms without a special taxonomic meaning

Source : MNHN, Paris

28 G. DURRIEU

Si la place des champignons dans le régne végétal n'a semblé faire de doute

pour la plupart des botanistes pendant fort longtemps, il faut cependant constater qu'il

s'est aussi écoulé un temps encore plus long avant qu'ils soient acceptés comme des

végétaux et des réticences se sont toujours exprimées quant à leur apparteneance à ce

monde.. En effet alors que Theophraste en 314 avant Jésus Christ explique déjà que les

"myces" à la différence des autres plantes "ne possédent pas une racine, une tige, des

branches, des rameaux, des feuilles, des fleurs et des fruits", Pline disait ne pouvoir se

prononcer sur le fait de savoir si les truffes (Tuber et Terfezia) ces "imperfections de la

terre", sont vivantes ou non". Et 17 siècles plus tard on n'était pas beaucoup plus avancé

puisque Bauhin (1623) considérait les champignons comme "rien de plus que l'humidité

superflue du sol, des arbres, du bois pourri ou d'autres substances en décomposition".

D'un règne à l'autre

Quoiqu'il en soit, dans le système à trois règnes de Linné, "Lapides crescunt,

Vegetabilia crescunt et vivunt, Animalia crescunt, vivunt et sentiunt" (Philosophia

botanica, 1751) les champignons sont placés parmi les végétaux et recensés dans le

Species plantarum (1753). Très vite, la différence des champignons attirait l'attention

de divers botanistes. Pour Necker dans son Traité sur la mycétologie (1783) il faudrait

exclure les champignons du système de Linné, étant de nature si différente des

animaux, des plantes et des minéraux, ils devraient être considérés comme des

organismes intermédiaires (mèsymaux) dans un règne à part "Regnum mesymale". De

même, A.L. de Jussieu écrivait dans le Genera Plantarum (1789) "Les champignons,

qui sont analogues en partie aux zoophytes animaux, débutent la série végétale, étant

comme intermédiaires entre les deux; ils ont quelques ressemblances avec certaines

algues, mais sont complètement différents des autres plantes dans leur structure,

floraison et habitat."

Et cependant, tout le long du 19ème siècle et jusqu'à la moitié du 20ème, les

traités de botanique continueront, sans hésitation, de parler des champignons aux côtés

des autres végétaux, souvent réunis avec les algues dans l'ensemble des thallophytes. Et

même lorsque, à la suite des nombreuses questions soulevées par la découverte du

véritable monde que sont les êtres unicellulaires, Haeckel (1866, 1894) propose une

subdivision du vivant en 4 règnes: Protophyta et Protozoa à côté des Metazoa et

Metaphyta, les champigons se trouvent toujours dans ces derniers, sauf les

Myxomycètes qui en sont détachés pour étre inclus dans les protistes.

Il faut attendre la fin des années 30 pour voir Copeland (1938) et Barkley

(1939) exclure les champignons du régne végétal et les placer parmi les protistes.

Copeland, sous le terme de Protoctista rassemblait les unicellulaires nucléés (les

protistes au sens strict) avec les organismes multicellulaires ou multinucléés dépourvus

de tissus somatiques différenciés, et donc à ce titre, les algues et les champignons

Langeron (1945) les classait lui aussi dans les protistes cependant que les ouvrages

classiques ne suivent toujours pas. Pour ne citer que deux exemples, sont dans ce cas le

Syllabus der Pflanzenfamilien d'Engler méme dans ses dernières éditions (Melchior et

Wedermann, 1954), ou le Traité de Botanique de Chadefaud et Emberger (1960).

C'est Whittaker (1969) qui franchira le pas en créant le "cinquième règne", celui

des Fungi s'ajoutant aux "Monera (les procaryotes), Protista, Plantae, Animalia". Posant

Source : MNHN, Paris

QUEL STATUT POUR LES CHAMPIGNONS ? 29

la question "Are the Fungi plants..."?, il trouvait de nombreuses raisons pour répondre

par la négative: différences dans l'origine, la structure cellulaire, les modes de nutrition,

les structures reproductives... Mais tous les champigons "classiques" n'étaient pas

compris dans ses Fungi, puisque les Plasmodiophoromycetes ег les

Hyphochytriomycètes étaient rangés dans le règne des Protista, cependant que les

Myxomycètes, déjà considérés à plusieurs reprises comme des protistes étaient

maintenus dans les Fungi. Ainsworth (1973) le suit partiellement en acceptant un règne

(ou sous-régne) des Fungi dans lequel il inclut tout ce qui est classiquement reconnu

comme champignon.

La boîte de Pandore était ouverte! ainsi dans les années 80 toute une série

d'auteurs ont pulvérisé ce malheureux règne végétal. En se basant sur diverses

conceptions phylogèniques ils l'ont partagé entre au moins 4 règnes différents . Ce sont

en particulier les champignons qui ont fait les frais de ces découpages (Cavalier-Smith,

1981, 1987; Tehler, 1988). En effet pendant les deux premiers tiers de ce siècle de

nombreuses discussions ont tourné autour de leur origine possible, monophylétique ou

polyphylétique, dérivant des algues, et dans ce cas desquelles, ou bien des protistes.

Pour ne citer que des mycologues français, Langeron (1945), Moreau (1954),

Chadefaud (1960) ont émis des opinions plutôt divergeantes. Si le premier les

considérait comme monophylétiques, dérivant d'une souche primitive de protistes

euglénoïdes, le dernier voyait deux grandes lignées, les Mycomycophytes, comprenant

ous les groupes dépourvus de cellules mobiles, dérivant des Rhodophycophytes,

parenté argumentée sur diverses similitudes avec les ascomycètes et les

Phycomycophytes, possédant à un moment ou à un autre de leur cycle des cellules

flagellées et provenant d'une souche commune aux Chryso et Pyrrophycées.

L'ascendance floridéenne sera également soutenue par Demoulin (1985) tandis qu'elle

était réfutée par Barr (1983) qui considere les analogies existantes comme le résultat

d'une évolution convergente. Gaumann (1963), pour sa part de 20 ans en avance, voyait

aussi deux origines différentes, mais l'une parmi les algues "Heterosiphonales"

(Xanthophycées) pour les Oomycétes, l'autre parmi les protistes Flagellés pour tous les

autre groupes.

Que sont devenus actuellement les champignons? Tous les auteurs récents ont

conservé un règne des Fungi, mais bien des champignons n'en sont plus les sujets. Les

idées sur le polyphylétisme de ces organismes se sont imposées, de sorte que de façons

à peu près concordantes ils se partagent actuellemnet entre deux ou trois règnes

différents:

Margulis & Schwarz (1982) classent tous les champignons à zoospores

(Mastigomycètes de Chadefaud) avec les algues et les protozoaires dans les Protoctista

et les autres champignons dans le règne des Fungi. Lipscomb (1985), elle aussi, dans

une analyse cladistique de caractères cytologiques, place Chytridio et Oomycétes

ensemble et bien à part des "higher fungi", pour lesquels toute ascendance floridéenne

est écartée.

Cavalier-Smith (1987) les distribue entre trois de ses règnes:

-Protozoa, au moins pour les Myxomycètes, ce qui était admis pour beaucoup

depuis longtemps.

-Chromista, pour les Oomycètes et les Hyphochytriomycètes au côtés de

certaines algues.

Source : MNHN, Paris

30 G. DURRIEU

-Fungi, ou Eumycota, pour les autres, c'est à dire Chytridiomycétes,

Zygomycétes, Ascomycetes et Basidiomycétes.

On aurait ainsi d'une part les "vrais" champignons et d'autre part des "faux

champignons" (Pseudomycotina).

Quels sont les bons caractères?

Sur quels arguments ces constructions phylétiques sont-elles basées? Ils sont

évidemment trés variés, aucun à lui seul ne semble complétement décisif, mais leur

ensemble donne un faisceau de preuves convaincant. Il faut constater, toutefois, qu'il

reste encore de nombreux points d'interrogation Pour certains petits groupes

relativement peu étudiés. Par exemple Tehler (1988) dans une analyse cladistique

portant sur 51 caractères, inclue les Hyphochytriomycètes dans ses Eumycota, il est

vrai comme groupe frère de tous les autres. Barr (1992) les en exclut pour les ranger au

côté des Oomycètes dans les Chromista. Cela montre la part de sujectivité qui peut

subsister en fonction du choix des caractères utilisés. Par exemple Tehler utilise comme

caractère de la paroi la présence ou l'absence de chitine tandis que si l'on met l'accent

sur la cellulose, on arrive à des conclusions différentes (Lewis 1991), Oomycètes et

Hyphochyiriomycètes étant les seuls à posséder ce polymère dans leur paroi.

Il faut remarquer que l'une des grandes division, reconnue par de nombreux

auteurs, entre les Phycomycètes ou Mastigomycètes à cellules nageuses, et les

Mycomycophytes ou Amastigomycètes qui en sont dépourvus, ne tient plus. La ligne de

partage entre deux règnes passe maintenant à l'intérieur des premiers, reconnaissant

ainsi une origine phylogènique distincte pour les Oomycètes, telle qu'elle était déjà

proposée par Gaumann (1963). Cette hypothèse peut s'étayer sur des caractères d'ordre

cytologiques, comme la présence d'un appareil de Golgi typique chez les seuls

Oomycètes (Dargent), l'existence d'un réseau de vacuoles tubulaires à mouvements

péristaltiques observé chez diverses espéces de basidio, asco et zygomycétes (Rees er

al, 1994). De méme des différences importantes apparaissent dans la structure de

l'appareil moteur des cellules mobiles en particulier de la zone de transition des

flagelles (Bar, 1992). Les Chytridiomycètes, le groupe le plus primitif des vrais

champignons, ne possédent qu'un seul flagelle qui paraît voisin, surtout chez les

Monoblepharidales, du flagelle unique des Choanoflagellés. D'aprés Barr on pourrait

imaginer une origine à partir d'un protiste ancétre commun de ces deux ensembles,

cependant d'après Mollicone & Longcore (1944) toute idée de convergence ne doit pas

être exclue. Les choses paraissent plus nettes pour les Oomycètes, leur structure

biflagellée hétérokonte présente de nombreuses similitudes avec celle des

Xanthophycées. De plus la reproduction oogame, telle qu'on la connait chez Vaucheria,

améne à la conclusion que les Oomycétes "sont plus proches des Xanthophycées que de

n'importe quel autre taxon de Chromistes", Cette relation était également soulignée par

Lee (1989). Une question qui reste en suspens est de savoir si les Oomycètes dérivent

d'une souche déjà algale par perte totale de l'appareil plastidial. II parait cependant plus

vraisemblable que la séparation se soit réalisée au niveau d'un groupe ancestral de

Protistes, avant l'acquisition des plastes par endosymbiose (Douglas et al., 1991; Penny

& O'Kelly, 1991). Des ressemblances de même type se retrouvent aussi chez les

Hyphochytriomycètes et les Labyrinthulomycètes, mais avec suffisamment de diversité

Source : MNHN, Paris

QUEL STATUT POUR LES CHAMPIGNONS ? 31

pour faire penser à une origine polyphylétique des trois groupes. Cela renforce encore

les doutes émis par les auteurs précédents sur la validité d'un régne des Chromista tel

qu'il est défini par Cavalier-Smith.

En dehors de la composition des parois, divers caractéres phytochimiques

indiquent également des différences profondes entre Oomycétes et champignons

authentiques tel le stockage des glucides sous forme de mycolaminarine au lieu de

glycogéne. C'est aussi le cas des acides gras et des stérols (Muller et al., 1994) dont les

profils révélent l'absence totale de certains composés dans l'un ou l'autre groupe. Les

voies de synthèses conduisant aux stérols des Oomycètes démontreraient une origine de

ces organismes à partir d'ancêtres non chlorophylliens (Berg & Paterson, 1986).

La biologie moléculaire, une solution?

La biologie moléculaire se révèle, en effet, être un outil intéressant pour aider à

résoudre ces questions. Par exemple Forster et al., (1990) par séquençage de petites

sous unités d'ARN ribosomique montrent que des espèces de Myxomycètes,

d'Oomycètes et d'autre part de Chytridiomycètes et Ascomycètes se trouvent sur trois

branches évolutives nettement distinctes. Les premiers au voisinage de protistes, les

seconds de Diatomées et Chrysophytes, illustrant ainsi les Chromista, les troisièmes

dans un ensemble réunissant des plantes chlorophylliennes et des animaux avec un

protiste amiboide (fig. 1).

Les résultats de Douglas er al. déjà cités, de Kwok er al. (1986) obtenus par

hybridation d'ADN et de Hendriks er al. (1991) par séquençage d'ARN ribosomique

infirment les idées, longtemps soutenues, concernant la filiation algues rouges

Ascomycètes. Les relations entre Chytridiomycètes et champignons supérieurs ont été

par ailleurs confirmées par comparaison des ADN ribosomiques (Bowmann et al.

1991), alors que la proximité entre Hyphochytriomycètes et Oomycètes est démontrée

(Klassen in Barr, 1992). Cependant, ces résultats sont encore très fragmentaires et

méritent d'être poursuivis sur un beaucoup plus grand nombre de taxons. En effet, les

positions relatives des "régnes" ne paraissent pas parfaitement définies. Suivant les

diverses reconstructions cladistiques obtenues à partir de données de la biologie

moléculaire (Fig. 1), les Eumycétes apparaissent soit comme groupe frére des animaux

(Forster et al., 1990), ou des animaux et choanoflagelés (Wainright er al., 1993) ou bien

des Acanthamoeba et des plantes (Douglas et al.) ou encore d'un ensemble animaux,

plantes et Acanthamoeba (Gunderson er al., 1987). On peut remarquer en revanche les

places plus stables occupées par les Oomycota et les Myxomycota. Cependant si pour

Wainright, Gunderson ou Douglas les chromophytes et oomycota représentaient deux

lignées distinctes, d'aprés Forster, les oomycota inclus dans les chromophyta n'en

représenteraient qu'une lignée ayant perdu ses plastes. Il faut noter que ces

cladogrammes sont basés sur l'étude d'au plus une trentaine d'espèces pour représenter

l'ensemble du monde vivant. Des travaux prenant en compte davantage de séquences

sur un plus grand nombre d'organismes sont nécessaires. C'est dans ce sens que va

lessai de Baldauf & Palmer (1993) portant sur le séquençage de 4 protéines et

concernant une soixantaine d'organismes. Il confirme une plus proche parenté entre

animaux et eumycota qu'entre ceux-ci et plantes vertes. Mais à la différence des autres

résultats les Myxomycota se retrouvent au voisinage immédiat de ces Eumycota. Cela

Source : MNHN, Paris

32 G. DURRIEU

METAZOA ETAZOA

L— CHOANCFLAGEL.. мова

EUMYCOTA CHLOROPHYTA

г ACANTHAMOEBA ————"EUMYCOTA

772222... CHLOROPHYTA ООМҮСОТА

[PARAMECIUM | OCHROMONAS

[ — OOMYCOTA ————2 PARAMECIUM

— OCHROMONAS L DICTYOSTEL.

AE Pen OsrEL EUGLENA

(WAINWRIGHT) (GUNDERSON)

[ — METAZOA [m ORO RENT

“-- ЕИМҮСОТА АСАМТНАМОЕВА

[ || p—^ACANTHAMOEBA L——- EUMYCOTA

L— CHLOROPHYTA БЕ [ — OOMYCOTA

ООМҮСОТА Cc SKELETONEMA

— ——SKELETONEMA OCHROMONAS

OCHROMONAS PARAMAECIUM

PARAMAECIUM RHODOPHYTES

DICTYOSTELIUM METAZOA

E DHYSARUM, DICTYOSTELIUM

EUGLENA EUGLENA

(FORSTER) soa.

Fig.l. - Divers exemples de constructions cladistiques obtenues à partir de données de la biologie

moléculaire.

montre aussi qu'il est nécessaire de combiner ces résultats avec ceux de la morphologie

ou de la cytologie pour obtenir des conclusions plus probantes. La figure 2 est un essai

de reconstruction phylogènique dans lequel il a été tenté de recombiner les

connaissances acquises dans les divers domaines pour indiquer les places les plus

vraisemblables pour les divers phylums de champigons.

Les conséquences

Si donc nos idées sur la phylogènie et la classification paraissent en voie

d'éclaircissement, ce n'est peut être pas le cas de l'idée exacte que l'on peut se faire d'un

champignon. C'est à dire que ressurgit à un niveau très élevé dans la hiérarchie

taxonomique l'ambiguité entre les deux buts de la systématique telle qu'elle était déjà si

bien exprimée par A.L. de Jussieu (Flore Française, 1778) "Le premier consiste à

fournir le moyen le plus sûr et le plus facile pour résoudre... ce probléme général: étant

donné une production du régne végétal, trouver le nom que les Botanistes lui ont

assigné," mais il faut aussi fournir "... à l'étude du régne végétal un aspect sous lequel

Source : MNHN, Paris

QUEL STATUT POUR LES CHAMPIGNONS ? 33

МЕТА?ОА МЕТА?ОА

EUMYCOTA Choanofl

Choanoflagellés EUMYCOTA

Acantham. П Acanthamoeba (Rhizopoda)

MYXOMYCOTA CHLOROPHYTA

‘Entamoeba ООМҮСОТА

CHLOROPHYTA CHROMOPHYTA

ff — — - RHODOPHYTA

Paramecium (Ciliata)

Plasmodium (Sporozoa)

MYXOMYCOTA

Euglena (Euglenophyta)

Fig. 2.- Essais de présentation des relations phylogèniques montrant les places supposées possibles

pour les grands groupes de champignons.

on puisse le considérer dans son ensemble, et qui nous présentât la suite des affinités

que l'on à observées dans les plantes..."

Autrement dit qu'est ce qu'un champignon? La question est loin d'être

innocente, si les mycologues ne devaient plus s'occuper que des organismes inclus

aujourd'hui dans le règne de ce nom, est ce que pour autant les algologues

s'intéresseraient aux Oomycètes ou aux Plasmodiophoromycètes? C'est loin d'être

certain, et ce n'est pas sans importance pratique. Prenons le cas de la phytopathologie,

de nombreuses maladies des plantes, les mildious comme ceux de la pomme de terre,

de la vigne ou du tabac, certaines fontes des semis, l'encre du chataïgnier.…., sont

provoquées par des Oomycétes, c'est à dire des champignons qui n'en sont plus, si ce ne

sont les mycologues, qui les étudiera désormais?

Source : MNHN, Paris

34 G. DURRIEU

Plusieurs solutions sont possibles pour éviter l'incompréhension qui risque de se

développer entre systématiciens et praticiens. Et tout d'abord est-il réellement utile de

dénaturer la notion classique de régne en en créant tant de nouveaux pour les

organismes pluricellulaires dont tous les grand phylums paraissent s'enraciner dans

différentes lignées de protistes. En effet, tout en cernant beaucoup mieux les relations

phylogéniques, les systémes proposés masquent une évidence, l'hétérogénéité du règne

des protistes. Certains, du point de vue relations ancestrales, sont respectivement plus

proches des plantes supérieures ou des animaux que les uns des autres! Remarquons

aussi que ces divisions en règnes sont également hétérogènes d'un point de vue

taxonomique, l'une est "horizontale", celle des protistes indubitablement

paraphylétiques, les autres "verticales", Ne vaudrait-il pas mieux alors, à ce niveau

d'analyse, abandonner la notion même de règne, qui dans son état actuel de

morcellement n'a plus grande signification, pour s'attacher à celle de phylum beaucoup

plus riche d'enseignements systématiques. D'autant que si les conclusions de Barnes

(1991) se confirmaient, il faudrait aussi distinguer deux règnes chez les animaux.

Si l'on tient à cet éclatement, une solution qui aurait le mérite d'une plus grande

clartée, serait de ne pas utiliser des noms du langage courant, animaux, plantes... à côté

de termes plus scientifiques pour désigner ces nouveaux règnes. Ainsi pourait-on

conserver, sans ambiguité, à ces termes traditionnels la même large signification qui

leur est attribuée de façon générale. Cela a déjà été plus ou moins suggéré par divers

auteurs (Barr, 1992; Christensen, 1990). En effet si Linné a créé ses divisions Animalia

et Plantae en utilisant des termes d'origine triviale, la communauté scientifique leur a

donné un sens taxonomique précis puisque il existe aujourd'hui un code de la

nomenclature spécifique pour chacun d'eux .

П en est à peu prés de méme avec les mots algues ou champignons (fungi en

anglo-latin). Ils recouvrent des concepts qui, même s'ils n'ont plus grande valeur

taxonomique, gardent une signification intéressante de plusieurs points de vue,

biologique, physionomique, écologique. Notons aussi que les mycologues, pour des

raisons de commodité, continuent d'utiliser des termes traditionnels comme

Gastéromycétes ou Aphyllophorales, tout en sachant parfaitement que, mis à part leur

valeur physionomique, ils n'ont aucune signification systématique précise.

Quoi de plus ahurissant pour des gens peu au fait des derniers avatars de la

taxonomie d'apprendre qu'un Bolet ou un Fucus ne sont plus des plantes ou qu'un

Peronospora n'est plus un champignon! Donc si l'on tient réellement à proposer un

nouvelle subdivision du monde vivant en règnes, il paraît indispensable de créer une

terminologie spéciale, indépendante des termes traditionnels. Puisque ils n'avaient pas,

au départ, de signification taxonomique précise, autant ne pas leur en attribuer

aujourd'hui qui heurterait profondément le bon sens. Il n'y a pas lieu d'appliquer les

règles de priorité à ce niveau.

Aussi les propositions de Christensen et de Barr suivies par Joly (1993) de

conserver, pour des raisons de commodité, certains ensembles polyphylétiques en les

regroupant sous le nom d'Union paraissent la solution à retenir, ainsi les champigons ou

"Union of fungi" comprendrait ainsi des organismes appartenant à au moins trois des

nouveaux régnes. On revient ainsi, à peu de choses prés, aux concepts de Whittaker.

Source : MNHN, Paris

QUEL STATUT POUR LES CHAMPIGNONS ? 35

Conclusion

Ainsi les spécialistes des Oomycétes pourront, sans mauvaise conscience,

toujours se considérer comme des mycologues, et la mycologie pourra-t-elle continuer

à trouver sa place dans l'enseignement de la botanique. De même les organisateurs des

Congrès Internationaux de botanique et de mycologie peuvent continuer comme jusqu'à

présent, sans se poser beaucoup de questions, d'inclure dans leurs programmes les

"pseudo-végétaux" que sont les champignons ou les "faux champignons" comme les

mildious.

Alors, si un jour on vous demande quelle est la définition d'un champignon, le

plus simple sera de répondre, comme l'a suggéré Hawksworth (1992), qu'il s'agit tout

simplement des organismes étudiés par les mycologues, il ne reste plus qu'à trouver une

définition du mycologue!.

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Source : MNHN, Paris

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ETUDE PHYLOGENETIQUE DES LEVURES

DU GENRE ZYGOSACCHAROMYCES

E. CHRZAVZEZ et R. AUFRERE

IGM, Bat 409, Université Paris sud, 91 405 Orsay cedex.

RÉSUMÉ - Une étude phylogénétique des levures du genre Zygosaccharomyces a été entreprise dans

Је cadre de la mise au point d'un test de détection de Z. bailii. L'étude phylogénétique repose sur la

comparaison de séquences partielles du 18S. Ainsi les séquences nucléotidiques des domaines v3, v4

et v9, régions variables du 18S, ont été déterminées par séquengage direct aprés PCR pour différentes

espéces: Z. bailii, Z. bisporus, Z. cidri, 2. fermentati, Z. florentinus, 2. mrakii. Les séquences de Z

rouxii et Z. mellis utilisées sont issues de la littérature. L'alignement de ces séquences entre elles puis

avec celles d'autres micro-organismes ont permis d'obtenir des arbres phylogénétiques en utilisant

les méthodes de parcimonie et de distance. Les arbres obtenus montrent que certaines espèces sont

très proches, comme: Z. bailii et Z. bisporus, Z. rouxii et Z. mellis, Z. cidri et Z. fermentati, Z. floren-

tinus et Z. mrakii. Z. microellipsoides et Torulaspora delbruckii partagent un ancêtre commun et

semblent n'avoir que trés peu divergé. Z cidri et Z. fermentati partagent un ancêtre commun avec

Saccharomyces cerevisiae.

ABSTRACT - The phylogenetic interrelationship of species of the genus Zygosaccharomyces was

examined by partial 18S rRNA sequencing. Sequences of seven species of this genus were obtained

after à PCR amplification of the three variable v3, v4 and v9 domains. Species of the genus are

clustered in two distinct groups. The first one comprises the Z rouxii, Z. mellis pair and the Z bailii,

Z. bisporus pair. The second one is devised in two subgroups that have recently diverged.

INTRODUCTION

Par son exceptionnelle tolérance aux conservateurs, aux acides faibles ainsi que

par ses caractères osmophiles, Zygosaccharomyces bailii est capable de contaminer de

nombreux produits alimentaires (Thomas & Ravenport, 1985). Cette levure, connue

comme contaminant majeur des vins (Rankine & Pilone, 1973), a aussi été isolée dans

les concentrés de fruits, les sirops, le ketchup, la margarine et les assaisonnements pour

salade ... (Sand, 1977); elle est par là même un problème d'importance pour les indus-

tries agro-alimentaires. Il est nécessaire pour le monde de l'industrie d'être capable de

contrôler un tel fléau. Ainsi l'association UNIR (Ultra Propre Nutrition Industrie Re-

cherche) a incorporé dans son programme "Usine ultra propre" la mise au point d'un

test de détection rapide de Z. bailii, avec pour système modèle la confiture de fraise. La

cible du test de détection est l'ADN génomique de la levure Z. bailii. Une région poly-

Source : MNHN, Paris

38 E. CHRZAVZEZ et R. AUFRERE

morphe du génome est amplifiée à l'aide d'un couple d'oligonucléotides amorce spécifi-

que. La région cible est l'ADN ribosomique. L'unité ribosomique est constituée de

régions très conservées codant les ARN 18S, 5.88 et. 28S ainsi que de régions espa-

ceurs transcrites (ITS1 et ITS2) et non transcrites (IGS) réputées trés polymorphes.

C'est à l'intérieur des ITS1 et ITS2 que sont choisis les oligonucléotides amorce. Pour

cela les séquences nucléotidiques de ces régions ont été déterminées, et leur polymor-

phisme étudié. La spécificité du couple d'amorce défini doit étre vérifiée en testant

différents micro-organismes plus ou moins proches du point de vue de leur parenté

phylogénétique. C'est en essayant de choisir les espéces proches de Z. bailii qu'émerge

la difficulté de la classification du genre Zygosaccharomyces en particulier et des levu-

res en général. Par conséquent il apparaissait nécessaire d'entreprendre une étude phy-

logénétique concernant le genre Zygosaccharomyces de manière à mieux le situer par

rapport aux autres micro-organismes.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Les souches de levure

Les souches utilisées ainsi que leurs origines sont répertoriées dans le tableau 1

Les levures sont cultivées sur milieu contenant 1,8% d'agar, 1% d'extrait de levure, 1%

de bactopeptone, 2% de glucose à 25°C.

Extraction rapide d'ADN génomique

Les cellules sont prélevées sur boîte, et mises en suspension en tampon Tris-

HCI 50 mM pH8,5, EDTA 20 mM, SDS 0,6%, puis sont soumises à ébullition pendant

15 mn, Le surnageant dilué 10 fois dans l'eau est utilisé pour la réaction d'amplifica-

tion,

Tableau L- Espèces du genre Zygossacharomyces utilisées dans cette étude.

Table I - Zygossacharomyces strains used in this study.

Espèce n° de la souche

7. bailii (Lidner) Guilliermond DBVPG 6287!

2. bisporus Naganishi DBVPG 63821

Z. cidri (Legakis) Yarrow DBVPG 6385!

Z. fermentati Naganishi DBVPG 6297!

Z. florentinus Castelli ex Kudriavzev DBVPG 61861

Z. microellipsoides (Osterwalder) Yarrow DBVPG 6188!

Z mrakii Capriotti DBVPG 6289 IMUCL 31151

T Souche type (type strain)

DBVPG: Dipartemento di Biologia Vegetale, Perugia, Italy.

MUCL: Mycothèque de l'université catholique de Louvain, Belgium.

Source : MNHN, Paris

PHLOGENIE DU GENRE ZYGOSACCHAROMYCES 39

Oligonucléotides amorces

Les amorces utilisées pour l'amplification ont été déterminées selon Hausner er

al, (1992) et sont décrites dans le tableau 2. Les combinaisons SSF-SSG et SSU-SST

permettent l'amplification des domaines v3-v4 et v9 respectivement. La séquence nu-

cléotidique des régions v3 et v4 est déterminée pour chaque brin avec les amorces SSF

et SSU dans un sens et SSgl et SSG dans l'autre sens. Les amorces SS5 et SST sont

utilisées pour déterminer la séquence nucléotidique des deux brins du domaine v9.

Réaction d'amplification

L'amplification est faite dans un volume final de 100ml contenant 20mM Tris-

HCl, pH 8,5, (NH,),SO, 16mM, MgCl, 2,5mM, 150mg de serum albumine bovine,

0,2mM de chaque dNTP et 100mM de chacun des oligonucléotides amorce. Deux unité

de Taq DNA polymerase (BioTaq, Bioprobe Systems, France) sont utilisées par réac-

tion. Trente cycles de réaction sont effectués dans le thermocycler BIO-med 60, avec

les paramètres suivants: 50s à 94°C pour la dénaturation, 50s d'hybridation à 51*C,

1 mn 30s d'élongation à 72°C puis une étape d'extension finale de 10 mn à 72°C.

Chaque réaction est recouverte d'huile minérale (BDH, UK). Chaque produit de

réaction est purifié sur les colonnes Wizard PCR preps (Promega, Madison, USA).

Analyse des séquences

Les séquences obtenues ainsi que d'autres accessibles dans les banques

(EMBL/GenBank), Torulaspora delbruckii (n° d'accès v01335), Candida kefyr

(M60303), Candida glabrata (X51831), Zygosaccharomyces rouxii (X58057) et Z.

mellis (publiée par James er al, 1994), sont alignées grace au programme Clustal

(Higgins & Sharp, 1989). L'alignement multiple obtenu est utilisé pour construire des

arbres phylogénétiques en utilisant les différents programmes inclus dans l'ensemble

PHYLIP (Felsenstein, 1993, version 3.5c). Des arbres, par la méthode de parcimonie et

par la méthode des distances sont obtenus grace aux programmes DNAPARS et

NEIGHBOR. La force des noeuds est calculée dans chaque cas par le programme

SEQBOOT.

Tableau 2 - Oligonucléotides amorces utilisés pour amplifier et/ ou séquencer les domaines variables

V3, v4 et v9 de la petit sous-unité ribosomique.

Table2 - Primers used to amplify and/or sequence regions within the SSrRNA gene

Amorce Position de l' oligonucleotide" Sequence (5' vers 3")

*SSE 396-394 GATTCCGGAGAGGGAGCC

*SSU 576-594 GTAATTCCAGCTCCAATAGC

SSgl 623-642 CCCAAAGTTCAACTACGAG

*SSG 894-914 CCAAGAATTTCACCTCTGAC

*SS5 1522-1542 GTGCTGGGGATAGAGCATTG

*SST 1744-1764. ACGGAACCTIGTTACGACT

* Décrit par Hausner et al 1992

| Numérotation faite par rapport à Saccharomyces cerevisiae,

| Saccharomyces cerevisiae numbering.

Source : MNHN, Paris

40 E. CHRZAVZEZ et R. AUFRERE

RÉSULTATS DISCUSSION

L'étude phylogénétique repose sur l'étude des séquences partielles codant l'ARN

18S ou petite sous-unité ribosomique. Il a été montré que l'emploi de séquences partiel-

les était suffisant pour ce genre d'étude (Mac Caroll, 1983; Lane, 1985). Le 18S est

réputé étre trés conservé dans le monde vivant et permet de comparer une palette assez

large de micro-organismes. De plus, les différentes régions du 18S connaissent des

vitesses d'évolution variables. Ainsi apparaissent des régions comme les domaines v3,

v4 et v9 qui évoluent un peu plus rapidement que les autres. Dans le cas présent il s'agit

d'étudier des micro-organismes relativement proches, il est donc préférable de

sélectionner des régions variables afin d'obtenir suffisamment de sites informatifs. Les

séquences nucléotidiques des régions v3, v4 et v9 ont été déterminées directement aprés

amplification en chaîne par polymérisation. Les séquences obtenues ont été alignées

(Figure 1) et comparées aux séquences d'autres micro-organismes comme Torulaspora

delbruckii, Candida glabrata, C. kefyr et Saccharomyces cerevisiae. Alors que cette

étude était terminée, nous avons eu connaissance de travaux similaires effectués par

James et al (1994). Les séquences obtenues par cette équipe ont été comparées à celles

obtenues dans notre laboratoire. Elles étaient toutes identiques mis à part celles de Z.

mrakii, pour laquelle nous avons à nouveau déterminé la séquence nucléotidique à

partir d'une nouvelle souche type provenant d'un autre collection. La séquence obtenue.

était la méme que celle obtenue la premiére fois.

L'alignement multiple des séquences a été analysé à l'aide des programmes

NEIGHBOR et DNAPARS. La force des noeuds a été calculée par bootstrap. Les résul-

tats obtenus par l'analyse en distance (plus proches voisins) et par la méthode de parci-

monie sont représentés sur les figures 2 et 3. Excepté dans le cas de C. glabrata, les

arbres obtenus par les méthodes de distance et de parcimonie générent des arbres phy-

logénétiques semblables. Deux groupes distincts émergent clairement. C. kefyr se bran-

che sur l'ancétre le plus éloigné. Dans le premier groupe deux paires de micro-organis-

mes trés proches (Z. rouxii et Z. mellis, Z. bailii et Z. bisporus) partagent un ancêtre

commun. Le second groupe peut être divisé en deux sous-groupes. Dans le premier

sous-groupe la paire Z. cidri, Z. fermentati qui partage un ancêtre commun avec 5.

cerevisiae; ce triplet a un ancêtre commun avec T. delbruckii et Z. microellipsoides qui

n'ont pas divergé de cet ancétre commun. Dans le second sous-groupe, la paire Z.

mrakii, Z. florentinus est branchée sur le méme noeud que C. glabrata dans le cas de

l'étude en parcimonie. Bien que deux groupes émergent, toutes ces espèces n'ont certai-

nement divergées que récemment. Ces résultats montrent que T. delbruckii et Z.

microellipsoides, bien que portant des noms de genre différents sont trés proches, et

souligne ainsi l'existence des problèmes inhérents à la classification des levures.

Une telle étude reste limitée par le nombre de séquences disponibles dans les

banques, mais elle évoluera avec l'apport d’autres séquences nucléotidiques. Cette

étude nous aura permis de montrer que le genre Zygosaccharomyces n'est pas mono-

phylétique mais que l’ensemble des espèces qui le constituent sont proches de Saccha-

romyces cerevisiae. Ainsi, l’étude de la spécificité de la sonde passe par le test de

levures proches de Saccharomyces cerevisiae, espèce bien définie phylogénétiquement.

Source : MNHN, Paris

PHLOGENIE DU GENRE ZYGOSACCHAROMYCES 41

REMERCIEMENTS:

Nous sommes reconnaissants à Mme Martini (DBVPG, Perugia, Italie) qui nous a fourni les

souches de Zygosaccharomyces, et à Mme Roquebert (Muséum National d'Histoire Naturelle de

Paris, France) pour la lecture critique du manuscrit

BIBLIOGRAPHIE

HIGGINS, SHARP, 1989 - Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer.

Cabios. 5: 151-153.

JAMES S.A., COLLINS M.D. and ROBERTS I.N., 1994 - Genetic Interrelationship Among Species

of the Genus Zygosaccharomyces as Revealed by Small-Subunit rRNA Gene Sequences.

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LANE DJ., PACE B., OLSEN GJ., STAHL D.A., SOGIN M.L. and PACE N.R., 1985 - Rapid

determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA: 82: 6955-6959.

McCARROLL R., OLSEN GJ., STAHL Y.D., WOESE C.R. and SOGIN M.L., 1983 - Nucleotide

Sequence of the Dictyostelium discoideum Small-Subunit Ribosomal Ribonucleic Acid

Inferred from the Gene Sequence: Evolutionary Implications. Biochemistry . 22: 5858-5868

RANKINE B.C. and PILONE D.A., 1973 - Saccharomyces bailii, a resistant yeast causing serious

spoilage of bottled table wine. Amer. J. Enol. Viticult. 24: 55-58.

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243.

THOMAS D.J., DAVENPORT R.R.,1985 - Zygosaccharomyces bailii - a profile of characteristics

and spoilage activities. Food Microbiology. 2: 157-169.

Source : MNHN, Paris

E. CHRZAVZEZ et R. AUFRÈRE

À Domaine V3

S.cerev

Z.bailii

Z.bisporus

Z.cidri

Z.ferment

Z.florent

Z.micro

Z.mrakii

Z.rouxii

S.cerev

Z.bailii

Z.bisporus

Z.cidri

Z. ferment

Z. florent

Z.micro

Z.mrakii

Z.rouxii

S.cerev

Z.bailii

Z.bisporus

Z.cidri

Z. ferment

Z.florent

2.шісго

Z.mrakii

Z.rouxii

S.cerev

Z.bailii

Z.bisporus

Z.cidri

Z.ferment

Z.florent

Z.micro

Z.mrakii

Z.rouxii

Domaine V4

S.cerev

Z.bailii

Z.bisporus

Z.cidri

Z.ferment

Z.florent

Z.micro

Z.mrakii

Z.rouxii

S.cerev

Z.bailii

Z.bisporus

Z.cidri

Z.ferment

Z.florent

Z.micro

Zmrakii

Z.rouxii

S.cerev

Z.bailii

Z.bisporus

Z.cidri

Z.ferment

Z.florent

Z.micro

Z.nrakii

Z.rouxii

CCAAGGAAGG CAGCAGGCGC GCAAATTACC CAATCCTAAT TCAGGGAGGT

OPP bbb aD

озазазза

Pep pape

TCGGGTCTTG TAATTGGAAT

: AC.

BRRRRRRR

AATTGGAGGG CAAGTCTGGT

TAGCGTATAT

Gaun

TTTTT---CG TGTACTGGA TTT-

HOP E

ТСТ.

TIT

ттт

IM.

ТТТ. =

mms

-CCAA CGGGGCCTTT CCTTCTGGCT

2.Т ТТТААТТ-СС. .С.. EY

-.T TTTAATTTCG.

‘aba

Jes

AACC-TT-GAGT TCT--TGGCG AACCAGGACT TTTACTTT

G...CT.GGGT сст-.

G...CT.GGGT . сст-.

«А...Тт.006С .. CCT-

+À. . TT. GGGC CCT-

-A. . .CG.TGTC Caco

А. i сст-

АА. $ Caco.

.G. .. CT. GGGT сст-

Source : MNHN Paris

PHLOGENIE DU GENRE ZYGOSACCHAROMYCES 43

cerev GAAAAAATTA

ipai M

‘bisporus ..

cidre

` ferment

florent .

micro Li

.mrakii — 2.

‘rouxii

GAGTGTTCAA AGCAGGC--G TATTGCTCGA ATATATTAGC

эз

Bos

533531

cerev ATGGAATAAT AGAATAGGAC GTTTGGTTCT

bailii . es SNAP COEM e

bisporus

cidri

ferment

florent

micro

mrakii

rouxii

NNNNONNNO NNNNNNNNO

0000000»

Domaine V9

.Cerev АТІССТАСТА АССССААСТС АТСАССТТСС СТТСАТТАСС ТСССТССССТ

AU ees, ТТ ее E:

араа ШІ PERTE

сійгі eae T

беша a o ES e a een

florent .....

micro

mrakii 2.

‘rouxii

ызмынымыш w

.cerev TTGTACACAC CGCCCGTCGC TAGTACCGAT

PRE MR ne mere

bisporus ........

диаг ee

ferment ...

.florent .

«micro

.mrakii

rouxii

ымымынымо

сеге CAG-GATCTG CTTAGAGAAG GGGGCAACTC CATCT-CAGA

bailii ERN NN dun ON

bisporus

cidri

ferment

florent

micro — .

-mrakii

.rouxii

NNNNAN ANN O

зозозаз

.cerev ^ TGGACAAAC TT

.bailii foy Ium

-bisporus

cidri

-ferment

-florent

micro

mrakii

rouxii

ззазазз»

Figure 1 - Alignement des domaines v3, v4 et v9 du 18S. Les points indiquent que le nucléotide est

identique à celui de la souche de référence, Saccharomyces cerevisiae, les tirets indiquent qu'il n'y a

pas de base présente à cette position.

Figure 1 - Alignment of SSrRNA partial sequences. Dots indicate nucleotide identical to the re-

ference species (Saccharomyces cerevisiae), dashes show no base present at this position.

Source : MNHN, Paris

44 E. CHRZAVZEZ et R. AUFRERE.

Z. bailii

Z. bisporus

1 Z. rouxii

Z. mellis

€. kefyr

Г Z. cidri

үз Г Z. fermentati

S. cerevisiae

Z. microellipsoides

T. delbruckii

Z. florentinus

PENNE.

E Z. mrakii

C. glabrata

Figure 2- Arbre phylogénétique obtenu en parsimonie. Les chiffres encerclés indiquent la force des

noeuds définie par bootstrap. La longueur des branches calculée par le programme PAUP est indi-

quée en italique. C. glabrata et C. kefyr ont été choisis comme groupe externe.

Figure 2- Phylogenetic tree obtained with the parsimony method. Numerals within circle indicate

the node strength defined by bootstrap test. The branch lengths, calculated within the PAUP program,

are drawn to scale and indicated by numbers in italics. Tree were rooted by taking C. glabrata and D.

kefyr as outgroup.

Source : MNHN, Paris

PHLOGÉNIE DU GENRE ZYGOSACCHAROMYCES 45

C. kefyr

rouxii

Z. mellis

Z. bailii

oZ: bisporus

0.13,

T. delbruckii

Z. fermentati

S. cerevisiae

Z. mrakii

Z. florentinus

C. glabrata

Figure 3 - Arbre phylogénitique obtenu par la méthode du NEIGHBOR-JOINING. Les chiffres

enceclés indiquent la force des noeuds définie par bootstrap. La longueur des branches, représentées

à l'échelle, est indiquée par les nombres en italiques. C. glabrata et C. kefyr ont été choisis comme

groupe extérieur.

Figure 3 - Tree obtained with NEIGHBOR-JOINING method. Numeral within circle represent the

node strength calculated by bootstrap. The branch lengths are drawn to scale and indicated by the

numbers in italics. Tree were rooted by taking C. glabrata and C. kefyr as outgroup

Source : MNHN, Paris

Source : MNHN. Paris

Cryptogamie, Mycol. 1995, 16 (1): 47-57 47

TOXIC TERPENOIDS FROM HIGHER FUNGI

AND THEIR POSSIBLE ROLE IN CHEMICAL

DEFENCE SYSTEMS

Olov STERNER

Division of Organic Chemistry 2, University of Lund, P.O.Box 124,

S-221 00 Lund (Sweden)

ABSTRACT - A considerable number of biologically active terpenoids, possessing for example

antibiotic, antifeedant and mutagenic activities, have been isolated from mushrooms. For most of

them the biological activity is caused by the presence of a reactive chemical functionality (e.g. a

O B-unsaturated ketone or lactone), and it has been proposed that many of them in fact are defensive

compounds. The cytotoxic sesquiterpenes responsible for the strong taste of the fruit bodies of

pungent Lactarius species are good examples. These sesquiterpenes are not present in the intact fruit

bodies, but are formed enzymatically from a biologically inactive and tasteless sesquiterpenoid

precursor as a response to injury. Different species, e.g. L. vellereus, L. piperatus and L necator,

form different combinations of pungent sesquiterpenes, and it is possible to distinguish between very

close species by comparing the sesquiterpenes formed as a response to injury.

RÉSUMÉ - Un nombre considérable de terpénoïdes biologiquement actifs, ayant par exemple des

activités antibiotiques, répulsives et mutagènes, ont été trouvés dans des champignons. Pour un

grand nombre d'entre eux, les activités biologiques sont liées à la présence de fonctions chimiques

réactives (p. ex. cétones et lactones o,B-insaturées), et il a été proposé qu'ils étaient en réalité des

composés de défense. Les sesquiterpènes cytotoxiques responsables du goût âcre de la chair

d'espèces de Lactarius piquantes en sont un exemple. Il est intéressant de noter que les sesquiter-

pénes ne sont pas présents originairement dans la chair du champignon, mais sont ultérieurement

formés de façon enzymatique à partir de précurseurs sesquiterpénoides biologiquement inactifs et

n'ayant aucun goût lorsque le champignon est attaqué. Différentes espèces comme L. vellereus, L.

piperatus et L. necator, forment différents ensembles de sesquiterpènes piquants en tant que réponse

à une attaque, et il est possible de distinguer des espèces très proches par leurs sesquiterpènes

formés

INTRODUCTION

The number of terpenoids isolated from Nature is large, more than 22,000

compounds have been reported in the literature (Connolly & Hill, 1991), and the

kingdom of Fungi have proven to be a rich source. Although only few of the classical

mushroom poisons belong to this class of natural products, many fungal terpenoids

possess potent biological activities and are toxic to man (Bresinsky & Besl, 1985; Anke

& Steglich, 1988). A few examples are shown in Figure 1.

Source : MNHN, Paris

48 O. STERNER

HCO

Figure 1

The crinipellins (e.g. crinipellin A [1]), are cytotoxic diterpenoids isolated from

cultures of Crinipellis stipitaria (Anke et al., 1985), while the striatins (e.g. striatin A

[2]) are produced by both cultures (Hecht et al., 1978) and fruit bodies (Rabe, 1989) of

Cyathus striatus as well as by other species. The LD., value for striatin A (2) is 60-110

mg/kg (i.p. administration to tumour-bearing mice) (Douros & Anke, 1994). The

acorane hemimycin (3) was isolated from cultures of Hemimycena cucullata and H.

candida, and possess potent cytotoxic activity (Bäuerle et al., 1986). The fruit bodies of

Hypholoma fasciculare have yielded a series of toxic triterpenoids, the fasciculols

(Suzuki et al., 1983), and from cultures of several Hypholoma species the cytotoxic

caryophyllane naematolon (4) was obtained (Backens et al., 1984). However, the

toxicity of the latter toward mammals appear to be limited, as the LD,, value is well

above 225 mg/kg (i.p. administration to tumour-bearing mice) (Douros & Anke, 1994).

Fruit bodies and cultures of Omphalotus olearius produce the toxic but also

antineoplastic illudane illudin S (5) (McMorris & Anchel, 1963). Several cytotoxic

triterpenes, the saponaceolides, have been isolated from Tricholoma species, e.g. T.

saponaceum (De Bernardi et al., 1988; 1991), and although their cytotoxic activity is

remarkable (for saponaceolide B (6) ID,, on the LoVo cell line is 0.16 g/ml, and LD,

on brine shrimps is 40 ng/ml) they possess no antimicrobial activity (De Bernardi et al.,

1991). Two further examples of toxic sesquiterpenes are the mutagenic (Anke &

Sterner, 1991) marasmic acid (7) and merulidial (8), originally isolated from

Marasmius conigenus (Kavanagh et al., 1949) and Merulius tremellosus (Giannetti et

Source : MNHN, Paris

TOXIC FUNGAL TERPENOIDS. 49

al., 1986), respectively. The LD,, value for marasmic acid (7) is 15-30 mg/kg (i.p.

administration to tumour-bearing mice) (Douros & Anke, 1994).

THE SESQUITERPENES OF THE RUSSULACEAE SPECIES

In general, nothing is known about any possible function of the terpenoids in

the fungi. However, in the fruit bodies of the pungent species belonging to the genus

Lactarius (family Russulaceae of the Basidomycotina subdivision) biologically active

terpenoids are formed as a response to physical injury, in what appears to be a chemical

defence system that protects the fruit bodies against parasites and infections (Camazine

et al., 1983; Sterner er al., 1985a). In this, pungent metabolites with antifeedant and

antimicrobial activity are formed when an inactive precursor is brought in contact with

enzymatic systems by the injury, not unlike a binary weapon system. The precursor is

present as an emulsion in the latex of the fruit bodies, this latex is characteristic for the

Lactarius species and can be observed if a fruit body is cut or broken. The colour and

taste of the latex, as well of the flesh, vary between different species, such characters

are important taxonomic markers for mycologists and the chemistry related to these

differences has been clarified for several species. Interestingly, there seems to be a

general pattern within the Lactarius genus, also in the non-pungent species, in that the

metabolites responsible for the characteristic differences in taste and colour are formed

enzymatically from fatty acid ester precursors as a response to injury to the fruit bodies.

Depending upon the precursor originally present in the fruit bodies, the Lactarius

species and the metabolites may be divided into three major groups:

1. The largest is made up by species belonging to the Albati and Lactarius

sections, for example L. vellereus, L. piperatus and L. scrobiculatus. They generally

have white latex containing large amounts of a biologically inactive fatty acid ester of a

marasmane sesquiterpene which rapidly (in seconds) is converted enzymatically to

bioactive marasmane, lactarane and seco-lactarane sesquiterpenes as a response to

injury (vide infra).

2. In the species belonging to the Dapetes section of Lactarius (e.g. L. deliciosus,

L. deterrimus, and L. sanguifluus) the latex is initially carrot-coloured or wine-coloured

but slowly turns green. This has been shown to be due to the presence of stearic acid

esters of guaiane sesquiterpenes in the intact fruit bodies which are converted mainly

by ester hydrolysis and oxidation to guaiane alcohols and aldehydes in the injured fruit

bodies (vide infra).

3, The latex and flesh of the fruit bodies of species belonging to the Plinthogali

section (e.g. L. fuliginosus and L. picinus) is originally white and sweet, but due to the

enzymatic hydrolysis of the stearic acid ester of a phenolic derivative to the free

phenol, which is a potent fungicid, and the enzymatic oxidation of this phenol to a

number of derivatives as a response to injury, the latex and flesh turn reddish and

bitterly acrid (De Bernardi et al. 1992).

Source : MNHN, Paris

50 O. STERNER

In addition, an isolactarane sesquiterpene has in some investigations been isolated

from extracts of L. rufus and L. vellereus (Daniewski et al., 1976; 1988), species that

mainly make marasmane and lactarane sesquiterpenes (vide infra). Also, from fruit

bodies of species belonging to other sections of Lactarius, sesquiterpenes with

caryophyllane (isolated from L. camphoratus [Daniewski et al, 1981]), drimane

(isolated from L. uvidus [De Bernardi et al., 1980; 1983]) and glutinopallal (isolated

from fruit bodies of L. glutinopallens [Fabre-Bonvin & Gluchoff-Fiasson, 1988])

skeletons have also been identified.

A CHEMICAL DEFENCE SYSTEM IN THE PUNGENT LACTARIUS SPECIES

In the fruit bodies of L. vellereus, the two sesquiterpenes isovelleral (10) and

velleral (11) are formed in seconds from the inactive precursor stearoylvelutinal (9) as

a response to injury. Isovelleral (10) and velleral (11) both contain an unsaturated

dialdehyde functionality and possess several striking biological activities that suggest

that at least part of their function in the injured fruit body should be to discourage

parasites and/or to avoid infections (Sterner ef al., 1985a; Anke & Sterner, 1991). Large

amounts of the two dialdehydes are formed, together the two compounds constitute 6 %

of a hexane extract made 10 seconds after injury by grinding a fruit body in a meat

grinder (Sterner er al., 1985a). The dialdehydes are subsequently reduced to isovellerol

(12) and vellerol (13), and the reduced derivatives have lost the pungency and most of

the biological activities of the unsaturated dialdehydes (Sterner et al., 1985b; 1987).

xd queen JuCHs

EG м. СНО

& CHO. CHOH

| Nebr abe:

сно ‘CHOH

сно он or CI ow

г OHC сно

сно ні CHO

15 16 17 18

Figure 2

Source : MNHN, Paris

TOXIC FUNGAL TERPENOIDS 51

In injured fruit bodies of L. bertillonii, only velleral (11) is formed from the

precursor stearoylvelutinal (9), velleral (11) is then reduced to vellerol (13) which

subsequently is oxidised to vellerolactone (14) (Hansson et al., 1994), a metabolite not

observed in the closely related species L. vellereus. Piperdial (15) is formed in injured

fruit bodies of for example L. torminosus (Sterner et al. 1985b), while the epimer epi-

piperdial (16) was isolated from the fruit bodies of L. necator (Sterner, 1989).

Lactardial (17) [containing an unsaturated dialdehyde functionality in disguise and

possessing relative modest bioactivities (Anke & Sterner, 1991)] has been isolated from

several species (Sterner et al., 1985b), for example L. necator, and its status as a

natural product is somewhat questionable as it under certain circumstances may be

formed as an artefact by chemical transformation of stearoylvelutinal (9) (vide infra).

Chrysorrhedial (18) is formed in injured fruit bodies of L. scrobiculatus (Pang et al.,

1992; De Bernardi et al, 1993) and L. chrysorrheus (De Bernardi et al., 1993). The

unsaturated dialdehydes 15-18 are by the injured mushroom tissue reduced to the

corresponding monoaldehydes, which subsequently are oxidised to the lactones, as

velleral (11) is reduced to vellerol (13) which is oxidised to vellerolactone (14).

Besides the potent antimicrobial, cytotoxic and, in some cases, mutagenic

activities of the unsaturated dialdehydes isolated from Lactarius fruit bodies (Anke &

Sterner, 1991), features that are shared with unsaturated dialdehydes isolated from

other natural sources such as insects, molluscs and plants, an additional important

quality is their intense pungent taste which actually make them excellent as human

antifeedants. It has also been shown that mammals that normally feed on mushrooms

will avoid edible specimens that have been treated with isovelleral (10) (Camazine et

al. 1983). However, their pungency probably limits the hazard to consumers of wild

mushrooms, as it would be difficult to consume significant amounts of the dialdehydes.

1 wg of for example isovelleral (10) (adsorbed on a filter paper disc) distinctly

stimulates the taste-buds of the human tongue, and as 1 g of freshly injured L. vellereus

tissue may contain more than 1000 pg isovelleral (10) and velleral (11), only small

amounts of the raw mushrooms can in practice be consumed by a normal individual. No

toxicity tests with mammals have been performed, but the in vitro data suggest that the

unsaturated dialdehydes would be highly toxic to mammals. The lactones, which appear

to be the end-products in several species, also possess cytotoxic activity (De Bernardi et

al., 1993), some of them have been reported to possess antifeedant activity against

storage pests (Daniewski et al., 1992).

The precursor of all the sesquiterpenes isolated from fruit bodies of the pungent

Lactarius species is velutinal, present in the intact fruit body as a fatty acid ester [e.g

stearoylvelutinal (9)] (Favre-Bonvin et al., 1982; Sterner et a/., 1983) as an emulsion

(the latex) in specialised hyphae (Gluchoff-Fiasson & Kiihner, 1982). Injury apparently

brings the precursor in contact with enzymatic systems, and the conversions of

stearoylvelutinal (9) to isovelleral (10), velleral (11), piperdial (15) and epi-piperdial

(16) are depicted in Figure 3 (Hansson er al. 1991; 1993). Enzymatic B-elimination of

the epoxide function of stearoylvelutinal (9) formes a metabolite that spontaneously is

Source : MNHN, Paris

52 O. STERNER

transformed to isovelleral (10), while the lactaranes (with a seven-membered ring) are

believed to be formed via a slightly different mechanism.

Figure 3

In addition, quite a number of lactarane furans have been reported from the

pungent Lactarius species, although the majority of the furans are believed to be

artefacts formed by chemical transformations of the labile velutinal esters (Sterner et

al, 1985c). Traces of acid (present in for instance undistilled solvent or in

chromatography gels) will rapidly transform any velutinal derivative to a number of

dihydro-hydroxy-(acyloxy)-furans that easily eliminate water to form furans (see Figure

4). However, some furans are co-formed with the dialdehydes, and should be

considered as true natural products (Sterner er al., 1988). In addition, it has been

observed that the dialdehydes are very sensitive to autoxidation, whereby isovelleral for.

example is hydroxylated and forms a nor-lactarane via a nor-marasmane (Jonassohn et

al., 1995). Many of the Lactarius sesquiterpenes reported have been obtained from

extracts of the fruit bodies which have been prepared by soaking the mushrooms in

ethanol for several weeks. This was for instance the case for two nor-marasmanes

isolated in small amounts from L. vellereus (Daniewski et al., 1988), and it is possible

that autoxidation of the natural products during extraction and isolation is the origin of

some minor metabolites reported as natural products,

Source : MNHN, Paris

TOXIC FUNGAL TERPENOIDS 53

"СНО

7 + —

сно о

Figure 4

CONVERSIONS OF SESQUITERPENOIDS IN THE SAFFRON MILK CAPS

(SECTION DAPETES)

Contrary to the pungent Lactarius fruit bodies which only are consumed in

exceptional cases, the saffron milk caps are considered to be among the most desirable

by consumers of wild mushrooms. They are characterised by strong and with time

changing colours of the latex as well as by an agreeable peppery taste, but also by their

lack of resistance to parasites compared to the pungent species. The colours of the latex

are caused by the presence and formation of azulene and hydroazulene sesquiterpenoids

with a guaiane skeleton, and the enzymatic conversions that take place as a response to

injury resembles those of the pungent species in that the intact fruit bodies contain fatty

acid (mainly stearic acid) esters of sesquiterpenes (esters 19, 20 and 21) which are

converted to sesquiterpenoic alcohols (compounds 22, 23 and 24), aldehydes

(compounds 25, 26 and 27) and a hydrocarbon (compound 28). The major differences

are that the amounts of sesquitepenoids in the saffron milk caps are much smaller, that

the enzymatic conversions are less rapid, and that the chemical functionalities present

in the guaiane sesquiterpenes make them considerably less biologically active. In intact

fruit bodies of L. deliciosus and L. deterrimus, only the orange ester 19 could be

detected (together with minor amounts of the corresponding linolic acid ester) (Vokac

et al, 1970; Bergendorff & Sterner, 1988). As a response to injury, 19 is slowly

(minutes) converted by ester hydrolysis and oxidations to the dihydroazulenes alcohol

22 and delicial (25), as well as the azulenes deterrol (24) and lactaroviolin (27)

Source : MNHN, Paris

54 O. STERNER

(Bergendorff & Sterner, 1988). The reduced azulene lactarazulene (28) was also

detected in extracts of injured specimens, and it is believed that all these sesquiterpenes

are formed enzymatically as they never could be observed as transformation products

during work-up and isolation. Several of the compounds have been isolated in previous

investigations of L. deliciosus and L. deterrimus, i.e. alcohol 22 (Vokac et al., 1970),

lactaroviolin (27) (Heilbronner & Schmid, 1953), and lactarazulene (28) (Sorm et al.,

1954). The green colour of the injured mushroom tissue emerges from a mixture of

orange-yellow (19, 22 and 25) and violet-blue (24 and 27) compounds. The fruit bodies

of L. sanguifluus originally contain a mixture of the orange 19 and the red 20,

predominantly the stearic acid esters, which gives the latex its deep red colour (Sterner

et al., 1989). Fruit bodies that had been injured (by grinding them in a meat grinder) for

30 minutes prior to extraction, yielded only sangol (23) (Sterner ert al., 1989), although

the aldehyde 26 previously has been isolated from L. sanguifluus (De Rosa & De

Stefano, 1987). The blue ester 21 has only been isolated from fruit bodies of L. indigo,

which also yielded lactaroviolin (27) (Harmon et al., 1980).

e «e «3

9 19 9 20 9 21

сосн СНз со(сн,) сн, CO(CHj)CHs

CH;OH CH;OH CH;OH

2 23 24

Q- Чч у «o

сно сно сно

25 26 27 28

Figure 5

Although the bacteriostatic activity of lactaroviolin (27) was reported already in

the 1940-ies (Willstaedt & Zetterberg, 1946), the guaiane sesquiterpenoids formed in

the saffron milk caps do not appear to affect humans otherwise than by colouring the

urine. However, in vitro assays performed with compounds 19, 22 and 25 (which all are

reasonable stable), showed that especially deterrol (22) possesses moderate cytotoxic

activity (10 g/ml inhibits the growth of ECA cells 50 %) and weak mutagenic activity

Source : MNHN, Paris

TOXIC FUNGAL TERPENOIDS 55

towards Ames tester strains TA98 and TA100 (2.4 revertants/mg/plate) in the presence

of rat liver extract (Anke er al., 1989).

CONCLUSIONS

The secondary metabolism of higher fungi has evolved during millions of years

in order to increase the competitiveness of fungi, and produces a large number of

biologically active and toxic compounds of which a substantial part is terpenoids.

Although the natural function of natural products in general is unknown, many have

never the less been suggested to play roles for example as pheromones, as feedants,

antifeedants or repellants, as regulators of the development of organisms as well as

social behaviours, and in chemical defence systems. All such functions demand of a

compound that it possesses biological activities, and the higher the activity is the more

efficiently would it normally be able to perform its duties. The likelihood for such

compounds to be toxic is therefore not negligible. In view of the fact that mushrooms

have a low nutritional value and should be regarded more as a spice than as food in

modern cuisine, one way to limit the risks to consumers is simply to avoid consuming

excessive amounts of wild mushrooms.

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ECOTOXINOGENESE DU FUSARIUM MONILIFORME:

ENVELOPPE DES RISQUES DES FUMONISINES

Pierrette LE BARS et Joseph LE BARS

Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie - LN.R.A.

B.P.3 31931 Toulouse

RÉSUMÉ - Soixante souches de Е. moniliforme furent isolées de 73 échantillons de semence de maïs

récoltés à la main. Ces souches furent ensemencées sur du mais réhydraté (50 %) et stérilisé, et

incubées dans les conditions optimales de production de fumonisine B1 (FB1): 22°C pendant 28

jours . Le dosage hebdomadaire de la FB1 fut effectué par chromatographie planaire instrumentali-

sée. 95 % des souches produisirent plus de 50 mg FB1/g de mais; 50 %, produisant plus de 800 mg/g

peuvent être considérées comme effectivement dangereuses. Les durées de la demi-vie de la FB1

dans le mais sont nettement supérieures aux différents traitements thermiques (50 à 150°C). Compte-

tenu, d'une part de la fréquence élevée de F. moniliforme et de la toxinogénicité des souches, et,

d'autre part, de la thermostabilité de la FB1, la contamination du mais et de ses dérivés constitue un.

nsque réel, confirmé par quelques mycotoxicoses aiguës.

ABSTRACT - Sixty strains of F. moniliforme were isolated from 73 samples of corn seeds harvested

by hand. These strains were cultivated on hydrated (50 %) and sterilized corn, in optimal condition

for fumonisin B1 (FB1) production: 22°C, 28 days, Weekly analysis of FB was performed by

instrumentalized planar chromatography. 95 % of strains produced more than 50 mg FB1/g corn:

50% producing over 800 mg/g might be considered as actually toxigenic in agronomic situation.

Half-life times of FB1 in corn was definitely longer than different thermal treatments (50 to 150°C)

As a consequence , first, of the high frequency of F. moniliforme and toxigenesis of strains, and,

secondly, of FB1 stability, contamination of corn and its derivatives is a permanent threat, confirmed

hy occasional acute toxicosis.

MOTS CLÉS - Mycotoxine, Fusarium moniliforme, fumonisine B1, toxinogénése, mais

TRODUCTION

Des cas aigus de leucoencéphalomalacie équine (ELEM) furent associés à la

consommation de maïs moisi dès la moitié du 19ème siècle aux USA, puis, plus tard,

dans d'autres pays (Marasas et al., 1984). En 1971, cette mycotoxicose fut attribuée au

Fusarium moniliforme Sheldon (Wilson et Maronpot, 1971). Aprés de longues années

de recherches infructueuses, un nouveau groupe de mycotoxines fut isolé et caractérisé,

les fumonisines (Gelderblom er al., 1988; Benzuidenhout et al., 1988). Enfin, le rôle de

la fumonisine B1 (FB1) dans l'ELEM fut démontré (Marasas ег а/., 1988; Laurent ef al.,

1989), De plus, cette toxine provoque expérimentalement l'oedéme du poumon chez le

porc (Harrison et al., 1990). Enfin, la FB1 a été impliquée comme l'un des métabolites

Source : MNHN, Paris

60 P. LE BARS et J. LE BARS

du F. moniliforme responsable d'effets cancérigènes chez le rat (Gelderblom er al.,

1991).

En France, le premier cas d'ELEM fut diagnostiqué sur la base des lésions

pathognomoniques et l'examen mycologique (Magnol et al., 1983; Le Bars, 1985).

Après quelques intoxications épisodiques mortelles, au cours des deux dernières an-

nées, une dizaine de toxicoses fatales furent confirmées par le dosage de la FB1 (Le

Bars et al., 1993 et 1994; Dupuy et al., 1993a).

En conséquence, un programme de recherche sur la définition de l'enveloppe

des risques de contamination du maïs par la FB1 fut entrepris.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Conditions optimales de croissance et de toxinogénèse

Une des souches isolées de maïs ayant provoqué l'une des intoxications évo-

quées ci-dessus fut ensemencée au centre de boites de Pétri (90 mm) contenant le

milieu PDA; les températures d' incubation furent les suivantes: 5, 10, 15, 20, 25, 30,

35 et 40°C. La croissance fut estimée quotidiennement par le rayon du thalle. Cette

même souche fut cultivée, en erlenmeyer de 100 ml, sur des grains de maïs réhydratés

(20 g + 20 ml d'eau) et stérilisés. Au cours de l'incubation, pendant 10 semaines, aux

mêmes températures que ci-dessus, un dosage hebdomadaire de la FB1 fut effectué par

chromatographie planaire instrumentalisée, comme décrit précédemment (Dupuy et al.,

1993).

Origine des souches de F. moniliforme

Des échantillons de semence de maïs furent récoltés à la main en fin de ma-

turité et séchés à 35°C pour assurer leur conservation. A partir de 73 lots de différentes

variétés et régions, 50 grains furent désinfectés superficiellement et placés sur le milieu

PDA. Après incubation à 22°C, 60 souches de F. moniliforme furent isolées.

Distribution du pouvoir toxinogène

Chaque souche fut ensemencée sur du maïs, en trois répétitions comme ci-

dessus. Après incubation à 22°C pendant 28 jours, le dosage de la FB1 fut effectué. Le

méme protocole fut mis en oeuvre pour 25 souches "anciennes", isolées au cours des 10

années précédentes et repiquées à plusieurs reprises.

Thermostabilité de la FB1

L'un des paramétres déterminant les niveaux réels de contamination myco-

toxique est la stabilité de la toxine dans le substrat cible. Cette étude a été effectuée sur

une farine de maïs contaminée par le FB1, après culture d'une souche toxinogène de F.

moniliforme sur des grains de mais; 500 mg de farine homogénéisée ont été placés

dans des tubes de 20 ml et soumis à 50, 75, 100, 125 et 150°C, dans des bains d'eau ou

Source : MNHN, Paris

PRODUCTION ET STABILITE DE LA FUMONISINE 61

d'huile, pendant des durées de 5 à 135 minutes. Chaque traitement et chaque dosage ont

fait l'objet de trois répétitions.

RÉSULTATS

A partir des données concernant la croissance et la toxinogénèse, les vitesses.

maximales pour chaque température furent calculées (figure 1). La température mini-

male pour la croissance et la toxinogénése est supérieure à 5°C; les températures

maximales sont inférieures ou égales respectivement à 40 et 35°C. La température

optimale de toxinogénèse (environ 22°C) est légèrement inférieure à celle de la crois-

sance. En dehors de l'intervalle 15-27°C, la production de FB1 est fortement réduite.

Pour les souches fraîchement isolées, la FB1 fut détectée, au seuil fixé dans

cet essai (50 mg/g), dans 95 % d'entre elles; 32 % des souches "anciennes" se révélè-

rent négatives dans les mêmes conditions (figure 2). La distribution du potentiel toxi-

nogène dans les souches "fraîches" était la suivante: 5 % étaient faiblement toxinogènes

(50 - 200 mg/g), 32 % modérèment (200 - 800 mg/g), 39 % fortement (800 - 3200

mg/g) et 18 % trés fortement toxinogénes (> 3200 mg/g).

mm/Jour HgFB1/g/jour

7] —— em qm)

180

6 EE Тес

5 140

120

100

i 80

: 20

0 0

5 10 15 20 25 30 35 40

Température °C

Figure 1 - Vitesse maximale de croissance (mm/jour) et de production de fumonisine Bi (ug

FB1/g/jour) en fonction de la température d’ incubation

Figure 1 - Maximal rate for growth (mm/day) and for fumonisin B1 production (ug FB1/g/day)

according to incubation temperature.

Source : MNHN, Paris

62 P. LE BARS et J. LE BARS

Fréquence %

Ай 9% anciennes souches

s, nouvelles souches

50-200 »3200

hig FB1/g

Figure 2 - Distribution du potentiel de production de fumonisine Bi dans 60 souches de Fusarium

moniliforme «fraîchement» isolées et dans 25 souches «anciennes».

Figure 2 - Distribution of fumosin Bi production among 60 «recently» isolated and 25 «old» strains

of Fusarium moniliforme.

La stabilité de la FB1 dans le broyat de mais en fonction de la température et

de la durée est décrite dans la figure 3; la disparition de la FB1, pour chaque tempéra-

ture suit une cinétique de premier ordre: Ln C/Co = -kt, Co étant la concentration

initiale et C la concentration pour un traitement donné. Une telle représentation permet

de calculer la durée de demi-vie, qui fut de 10, 38, 175 min et 8 h à respectivement 150,

125, 100 et 75°C.

DISCUSSION - CONCLUSION

Le F. moniliforme est un contaminant interne fréquent des grains de mais. La

fréquence et la capacité de production de FB1 sont très élevées; en ce qui concerne les

souches fraîchement isolées, elles sont généralement supérieures à celles rapportées par

ailleurs (Nelson er al., 1991; Ross er al., 1992; Thiel er al., 1991). Par contre, les

souches conservées quelques années sont plus fréquemment peu toxinogènes. Ceci peut

résulter d'une perte progressive du pouvoir toxinogène au cours des repiquages succes-

sifs, phénomène fréquent en ce qui concerne les métabolites secondaires, en particulier

chez les Fusarium (Nelson, 1992). Quoiqu'il en soit, plus de 50 % des souches peu-

Source : MNHN, Paris

PRODUCTION ET STABILITE DE LA FUMONISINE 63

Ln C/Co

minutes

0 50 100 150 200

Figure 3 - Etude de la stabilité de la fumonisine B1 dans de la farine de mais contaminée en fonction

de la durée de différents traitements thermiques.

Figure 3 - Stability of fumosin B1 in contaminated powdered corn according to duration of different

thermal treatments.

vent étre considérées comme potentiellement dangereuses dans les conditions naturel-

les. La production effective de FB1 dépend en outre de facteurs de l'environnement,

principalement disponibilité en eau et en oxygéne (Le Bars et al., 1994).

Enfin, la FB1 peut être considérée comme une mycotoxine stable dans le

maïs, étant donné que la durée de demi-vie est nettement supérieure à la durée des

différents types de traitement thermique (Dupuy et al., 1993b).

En conséquence, parallèlement aux études toxicologiques, il convient d'appro-

fondir ces mécanismes de contamination afin d'en dégager une prévention raisonnée.

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PARTIAL CHARACTERIZATION OF AROMA PRODUCED

BY SUBMERGED CULTURE OF MOREL MUSHROOM

MYCELIUM,

M. BENSOUSSAN ’, E. TISSERAND', W. KABBAJI, S. ROUSSOS?

"Université de Bourgogne, ENS.BANA,

Département de Microbiologie-Biotechnologie,

F-21000 Dijon

"O.RS.T.O.M,, Laboratoire de Biotechnologie,

B.P. 5045, F-34032 Montpellier cedex

ABSTRACT - Among the edible mushrooms, the genus Morchella presents the advantage to

produce pleasant odorous substances by mycelial biomass as well as by fruiting bodies. Three morel

mushroom mycelium were grown in submerged culture in order to approach the optimal conditions

for biomass and aroma production. Succession of odorous substances, as fruity, woody-nusty and

flowery notes were expessed during incubation on malt extract broth. Sniffing evaluation allowed to

select Morchella crassipes for further cultivation on ammonium-glucose basal medium and

ammonium-glucose malt extract medium and aroma production. Samples of mycelial biomass and

fresh or rehydrated fruiting bodies were extracted by distillation-extraction with methylene chloride

as solvent. The extracts obtained were concentrated under nitrogen flux and analysed by gas

chromatography. In parallel, an excess load of 5 standard aromatic molecules supposed to be

contained in the mushroom extracts were added to the samples before analysis. Chromatographic

profiles analysis show that similarities between mycelium extracts are higher than between mycelium

and fruiting bodies extracts. They also reveal the losses of many molecules for the extracts of

rehydrated material , indicated by the absence of many peaks with low retention time. 1-octen,3-ol

amounts are shown to be higher in mycelium than in fruiting bodies.

RÉSUMÉ - Il existe aujourd'hui des champignons "nobles" pour lesquels la maitrise du

développement en vue de l'obtention de volumes importants de carpophores n'a pu étre efficacement

établie in vitro, Certains, cependant, présentent la particularité de posséder un mycélium aromatique,

mais rares sont les espèces dont l'odeur du mycélium rappelle celle du carpophore. La morille, en

particulier, présente cette caractéristique. Il est donc apparu intéressant d'en cultiver le mycélium afin

de caractériser l'arôme produit. Au cours d'une étape de sélection, les cultures sont réalisées sur un

milieu à l'extrait de malt. Croissance mycélienne et pH des milieux sont relevés sur 14 jours, en

parallèle avec l'intensité et la qualité des arômes évalués par flairage. Des fractions mycéliennes

retenues pour l'opération d'extraction et des échantillons de carpophore sont homogénéisés

mécaniquement, soumis aux ultrasons, puis traités par co-distillation au dichlorométhane sur un.

appareil de Lickens-Nickerson pendant 40 minutes. Les extraits sont ensuite concentrés 5 fois sous

courant d'azote et dosés en C.P.G. Ramenées à la même quantité de biomasse, les concentrations en

extraits aromatiques totaux dans les fractions mycéliennes et les carpophores sont équivalentes. On

note que le milieu de culture influence la composition de l'aróme extrait du mycélium. En utilisant la.

méthode des surcharges au moyen de quelques molécules standards, on montre cependant que le

mycélium est plus riche en octène-1, ol-3 que le carpophore.

Source : MNHN, Paris

66 M. BENSOUSSAN et al.

INTRODUCTION

Few edible mushrooms have been integrated in cultivation processes which

allow to produce important quantities of fruiting bodies. Nevertheless, many

mushrooms exhibit aromatic mycelia, but rare are those which have odorous qualities

identical to their corresponding fruiting bodies (Babcock, 1939). The morel mushroom

presents this particular feature (Gilbert, 1960), and the cultivation of its mycelium

appears susceptible to conduct to an appreciable aromatic food additive.

From the 50's, the researches have mainly been concerned with submerged

production of morel mycelium, a patent was deposited by Szuecs (1956). The product

was generally washed, dehydrated and crushed to give a powder used for incorporation

in food preparations, as soups.

In view to optimize the growth of the mycelium and to reduce the production

costs, various solutions have been described for the formulations of the culture media.

Several fermentation processes have been proposed utilizing synthetic substrates

(Willam er al., 1956), by-products of the food industry (Gilbert, 1960; Litchfield er al.,

1963; Litchfield, 1967) or residues of the paper industry (Le Duy er al., 1974).

Comparatively to the works devoted to improve the mycelium production, very

few studies have been focused to the separation of the aroma fraction from the

mycelium (Szuecs, 1950). In fact, volatile coumpounds extracted from fruiting bodies

were described by Pyysalo (1976) from seven species and by Audouin et al. (1989)

from four species, including a morel.

The influences of the culture conditions on the flavour qualities of the

mycelium were reported for fungi by Sanchez-Font er al, (1985) and reviewed for

basidiomycetes by Gross and Asther (1989) and Gallois et al. (1990). The general way

to optimize the aroma production in submerged fermentation has been reviewed by

Belin et al. (1992).

The production of an aromatic mycelium extract allowed to valorize various by-

products and have, independantly of the seasonal conditions, the advantage to utilize

the filamentous phase of a mushroom in place of the fruiting body which remains an

appreciable food.

MATERIAL AND METHODS

Organisms and maintenance

Three mycelia of Morchella were provided from the collection of Station

d'Agronomie et de Mycologie (I.N.R.A., Clermont-Ferrand, France). M. crassipes MCR

92.24 (CBS N° 289.63, Baarns), M. esculenta MES 91.9 (from danish forest) and M.

hortensis MH 88.7 (from Provence). The stains were stored at +4°C on potato dextrose

agar slants (Bio-Mérieux, Charbonniéres-les-Bains).

Fruiting bodies of Morchella sp. fresh or dehydrated were collected for

comparative studies.

Source : MNHN, Paris

AROMA OF MOREL MUSHROOM MYCELIUM 67

Media, culture conditions and sensory analysis.

Incubations for growth kinetics and sensory analysis were performed on 6 ml of.

malt extract broth in test tubes carried by a slow speed inclined rotative holder at 25°C

during 14 days. Each day, tubes were sampled in triplicate to minimize aberrant results.

pH of the medium and biomass increase (dry matter) were measured. Qualitative

identification of aroma production by sniffing was evaluated during the 14 days

cultures. Aroma intensity was recorded versus an increasing scale: I (low) to III (high).

Aroma production was performed in 500 ml flasks containing 200 ml of liquid

medium supplemented with chloramphenicol (50 ppm, Aldrich). The liquid cultures

were run on a basal (B) medium containing glucose (20 g/l, Aldrich, Strasbourg,

France), ammonium-monophosphate (2 g/l, Aldrich) and 100 ml/l of the Szuecs's

mineral solution and on a basal malt extract medium (BME) consisting of the same B

medium enriched by malt extract broth (10g/l; BioMérieux, France). Initial pH was

adjusted to 5.9 for all cultures. Szuecs's mineral solution include, in g/l: CaCO3: 63;

MgSOs4,7H20: 15,3; K2SOa: 11; Мп504,4Н:0: 0,42; Еег(5О4)з: 0,086 (Szuecs, 1956).

Incubation was run on a rotary shaker at 110 rev./min at 25°C during 14 days.

Preparation of the biomass extracts

Wet mycelia (25 g) and fresh or rehydrated fruiting bodies (12 g) were

separately transfered in equal volume of distilled water and crushed during 45 sec with

an Ultra-Turrax mixer (BioBlock, Strasbourg, France). Ultrasonication 20 sec, three

times at 250 watts, using a Vibra Cell Sonics and Material apparatus (Danbury, CT,

USA) 250 watts; BioBlock, France) was realized to burst the cell walls. The treatment

was controlled by microscopic examination.

Aroma extraction and analysis

The aroma compounds were extracted from the crushed biomass by distillation-

extraction in a Likens-Nickerson apparatus modified by Godefroot et al., (1981),

according to the work of Vidal et al., (1988) on Marasmus oreades. Samples (10 ml)

were distillated simultaneously with methylene chloride (20 ml) at 115 and 70°C,

respectively, for 40 min. The organic phase was 5-fold concentrated (Vidal er al., 1988;

Audouin er al., 1989) under nitrogen flux and quantified by gas chromatography. 0.1 ml

of internal standart, g-undecanoic acid lactone (g-C11; 0.002 mg/ml in methylene

chloride), was added to samples before extraction.

Chromatographic analysis were carried out on a Spirawax column (internal

diameter, 0.32 mm, and film thickness, 0.25 mm; Spiral, Dijon, France) using a

Packard chromatograph, model 627A (Chrompack, Middelburg, The Nederlands),

equipped with a flame ionization detector. The oven rise temperature was set from 40

to 230°C, with a rate of 2°C/min. Injector and detector temperatures were 200 and

300°C respectively. Nitrogen (4 ml/min) was used as gas vector.

To identify some molecules in the morel mushroom extract by overloading,

similar extraction and analysis of the samples were run after addition of 0.1 ml of a

standard solution in methylene chloride containing five aroma substances of known

concentrations: 1-octen,3-ol (mushroom aroma), 2-heptanone (blue cheese aroma), 2,5-

Source : MNHN, Paris

68 M. BENSOUSSAN et al

dimethylpyrazine (nusty-roasty aroma), linalool (flowery terpenic odor) and

acetophenone (almond aroma).

RESULTS AND DISCUSSION

Comparative study of the odorous notes of the entire cultures of the three

Morchella strains.

The sniffing of the three cultures during the 14 days has shown some

similarities in the aromatic profiles (Figure 1). Succession of dominant aromatic notes

indicate: fruity notes in the beginning of the cultures, woody and nusty notes and

finally, flowery notes. M. esculenta exhibited a particularity with an intercalation of a

strong mushroom odor between the 7th and 9th days, just before the production of

woody and nusty notes.

Aroma

intensity

п I | |

1 | ]

M. crassipes

M. esculenta

п a

M. hortensis

Hee) hE ы”;

Days

Fruity notes

Ш Woody and nusty notes

HC Flowery notes

HBC Mushroom notes

Figure 1.

Odorous profiles of submerged cultures of morel mushroom mycelium in malt extract broth.

Profils odorants des cultures mycéliennes de morille en bouillon à l'extrait de malt.

Source : MNHN, Paris

AROMA OF MOREL MUSHROOM MYCELIUM

Morchella crassipes produced the higher and more stable aromatic intensity of

all notes during the incubation on malt extract broth , so it was selected for aroma

production.

Nevertheless, it has to be stressed that, in the same period, M. crassipes

produced less biomass than the other strains; about 30% lower at the 5 last days of

cultivation (Figure 2). This can be related to the pH conditions of the medium. The pH

of the M. crassipes culture (Figure 3) remains in a more acidic zone (5,1 - 5,3), which

is one or two points lower than the pH conditions favourable to the mycelium

production as previuosly described (pH=6: Szuecs, 1956; Martin, 1981; pH=6,93:

Willam et al., 1956).

81 Я

7 | # +

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8 | +

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1} À

ож 7 '

0 5 10 15

Days

Figure 2.

Growth kinetics of three morel mycelia species.

Cinétiques de croissance du mycélium de trois espéces de morille.

А A =

Days

Figure 3

PH variation in submerged cultures of three morel mushroom mycelia.

Evolution du pH dans les cultures en milieu liquide de trois espèces de morille.

M. crassipes

M. esculena |

M. hortensis |

M. crassipes

M. esculenta

M. hortensis

Source : MNHN, Paris

M. BENSOUSSAN et al.

361

yet

10 20 30 40 50 60 70 80

Source : MNHN, Paris

AROMA OF MOREL MUSHROOM MYCELIUM 71

Aroma production by Morchella crassipes.

Litchfield et al. (1963) have pointed out the positive role of glucose and

ammonium-monophosphate on the growth of morel mushroom mycelium in submerged

conditions.

Complementary, in this study, in which a similar basal medium was used, it has

been observed that morel aroma was strong and perceptible during the first 12 days of

cultivation and was not increased by a supplementation of organic nutriment, as malt

extract, in the culture medium.

Chromatographic analysis performed on the mycelial extracts from the B

medium (Figure 4) and the BME medium (Figure 5) are presented and compared to the

results obtained from the fruiting bodies of fresh (Figure 6) or rehydrated (Figure 7)

material,

On the basis of the profiles appearing on the chromatograms, a clear separation

is visible between the mycelial extracts and the. fruiting bodies extracts, the latter

showing more important peaks with high retention time.

The presence of g-undecanoic acid lactone (g-C11) as an internal standart in the

samples allowed to calculate two parameters: the extraction yield (YE) and the

concentration of the total aroma (CT). The results confirmed that, even the extraction

yield is lower (YE= 0,44; Table 1), the culture on a basal medium containing

ammonium mono-phosphate and glucose is more favourable to the production of

Morchella aroma (CT=170 ppm) in submerged culture

Table 1 shows also the results of a five molecules overloading of pure

compounds in extracts taken from mycelium and fruiting bodies,

The l-octen,3-o| appears more concentrated in the extracts issued from the

mycelium (13-40 ppm) than in the extracts of the fruiting bodies (1-3 ppm).

Nevertheless, these amounts remain very low, Utilizing a gassed stirred tank reactor to

cultivate Morchella esculenta, Schindler and Seipenbush (1990) indicated that the

growth form of the mycelium in submerged culture is of a great importance upon the

formation of 1-octen,3-ol. For optimal formation of this molecule (70 ppm), small and

compact pellets are preferable to loose pellets. The amount of 1-octen,3-ol can be

greatly incresed if mycelium is submitted to shear stress and disruption (Schindler and

Seipenbush, 1990), in the presence of linoleic acid as flavour precursor (Grosh and

Wurzenberger, 1985; Bensoussan er al., 1988; Muguet et al., 1994).

The detection of small quantity of linalool (5 ppm) in mycelium cultivated on

malt extract broth could explain the fruity notes detected by sniffing (Collins and

Morgan, 1970).

Figure 4,

Chromatogram of extract of morel mycelium cultivated on ammonium-glucose basal medium.

Chromatogramme d'un extrait mycélien de morille cultivée sur milieu de base ammonium-glucose.

Figure 5

Chromatogram of extract of morel mycelium cultivated on malt extract basal medium

Chromatogramme d'un extrait mycélien de morille cultivée sur milieu de base à l'extrait de malt.

Source : MNHN, Paris

72 M. BENSOUSSAN et al.

|| | L LL Lu

10 20 30 40 50

yet

КЕШ

60 70 80 90

yen

10 20 30 40 50

70 80

Source : MNHN, Paris

AROMA OF MOREL MUSHROOM MYCELIUM 73

Table 1

Identification of some volatile compounds extracted from morel mushroom aroma.

Identification de quelques composés volatils extraits de l'aróme de morille.

SAMPLES

MYCELIUM FRUITING BODIES

Glucose- | Glucose-

ammonium | ammonium Fresh Rehydrated

malt extract

Extraction yield 0,44 0,65 0,56 0,57

Concentration of total aroma (pg/g); 153 69 70 170

Amount of identified molecules

in the total aroma (ug/g):

L-octene,3-ol 40 13 1 3

2-heptanone 0 0 0 0

2,5-dimethylpyrazine 0 0 traces 5

linalool 0 2 0 0

acetophenone 17 1 4 29

A comparative analysis of the chromatograms corresponding to the two fruiting

bodies (Figures 6 and 7) show that the extracts of fresh material are qualitatively and

quantitatively richer in volatile compounds than the dry material.

According to Maga (1981), the drying process promote the desorption of many

volatile compounds. In this study, the loss has an important effect on the molecules of

which retention times are lower than those of the g-undecanoic acid lactone; its peack is

placed in the central part of the chromatograms.

CONCLUSION

We have demonstrated that aroma produced by morel mushroom mycelia are

dependent on the strains and on the culture conditions. In a screening on malt extract

broth, we have noticed alternation of odorous notes during the incubation, with, in the

beginning, permanence of fruity notes.

The submerged conditions allow to grow mycelium of Morchella which amount

of total aroma is in the same order with the quantities extracted from fruiting bodies

(CT: 70-170 ppm).

Figure 6.

Chromatogram of extract of fresh morel fruiting body.

Chromatogramme d'un extrait de carpophore frais de morille

Figure 7.

Chromatogram of extract of rehydrated morel fruiting body.

Chromatogramme d'un extrait de carpophore rehydraté de morille .

Source : MNHN, Paris

74 M. BENSOUSSAN et al.

In comparison to fruiting bodies fresh or rehydrated, the mycelium appears to

contain greater quantity of 1-octen,3-ol.

ACKNOWLEDGMENT. The work was supported in part by a grant from the Ministére de

l'Enseignement Supérieur et de la Recherche (94.G.0086), Paris. The authors are grateful to Mrs V.

Says-Lesage, INRA-Clermont-Ferrand, for providing the Morchella strains.

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rotées dans l'ordre d'appel dans le texte. Les tableaux devront étre dactylographiés clairement, sans

rature ni surcharge, en s'assurant de la qualité de la frappe. Les documents photographiques doivent

être montés par planches. Les dimensions des originaux ne devront pas excéder le triple de celle de

leur reproduction définitive (justification de la revue: 11,5 x 17,5 em) et les auteurs choisiront l'épais-

seur des traits et la taille des caractères en fonction de la réduction éventuelle. La publication de

planches en couleurs est à la charge des auteurs.

Pour diminuer les délais de parution, envoyez à la rédaction la version finale de votre article,

enregistrée sur disquette utilisable sous DOS (IBM) ou Mac Intosh; le logiciel WORD est conseillé.

Tirage à part: limités à 150, dont 25 gratuits.

Conformément à la règle, les auteurs décrivant une espèce nouvelle doivent déposer le matériel type

(échantillon sec ou culture) dans un herbier officiel: P.C. (Paris, Cryptogamie), CAB-IMI (Kew,

Surrey) ou une collection de souches: L.C.P. (Lab. Cryptogamie, Paris), CAB-IMI, CB-IMI, C.B.S

(Baarn, Hollande), etc.

Source : MNHN, Paris

INSTRUCTIONS TO AUTHORS

CRYPTOGAMIE, Mycologie publishes the results of scientific research in systematics, biology and

ecology of fungi. The journal accepts manuscripts written in French, English, German, Spanish, and

Italian.

TEXT. - Three copies of the manuscripts, typed in double-spacing on one side paper with margins of

4 cm, should be sent to the Redaction. Each typescript should include:

- the title, in the language of the manuscript, and its translation in English;

- the running title, of more than 50 letters;

- the name and first name(s) of each author, and their complete address;

- two summaries, the first in the text language, the other in French or in English, of no more than 180

words or 15 lines, pointing out the main results of the paper;

- key words, chosen by the Review Comittee;

- legends of text-figures, plates and tables should be self-explanatory, and listed together; written in

the text language, and in English or in French,

The presentation of the text should point out very clearly its subdivisions and their hierarchy, as well

as the beginning of each paragraph. The foot-notes should be numbered and collected at the end.

REFERENCES. - The references should be listed at the end of the text, arranged alphabetically and

chronologically according to the first author. The titles of the journals should be abbreviated

according to B-P-H (Botanico-Periodicum-Huntianum, Pittsburgh: Hunt Botanical Library, 1968)

and its supplement B.P.H//S. (Pittsburg, 1991); the books, cited according to F.A. Stafleu & R.S.

Cowan, 1976... Taxonomic literature. Ed. 2. Utrech/Antwerpen: Bohn, Scheltema & Holkema. In

the list of the references, the following outline should be adopted:

PATOUILLARD N., 1881 - Sur l'appareil conidial de Pleurotus ostreatus. Bull. Soc. Bot. France 27; 125.

HEIM R,, 1957 - Les champignons d'Europe. Paris, Boubée et Cie, 2: 571 p.

MANDELS G.P., 1965 - Kinetics of fungal growth. /n: G.C. AINSWORTH & A.S. SUSSMAN, The fungi. N.Y. &

London, Academic Press, І: 599-612.

The corresponding references in the text should figure by the name of the author and the year of

publication (use "et al.", for more than two authors), The numeric refer is prohibited.

ILLUSTRATIONS. - Each illustration, included tables, should be original ones, clearly drawn or

typed, and of good quality, ready for direct reproduction by offset. They should include the scale

bars, symbols necessary for their understanding, and they should be numbered consecutively,

according to the order in the text. The photographs should be mounted on light carbocard, ready for

reproduction. Originals should not be more than three times the size of the final reproduction

(11,5x17.5 cm). The authors should choose very carefully the corresponding thickness of lines, or

characters size. The publication of color plates is at the charge of the authors.

For shortening the delays of the publication, the authors should send the corrected version of their

manuscript on floppy disks (5 1/4, 3 1/2) using the DOS (IBM) or Mac Intosh format. In addition, the

use of WORD would be appreciated

Separata: not more than 150, of which 25 free copies.

Commission paritaire 16-1-1986- ?

. Sortie des pre

Éditeur : A.D.A.C. (Association d ryptogames)

Président : D. Lamy; Secrétaire : B. netière

Trésorier : B. de Reviers; Directeur de la publication : H. Causse

BIBL. DU

MUSEUM

PARIS Source : MNHN, Paris