CRYPTOGAMIE

MYCOLOGIE

TOME 18 FASCICULE 2 1997

CONTENTS

D. WIPF., S. KOSCHINSKY, P. CLOWEZ, J. C. MUNCH., В. ВОТТОМ &

Е BUSCOT — Recent advances in ecology and systematics of morels. .

S. BREHERET, T. TALOU, S. RAPIOR & J. M. BESSIERE — Basidiomycetes

volatile compounds: a possible tool for their chimiotaxonomy

T. RICHARD, J. GUILLOT & B. BOTTON — Immunological properties of

the lectin isolated from the phytopathogenic basidiomycete Rigidoporus

Bosh M нт HR S EDEN A AS d

O. REISINGER & S. BALÀZSY — Aerofungal propagules and dispersal of

база 51015. ARTE M ee о ыру ш

С. STEINBERG, V. EDEL & C. ALABOUVETTE — Incidence of selected for-

mulation modalities on survival and antagonistic activities of biocontrol

agents against plant cultivated fusarioses .............................

P. REY, М. BENHAMOU, J. HOCKENHULL & Y TIRILLY -Possible use of

Pythium oligandrum in an integrated protection model against Fusarium

oxysporum f. sp. radicis-lycopersici in hydroponic cultivation of tomatoes.

P. GUIRAUD, J. L. BENOIT-GUYOD, В. STEIMAN & Q. К. TRAN —

Fungistatic and fungicidal action of six biocides applied in the treatment

of contaminated archaeologic wood

С. $. TAN — Preservation of fungi

F. BABA-MOUSSA, K. KOUMAGLO, A. AYEDOUN, K. AKPAGANA,

M. MOUDACHIROU & P. BOUCHET — Antifungal activity of essen-

tial oils extracted in the African states of Togo and Benin ...

Р. НАГАМА & С. van HALUWYN — Antifungal activites of certain lichen

extracts.

Cryptogamie, Mycol. 1997, 18 (2) : 95-172

111

115

135

149

155

157

167

Source : MNHN. Paris

SFT ут Ч

Société Francaise de Microbiologie

28 rue du Docteur Roux - 75724 Paris cedex 15.

Tél : 01 45 68 81 79

Section de Mycologie

23-24 Janvier 1997

Faculté de Pharmacie

Lyon

REUNION DU RESEAU DE

MYCOLOGIE

Programme et résumés des communications et affiches

A «4

WM =

Les articles du fascicule 18(2) sont issus des communications présentées lors du colloque

organisé conjointement par la section de Mycologie de la Société Française de Microbio-

logie et par le Réseau de Mycologie.

Contents of vol. 18(2) represents communications delivered at the meeting jointly

organised by the Mycological section of the French Society of Microbiology ant the

Mycology Network.

Les articles de ce fascicule n’ont pas été soumis au comité de lecture avant publication.

Articles presented in this issue were not reviewed by referees.

Source : MNHN, Paris

Cryptogamie, Мусо 1997, 18 (2): 95-109 95

RECENT ADVANCES IN ECOLOGY

AND SYSTEMATICS OF MORELS.

Daniel WIPF', Stephanie KOSCHINSKY?, Philippe CLOWEZ?, Jean Charles MUNCH?*,

Bernard BOTTON! and François BUSCOT?

"Université Henri Poincaré, Laboratoire de Biologie Forestière, Unité de Physiologie Mycorhizienne,

BP 239, F-54506 Vandoeuvre-les-Nancy, France.

wipf@scbiol.u-nancy.fr

*Institut für Bodenbiologie, Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft,

Bundesallee 50, D-38116 Braunschweig, Germany

346, rue Jeanne d'Arc, F-60400 Suzoy, France

"Present address: Institut für Bodenókologie, GSF-Forschungszentrum für Umwelt

und Gesundheit GmbH, Neuherberg Postfach 1129, D-85758 OberschleiBheim, Germany

RÉSUMÉ — Le présent article fait la synthése des avancées récentes dans le domaine de la biologie

et de l'écologie des morilles avant de présenter des résultats nouveaux, susceptibles, d'éclairer le débat

sur la notion d'espèce dans ce groupe dont la systématique est controversée. Des expériences de

confrontations menées avec différentes “espèces de morilles” montrent que l'association à une plante

supérieure peut être spécifique. Cependant, le fait que des facteurs bactériens puissent modifier la

nature de telles associations incite à une utilisation prudente de telles spécificités d'association comme

critère de caractérisation des espèces de morilles. Parmi les approches modernes, c'est l'analyse de

l'espaceur ITS de l'ADN ribosomal qui est la mieux adaptée à cette caractérisation et à la révision

systématique des Morchellaceae. Des exemples sont fournis au sein du groupe des morilles rondes.

ABSTRACT — The paper summarises recent advances in the field of the biology and ecology of

morels and presents new results aiming to highlight the species definition in this group with

controversial systematics. Experiments using different morel species show that the association with

plants can be specific. However, as bacteria may modify their nature, the specificity of the associations

must be used cautiously as criterion to characterise morel species, Within the modern approaches, the

analysis of the ITS-region appears as the most adapted to characterise true species and to revise the

systematics of the Morchellaceae. Examples within the group of the yellow тоге are given.

KEY WORDS: Morchella, ecology, systematics, associations with plants, review.

MOTS CLES: Morchella, écologie, systématique, associations avec des plantes, revue

Morels are often one of the first spring edible mushrooms collected in temperate

regions (Weber, 1995). The stipitate mitrate ascomata with folded to spongiform hyme-

nium make the genus Morchella easy to define (Chadefaud, 1960). In contrast, the fact that

Korf (1973) and Jacquetant (1984) distinguished respectively 3 and 28 species illustrates

Source : MNHN, Paris

96 D. WIPF et al.

the debatable species definition. The basic difficulty here is that within each taxon, the

ascomata display high macroscopic morphological variations (fig. 1), whereas the micros-

copical features of the hymenium are remarquably homogenous within all Morchellaceae.

In this context, Gessner (1995) recently underlined the importance to consider also

biological and ecological features in order to distinguish form variations respectively

reflecting ecotypes and true species. The present article constitutes an attempt to follow

this line of thought. A review of known biological and ecological features and the

presentation of new results on the specificity of associations between morels and plants

will be used to highlight the most recent advances on systematics of this fungal group

which base on molecuiar biological investigations.

Fig. 1. — Morphological variability of fruitbodies within the taxon Morchella vulgaris

MNHN, Paris

ECOLOGY AND SYSTEMATICS ОЕ MORELS 97

BIOLOGICAL AND ECOLOGICAL CYCLES

The observation by Molliard (1905) and Matruchot (1909) that morels fruit at

the expense of preformed sclerotia constituted a crucial step of the ancient effort to

elucidate morel biology and ecology. The central biological role of sclerotia was confirmed

by the experimental work of Ower (1982 & 1986), which resulted in mastering the

fructification under culture conditions. In addition, ecophysiological field investigations

allowed Buscot (1989) to demonstrate the biennial life cycle of morels in temperate regions

and revealed that sclerotia constitute the mycelial structure which overlives the cold season

and provides the nutrients for the ascomata development in early spring. Both latter

functions of sclerotia were confirmed by biochemical (Buscot & Bernillon, 1991) and

experimental ecophysiological investigations (Buscot, 1993), which also supported the

observation by Mayr (1982) that morels form two types of sclerotia. The first type

represents the storage and overlive structure described above, while the second one can be

considered as abortive ascomatal primordia.

A second crucial step in the elucidation of morel biology was the hypothesis by

Hervey et al. (1978) and its confirmation by Volk and Leonard (1989) that the mycelium

can become heterokaryotic after forming vegetative anastomoses. In their representation

of the life cycle (fig. 2), the latter authors considered that only sclerotia formed by such

heterokaryotic mycelium, which they termed secondary mycelium, are able to produce

ascomata (Volk & Leonard, 1990). Buscot (1993) showed that heterokaryons are being

formed under low nutrient availibility, while monosporal strains segregate when cultivated

on nutrient rich media. He related this duality of mycelial somatic interactions with the

two ecological strategies (see fig. 3) which morels show in nature (Buscot, 1992a). Within

the so called “pioneer strategy”, morels behave as ruderal organisms, colonising tempo-

rary recently disturbed soils on which they display a high fructification abundancy (Kaul,

1975; Turnau, 1984, 1987; Carpenter ег al., 1987; Duchesne & Weber, 1993). In the so

called “perennial strategy”, they grow in stable ecosystems over several years and form

fruitbodies only sparsely. Considering the effective nutrient lability in both ecological

situations, Buscot (1992a) hypothesised that non self incompatibility between monospo-

ral mycelial strains should be enhanced in the pioneer strategy, while heterokaryons

should predominate in the perennial strategy. He related the homokaryotic stage with the

saprotrophic nutrition in the pioneer strategy and respectively the heterokaryon formation

with the capability to form trophic associations with plant roots in the perennial strategy

(see below association with roots). Thus, as is summarised in figures 2 and 3, Volk and

Leonard (1990) considered heterokaryosis from the point of view of its role for the

reproductive cycle, while Buscot regarded it as a somatic feature allowing the fungus to

adapt to an ecological situation marked by enhanced competition for nutrient and

complex associations with other organisms.

Additionally to describing morel sclerotia, Molliard (1905) also established a

link between the anamorph Costantinella cristata and the conidial stage of Morchella

elata. Paden (1972) confirmed this observation and Gams (pers. communication) obtained

conidia of M. elata in pure culture. Thus, this feature can be considered as well established.

To our knowledge however, M. elata is the only morel taxon in which conidia were

described and as conidial germination has never been reported, their biological function

remains unclear. This conidial stage has been included in the biological life cycle proposed

by Volk and Leonard (1990, see fig. 2).

Source : MNHN, Paris

D. WIPF et al.

[> spore germination

primary homokaryotic

mycelium

vegetative anastomoses

secondary heterokaryotic

mycelium

sporulation

poe o

Perennial Strategy

(in stable ecosystems)

spore germination) 42

Sprin;

р! Е 1

' enhanced non-self compatibility

ü heterokaryotlc mycelium predominant

Summer

& formation of sclerotia in association

esa with plant roots

* |

Winter hibernation

ascomata

Sane formation,

ЇЇ

. 2. — Biological life cycle of morels according to Volk and Leonard (1990).

Pioneer Strategy

(оп recently disturbed soils)

> (romanes)

reduced non-self compatibility

homokaryotic mycelium predominant

saprotrophic formation of sclerotia

hibernation

ascomata formation

2 а.а

Fig. 3. — Biological and ecological life cycle о!

f morels according to Buscot (1992).

Source : ММНМ. Paris

ECOLOGY AND SYSTEMATICS ОЕ MORELS 99

ASSOCIATIONS WITH HIGHER PLANTS IN NATURE

The morel fidelity to vegetation types and to particular plant species is well

known by morel hunters and is well documented (table 1). This feature was also largely

used for species characterisation by authors such as Jacquetant (1984), who distinguishes

a great number of taxa in morels. For example, within the yellow morels (sectio adnatae

sensu Jacquetant), an association with sand dune vegetation is a crucial characteristics to

identify M. spongiola var. dunensis (Romagnesi, 1963) and respectively, an occurence in a

ash tree forest is a helpful even if not a definitive criterion to characterise M. vulgaris

(Clowez, 1992). Nevertheless, several of the described associations of morels with plants

have to be interpreted cautiously for two reasons. Firstly, within mixed vegetation types.

the exact connection to a specific plant species was often not verified. Secondly, the nature

of the associations was mostly not investigated. In certain cases however, connections

between ascomata and plant roots or rhizomes could be traced and the kind of association

characterised. The spectrum of such thoroughly characterised associations appeared to

range from parasitism to ectomycorrhizal symbiosis (tab. 2). In the latter case, field

observations suggest that the mycorrhizal formation occurs in spring at the same time as

fruiting (Buscot & Kottke, 1990; Buscot, 1994) and represents the beginning of a new

vegetative cycle within the perennial strategy (Buscot 19924).

EXPERIMENTAL INVESTIGATIONS ON ASSOCIATIONS WITH PLANTS

While the potential to parasitism was confirmed experimentally, the formation

of true mycorrhizas under controlled conditions was not successfull until now (Buscot,

1992b). Nevertheless, with seedlings of Picea abies, the author obtained formation of

mycorrhiza-like modified short rootlets after inoculation of M. esculenta precultivated on

a nitrogen rich medium which also enhanced the proliferation of two bacteria (Bacillus

circulans and Acinetobacter johnsonii), probably originating from the spore surface (Fig.

4). Complementary assays to highlight these results are presented here briefly.

First series of assays were performed in a gnotobiotic culture system in which

axenic root systems of Norway spruce seedlings were confronted with homo- or hetero-

karyotic strains of M. esculenta and/or the bacteria isolates mentioned above (for the

method, see Buscot 1992 b). The experiments showed clearly that only the morel is able to

induce root modifications, as control plants and plants inoculated only with the bacteria

never formed modified roots. In all assays inoculated with morel strains, the formation of

mycorrhiza-like modified short roots with generally limited growth was induced (fig. 5a &

c). In few cases, the modified roots displayed a prolonged growth, which confered a

club-shape to them (fig. 5a). Co-inoculation with the morel and the bacteria appeared to

enhance this latter event (fig. 50 & d). Furthermore, confirming the above mentioned

hypothesis of a link between heterokaryosis and the capability of association with roots in

nature (Buscot, 1992 a), the production of both mycorrhiza-like and club-shaped roots

was clearly higher in case of inoculation with a heterokaryotic than with a monosporal

strain (fig. 5). The clearest morphological effect was obtained with polysporal inoculates

(fig. 4).

Source : MNHN, Paris

100 D. WIPF et al.

Fig. 4 — Mycorrhiza-like modified short roots of a Norway spruce seedling (Picea abies) infected

with a polysporal inoculate of Morchella esculenta

Source : MNHN, Paris

Fig. 5. — Root systems of Norway spruce seedlings inoculated with Morchella esculenta and

eventually with Bacillus circulans and Acinetobacter johnsonii. a, single inoculation with a monospo-

ral morel strain; b, dual inoculation with a monosporal fungal strain and with the bacteria; c, single

inoculation with a heterokaryotic morel strain; d, dual inoculation with a heterokaryotic morel strain

and with the bacteria (small arrows, mycorrhiza-like modified short roots with limited growth

potential; large arrows, club-shap modified rootlets with prolonged growth potential)

MNHN, Paris

102 D. WIPF et al.

Additional experiments were also performed to assess the specificity of different

morels to plant species. Surface sterilised seeds of Pinus banksiana Lamb. and Betula

pendula Roth. were germinated and precultivated on peat during 5-6 weeks in а growth

QUEE (photoperiod, 16/8 h; light intensity, 80 mmol m^ 571; temperature, 24°C). They

were inoculated with a mix of Morchella esculenta and Morchella elata and grown for 8-10

weeks. In comparison with control plants, the inoculated birches exhibited reduced shoot

but a similar root development (data not shown). In contrast, in pine assays, the effects

of the inoculation were higher, as both shoot and root development were reduced (fig. 6).

Fig. 6. — Confrontation assay between Pinus banksiana and а Morchella esculenta + M. elata mix. A,

control plant; B, inoculated plant; C, sclerotia formed close to B roots. Scale bar represents 1 cm.

The kind of the interaction with the roots was also different according to the plant partner.

Dense mycelial masses formed around root sectors of the birch trees (fig. 7), whereas large

sclerotia formed close to, but not in direct contact with, the pine roots (fig. 6). With either

of the plant species, a direct penetration of root tissues by the fungus could not be

detected, but the remarkable number of dead plants at the end of the assays suggests a

kind of necrotrophic parasitism of the fungus. Using PCR techniques described in the

following section, it was possible to demonstrate that from the mixed inoculates, only

M. esculenta developed in presence of birchs, and respectively that only M. elata grew in

Source : MNHN, Paris

ECOLOGY AND SYSTEMATICS ОЕ MORELS 103

presence of the pines (fig. 8). In additional control assays without plants, the mixed

inoculum displayed a very reduced growth in the peat substrate used for the assays. Thus,

this second series of experiments demonstrates clearly that morel species need a compa-

tible plant partner to colonise certain kinds of substrates.

Fig. 7. — Detailed view of birch roots with dense mycelial masses formed by Morchella elata (white

arrows).

M 1 2 3 4 M

[—— 1353 bp

| 1078 bp

| 872 Бр

-- 603 bp

. — Agarose electrophoresis gel of the rDNA spacer ITS of Morchella esculenta (1), M. elata (2),

the mycelial masses formed around root sectors of the birches (3) and of the large sclerotia formed

close to Pinus banksiana roots (4). M = fragment size markers fX 174 digested by Hae ITI

104 D. WIPF et al.

In summary, the above experimental investigations firstly reinforce the hypothe-

ses emitted by Buscot (1992a and 1993), that associations of morels with plants are crucial

in the perennial ecological strategy observed in stable ecosystems and that heterokaryosis

is an advantage for the fungus in this situation. Secondly, the experiments implied that not

only the associations but also their nature could be specific and depend on the taxa of both

partners. M. esculenta formed a different kind of association with the Norway spruce than

with the birch and none with Р banksiana with which M. elata in turn formed a third kind

of association. However, the experiments with the bacteria also demonstrate that the

features of the associations can be modified by other biological factors. This suggests that

using the associations with plants as a criterion for determination and as an element

helping to clear the morel systematics must be done cautiously and in combination with

further criteria.

LINK WITH THE SYSTEMATICS

In recent years the potential of modern biological methods to improve the morel

systematics was assessed by several authors.

The isozyme polymorphism was used by Gessner et al. (1987) and Yoon et al.

(1990) to characterise geographic isolates of Morchella esculenta from North America.

Kulkarni and Kamerath (1989), Royse and May (1990) also compared different American

Morchella species by this method. Finally, Wipf et al. (1996a) assessed whether isozyme

polymorphism in different members of the Morchellaceae could be used to clarify the

systematics of the familly. The analysis by the different authors allowed fine discrimina-

tions at the inter — or intraspecific levels and appeared useful in strain characterization.

However, Wipf er al. (1996a) underlined that the exhibited polymorphism is not adequate

to perform phylogenetic analysis or to clear the species concept.

The large subunit of the rDNA of Morchellaceae was also analysed with

PCR/RFLP by Bunyard et al. (1994). However, the authors reported higher degrees of

polymorphism between intraspecific populations than among putative species in certain

cases, which illustrates further the difficulty to define species in morels. In a more recent

paper, Buscot ef al. (1996) showed that polymorphism of the internal transcribed (ITS)

spacer of ribosomal DNA is more adequate to clarify morel systematics. The analysis

allowed to differentiate clearly all genera in the Morchellaceae and confirmed both species

groups recognised in all classifications, i.e. black (sectio distantes) (Jacquetant, 1984;

Weber, 1995) and yellow morels (sectio adnatae), which exhibited respective ITS lengths of

740-750 and 1150-1220 bp, respectively (fig 9). Sequence analysis of the ITS region

confirmed this high genetical distance between black and yellow morels (Wipf et al.

1996b), further suggesting that they should perhaps be considered as distinct genera, as

Mitrophora is. Within each "genera", slight length variations and different restriction

profiles of the ITS region allowed to separate several species (fig. 9).

At present, the performed molecular biological analysis reinforce the validity of

taxa like the yellow morels M. spongiola var dunensis and M. hortensis which do not exhibit

remarquable typological criteria but are well characterisable by their specific ecology. In

contrast, the distinction between M. esculenta and M. vulgaris proposed by Clowez (1992),

on the basis of ecological features is not confirmed by the molecular biological analysis

(data not shown).

Source : MNHN, Paris

105

ECOLOGY AND SYSTEMATICS ОР MORELS

(Od) 0с штошм

ureiSord лоупашоз ou цим payonnstod (5/61 "eos pue yeus) oon ууа 2022011242407 әшо jo ѕ@цепотеәт Aires — `6

sisueunp `W

L sisuayoy w

p- 4v Eluenose үй

оу ejuajnose `w

взоиел 51010510

p- геш елоцаолуу

L үндвюцаолуу

[=> ejuejnose emulo

L egnu eniwosAD

г- 109 91009 у

CHS вере `w

Eden

Ov 08 09 OL 08 06 001

(92) хәри Auei

Source : MNHN, Paris

106 D. WIPF et al.

Plants References

Equisetaceae

Equisetum hiemale Buscot & Roux, 1987

Polypodiaceae

(species not given) Lakhanpal ef al., 1990

Pinaceae

Abies alba, Pinus banksiana, Picea Jacquetant, 1984; Duchesne & Weber, 1993

abies Buscot & Roux. 1987; Clowez & Wipf. 1997

Magnoliaceae

Magnolia sp. Clowez & Wipf, 1997

Fagaceae

Fagus sylvatica, Quercus sp. Jacquetant, 1984; Buscot & Roux 1987

Betulaceae

Betula sp., Carpinus betulus, Alnus sp. Jacquetant, 1984

Corylaceae

Corylus avellana Jacquetant, 1984, Buscot & Roux, 1987

Ulmaceae

Ulmus miror, Celtis australis Jacquetant, 1984; Buscot & Roux, 1987: Clowez

& Wipf. 1997

Rosaceae

Prunus avium: Prunus spinosa; Clowez and Wipf, 1997; Buscot & Roux, 1987:

Crataegus monogyna, Rubus fruticosus, Philippoussis & Balis, 1995; Jacquetant, 1984

Malus pumila, Pyrus communis

Fabaceae

Robinia pseudioaccacia Philippoussis & Balis, 1995

Aceraceae

Acer pseudoplatanus Clowez & Wipf. 1997

Cornaceae

Cornus sanguinea

Hedera helix

Vitaceae

Vitis vinifera

Salilicicaceae

Populus nigra

Oleaceae

Fraxinus excelsior, Ligustrum vulgare,

Olea europaea , Syringa vulgaris

Asteraceae

Cynara scolymus, Helianthus tuberosus,

Hieracium murorum, Taraxacum sp.

Liliaceae

Allium ursinum

Buddlejaceae

Buddleja

Buscot & Roux. 1987

Clowez & Wipf. 1997

Condamy & Cornu, 1878

Jacquetant, 1984: Clowez and Wipf, 1997

Robert, 1865; Jacquetant, 1984: Buscot & Roux:

Clowez & Wipf, 1997

Jacquetant, 1984: Buscot & Roux, 1987

Buscot & Roux, 1987

Clowez & Wipf. 1997

Table 1 — Listing of plant species near which occurence of morels have been reported.

Source : MNHN. Paris

ECOLOGY AND SYSTEMATICS ОЕ MORELS 107

Morel species — Associated plants Observations Références

M. esculenta Vitis vinefera Parasitism Condamy & Cornu, 1878

M. esculenta Oleaceae; Cornaceae Parasitism Robert, 1865; Buscot &

Roux, 1987

M. esculenta Helianthus tuberosus Parasitism Roze, 1883

М spongiola Poacea Parasitism Romagnesi, 1963

M. semilibera Ulmus minor Ectomycorrhizas Matruchot, 1909

M. esculenta Picea abies Ectomycorrhizas Buscot & Kottke, 1990

M. elata Picea abies Ectomycorrhizas Buscot, 1994

Table 2 — Association between morels and plant roots in nature which have been analysed precisely.

It appears that a sequence analysis of the ITS region of representative taxa will

allow to clear the species concept and possibly the philogeny of the Morchellaceae.

Furthermore, it will give indications on which of the ecological features really characterise

species and respectively on which of them only reflect the high ecological plasticity of

morels.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors are indebted to the *Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG-

Project -Mykorrhiza und Pflanzenmorphogenetik —, Mu 831/2-3) and to the French

German Cooperation Program PROCOPE for their financial support. Dr. M. M. Kyto-

viita kindly revised the language.

REFERENCES

BUNYARD B.A., NICHOLSON M.S. & ROYSE D.J., 1994 — A systematic assessment of Mor-

chella using RFLP analysis of the 288 ribosomal RNA gene. Mycologia 86: 762-772.

BUSCOT Е, 1989 — Field observations on growth and development of Morchella rotunda and

Mitrophora semilibera in relation to forest soil temperature. Canadian journal of Botany 67:

589-593.

BUSCOT F. & KOTTKE L., 1990 — The association of Morchella rotunda (Pers.) Boudier with roots

of Picea abies (L) Karst. New phytologist 116: 425-430.

BUSCOT F. & BERNILLON J., 1991 — Mycosporins and related compounds in field and cultured

mycelial structures of Morchella esculenta. Mycological research 95: 752-754.

Source : MNHN, Paris

108 D. WIPF et al.

BUSCOT Е, 1992а — Stratégies écologiques et biologiques des Morilles. Cryptogamie, Mycologie 13:

171-179.

BUSCOT Е, 1992b — Synthesis of two types of association between Morchella esculenta and Picea

abies under controlled culture conditions. Journal of Plant Physiology 141: 12-17.

BUSCOT Е, 1993 — Mycelial differentiation of Morchella esculenta in pure culture. Mycological

Research. 97: 136-140.

BUSCOT Е, 1994 — Ectomycorrhizal types and endobacteria associated with ectomycorrhizas of

Morchella elata (Fr.) Boudier with Picea abies (L.) Karst. Mycorrhiza 4: 223-232.

BUSCOT F., WIPF D., DI BATTISTA C., MUNCH J.C., BOTTON B. & MARTIN Е, 1996

DNA polymorphism in morels I: PCR/RFLP analysis of the ribosomal DNA spacers and

microsatellite-primed PCR. Mycological Research 100: 63-71.

CARPENTER S.E., TRAPPE J.M. & AMMIRATI J.R., 1987 — Observations of fungal succession

in the Mont-St Helens devastation zone 1980-1983. Canadian Journal of Botany 65:

716-728.

CHADEFAUD M., 1960 — Traité de botanique, Tome I, Masson Eds, Paris, 1118 p.

CLOWEZ Р, 1992 — Mycorhize entre Fraxinus excelsior et Morchella vulgaris “signe bioindicateur

de site archéologique". Bulletin de la Société Linnéenne Nord Picardie 10: 43-46.

CLOWEZ P. & WIPF D., 1997 — (submitted). Les morilles de stratégie pérenne et colonisatrice:

relations avec certaines essences d'arbres et plantes melliféres d'apparition spontanées

en France. Documents Mycologiques, M. Bon Eds.

CONDAMY & CORNU M., 1878 — Communication puis notes sur quelques champignons

printaniers (Morchella, Gyromitra, Verpa). Bulletin de la Société Botanique de France 25:

128-131.

DUCHESNE L.C. & WEBER M.G., 1993 — High incidence of the Edible Morel Morchella conica

in a Jack Pine, Pinus banksiana, forest following prescribed burning. Canadian Field —

Naturalist, 107, 1 (Jan-Mar 1993): 114-116.

GESSNER R.V., 1995 — Genetics and systematics of North American populations of Morchella.

Canadian Journal of Botany 73 (Suppl. 1): 967-972

GESSNER R.V., Romano M. A. & Schultz В. W., 1987 — Allelic variation and segregation in

Morchella deliciosa and M. esculenta. Mycologia 79: 683-687.

HERVEY A., BISTIG С. & LEONG 1., 1978 — Cultural studies of single ascospore isolates of

Morchella esculenta. Mycologia 70: 1269-1274.

JACQUETANT E., 1984. Les Morilles. Plantanida Eds, Lausanne, 112 p.

KAUL T.N., 1975 — Studies on genus Morchella in Jamma and Kashmir, 1) Soil composition in

relation to carpophore development. Bulletin de la société Botanique de Bengal 29: 127-134.

KORF R.P., 1973 — Discomycetes and Tuberales. In G.C. Ainsworth, ЕК. Sparrow and A.S.

Sussman (ed.), The Fungi Vol.4, Academic Press, New York-London. pp. 249-319.

KULKARNI К. & KAMERATH G.D., 1989 — Isozyme analysis of Morchella species. Mushroom

Science 12: 451-457.

MATRUCHOT L., 1909. La culture des champignons comestibles : 418-659.

MAYR R., 1982 — Untersuchungen zum wachstum und zur Entwicklung einiger Arten der Mykorrhiza

bildenden Gattung Morchella. Dissertation zur Erlagung des Doktorgrades der Naturwis-

senschften, Universitát Giessen: 135p.

MOLLIARD M., 1905 — Production expérimentale de l'appareil ascosporé de la Morille. Comptes

Rendus Hebdomadaires des Scéances de l'Académie Sciences 140: 1146-1148.

OWER R., 1982 — Notes on the development of the morel ascocarp: Morchella esculenta. Mycologia

74: 142-144.

OWER R., MILLS G.L. & MALACHOWSKI J.A., 1986 — Cultivation of Morchella. U.S. Patent,

nb 4,594,809.

PADEN J.W., 1972 — Imperfect states and the taxonomy of the Pezizales. Persoonia 6: 405-414.

ROBERT E., 1865 — Relations entre la famille des oleinées et les morilles. Bulletin de la Société

Botanique de France 12: 244-246.

ROMAGNESI H., 1963 — Petit atlas des champignons. Bordas Eds., Paris.

Source : MNHN, Paris

ECOLOGY AND SYSTEMATICS ОЕ MORELS 109

ROYSE D.J. & MAY B., 1990 — Interspecific allozyme variation among Morchella spp. and its

interferences for systematics within the genus. Biochemical Systematics and Ecology 18:

475-479.

ROZE M.E., 1883 — Le parasitisme de Morchella esculenta Pers. sur Helianthus tuberosus L. Bulletin

de la Société Botanique de France 30: 139-143.

SNEATH PH.A. & SOKAL R.R., 1973 — Numerical Taxonomy. W.H. Freeman and Co. San

Francisco, California, 573 pp.

TURNAU K., 1984 — Post-fire cup-fungi of Turbacz and Stare Wiechy montains in the Gorge Range

(Polish Western Carpathians). Prace Botaniczne 12: 145-170.

TURNAU K., 1987 — Anemergence of Morchella semilibera D.C. Fr. after application of gesaprim

50. Prace Botaniczne 15: 153-157.

VOLK T.J. & LEONARD T.J., 1989 — Experimental studies on the morel, 1) heterokaryon forma-

tion between monoascosporous strains of Morchella. Mycologia 81: 523-531.

VOLK ТЈ. & LEONARD T.J., 1990 — Cytology of the life-cycle of Morchella. Mycological Research

94: 399-406.

WEBER N.S., 1995 — A morel's hunter companion. Lansing, MI: Two Peninsula Press, 209 р.

WIPF D., BEDELL J.P, MUNCH JC., ВОТТОМ В. & BUSCOT Е, 1996a — Polymorphism in

Morels: Isozyme Electrophoretic Analysis. Canadian Journal of Microbiology 42: 819-827

WIPF D., MUNCH J.C., BOTTON B. & BUSCOT Е, 19966 — DNA polymorphism in morels:

Complete sequences of the Internal Transcribed Spacer of Genes Coding for rRNA in

Morchella esculenta (yellow morel) and Morchella conica (black morel). Applied and

Environmental Microbiology 62: 3541-3543.

YOON CS., GESSNER R.V. and ROMANO M.A., 1990 — Population genetics and systematics of

the Morchella esculenta complex. Mycologia 82: 227-235

Source : MNHN. Paris

Cryptogamie, Mycol. 1997, 18 (2) : 111-114 111

COMPOSÉS VOLATILS : UN OUTIL

POUR LA CHIMIOTAXONOMIE DES BASIDIOMYCÈTES.

Sophie BREHERET', Thierry TALOU', Sylvie RAPIOR?, Jean-Marie BESSIERE?

! Laboratoire de Chimie agro-industrielle, Institut National Polytechnique de Toulouse,

École Nationale Supérieure de Toulouse, 118 Route de Narbonne, 31077 Toulouse cedex,

2 Laboratoire de Botanique, Phytochimie et Mycologie, Faculté de Pharmacie,

Université de Montpellier, 15 Avenue Charles Flahault, 34060 Montpellier cedex 2.

3 Laboratoire de Chimie Appliquée, École Nationale Supérieure de Chimie de Montpellier,

8 Rue de l'École Normale, 34296 Montpellier cedex 5.

INTRODUCTION

Les odeurs des Basidiomycètes, largement décrites dans la littérature mycologi-

que, peuvent être un critère important pour l'identification des champignons (Heim,

1957 ; Claus, 1978 ; Locquin, 1984 ; Courtecuisse & Duhem, 1994). Quelques bibliothè-

ques de champignons classés par note odorante, c'est-à-dire par odeur, sont d'ailleurs

fournies (Gilbert, 1934 ; Claus, 1978 ; Mornand & Taillandier, 1978 ; Locquin, 1984).

D'autre part, les composés volatils des Basidiomycètes, extraits par différentes techniques,

ont largement été étudiés (Maga, 1981 ; Mau et al., 1994). Pourtant peu d'auteurs ont

établi les corrélations entre l'odeur du champignon analysé et les molécules extraites

(Wood et al., 1992 ; Wood et al., 1994). Dans cette étude, les arômes des carpophores de 26

champignons odorants, classés par note odorante selon le référentiel olfactif « Le Champ

des Odeurs » (Jaubert, 1987), ont été piégés par concentration des effluves sur TENAX,

puis analysés par GC-Sniffing et GC/MS, afin d'identifier les composés clés odorants.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Des carpophores frais de 26 espèces ont été récoltés dans la région Languedoc-

Roussillon et identifiés par l'un d'entre nous (SR) sur la base de la classification de

Courtecuisse et Duhem (1994) : Agaricus silvicola (Vitt.) Peck, Agrocybe aegerita (Brig.)

Fayod, Amanita citrina (Sch. : Fr.) S.F. Gray, Amanita ovoidea (Bull. : Fr.) Link, Boletus

aestivalis (Paulet) Fr., Cantharellus cibarius (Fr. : Fr.) Fr., Clitocybe nebularis (Batsch : Fr.)

Kummer, Clitocybe odora (Bull. : Fr.) Kummer, Cortinarius cinnamomeus (L. : Fr.)

Fr., Cystoderma amianthinum (Scop.) Fayod, Cystoderma carcharias (Pers. : Fr.) Fayod,

Gomphidius glutinosus (Sch. : Fr.) Fr., Hydnum repandum L. : Fr., Hygrophoropsis

aurantiaca (Wülf. : Fr.) Maire, Hygrophorus agathosmus (Fr.) Fr., Laccaria amethystina

(Huds.) Cooke, Lactarius salmonicolor Heim & Leclair, Lepista nuda (Bull. : Fr.) Cooke,

Source : MNHN, Paris

5.ВЕЕНЕКЕТ ег al.

112

Espèce de Description de l'odeur du | Composés clés odorants | Description des odeurs

champignon champignon et ou marqueurs des composés

chimiques

G. glutinosus terpénique monoterpènes odeurs diverses,

dominante terpénique

A. ovoidea marine monoterpenes dominante 2516

C. nebularis moisie-terreuse (farineuse) octanol orangée, fruitée

hexanol fruitée

L. amethystina moisie-terreusc (farineuse) octa-1,3-diène fruitée

T. portentosum moisie-terreuse (farineuse) octène éthérée-fruitée

T. sulfureum moisic-terreuse (gaz linalol fraiche

d'éclairage) undécène fraiche

В. aestivalis moisie-terreuse (fongique) 4-méthylanisole florale, verte

C. carcharias moisie-terreuse géosmine moisie-terreuse

C. amianthinum moisic-terreuse géosmine moisie-terreuse

M. pura verte (raphanoide) géosmine moisic-terreusc

hexanal verte.

M. rosea verte (raphanoïde) hexanal verte

hexan-2-one fruitéc-cthérée

С cinnamomeus verte (raphanoide) hexan-2-one fruitée-éthérée

A. синта verte (pomme de terre crue) octène éthéréc-fruitée

styrène éthérée-fruitée

undécène fraîche

L. salmonicolor zestéc (mandarinc) octanal orangée, miclléc

octanol orangée, fruitée

oct-2-énal fraiche

A. aegerita fruitée (lie de vin) 2-méthylbutanol éthérée

3-hydroxybutan-2-one beurrée-lactée

5. luteus fruité 7 octanol orangée, fruitée

H. aurantiaca Truitée (aromatique) octène éthérée-fruitée

P. betulinus fruitée octènc éthérée-fruitée:

octanol orangé, fruitée J

T. caligatum fruite (aromatique) styrène éthéréc-fruitée

monoterpènes odeurs diverses, agréable

L. nuda fruitée (vitaminée) linalol E fraîche

H. repandum. lactonée-fruitée fruitée

C. cibarius lactonée-fruitée fruitée

A. silvicola anisée benzaldéhyde douce-épicée (amande

alcool benzylique amère)

douce-épicée

C. odora anisée anisaldéhyde anisce

H. agathosmus douce-épicée (amande benzaldéhyde douce-épicée (amande

amère) amère)

M. alliaceus alliacée composés soufrés soufrée, alliacée

Tableau 1. — Corrélation entre les odeurs de champignons et les composés clés odorants selon le

référentiel olfactif « Le Champ des Odeurs »

Source : MNHN. Paris

COMPOSÉS VOLATILS 113

Marasmius alliaceus (Jacq. : Fr.) Fr., Mycena pura (Pers. : Fr.) Kummer, Mycena rosea

(Bull.) Gramberg, Piptoporus betulinus (Bull. : Fr.) Karst., Suillus luteus (L. : Fr.) Roussel,

Tricholoma caligatum (Viv.) Ricken, Tricholoma portentosum (Fr.) Quélet, Tricholoma

sulfureum (Bull. : Fr.) Kummer.

La fraction volatile des carpophores frais a été extraite, 24 heures après la récolte,

par analyse directe des effluves, et analysée par chromatographie en phase gazeuse couplée

à la technique du Snifling et à la spectrométrie de masse. Les conditions expérimentales

sont décrites dans Breheret et al. (1996, 1997).

RÉSULTATS ET DISCUSSION

Les analyses chimiques et sensorielles des arômes de 26 espèces de champignons

ont révélées la présence de 14 composés à huit atomes de carbone, dont l'oct-1-én-3-ol et

l'octan-3-one, connus comme responsables de l'odeur fongique (Maga, 1981 ; Mau et al.,

1994). 15 molécules à noyau benzénique ont également été identifiées, ainsi que 10

molécules soufrées. Ces dernières ont uniquement été décelées dans l'aróme de

M. alliaceus et sont responsables de l'odeur soufrée (Rapior et al., 1997). Trente huit

composés terpéniques dont 24 monoterpenes (Breheret er al., 1997) et 15 sesquiterpenes

ont été analysés. Les stuctures chimiques de 2 monoterpènes et de 13 sesquiterpènes

restent méconnues. Les analyses ont révélé la présence d'une série de 28 autres composés

de diverses familles chimiques et de 38 molécules non identifiées. Parmi tous ces composés,

quelques-uns peuvent étre considérés comme des composés odorants clés, c'est-à -dire que

leurs odeurs expliquent totalement ou en partie celle du carpophore ; il peut s'agir d'un

composé unique ou d'un mélange de composés. Quelques composés pourraient également

étre considérés comme marqueurs chimiques d'une espéce donnée, s'ils sont spécifiques

d'un champignon et présents en quantité suffisamment importante. Les résultats sont

rassemblés dans le tableau 1.

RÉFÉRENCES

BREHERET S., TALOU T., RAPIOR S. & BESSIERE J.M., 1996 — Analyse comparative de

l'arôme du Clitocybe anisé (Clitocybe odora) par extraction au solvant et analyse des

effluves. Rivista Italiana EPPOS 7 (Spec. Num) : 449-457.

BREHERETS, RAPIOR S., TALOU T. & BESSIERE J.M., 1997 — Monoterpenes in the aromas of

fresh wild mushrooms (Basidiomycetes). Journal of agricultural and food chemistry (sous

presse).

CLAUS G., 1978 — Des odeurs en mycologie. Documents mycologiques 8(30-31) : 31-63.

COURTECUISSE В. & DUHEM B., 1994 — Guide des Champignons de France et d'Europe.

Delachaux and Niestlé, Lausanne, Zwitzerland, 476 p.

GILBERT E.J., 1934 — Méthode de Mycologie Descriptive. Librairie E. Le François, Paris, France,

pp. 323-366.

HEIM R., 1957 — Les champignons d'Europe, Tome 1. Boubée & Cie, Paris, France, рр. 115-122.

JAUBERT J.N., GORDON G. & DORÉ J.C., 1987 — Une organisation du champ des odeurs.

Deuxième partie : Modele descriptif de l'organisation de l'espace odorant. Parfums

Cosmétiques Arómes 78 : 71-82.

LOCQUIN M., 1984 — Mycologie Générale et Structurale. Masson, Paris, France, pp. 337-346

Source : MNHN, Paris

114 $. BREHERET er al.

MAGA J.A., 1981 — Mushroom Flavor. Journal of agricultural and food chemistry 29 : 1-10.

MAU 1, BEELMAN R.B. & ZIEGLER R.G., 1994 — Spices, Herbs and Edible Fungi. G. Chara-

lambous, Elsevier, Amsterdam, The Netherlands, pp. 657-684.

MORNAND J. & TAILLANDIER P., 1978 — Guide Pratique des Odeurs de Champignons, édition

du Choletais, Cholet, France, 14 p.

RAPIOR S., BREHERET S., TALOU T. & BESSIERE J.M., 1997 — Volatile Flavor constituents of

fresh Marasmius alliaceus (Garlic Marasmius). Journal of agricultural and food chemistry

(sous presse, 45 (3)).

WOOD W.F, BROWNSON M. & SMUDDE R.A., 1992. 2-aminobenzaldéhyde : the source of the

« sweet odor » of the Hebeloma sacchariolens. Mycologia 84 : 935-936.

WOOD WF, BRANDES M.L., WATSON R.L., JONES R.L. & LARGENT D.L., 1994 —

Trans-2-nonenal, the Cucumber Odor of Mushrooms. Mycologia 86 : 561-563.

Source : MNHN. Paris

Cryptogamie, Mycol, 1997, 18 (2): 115-123 115

IMMUNOLOGICAL PROPERTIES OF А LECTIN ISOLATED

FROM THE PHYTOPATHOGENIC BASIDIOMYCETE

RIGIDOPORUS LIGNOSUS.

Thierry RICHARD, Jean GUILLOT? and Bernard BOTTON!*

! Université Henri Poincaré,

Nancy I, Faculté des Sciences,

Laboratoire de Biologie Forestière associé INRA,

BP 239, 54506 Vandoeuvre-lès-Nancy Cedex, France

? Université d'Auvergne, Clermont-Ferrand I,

Faculté de Pharmacie,

Laboratoire de Botanique, Cryptogamie et Microbiologie,

28, Place Henri Dunant, 63000 Clermont-Ferrand, France

* To whom correspondence should be addressed

ABSTRACT: An antiserum raised against the lectin purified from mycelial strands of Rigidoporus

lignosus (isolate FCA3) was used in Ouchterlony double diffusion to detect lectin in other parts of the

colony and in the culture medium, as well as in a number of other African and Asian isolates. The

lectin was strongly accumulated in mycelial strands and less concentrated in undifferentiated myce-

lium. А significant amount was excreted in the culture medium. The lectin in the strands of the FCA3

isolate was serologically identical to those synthesized by the vegetative mycelium, excreted in the

culture medium and present in the other isolates. Hemagglutination activity determined with the O

group erythrocytes was wery low in a few isolates, and consistent with this, no precipition lines were

detected by immunodiffusion, especially in the isolates which hardly ever differentiated mycelial

strands. Cross reactions indicated that the lectin of Rigidoporus lignosus was related to that of Boletus

edulis and Ulex europaeus I and II, but however not identical with the two latter. No serological

relationship was found with 13 other lectins purified from fungi and higher plants, thus confirming the

unicity of the lectins in Rigidoporus lignosus.

KEY-WORDS: Basidiomycete, Fungi, Lectin, Ouchterlony double diffusion, Rigidoporus lignosus

INTRODUCTION

Lectins are diverse multivalent carbohydrate-binding proteins or glycoproteins

of non-immune origin that have the property of agglutinating animal and plant cells

(Goldstein & Poretz, 1986; Lis & Sharon, 1986). They are widely distributed in animals,

plants and fungi and the most extensively studied group of lectins to date is that of the

plant family Leguminoseae (Etzler, 1985; Maliarik et al., 1991).

Source - MNHN. Paris

116 T. RICHARD et al.

Although many lectins have been isolated and characterized from fungi, the

physiological roles of most fungal lectins is still unclear and speculative. In Conidiobolus

lamprauges and Neurospora sitophila the lectin is thought to play an important role in cell

wall biosynthesis and mycelial differentiation (Ishikawa ег al., 1983; Ishikawa & Oishi,

1989). It has also been postulated that fungal lectins are involved in adhesion and

recognition phenomena. Flocculation in Kluyveromyces bulgaricus and mating interaction

in Saccharomyces cerevisiae are mediated by lectins (Al-Mahmood et al., 1988; Terrance et

al., 1987), while in lichens, fungal lectins are involved in the relationship between fungi and

algae (Lockhart et al., 1978). The lectins of ectomycorrhizal fungi such as Lactarius

deliciosus, L. deterrimus and L. salmonicolor appear to be involved in the early stages of

recognition with Pinus sylvestris, P. abies and Abies pectinata, respectively (Giollant, 1991;

Giollant et al., 1993). Adhesion by lectins may also be the initial step in certain infection

processes. Thus, the zoospores of Phytophthora cinnamomi adhere to root cells of corn by

means of lectins (Hinch & Clarke, 1980). In addition, the lectins on the trap surface of

many nematode-trapping fungi are important in the attachment of those fungi to nema-

todes (Tunlid et al., 1992).

Rigidoporus lignosus is a tropical basidiomycete causing great losses in planta-

tions of a number of species, especially Hevea brasiliensis (Rubber tree) and Tectona

grandis (Teak). The fungus differentiates flattened mycelial strands which infest the roots

of healthy rubber trees (Nandris et al., 1987). With the aim to control dissemination of the

fungus, research has been conducted to gain better knowledge of the mycelial strand

differentiation processes. Results have demonstrated the presence in Rigidoporus lignosus

of a lectin which was composed of four identical submits of 35 kDa, had a high affinity for

L-fucose and was synthesized concomitantly with strand formation (Richard, 1995). The

lectin was cytosolic in the vegetative cells but was located at the periphery of the strand

cells where the affinity sites for the lectin were also distributed (Richard et al., 1994). In

addition the affinity sites for the lectin were also present on the root surfaces of Hevea

brasiliensis (Richard, 1995), suggesting that this lectin may be involved, both in the

processes of mycelial strand formation and in host recognition. However a detailed

analysis of the accumulation and distribution of this lectin has not been carried out yet.

In the present paper, the lectin extracted from Rigidoporus lignosus strands was

immunologically compared to the lectins present in the other parts of the colony and in

several other strains of this pathogenic fungus. Moreover, the antibodies were used to

assess the immunological relationship between the Rigidoporus lignosus lectin and a few

others isolated from fungi and higher plants.

MATERIALS AN

Fungi and culture conditions

Ten Rigidoporus lignosus strains (also called isolates), isolated from Hevea

brasiliensis roots were obtained from the Rubber Research Institute in Paris. The details of

geographical origin and year of isolation are listed in Table 1. Five strains were isolated

from Africa and five from Asia. Purification and characterization of a lectin were carried

out from the FCA3 strain coming from Cameroun.

All the strains were conserved as mycelial stock cultures in the dark on 2% malt

agar medium at 24°С. For the extraction of the lectins, the fungi were grown in static

cultures at 28°C, in 240 ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml 290 malt liquid medium.

Source : MNHN, Paris

IMMUNOLOGICAL PROPERTIES OF THE LECTIN OF R/GIDOPORUS LIGNOSUS 117

The surface of the medium was inoculated with a 7 mm-diameter disc of solid medium

punched out from the edge of a 7 day-old colony grown on malt agar.

Isolates Origin Isolation (year)

FCI9 Ivory Coast (South-West) 1989

FCA3 Cameroun (South-West) 1989

FGAI Gabon (North-Mitzic) 1989

ЕСА4 Gabon (North-Mitzic) 1991

FGA7 | Gabon (South-Kango) 1991

FIDI Indonesia (North-Sumatra) 1988

FID2 Indonesia (North-Sumatra) 1989

FID3 Indonesia (West-Kalimatan) 1989

FML3 Malaysia (South) 1989

FML4 Malaysia (South) | 1989

Table 1. Isolate designation, geographic origin and year of isolation of the studied Rigidoporus

lignosus isolates

Estimation of lectin activity

To determine lectin content in colonies, all the strains were grown for 3 weeks in

liquid medium. Vegetative mycelia and mycelial strands were weighed and extracted

separately in PBS (phosphate-buffered saline; 1.5 тМ-КН2РО4/10 mM-Na2HPO4, pH

7.4; 3 mM-KCI; 140 mM-NaCl). The resulting homogenate was centrifuged at 40,000 g for

20 minutes to remove insoluble residues. Thereafter, lectin and protein concentrations of

the supernatant were determined.

Lectin activity was estimated in microtiter plates by a serial dilution method as

already described by Al-Mahmood et al. (1988). To 100 pl aliquots obtained by dilution of

the lectin solution, an equal volume of a 2% suspension of washed human red blood cells

(О group) in PBS was added. Plates were left overnight at 4°С and examined for aggluti-

nation. The titre was defined as the reciprocal of the highest lectin dilution that still

agglutinated the cells. Specific activity was the titre expressed by 1 mg protein.

Protein concentration was measured according to the method of Bradford

(1976) using Bovin Serum Albumin as a standard.

Production of antibodies and Double immunodiffusion assay

Polyclonal antibodies were obtained with the lectin extracted from the mycelial

strands of the FCA3 strain according to a method described previoulsy (Botton et al.,

1987).

Specificity of the antibodies was tested by Western blot techniques as already

described (Richard, 1995). Since the antiserum against the lectin from the FCA3 strain

reacted exclusively with the lectin polypeptides on a Western blot of total extracts from

other strains and did not react with any polypeptide band when the same extracts were

depleted of lectin (result not shown) we assume that the antibodies were monospecific.

Source : MNHN, Paris

118 T. RICHARD et al.

Double immunodiffusion was carried out according to Ouchterlony (1959), on

the surface of microscope slides (76 x 26 mm) which were covered with 3 ml of 1.2%

agarose (Indubiose A37, Reactifs IBF) dissolved in PBS. Lectins and antibodies diffused

towards one another at room temperature under saturated atmosphere. Precipitation lines

were observed by examining the slides on a black background without any staining.

Alternatively, slides weres rinsed overnight with 0.85% NaCl so as to eliminate unprecipi-

tated proteins, then after dehydration, precipitation lines were stained with Coomassie

brilliant blue R.

Comparison of the Rigidoporus lignosus lectin with lectins from other fungi and higher

plants

In order to gain better knowledge of the structure of the lectin isolated from

Rigidoporus lignosus, cross reactions were performed with antibodies and different lectins

isolated and purified from fungi such as Boletus edulis (specificity: lactose), Russula

nigricans (specificity: N-acetyl-B-D-galactosamine) and Candida albicans (specificity:

L-fucose/N-acetyl-B-D-glucosamine), as well as from higher plants such as Sophora

japonica (specificit D-galactosamine), Canavalia ensiformis (specificity: a-D-

mannose), Ricinus communis (specificity: B-D-galactose), Lens culinaris (specificity: o-D-

mannose/o-D-glucose), Phaseolus vulga specificity: N-acetyl-B-D-galactosamine/

lactose), Genista scoparia (specificity: N-acetyl- -D-galactosamine/B-D-galactose), Gly-

cine max (specificity: N-acetyl-B-D-galactosamine, Ulex europaeus 1 (specificity: o-L-

fucose), Ulex europaeus И (specificity: N-acetyl-B-D-glucosamine), Pisum sativum

(specificity: D-mannose), Laburnum alpinum (specificity: salicine) and Cytisus sessilifolius

(specificity: salicine/di-N-acetylchitobiose).

Most of the lectins were provided by Prof. J. Guillot's laboratory of Botany,

Cryptogamy and Microbiology, Faculty of Pharmacy, University of Clermont-Ferrand

(France). They were purified using protocols previously described (Guillot et al., 1983:

Guillot et al., 1991).

RESULTS

Comparison of the lectins from different parts of the colony and excreted in the culture

medium

The Rigidoporus lignosus lectins of the FCA3 strain were compared by Ouch-

terlony double diffusion using antiserum raised against the mycelial strand lectin. As

shown in Fig. 1, antibodies gave rise to a precipitation line with the strand crude extracts

and with those obtained at different purification steps. Similar immunoprecipitations were

obtained with crude extracts from vegetative mycelium and with culture filtrates. This

suggests that the lectin was produced, not only by mycelial strands, but also by undiffe-

rentiated cells and, moreover, partially excreted into the culture medium. The Ouchterlony

test gave rise to one continuous precipitation band, indicating that all the lectins were

serologically identical to that of the strands.

Source : MNHN, Paris

Fig. 1 — Ouchterlony double diffusion patterns of lectins

produced by the FCA3 strain of Rigidoporus lignosus. Anti-

serum raised against the mycelial strand lectin was deposited

in the central well and challenged with antigens in the outer

wells. 1: crude extract of mycelial strands, 2: mycelial strand

extract purified by ammonium sulfate (30-80 % saturation),

3: mycelial strand extract purified by subsequent anion-

exchange chromatography on DEAE-Sephacel, 4: mycelial

strand extract purified by subsequent affinity chromatogra-

phy on L-fucose-agarose column, 5: crude extract of vegeta-

tive mycelium, 6: twice concentrated culture filtrate of Rigi-

doporus lignosus, strains FCA3 (3 week-old-cultures).

Each well contained about 5 pg of purified lectin or antibodies and 25 yg of protein when crude

extracts were used. Precipitation lines were observed on a black background without any staining

Fig. 2 — Ouchterlony double diffusion patterns of lectins produced by different isolates of Rigido-

porus lignosus. Antiserum raised against ће FCA3 lectin was deposited in the central well and reacted

with mycelial crude extracts placed in the outer wells (outer well numbers correspond to those in Fig.

1). a) 1: purified lectin from vegetative mycelium (isolate FCA3), 2: FIDI isolate, 3: FID2 isolate, 4:

purified lectin from mycelial strands (isolate FCA3), 5: ЕСА isolate, 6: FML3 isolate, b) 1: purified

lectin from mycelium (isolate FCA3), 2: FMLA isolate, 3: ЕСІ isolate, 4: purified lectin from mycelial

strands (isolate FCA3), 5: RPI isolate, 6: FGA7 isolate, c) 1: purified lectin from the culture medium

(isolate FCA3), 2: FCA3 isolate, 3: Bovine Serum Albumin (control), 4: purified lectin from the

culture medium (isolate FCA3), 5: FID3 isolate, 6: FGA4 isolate,

Each well correspond to a crude extract containing 25 pg proteins. Precipitation lines were visualized

by Coomassie blue staining.

Fig. 4 — Ouchterlony double diffusion patterns of different lectins produced by fungi and higher

plants, Antiserum raised against the FCA3 lectin of Rigidoporus lignosus was deposited in the central

well and reacted with purified lectins of different organisms placed in the outer wells (outer well

numbers correspond to those in Fig. 1). a) 1: purified lectin from vegetative mycelium (isolate FCA3:

control), 2: Sophora japonica lectin, 3: Canavalia ensiformis lectin, 4: Ricinus communis lectin, 5: Lens

culinaris lectin, 6: Phaseolus vulgaris lectin, b) 1: purified lectin from vegetative mycelium (isolate

FCA3: control), 2: Genista scoparia lectin, 3: Russula nigricans lectin, 4; Boletus edulis lectin, 5:

Glycine max lectin, 6: Candida albicans lectin, с) 1: purified lectin from vegetative mycelium (isolate

ЕСАЗ: control), 2: Ulex europaeus II lectin, 3: Ulex europaeus 1 lectin, 4: Pisum sativum lectin, 5:

Laburnum alpinum lectin, 6: Cytisus sessilifolius lectin

Each well contained about 5 pg of lectin. Precipitation lines were visualized by Coomassie blue

staining.

Source : MNHN, Paris

120 T. RICHARD et al.

Cross reactions with other Rigidoporus lignous strains

Several lectin crude extracts obtained from different isolates of Rigidoporus

lignosus were challenged with the antiserum in double immunodiffusion assays (Fig. 2).

When precipitation lines were obtained they were continuous with each other, Therefore

the lectins synthetized by the strains FID1, FML3 (Fig. 2а), FML4, FCI9, RP1, FGA7

(Fig. 2b), FID3 and FGA4 (Fig. 2c) are qualitatively similar to that of the FCA3 isolate,

in terms of their immunological properties. However, reactivity of the lectins towards the

antibodies was quantitatively different. Indeed, as lectin extraction was carried out from a

similar mass of mycelium in each isolate, it can be seen that lectins were much less

abundant in FIDI (Fig 2а), ВР! (Fig. 2b), FGA4 (Fig. 2c) and especially in the FID3

isolate (Fig. 2c). No precipitation lines were observed with the isolates FID2 and ЕСА!

(Fig. 2a).

Estimation of a lectinic activity in different Rigidoporus lignosus isolates

Specific activity of the lectins was measured by the hemagglutination test in the

isolates mentioned above, except in the ВР! isolate which was not included. As shown in

figure 3, the highest productions of lectin were found in decreasing order in the isolates

FCA3, FGA4, FCI9, FML4 and FML3. Hemagglutination activity was considerably

reduced with the other isolates, especially in the FID1, FID2 апа FGA1 isolates, which is

in agreement with the Ouchterlony tests, as no precipition bands were detected in the two

latter isolates,

The highest lectinic activities were found in mycelial strands and the lowest were

usually confined to the vegetative mycelium, an intermediate significant amount of the

lectin being excreted into the culture media. However, isolates FID1 and FID2 did not

reveal excreted lectins (Fig. 3). Two isolates, FCI9 and FID3 did not differentiate mycelial

strands. In the former isolate, lectin was highly concentrated in the mycelium and in the

latter isolate, lectin synthesis was strongly reduced (Fig. 2), which is consistent with the

faint precipitation band found in the Ouchterlony test (Fig. 2c).

Cross reactions with purified lectins of other organisms

Fifteen purified lectins from higher plants and fungi were challenged with the

antibodies in immunodiffusion tests. The FCA3 lectin, isolated from vegetative mycelium

was used as a control. Figure 4 shows the results of these studies and reveals that only the

lectins of the Basidiomycete Boletus edulis (Fig. 4b) and to a lesser extent, the lectins I and

II of Ulex europaeus (Fig. 4c) gave rise to a weak but discernible reaction upon double

immunodiffusion. The position of the Boletus edulis lectin on the microscope slide did not

allow determining any serological relationship with the FCA3 lectin. On the other hand,

the result shown in Fig. 4c reveals that the FCA3 lectin is related, but not identical, to the

two Ulex europaeus lectins, as evidenced by a substantial spur formation between wells

1 and 2. No precipitation bands were detected with the other lectins.

These results indicate that the FCA3 lectin of Rigidoporus lignosus shares some

antigenic determinants with the lectins of Boletus edulis and Ulex europaeus, but reaction

with this latter clearly indicates that each lectin is slightly different. The results obtained

with the other lectins indicate that their antigenic determinants are different from those of

the FCA3 lectin, probably reflecting differences in their primary or/and tertiary structures.

Source : MNHN, Paris

IMMUNOLOGICAL PROPERTIES OF THE LECTIN OF RIGIDOPORUS LIGNOSUS 121

300 нити ||

vegetative mycelium

Е mycelial strands

ulture medium

Specific activity

Fig. 3 — Lectinic activity in 10 isolates of Rigidoporus lignosus. Hemagglutination tests were

carried out separately on vegetative mycelium, mycelial strands and with the culture medium. Age of

the cultures: 3 weeks.

CONCLUSION

A lectin was found to be present in Rigidoporus lignosus and purified from

mycelial strands. The antibodies raised against this lectin allowed an analysis of its

accumulation and distribution in fungi and plants. А comparative study carried out by

double immunodiffusion assays on ten strains isolated from Asia and Africa revealed that

all of them contained a serologically identical lectin. The lectin was found at low concen-

trations in the vegetative mycelium, while it accumulated much more in mycelial strands.

Many lectins have been isolated from fruit bodies of higher fungi and characterized, and

there are only a few reports describing lectins in mycelia (Guillot et al., 1991; Kawagishi et

al., 1997). The lectin of Rigidoporus lignosus is also excreted in the culture medium which

Source : MNHN, Paris

122 T. RICHARD er al.

has, so far, rarely been reported, except for a few yeasts such as Saccharomyces cerevisiae

(Basu et al., 1986), Candida albicans (Critchley & Douglas, 1987) and Kluyveromyces

bulgaricus (Al-Mahmood et al., 1988).

Some isolates investigated in this study did not differentiate mycelial strands and

usually produced a low level of lectin. This is consistent with a significant accumulation of

lectin found in the strands and with a close correlation between production of lectin and

differentiation of these aggregated structures. It has been proposed that the lectin of

Rigidoporus lignosus be involved in cell aggregation (Richard, 1995).

AII the lectins found in the different isolates of Rigidoporus lignosus were closely

related to each other, obviously sharing the same antigenic determinants and no serologi-

cal differences were detected. Some slight differences probably exist between the different

lectins but they were not detected by the immunological procedures used in this study.

Richard (1995) showed that the FCA3 isolate actually produced three different lectins

which are glycoproteins slightly different as to their carbohydrate contents. They were

respectively accumulated in vegetative mycelium, strands and excreted into the culture

medium. Such differences detected within a species, very likely should exist between

isolates.

The lectin of Rigidoporus lignosus is immunologically different from most of the

other lectins already purified from fungi and higher plants. This is in agreement with the

amino acid sequence data of the lectin which showed no homology with known lectins

(Richard, 1995). Future approaches should be directed to the molecular analysis of the

role of this lectin in the fungus, especially in the processes leading to strand formation.

REFERENCES

AL-MAHMOOD S., GIUMELLY Р, BONALY R., DELMOTTE F. & MONSIGNY M., 1988 —

Kluyveromyces bulgaricus yeast lectins. Isolation of N-acetylglucosamine and galactose-

specific lectins: their relation with flocculation. The journal of biological chemistry 263:

3930-3934.

BASU J., KUNDU M., MUKHERJEE К. & CHAKRABARTI P., 1986 — Release of a lectin from

a fatty acid auxotroph of Saccharomyces cerevisiae grown in presence of oleic acid.

Biochemical and biophysical research communications 136: 596-602

BOTTON B., MSATEF Y. & GODBILLON G., 1987 — Regulation of NADP-dependent glutamate

dehydrogenase during morphogenesis of the Ascomycete Sphaerostilbe repens. Journal of

plant physiology 128: 109-119

BRADFORD M.M., 1976 — А rapid and sensitive method for the quantitation of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry

72: 248-254.

CRITCHLEY LA. & DOUGLAS L.J., 1987 — Role of glycosides as epithelial cell receptors for

Candida albicans. Journal of general microbiology 133: 637-643.

ETZLER M.E., 1985 — Plant lectins: molecular and biological aspects. Annual review of plant

physiology 36: 209-234.

GIOLLANT M., 1991 — Les lectines des Lactaires du groupe Dapetes: (L. deliciosus, L. deterrimus,

L. salmonicolor) purification, étude biochimique et spécificité. Intervention des lectines dans

les phénoménes de reconnaissance moléculaire au cours des événements précoces de la myco-

rhization avec les conifères associés. Dissertation thesis, University of Auvergne, Clermont-

Ferrand, France. 181 p.

Source : MNHN, Paris

IMMUNOLOGICAL PROPERTIES OF THE LECTIN OF RIGIDOPORUS LIGNOSUS 123

GIOLLANT M., GUILLOT J., DAMEZ M., DUSSER M., DIDIER P. & DIDIER E., 1993 —

Characterization of a lectin from Lactarius deterrimus. Research on the possible involve-

ment of the fungal lectin in recognition between mushroom and spruce during the early

stages of mycorrhizae formation, Plant physiology 101: 513-52

GOLDSTEIN 1. & PORETZ R.D., 1986 — Isolation, physicochemical characterization, and

carbohydrate-binding specificity of lectins, In: Liener LE., Sharon N & Goldstein 1.1. (eds),

The lectins. Properties, functions and applications in Biology and medecine. Academic Press,

Orlando, FL, U.S.A., pp. 33-247.

GUILLOT J., GENAUD L., GEUGNOT J. & DAMEZ M., 1983 — Purification and properties of

two hemagglutinins of the mushroom Laccaria amethystina. Biochemistry 22: 5365-5369.

GUILLOT J., GIOLLANT M., DAMEZ M., DUSSER M., DIDIER P. & DIDIER E., 1991 —

Isolation and characterization of a lectin from Lactarius deliciosus. Journal of biochemistry

109: 840-845.

HINCH J.M. & CLARKE A.E., 1980 — Adhesion of fungal zoospores to root surfaces is mediated

by carbohydrate determinants of the root slime. Physiological plant pathology 16: 303-307.

ISHIKAWA Е & OISHI K., 1989 — Production, purification and characterization of Neurospora

sitophila lectin. Agricultural and biological chemistry 53: 1769-1776.

ISHIKAWA Е OISHI K. & AIDA K., 1983 — Chitin-binding haemagglutinin associated with the

cell wall of Conidiobolus lamprauges. Agricultural and biological chemistry 47: 587-592.

KAWAGISHI H., MITSUNAGA $1., YAMAWAKIM., IDO M., SHIMADA A., KINOSHITA T.,

MURATA T., USUI T., KIMURA А. & CHIBA S., 1997 — A lectin from mycelia of the

fungus Ganoderma lucidum. Phytochemistry 44: 7-10.

LIS Н. & SHARON N., 1986 — Applications of lectins. Jn: Liener I.E., Sharon N & Goldstein 1.1.

(eds), The lectins. Properties, functions and applications in Biology and medecine. Academic

Press, Orlando, FL, U.S.A., pp. 293-370.

LOCKHART C.M., ROWELL P. & STEWART W.D.P., 1978 — Phytohemagglutinin from the

nitrogen-fixing lichens Peltigera canina and Peltigera polydactyla. FEMS microbiology

letters 3: 127-130.

MALIARIK M.J., ROBERTS D.D. & GOLDSTEIN I.J., 1991 — Antigenic and calcium binding

properties of a peptide containing the essential cysteine in lima bean lectin. Plant physiology

95: 286-290

NANDRIS D., NICOLE M. & GEIGER J.P., 1987 — Root rot diseases. Plant diseases, 71: 298-306

OUCHTERLONY О., 1959 — Diffusion-in-agar methods for immunologic analysis. Progress in

allergy 5: 1-78.

RICHARD T., 1995 — Contribution à l'étude de la lectine du champignon basidiomycete Rigidoporus

lignosus. Purification, propriétés physico-chimiques et localisation de la lectine et de ses sites

d'afnité. Dissertation thesis, University of Nancy I, France. 202 p.

TERRANCE K., HELLER Р, WU Y-S. & LIPKE P.N., 1987 — Identification of glycoprotein

components of a-agglutinin, a cell adhesion protein from Saccharomyces cerevisiae, Journal

of bacteriology 169: 475-482.

TUNLID A., JANSSON H.-B. & NORDBRING-HERTZ B., 1992 — Fungal attachment to

nematodes. Mycological research 96: 401-412.

Source - MNHN Paris

Source : ММНМ. Paris

Cryptogamie, Mycol. 1997, 18 (2) : 125-137 125

PROPAGULES FONGIQUES DE L'AIR

ET DISPERSION DE LA POLLUTION INDUSTRIELLE

REISINGER Otto (1) et BALÀZSY Sändor (2)

Réseau Européen d'Écologie Microbienne:

(1) Université de Nancy I, Faculté des Sciences, Unité d'Écologie Microbienne.

B.P. 239, 54 506 VANDOEUVRE LES NANCY, FRANCE

Fax : 33 (03) 83 27 09 59

E-Mail : reisinge@scbiol.u-nancy ; fr

(2) Bessenyei György Tanärképzô Fóiskola, Növénytani Tanszék, Sostoi üt 31/B,

4400 NYIREGYHAZA, HONGRIE

Fax : 36 (06) 42 312 116

E-Mail : balazsy@ny1.bgytf.hu

RÉSUMÉ : Les propagules végétales et microbiennes formées sur des sites pollués (métaux lourds,

xénobiotiques, etc.) transportent également lors de leur dissémination des polluants dont elles sont

sans doute chargées. Les résultats partiels rapportés ici, obtenus dans le cadre d'un vaste programme

(%), apportent les premiers éléments de caractérisation de ce nouveau flux qui n'a pas encore fait

l'objet d'étude cohérente. Ils concernent la composition qualitative et quantitative de la microflore

fongique des zones contaminées ou non, le transfert des métaux du sol vers les propagules via la plante

et l'efficacité de libération, par des microorganismes, du Ni des tissus végétaux. Les études ultrastruc-

turales montrent que les PCB (polychlorobiphényles), produits trés toxiques, ou des fractions

importantes de cette substance se localisent dans la paroi et le cytoplasme microbiens. Ils peuvent

donc être exportés hors du site et rien ne s'oppose à l'hypothèse de leur concentration dans des lieux

plus ou moins éloignés et au sein d'organismes divers.

(*) Titre : Róle de la microfaune, de la flore et de la microflore dans la gestion de la pollution

industrielle.

MOTS CLÉS : Site pollué, microflore de l'air, métaux lourds, transport des polluants, bilan de

transfert, efficacité de libération, PCB - localisation ultrastructurale.

SUMMARY : Plant and microbial propagules formed on polluted sites (heavy metals, xenobiotics..)

also transport, during their dissemination, pollutants of which they are probably loaded. Partial

results reported here, obtained within a large program (*) give the first elements of characterization of

this new flux not yet been coherently studied. They concern : - qualitative and quantitative compo-

sition of fungal microflora of zones, contaminated or not contaminated, - transfer of metals from soil

to propagules by the way of plants, - efficiency of liberation, by microorganisms, of Ni from plant

tissues. Ultrastructural studies reveal that PCBs (polychlorobiphenyles), which are very toxic, or

important fractions of these substances, become fixed in the microbial wall or in the cytoplasm. So

they may be exported from the site and nothing can be opposed to the hypothesis of their concen-

tration in more or less distant places, inside various organisms.

(*) Title : Role of microfauna, of flora and of microflora in management of industrial pollution

Source : MNHN, Paris

126 O. REISINGER & $. BALÀZSY

KEY WORDS : Polluted site, air microflora, heavy metals, pollutant transport, transfer balance,

liberation effeciency, ultrastructural loca

INTRODUCTION

L'aptitude des plantes à concentrer certains métaux est connue depuis long-

temps. Il en est de même pour des microorganismes dont la capacité de bioimmobilisation

et/ou de bioaccumulation est exploitée, lors de la confection des biofiltres util pour la

purification des effluents et la réhabilitation des sites. La bibliographie, surabondante sur

ce sujet, et les pratiques maintenant courantes oublient cependant qu'il existe une fraction

de la flore et de la microflore, qui chargée de polluants par les mécanismes précités quitte

le biotope grâce aux facteurs : Homme, faune, eau et air.

La réglementation permet de maîtriser l'effet de l'Homme et, en partie, celui des

animaux. Un contrôle régulier des eaux de surface et des nappes phréatiques autorise en

cas de besoin une intervention rapide et efficace

Il n'en est pas de même pour la microfaune et pour l'air. Les propagules, sensu

lato , exportées par voie aérienne ou par des animaux incontrôlables (Acariens, Collem-

boles, Abeilles, etc..) sont selon toute logique chargées sinon surchargées en polluants.

De plus, on sait par ailleurs et depuis longtemps (Al Mahmood et al.., 1987: Bartnicki-

Garcia, 1968 ; Bartnicki-Garcia & Lippman, 1982 : Bonaly & Reisinger, 1971 ; Mbbawala

et al., 1990 ; Zaamoun et al., 1995) que les conditions de culture, surtout la nature de la

source trophique, changent les taux relatifs des composants de la paroi microbienne en

modifiant la quantité et la qualité des protéines. Ainsi des nouvelles protéines, en situation

périphérique, seront méme en contact direct avec le milieu extérieur. Cette situation est

peut-étre comparable à celle analysée par Moneret-Vautrin (1997) pour les modifications

des allérgènes alimentaires.

Il est alors surprenant de noter qu'il n'existe aucune étude ou proposition

cohérente pour l'évaluation quantitative et qualitative des polluants exportés et de

l'impact que représente ce flux de propagules modifiées pour l'environnement et surtout

pour l'environnement humain. Le but essentiel de ce travail est donc de présenter une

première tentative d'évaluation des charges transportées par les propagules de l'air dans

quelques situations choisies. Les résultats partiels, rapportés ici, ont été obtenus dans le

cadre d'un vaste projet européen ayant pour but d'étudier le rôle de la flore, de la

microfaune et de la microflore dans la gestion de la pollution industrielle. Ils concernent

essentiellement les propagules fongiques libres (spores, fragments d'organes végétatifs,

etc.). Le cas des propagules associées à des particules de nature diverse (grains de pollen,

fragments végétaux, feuillets d’argiles, etc.) fera l'objet de travaux ultérieurs. Il ne sera

qu'évoqué dans le cadre de cette étude.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Matériel fongique

Dans le cas des parasites obligatoires, le matériel fongique, les échantillons de

terre, les jeunes plantules et les plantes en fin de végétation ont été directement prélevés

dans un champ (en Meurthe et Moselle, France), proche de Badonviller.

Source : MNHN, Paris

PROPAGULES AÉRIENNES ЕТ POLLUTION INDUSTRIELLE 127

Dans le cas des saprophytes, les souches, isolées de l'air en Lorraine, sont

cultivées sur extrait de malt gélosé ou liquide additionné ou non de doses croissantes de

métal.

Microflore de l'air

La писгойоге de l’air est étudiée par sédimentation à l’aide de la technique

«boîtes de Pétri ouvertes » (fig. 2) ou en utilisant un aérocollecteur (Airtest). Cet appareil

projette les propagules sur la surface d’un milieu gélosé contenu dans des boîtes de 6 em de

diamètre. Les deux méthodes ne permettent d'étudier que la fraction cultivable. Le

dénombrement des propagules est donc basé sur le comptage des UFC (Unité Formant

une Colonie).

Les colonies obtenues sont ensuite classées en 4 catégories et les microorganis-

mes sont caractérisés et identifiés, jusqu'au genre dans le cas des champignons.

Études ultrastructurales

La localisation des PCB dans les cellules microbiennes est effectuée suivant la

méthodologie décrite par Bully et Reisinger (1994). Le matériel microbien provient d'un

sol contaminé « par erreur » ou il est obtenu en présence de doses connues de PCB. Il est

traité suivant la méthodologie classique après double fixation (glutaraldéhyde et OsO4)

Les coupes fines obtenues à l’aide d’un couteau de diamant sont observées directement ou

sont d’abord contrastées au citrate de plomb (Reynolds, 1963) ou suivant la technique de

mise en évidence des polyosides (Thiery, 1967).

Dosages chimiques

À l'exception des PCB, les dosages chimiques sont effectués par deux laboratoi-

res extérieurs.

Efficacité de la libération et bilan de transfert

Dans le cas des saprophytes :

— la technique consiste à soumettre dans une toile à bluter des tissus végétaux

contaminés à l'action d'un ou plusieurs microorganismes ensemencés dans le milieu

liquide. Les métaux libérés sont dosés aprés incubation, suivie de centrifugation, dans le

surnageant et dans les cellules microbiennes (culot).

Dans le cas des parasites obligatoires

le bilan de transfert est évalué par la comparaison des taux des métaux dans

le sens « sol-plantes-propagules du parasite ».

Seuil de tolérance

La recherche des souches résistantes et la détermination des seuils de tolérance

sont réalisées à l'aide des techniques habituelles. (Techniques des puits, des stries, des doses

croissantes de métaux dans les milieux, pesées du matériel fongique obtenu en milieu

liquide, etc..).

Source : MNHN, Paris

128 О. REISINGER & $. BALÀZSY

RÉSULTATS ЕТ DISCUSSION

Distribution quantitative des UFC (site pollué et non pollué).

Nous avons réuni dans la figure 1 les données moyennes de deux années (sep-

tembre 199$ et 1996) recueillies sur deux sites, situés en Europe Centrale. Le site pollué (P)

représente en réalité un dépot « oublié » du pays, additionné de déchets étrangers. La zone

témoin (N) comparable est une ancienne carrière distante de 21 km. Les deux structures

résultent d'une excavation étagée de 2-7 m de profondeur. Les prélèvements sont effectués

de 50 en 50 cm du bas vers le haut. (1P à 5P pour la zone polluée et IN à 5N pour la zone

non polluée). Les valeurs représentent la moyenne de 5 répétitions effectuées à des points

éloignés de 2 m en 2 m et situés sur une méme ligne. L'analyse des valeurs montre

l'existence de deux concentrations élevées en propagules fongiques situées respectivement

au niveau | (IN et IP = 50 cm du sol) et au niveau 5 (SN et SP = 2,50 cm du sol). Le niveau

1 correspond au creux des sites et le 5 à l'étage supérieur où dans la décharge, les résidus

ont été couverts de terre, et, où apparaît déjà une végétation naturelle. Cette dernière,

composée essentiellement d'une Graminée, concentre un taux très élevé de métaux,

notamment du Cr, Zn, Ni, As, Co, etc. Elle est également associée à une flore fongique

particulière dont l'analyse est en cours.

On notera également que dans les cas extrêmes (niveau 1 et 5), la charge fongique

est plus élevée dans l'air de la zone polluée (Р) que celle notée dans l'espace naturel (№).

La différence signalée pour le niveau 1 est sans doute due à « l'effet creux » créé

par les vents dominants descendants. Celle des zones polluées est l'image d'une plus

grande quantité de propagules fongiques formées à cause de la pollution. Cette flore reste

cependant qualitativement plus pauvre que celle de la zone exempte de polluants (fig. 2)

Elle contient donc des espéces et des souches résistantes sélectionnées naturellement. Nous

possédons actuellement 67 isolats dont certains, en plus de leur seuil de tolérance élevé,

concentrent des doses inhabituelles de métaux. Tel est le cas d` Aureobasidium pullulans (De

Bary) Arnaud apte à emmagasiner dans des conditions expérimentales 12 fois plus de Ni

que les souches sauvages de référence. Le seuil de tolérance d'une subculture de Clados-

porium sp. probablement herbarum, obtenue par sélection, est de 40 mg/l de NiCI2 alors

que celui des isolats habituels n'est que 5 mg/l en milieu liquide. Ces microorganismes

représentent un matériel de choix pour la confection des filtres industriels performants.

Transfert des métaux. Sol non pollué-plante-parasite obligatoire

Pour illustrer ce type de transfert de polluants du sol vers l'ensemble de l'écosys-

téme via les propagules fongiques et l'air, nous avons retenu le couple Mais — Uromyces

maydis (DC) Corda Le site a été choisi au hasard sur le seul critère d'abondance des plantes

atteintes durant les années 1993 et 1994. La culture n'a donc subi aucun traitement

particulier.

Les résultats des dosages effectués sont réunis dans la figure 3.

Le taux de métaux du sol est inférieur aux normes (No) hollandaises. La seule

augmentation notable de la concentration intéresse seulement les jeunes plantules. Méme

les données cumulées pour l'ensemble du végétal restent inférieures à celles du sol en

mg/kg. А première vue la quantité de métaux pouvant être exportés par les chlamydospo-

res semble insignifiante. Soulignons cependant que l'invasion fongique des tissus par ce

parasite est restreinte à une fraction d'organe. Un épi de mais d'environ 200 gr contient 3

mg de Cu et 0,025 mg de Ni., l'ensemble de chlamydospores récoltées à la place de cet épi

Source : MNHN, Paris

129

PROPAGULES AÉRIENNES ЕТ POLLUTION INDUSTRIELLE

009

008

0001

0021

0091

€W/D4N 3AN

Source

130 О. REISINGER & S. BALÀZSY

ISOLEMENT ET IDENTIFICATION

Champignons isolés par la technique de sédimentation

en ordre décroissant

EN LORRAINE

Genres rares

< à 50 % des cas

Genres fréquents

> à 50 % des cas Site pollué

Cladosporium sp.

Penicillium sp.

Acremonium sp.

Cladosporium sp.

Penicillium sp.

Epicoccum sp.

Drechslera эр.

Stemphylium sp.

Alternaria sp. Graphium sp. Alternaria sp.

Aspergillus sp. Rhizopus sp. Aureobasidium sp.

Fusarium sp. Mucor sp. Chrysosporium sp.

Aureobasidium sp.

Hormonema sp.

Phoma sp.

Mycélium stérile

Trichoderma sp.

Gyrophana lacrymans

Trichothecium sp.

Chrysosporium sp.

Botrytis sp.

Chaetomium sp.

Phialophora sp.

Phoma sp.

Oidiodendron sp.

Verticillium sp.

etc.

SÉDIMENTATION

15 et 30 minutes

d Ї 1

ЕМЗЕМЕМСЕМЕМТ > — MN «< INCUBATION

EN EUROPE CENTRALE

Site non pollué

Acremonium sp.

Cladosporium sp.

Penicillium sp.

Alternaria sp

Aspergillus sp.

Fusarium sp.

Aureobasidium sp.

Ногтопета sp

Chrysosporium sp.

Epicoccum sp.

Drechslera sp.

Stachybotrys sp.

Trichoderma sp.

Ulocladium sp. Rhizopus sp.

Beauveria sp. Mucor sp.

Ulocladium sp.

POUR LA LORRAINE

Résultats de 7 ans d'observation avec 89

études par semaine de janvier à avril tous

les ans. Plus 6 expériences, en moyenne

par semaine toute l'année depuis 3 ans.

POUR L'EUROPE CENTRALE

Résultats de 2 séries d'observation

effectuées en septembre 1995 et en

septembre 1996.

Fig. 2. — Sédimentation et culture. Flore fongique identifiée à partir des UFC de l'air des locaux en

Lorraine et de l'air des sites de la figure 1.

Fig. 2. _- Sedimentation and culture. Fungal flora identified from CFUs in air in Lorraine and in air

of sites in Figure 1.

Source : MNHN, Paris

PROPAGULES AERIENNES ЕТ POLLUTION INDUSTRIELLE 131

100

Bi ca

mg/kg 50

No Te PI Ti Fe Ch

Fig. 3. — Charbon du mais. En grande culture Transfert des métaux : sol-plante-parasite (Uromyces

maydis ).

(Ch=chlamydospor

terre, No=normes).

— In large-scale culture. Transfer of meta

parasite chlamydospores, Fe = leaves, Ti

Te = soil, No = standard)

du parasite, Fe=feuilles, Ti=tiges (fin de v

tation), Pl=plantules (40cm),

oil-plant-parasite (Uromyces maydis ).

stem (end of growth), PI = plantlets (40 cm),

Source : MNHN, Paris

132 О. REISINGER 4 S. BALÀZSY

moyen (pour le champ étudié) est de 150 gr lors des infections précoces. Cette masse

contient 1,4 mg de Cu et 0,02 mg de Ni. Les erreurs d'évaluation mises à part, il apparaît

clairement que les chlamydospores contiennent à la place de l'épi, la quasi totalité des

métaux cités qui deviennent ainsi exportables par voie aérienne. Nous reviendrons par

ailleurs sur la signification possible de ce type de calculs. Pour d’autres métaux et plantes,

la situation est variable. Ainsi les plantules de maïs ont un taux 3 fois supérieur à celui du

sol en Se et Mo (Biro & Szilikovacs, comm. pers.). Par contre, toujours selon les mêmes

auteurs, l'accumulation du Cd, Zn et Ni reste inférieure dans les mêmes plantules par

rapport au taux relevé dans le sol. Nos résultats sont donc conformes à ceux des auteurs

cités.

Transfert des métaux. Sol surchargé en polluants (cas d'Ambrosia elatior)

Le biotope étudié ici est une décharge industrielle dont le sol (boue) contient des

taux inhabituellement élevés (même pour une décharge) de différents métaux. La végéta-

tion est dominée par А. elatior qui représente sur tous les sites semblables de la région la

plante la plus tolérante.

La figure 4 réunit les données recueillies depuis 2 ans avec 2 prélèvements par an ;

Tun effectué au mois d'aoüt et l'autre au mois d'octobre. Pour équilibrer et rendre lisible le

diagramme, nous avons divisé les valeurs des analyses du sol (Bu) par 10. Mêmes

représentées ainsi, ces valeurs dépassent largement le taux « légal » des pays d'Europe

Centrale.

Les résultats montrent que la concentration des métaux dans les différents types

d'organes (racines = В, tiges = T, Е = fleurs, P = pollens) augmente avec l'âge. Elle est

souvent plus importante que le seuil de tolérance réglementaire (No) du sol.

Les grains de pollen, redoutables allergènes, contiennent également une charge

notable. Ils constituent la fraction la plus disséminée de la plante. Cette dernière est

réputée pour sa résistance aux parasites et ravageurs. Les grains de pollen portent

cependant, dès leur libération, une microflore associée pauvre, constituée par des bactéries

et des champignons. L'isolement, la caractérisation, l'évaluation quantitative et l'étude du

comportement envers les métaux de ces microorganismes sont actuellement à l'étude.

Le cas ФА. elatior a été étudié en priorité à cause des besoins locaux de la Santé

Publique. Le pays subit, en effet, depuis quelques années l'invasion de ce végétal du Sud

vers le Nord. Parallélement on enregistre une augmentation du nombre de consultations

dans les Services Allergologie-Pneumologie des hópitaux. L'apparition du pollen de cette

plante, nouvel allergène pour la population autochtone, n'explique cependant pas dans

tous les cas l'importance de l'augmentation numérique des symptómes enregistrés par les

médecins. Le fait que les premières bases de l'installation de la plante sont des décharges et

des terrains d'aviation ou industriels abandonnés justifie le développement des enquétes

axées sur ce probléme.

L'efficacité de libération

Pour évaluer l'efficacité de la libération des métaux par action de la flore

microbienne, nous avons utilisé des radis contaminés expérimentalement par le Ni,

au-delà du taux normalement accepté pour les sols (50 mg/kg). Des lots de concentration

différents en Ni servent en mélange pour l'obtention des tissus dont le taux du métal est

ensuite déterminé. Cette démarche critiquable, respecte l'hétérogénéité habituelle de la

nature où n'existe pas une contamination individuelle homogène. Elle impose cependant le

Source : MNHN, Paris

PROPAGULES AERIENNES ET POLLUTION INDUSTRIELLE 133

1000

800 VM

mg/kg 600 д Zn

400 Cr

200

оч са

Во № Rm* Tm* Рт“ Р P2 Rm Тт Fm

Matériaux analysés

4. — Ambrosia elatior. Prélévements sur le terrain. Transfert des métaux : Sol (boue — Bu) —

racines (R) — tiges (T) — fleurs (F) — pollens (P1 = pollen jeune, P2

mois d'aoüt, m — récolte au mois d'octobre.

Moyenne 4

Fig. 4. — Ambrosia elatior. Field samplings Transfer of metals

flowers (F)— pollens (РІ = young pollen, P2 = old pollen). m

in october

Means of 2 series of analyses.

pollen âgé). m* = récolte au

oils (Bu) — roots (R) — stems (T)

sampling in August, m = sampling.

20 Quantité

15 libérée:mg/kg

Durée d'incubation 9

(semaines) ik

х ` : ЈЕ

1 8 24 36 45 52

Dose initiale mg/kg

Fig. 5. — Expérimentation au laboratoire. Libération du Ni des tissus végétaux (radis) par biodégra-

tion

mg/kg). Données non cumulées. Ni libéré

dation. Inoculation par des souches industrielles (brevet : Bully et Reisinger n° 9016248). Stérilis

à l'oxyde de propylène. Cultures stationnaires (témoin

est dosé dans le surnageant et dans les corps microbiens.

Fig. 5. — Laboratory experiment. Liberation of Ni from plant tissues (radish) by biodegradation.

Inoculation by industrial strains (Patent : Bully et Reisinger n? 9016248). Sterilization with propylene

oxide. Stationary cultures (control = Img/kg). No cumulate data. Liberated Ni is titrated in super-

natant and in microbial bodies.

Source : MNHN, Paris

134 O. REISINGER & S. BALÀZSY

fractionnement des tissus dont la première conséquence est l'accélération des processus

lytiques.

Le milieu liquide à base d'extrait de malt (0,1 %) et de traces d'extrait de levure

est inoculé 24 heures avant l'immersion du matériel végétal. L'inoculum est un mélange de

microorganismes réalisé pour les besoins de la dépollution industrielle ( Bully & Reisinger,

1990). II contient des bactéries et des champignons aptes à tolérer ou à prendre en charge

divers contaminants, méme organiques tels que les PCB.

Le dosage du Ni libéré dans le surnageant est réalisé 3 fois par semaine durant 3

mois. Les résultats obtenus (fig. 5), contenant également le Ni libéré spontanément,

montrent peu de changement durant les 3 premières semaines et une accélération de la

quantité de Ni libéré de la 4* à la 9* semaine. À ce stade, le matériel végétal est presque

totalement décomposé et le taux de métal libéré reste constant durant les périodes

suivantes. C'est à ce moment que l'on note également la stabilisation du taux du Ni (7-8

mg/l) dans la fraction fongique. Cette derniére, facile à récupérer, est la seule fraction

microbienne analysée.

Localisation ultrastructurale des PCB dans les cellules microbiennes

Les РСВ, produits de synthèse très toxiques, peuvent être métabolisés ou immo-

bilisés par certains microorganismes. Dans le premier cas, l'efficacité de la métabolisation

est inversement proportionnelle au nombre de chlores de la molécule (Furakawa et al.,

1979). Dans le second, la bioimmobilisation, les produits mémes trés chlorés, donc non

biodégradables, peuvent être neutralisés, au moins en partie, par une large fraction de la

microflore (Bullyt, 1991).

La réglementation actuelle concernant les PCB dans les milieux naturels est

extrêmement sévère. Afin de pouvoir détecter ces produits masqués ou présents en faible

quantité, nous avons utilisé la méthode proposée par Bully et Reisinger (1994).

Planche 1 : 1 ; Colonies bactériennes dans un sol pollué par les PCB. Souches résistantes. (R).Les

cellules vides de la souche sensible contiennent des granules denses aux électrons associés à des

membranes ou situés généralement en position pariétale. Contraste : citrate de plomb. X = 12 000.

2: Même échantillon que pour 1. Structures membranaires et résidus de paroi microbienne. Noter

l'absence des granules denses aux électrons, Contraste : Mise en évidence des substances de nature

polyosidique. X — 16 000. 3 : Débris de paroi fongique et produits denses aux électrons. Noter la

présence de granulations de petite taille, denses aux électrons, situées dans [SA Jenveloppe cellulaire.

Contraste : citrate de plomb. X — 24 000. 4 : Granules denses aux électrons associés à des. produits

structurés, probablement résidus de parois bactériennes. Contraste : citrate de plomb. X = 31 000.

5 : Paroi fongique obtenue en culture liquide dépourvu de PCB. Contraste : Mise en évidence des

substances de nature polyosidiques. X — 18 000

Plate 1 : 1 : Bacterial colonies in a soil polluted by PCBs. Resistant strains (R). Empty cells of the

sensitive strain contain electron-dense granules associated with membranes or generally situated in

parietal position. Contrast : Lead citrate. X = 1 200. 2 : Same sample as in Fig. 1. Membranous

structures and remains of microbial wall. Note the absence of electron-dense granules. Contrast : Гог

polyosidic substences. X = 1 600. 3 : Remains of fungal wall and electron-dense products. Note the

presence of small, electron-dense granules, in the cell envelope. Contrast : Lead citrate. X — 24 000

4: Electron-dense granules associated with structured substences probably bacterial wall remains,

Contrast : Lead citrate. X = 31 000. 5: Fungal wall obtained in liquid culture medium without PCBs.

Contrast : for polyosidic substences. X = 18 000

Source : MNHN, Paris

PLANCHE 1

Source : MNHN, Paris

136 O. REISINGER & $. BALÀZSY

Les examens ultrastructuraux au Microscope Électronique à Transmission

(MET) révèlent dans les échantillons contenant des PCB des granules denses aux électrons

de taille et de forme variable (Planche I, figures 1, 3 et 4). Ces granules présents sur des

coupes non contrastées ou contrastées au citrate de plomb font défaut dans les témoins

(Planche I, fig. 5) et sur les sections ultrafines, soumises à la technique de mise en évidence

des polyosides (Planche I, fig. 2). La détection des PCB par chromatographie à chacune

des étapes de la méthode de Thiery sur un matériel identique montre que l'agent respon-

sable de l'extraction est le thiocarbohydrazide. L'utilisation de ce dernier améliore

d’ailleurs de manière notable la sensibilité des analyses chimiques. Les données rapportées

ci-dessus démontrent de nouveau et clairement que les granules observés au MET repré-

sentent bien les PCB ou au moins une fraction de ceux-ci.

D'autres images telles que celle de la figure 3 de la Planche I, permettent de

montrer la migration de ces granules à travers la paroi et leur fractionnement à l'intérieur

de celle-ci ou dans le cytoplasme. Cette migration, condition essentielle de la réussite de la

bioimmobilisation est possible grâce à l'existence de « puits » de structure chimique

différente dans l'enveloppe cellulaire (Reisinger et al., 1977). C'est en se basant sur la

nature lipophile des PCB et sur la quantité de lipides pariétaux de quelques germes que

nous avons effectué un premier choix de microorganismes actuellement expérimentés en

tant que biocapteurs et bioindicateurs.

La sensibilité de cette méthode bien que longue et coüteuse garantit la démons-

tration indiscutable de la présence des PCB, strictement prohibés dans certains milieux.

CONCLUSIONS

Malgré la multiplicité des techniques employées rapportées ou non ici nous

rencontrons beaucoup de difficultés pour situer et discuter la valeur de nos résultats. La

cause principale en est bien entendu l'absence de travaux semblables donc de données

bibliographiques cohérentes. À ceci s'ajoute le manque d'une législation précise оц

variable d'un pays à l'autre rendant impossible la détermination du taux ой commence la

notion « légale » de la pollution. Nos données doivent donc étre manipulées avec beau-

coup de prudence. Ainsi nous avons effectué et à titre uniquement indicatif une évaluation

des métaux dans les chlamydospores de Ustilago maydis obtenues à partir d'une culture de

maïs absolument normal, excepté bien entendu sa forte contamination par le parasite

fongique. Les propagules contiennent donc des métaux. Sont-elles pour autant plus

dangereuses que celles qui en contiennent moins ou plus ?

Nous pouvons cependant accepter définitivement, comme prévu d'ailleurs, que

l'exportation des métaux ou des polluants organiques est réalisée réguliérement par voie

aérienne via les propagules d'origine végétale et microbienne. Il en est de méme pour les

éléments de la microfaune qui peuvent prélever ces organes ou d'autres par choix trophi-

que (microarthropodes mycophages par exemple) et les transporter dans leur tractus

digestif ou simplement par adhésion mécanique sur leur corps.

Dans un premier temps et schématiquement, ces facteurs réalisent une disper-

sion des matériaux étudiés dans l'espace environnant. Des concentrations inhabituelles de

ces organes, donc des métaux ou des polluants, peuvent ensuite intervenir dans les pelotes

fécales ou dans les tractus respiratoires des animaux autochtones, donc souvent à des

niveaux oü la notion « dose-effet » perd sa signification. Des études et des enquétes sont

prévues pour tenter de préciser les modifications induites dans l'environnement, par la

qualité et la quantité de cette nouvelle génération de propagules.

Source : MNHN, Paris

PROPAGULES AÉRIENNES ЕТ POLLUTION INDUSTRIELLE 137

L'existence d'une réglementation plus précise rend cependant le cas des РСВ

quelque peu différent. Ces substances sont considérées dans certains milieux (l'eau par

exemple) comme très dangereuses même en concentration faible. Leur présence dans et/ou

sur certaines cellules microbiennes est démontrée avec certitude. Comme les propagules

non modifiées, ces cellules sont donc susceptibles d’être disséminées par voie aérienne. La

réalité de cette dissémination n’est pas encore expérimentalement démontrée, mais aucune

raison logique ne s'oppose à cette éventualité.

BIBLIOGRAPHIE

AL MAHMOOD S., GIUMMELY Р. & BONALY R., 1987 — Structural modifications of mannans

during flocculation of Kluyveromyces bulgaricus. Applied microbiology and biotechnology

26 : 462-467.

BARTNICKI-GARCIA S., 1968 — Cell wall chemistry, morphogenesis and taxonomy of fungi.

Annual review of microbiology 22 : 81-108.

BARTNICKI-GARCIA S. & LIPPMAN E., 1982 — Fungal cell wall composition. CRC Handbook

of Microbiology IV : 229-252. _

BONALY В. & REISINGER O., 1971 — Études des modifications chimiques et ultrastructurales de

la paroi de trois levures du genre Rhodotorula cultivées sur deux milieux différents.

Comptes rendus académie des sciences, D, Paris 272 : 2309-2312.

BULLY Е, 1991 — Traitement par voie biologique de composés toxiques contaminant les milieux

naturels. Thése de Doctorat. Université de Nancy 1, 155 pp.

BULLY Е & REISINGER O., 1990 — Composition pour la décontamination des sols pollués. Procédé

et dispositif pour l'utilisation de cette composition. Brevet, E.M.C.. SERVICES, N° 493248,

EP.

BULLY F. & REISINGER O., 1994 — Relations des polychlorobiphényles (PCBs) avec des microor-

ganismes. Mise en évidence et évolution ultrastructurale. in Balàzsy & Reisinger. Environ-

mental Microbiology, 117-124.

MBAWALA A., AL MAHMOOD S., LOPPINET V. & BONALY R., 1990 — Acetolysis and 1 H

NMR studies on mannans isolated from very flocculent and weakly flocculent cells of

Pichia pastoris ТЕР 206. Journal of general microbiology 136 : 1279-1284.

MONERET-VAUTRIN D.A., 1997 — Les allergènes alimentaires et leurs modifications par les

technologies agro-alimentaires. Cahiers d'agricultures 6: 21-29.

REISINGER O., KIFFER E., MANGENOT F. & OLAH G.M., 1977 — Ultrastructure, cytochimie

et microdissection enzymatique de la paroi des hyphes et des propagules exopènes des

Ascomycètes et Basidiomycètes. Revue de mycologie 41 : 91-117.

REYNOLDS E.S., 1963 — The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron

microscopy. Journal of cell biology 17: 208-212.

THIERY J.P, 1967 — Mise en évidence des polysaccharides sur coupes fines en microscopie

électronique. Journal de microscopie 6: 987-1017.

ZAAMOUN S, TRAN THI, REISINGER O., GUIRAUD J.P, FONTANA A.& BONALY R.,

1995. — Influence of aeration and (rho?) mutation on the structure of the cell walls of

Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces diastaticus. Mycological research 99 : 492-

500.

Source : MNHN, Paris

Source : MNHN. Paris

Cryptogamie, Mycol. 1997, 18 (2) : 139-143 139

RÔLE DU MODE DE FORMULATION SUR LA SURVIE

ET L'ACTIVITE ANTAGONISTE

D'AGENTS DE LUTTE BIOLOGIQUE К

CONTRE LES FUSARIOSES DE PLANTES CULTIVÉES.

C. STEINBERG, У. EDEL, C. ALABOUVETTE

INRA-CMSE, Laboratoire de Flore Pathogéne du sol,17 rue Sully, BV 1540,

21034 Dijon Cedex. Email : steinberg@dijon.inra.fr

Parmi les maladies cryptogamiques dont sont affectées les plantes maraichéres et

les plantes horticoles, la fusariose vasculaire, trachéomycose due aux formes pathogènes

(formae speciales) du champignon Fusarium oxysporum, est l'une des plus problématiques

car il n'existe pas à ce jour de moyen de lutte chimique spécifique. La lutte biologique

faisant appel à la compétition entre d'un coté la forme pathogene spécifique de Fusarium

oxysporum et de l'autre, une forme non pathogéne appartenant à la méme espéce en

présence ou non de bactéries du genre Pseudomonas donne des résultats satisfaisants dans

les conditions de culture sous serre en substrat artificiel et en sol désinfecté (Alabouvette et

al., 1993). Cependant, l'utilisation de micro-organismes en lutte biologique suppose une

inoculation des souches antagonistes dans le substrat de culture, préalablement au semis

ou au repiquage. De plus, tous les sols maraichers ne sont pas systématiquement désinfec-

tés. Les souches introduites dans ces sols sont donc confrontes, outre l'adversité des

facteurs abiotiques, aux mécanismes de régulation liés à la présence des micro-organismes

indigènes (prédation, compétition pour le substrat ou l'espace, antibiose...) (Alabouvette

& Steinberg, 1995).

L'efficacité de la lutte biologique contre les fusarioses repose donc sur deux

composantes principales au moins : (i) une réelle activité antagoniste des agents de lutte

biologique en situation de production agricole, (ii) un systéme d'application qui permette

l'expression de cette activité.

(i) L'activité antagoniste de la souche non pathogène de Fusarium oxysporum

Fo47 et de la souche de Pseudomonas fluorescens C7r12, utilisées seules ou en association

contre des formes pathogènes de F. oxysporum a été démontrée (Lemanceau & Alabou-

vette, 1991).

(ii) Afin de définir un systéme d'application optimum, des inoculums de Fo47 et

de C7r12 ont été préparés en utilisant différents supports de formulation : liquide, talc,

microgranulés et microgranulés enrichis en substrat C et N. Ce dernier mode de formula-

tion a été récemment décrit et utilisé avec succès pour l'inoculation de Bradyrhizobium

japonicum à des cultures de soja (Fouilleux er al., 1996). Dans le cas des supports de

formulation liquide et microgranulés, enrichis ou non, les deux agents de lutte biologique

ont été apportés seuls, en association dans le méme support de formulation ou bien en

combinaison de deux inoculums formulés séparément. Dans tous les cas, la survie des

Source : MNHN, Paris

140 C. STEINBERG, У. EDEL, С. ALABOUVETTE

agents de lutte biologique introduits dans des sols désinfectés ou naturels a été appréciée

par dénombrement sur milieu sélectif en boîte de Pétri. L'activité antagoniste des souches

Fo47 et C7r12 introduites en sols naturels ou désinfectés par les différents systèmes de

formulation a été mesurée par des tests biologiques sur lin en présence d’une souche de F.

oxysporum pathogène du lin.

La survie des populations bactériennes et fongiques introduites en sol naturel

selon différents modes de formulation est représentée respectivement figures | et 2 et

l'activité antagoniste de ces populations est représentée figures 3 et 4. La meilleure survie

des inoculums de C7r12 est obtenue avec les microgranulés enrichis en substrat C+N

comparée à celle obtenue en utilisant la formulation liquide classique et surtout le support

microgranulés non enrichis, aussi bien en sol naturel qu'en sol désinfecté (fig.1). Les

formulations talc et support microgranulés non enrichis présentent des avantages prati-

ques de préparation et conservation mais ne peuvent étre envisagés que pour des inocu-

lums fongiques et ne permettent pas une mise en activité suffisamment rapide de la

population de Fo47 notamment en sol naturel (fig.2). Le support microgranulés enrichis

favorise le développement des populations introduites en sol naturel et désinfecté.

Il permet surtout une mise en activité trés rapide de la population de Fo47 qui est capable

de croître en sol naturel et assure de ce fait une meilleure protection des plantes vi isdu

pathogène (fig. 3). De méme, en stimulant la croissance bactérienne, l'utilisation du

support microgranulés enrichis renforce l'interaction positive Fo47-C7r12 quel que soit le

support de formulation adopté pour Fo47 en combinaison avec C7r12.

CFU/g de sol

4,00E+1

1,00E«09]

1,00E+08}

1,00E+07, —+— liq - nat

ОЕ —o— liq - des.

—&— Ke - nat

mou a Ке - dés.

1,00E+04} Ее

1,00E«0: —o- K- dés.

0 Ба Sum UNS YS 254 не

Fig. 1. — Dynamique des populations de C7r12 introduites en sol naturel (nat) ou désinfecté (dés) à

l'aide de différents modes de formulation : liquide (liq), microgranulés (К), microgranulés enrichis

(Ke).

Source : MNHN, Paris

RÔLE DU MODE DE FORMULATION SUR LA SURVIE 141

CFU/ g de sol

1,00E+08

1,00Е+07

1,00Е+06

1,00Е+05

1,00E+04

1,00E+03

1,00E+02 + А

0 5 10 15 20 Jous

Fig. 2. — Dynamique des populations de Fo47 introduites en sol naturel (nat) ou désinfecté (dés) à

l'aide de différents modes de formulatio

(ке)

liquide (liq), microgranulés (К), microgranulés enrichis

% plantes saines

100

80 —+— Témoin sain

—8— Témoin patho

60 —а— Fo47 talc

—— Fo47 K

40 —#— Fo47 Ke

201

o =>

20 30 40 50 60 70 deus

— Activité antagoniste de la souche de Е oxysporum non pathogène Fo47 vis-à-vis de la souche

pathogène du lin Foln3. La souche non pathogène est introduite dans le sol naturel selon différents

modes de formulation : talc, microgranulés (К), microgranulés enrichis (Ke) à une dose de 10°

propagules / de sol. L'activité antagoniste est exprimée en pourcentage de plantes saines.

Source : MNHN, Paris

142 C. STEINBERG, V. EDEL, C. ALABOUVETTE

% plantes saines

-#-- témoin sain

—e— témoin patho

—ж— Fo47 talc

—K— С7г12 liquide

—а— F047 tale+C7r12 liq

—#— (F047 K) +(C7r12 К)

—8— (Fo47 + 07:12) K

—%— (Fo47 Ke) +(C7r12 Ke)

—@— (Fo47 + С7г12) Ке

Fig. 4. — Activité antagoniste de la souche Fo47 et de la souche C7r12 vis-à-vis de la souche

pathogéne du lin Foln3. Les agents de lutte biologiques sont introduits en sol naturel, seuls ou en

combinaison selon différents modes de formulation : liquide (liq), talc, microgranulés (K), microgra-

nulés enrichis (Ke) à une dose de 107 propagules de Fo47 et 10* CFU de C7r12 /g de sol.

Cependant cet effet synergique est plus important lorsque les deux agents de

lutte biologique sont introduits ensembles mais sous forme de deux inoculums séparés

(fig. 4). Lorsque les deux populations sont introduites en sol désinfecté dans le méme

support de formulation, elles entrent en compétition mutuelle pour le substrat, ce qui

affecte leur croissance dans le sol et diminue leur activité antagoniste. En sol naturel,

l'adversité des facteurs biotiques minimise l'influence de cette compétition, ce qui se

traduit par une activité antagoniste équivalente des combinaisons Fo47-C7rl2.

La meilleure protection est cependant obtenue quand les microgranulés enrichis sont

utilisés comme support de formulation (fig. 4). Les inoculums bactériens et fongiques

doivent donc étre préparés séparément et mélangés avant l'introduction dans le sol, се qui

est compatible avec leur mode de production et les conditions pratiques d'application en

sol naturel comme en substrat de culture désinfecté.

RÉFÉRENCES

ALABOUVETTE C., LEMANCEAU P. & STEINBERG C., 1993 — Recent advances in biological

control of Fusarium wilts. Pesticide science, 37 : 365-373.

ALABOUVETTE C. & STEINBERG C., 1995 — Suppressiveness of soils to invading microorga-

nisms. In : H. Hokkanen and J.M. Lynch (eds), Benefits and risks of introducing biocon-

trol agents, Cambridge University Press, pp 3-12.

Source : MNHN, Paris

RÔLE DU MODE DE FORMULATION SUR LA SURVIE 143

FOUILLEUX G, REVELLIN C, HARTMANN А. & CATROUX G., 1996 — Increase of Brady-

rhizobium japonicum numbers in soils and enhanced nodulation of soybean (Glycine max

L. Merr.) using granular inoculants amended with nutrients. FEMS microbial ecology 20 :

173-183.

LEMANCEAU P. & ALABOUVETTE C., 1991 — Biological control of Fusarium diseases by

fluorescent Pseudomonas and non pathogenic Fusarium. Crop protection 10 : 279-286

Source : MNHN, Paris

Source : MNHN. Paris

Cryptogamie, Mycol. 1997, 18 (2) : 145-146 145

INTERÊT DU PYTHIUM OLIGANDRUM

DANS UNE PERSPECTIVE DE PROTECTION INTEGREE

CONTRE FUSARIUM OXYSPORUM F. SP.

RADICIS-LYCOPERSICI EN CULTURES

HORS-SOL DE TOMATE.

P. REY', N. BENHAMOU?, J. HOCKENHULL' et У. TIRILLY'

'ESMISAB,

Laboratoire de Microbiologie et Sécurité Alimentaire,

Université de Bretagne Occidentale,

Technopôle Brest-Iroise,

29280 Plouzané, France.

?Recherche en Sciences de la Vie et de la Santé,

Pavillon Charles-Eugéne Marchand,

Université Laval, Sainte-Foy,

Québec, Canada, GIK 7P4

"Department of Plant Biology,

the Royal Veterinary and Agricultural University,

40 Thorvaldsensvej, DK-1871 Frederiksberg,

Copenhague, Danemark.

Le choix de variétés sensibles au Fusarium ox)

(FORL) reste important en cultures hors-sol de tomati

une volonté de réduction des intrants chimiques.

Outre la prophylaxie, la lutte biologique a retenu l'attention. Les principaux

antagonistes microbiens testés sont Streptomyces griseo-viridis, Trichoderma harzianum,

des souches non pathogènes de Fusarium sp. et plusieurs souches de Pseudomonas fluo-

rescents. Selon le micro-organisme retenu et les conditions d'essais, les résultats sont

variables. Une seconde approche consiste à associer des antagonistes avec un objectif

d'effets synergistes (ex. F.o. 47 et Pseudomonas sp.). Il apparait, à ce niveau, important de

recenser les différents micro-organismes utilisables en protection intégrée dans le cadre

d'une introduction en cultures hors-sol.

La présence de Pythium mycoparasites de Fusarium sp. ou d'autres Pythium a été

signalée dans la rhizosphére des cultures de tomates en hors-sol. Le Pythium oligandrum

est l'un de ces antagonistes. Toutefois, les récentes études sont en défaveur d'une suffisante

efficacité du mycoparasitisme que peut exercer cette espèce dans la rhizosphére des

tomates ou concombres.

Au cours de ces travaux, nous avons observé, pour la première fois, l'aptitude de

P. oligandrum à pénétrer dans les tissus racinaires sans provoquer de symptómes visibles

porum Ё. sp. radii

s. Ce risque accepté est associé à

Source : MNHN, Paris

146 P. REY et al.

d’altération. De ce fait, l'étude des relations Р. oligandrum — tomate a été privilégiée. Dans

nos conditions expérimentales, les hyphes sont observées dans les différents tissus, y

compris le xyléme, la colonisation restant, cependant, réduite. Dans les 3à 4 jours qui

suivent l'infection, la majorité (90 %) des structures fongiques offrent des signes prononcés

de dégénérescence. Cette dégradation est associée avec le déclenchement de fortes réac-

tions de défense observables en microscopie électronique : production de substances

apparentées à des composés phénoliques, de papilles et d'appositions pariétales.

Afin de vérifier si les réactions de défense induites pouvaient ассгойге la résis-

tance des plants de tomate à une attaque ultérieure par un agent infectieux, nous avons

procédé à des apports décalés de Р oligandrum puis de FORL. L'utilisation en analyses

ultrastructurales de sondes sélectives a permis de détecter certaines cibles végétales et de

différencier le Pythium (paroi cellulosique) du FORL (paroi chitineuse).

Dans les conditions de notre expérimentation, tous les tissus racinaires des

plants témoins sont envahis par les hyphes de FORL. Cette colonisation est accompagnée

d'une désorganisation du contenu cytoplasmique des cellules hôtes envahies ainsi que par

des altérations marquées au niveau des parois végétales. La plante ne semble pas émettre

de réactions de défense (ou à un niveau trés faible) pour contrer l'avancée de l'agent

pathogene.

A l'inverse, chez les plants inoculés au préalable par Р. oligandrum, plusieurs

phénomènes vont conduire à une protection locale importante contre FORL. Tout

d'abord, l'étendue de la colonisation fusarienne est extrêmement limitée. Elle est réduite

aux cellules épidermiques ou aux couches cellulaires adjacentes. Les hyphes de FORL font

souvent face à des structures pariétales telles que des appositions et des papilles. Ce sont

souvent des structures compactes, massives, parfois enrichies en matériaux phénoliques,

qui renforcent les parois végétales. La plupart du temps, les hyphes de FORL sont

retardées voire arrêtées dans leur progression au niveau de ces parois renforcées. De plus,

une accumulation de matériaux de nature phénolique crée un environnement fongitoxique

qui conduit à une dégénérescence des filaments de FORL. Les observations sont en faveur

d'une intervention postérieure de chitinases et glucanases dont l'activité compléterait les

effets des métabolites toxiques.

En outre, il apparait clairement que le P oligandrum peut exercer une action

hyperparasitaire par pénétration et destruction, in planta, des cellules du FORL. Ainsi,

pour la première fois, il a été montré l'induction d'une résistance locale par Р oligandrum

dont l'effet est accru par une aptitude hyperparasitaire

Ces premiers résultats conduisent à étendre les études sur les relations Р oligan-

drum — tomate dans l'objectif. d'analyser plus précisément l'intérét d'élargir à ce cham-

pignon le recours combiné à différents antagonistes en vue d'une protection intégrée.

Source : MNHN, Paris

Cryptogamie, Mycol. 1997 18 (2) : 147-156 147

ACTION FONGISTATIQUE ET FONGICIDE DE SIX BIOCIDES

UTILISES DANS LE TRAITEMENT DE BOIS

ARCHEOLOGIQUES CONTAMIN

P. GUIRAUD У, J.L. BENOIT-GUYOD *, В. STEIMAN *. ОК. TRAN ++

* Groupe pour l'Étude du Devenir des Xénobiotiques dans l'Environnement (GEDEXE),

UFR de Pharmacie de Grenoble (UJF), BP 138, 38243 Meylan Cedex, France

** ARC Nucléart, Centre d'Études Nucléaires de Grenoble, BP 85X, 38041 Grenoble Cedex, France

RÉSUMÉ — Les bois archéologiques gorgés d'eau sont très sensibles à l'attaque par les microorga-

nismes. Un bateau datant de 1680 a été exhumé en juin 1990 à Bouliac prés de Bordeaux (France).

Sa restauration a été confiée à l'équipe de ARC Nucléart à Grenoble (France), spécialisée dans le

développement de procédés de conservation d'objets archéologiques. Malgré de nombreuses précau-

tions, des moisissures se sont développées sur différentes parties du bateau en février 1994. En dépit

d'un reconditionnement du bois, ces moisissures sont réapparues très rapidement. Différents échan-

tillons ont été prélevés, aussi bien dans les zones visiblement contaminées, que dans des zones sans

contamination apparente. La sensibilité de 7 espèces, représentatives des différents groupes taxono-

miques présents, a été recherchée vis-à-vis de 6 biocides commerciaux contenant différentes classes de

matiéres actives, en prenant pour référence le pentachlorophénol. Les concentrations minimum

inhibitrices et létales ont été déterminées.

ABSTRACT — Numerous microorganisms grow on waterlogged archeological woods leading to

their deterioration. Microbial proliferation should be avoided by the use of one or several biocides. In

a previous study, we surveyed the mycoflora found in a waterlogged boat from the end of the 17th

century, discovered in 1990 near Bordeaux ( Bouliac, France). In this work, 7 species, representative of

the different taxonomic groups isolated and identified from small wood samples, have been checked

for their sensitivity towards six commercial biocides containing various classes of active compounds.

The minimal inhibitory concentrations and the minimal lethal concentrations have been determined

for each biocide.

MOTS CLÉS : Bois archéologiques, dégradation, micromycétes, moisissures, conservation

KEY WORDS : Archeological wood, degradation, micromycetes, preservation

INTRODUCTION

La préservation et la restauration des objets archéologiques, historiques et des

objets d’Art est un problème trés complexe en raison де la multitude des types d’ agressions

possibles et également de la diversité des matériaux à protéger. Plusieurs centres de

recherche se sont spécialisés dans ce domaine.

Source : MNHN, Paris

148 P. GUIRAUD et al.

Nucléart est un service du Commissariat à l'Énergie Atomique (CEA), implanté

au Centre d'Études Nucléaires de Grenoble (CENG) et lié à l'Atelier Régional de

Conservation (ARC), formant le groupe ARC-Nucléart. Ce groupe est spécialisé dans le

traitement et la restauration d'objets archéologiques, en particulier les bois gorgés d'eau.

Différents procédés sont utilisés : le séchage par lyophilisation après imprégnation par

du polyéthylèneglycol (PEG) (Young & Wainwright, 1982 ; Cook & Grattan, 1984 ;

Hoffmann, 1984 ; Jannière & Meurgues, 1984), la consolidation selon le procédé Nucléart

(imprégnation par des résines styrène-polyester puis polymérisation par irradiation

gamma) ou imprégnation partielle ou totale par des polymères synthétiques (de Tassigny

& Ginier-Gillet, 1979 ; Ginier-Gillet et al., 1984).

Le problème majeur est le stockage des pièces avant traitement car sorties de leur

milieu d'immersion, les matériaux organiques sont altérés rapidement par les nouvelles

conditions physico-chimiques dans lesquelles ils se trouvent (oxydations...) ainsi que par

les insectes et les microorganismes. La procédure la mieux adaptée consiste à essayer de

maintenir au mieux les conditions dans lesquelles ont été découvertes les pièces, en les

plaçant en milieu immergé à l'obscurité. Cependant, il est souvent plus facile de stocker les

bois gorgés d'eau dans des gaines étanches saturées en eau en chambre froide à 6° C. Dans

ce cas, les contaminants présents lors du conditionnement peuvent se développer si l'on

n'utilise pas des techniques de désinfection ou de stérilisation telles que des biocides

chimiques ou bien les radiations gamma (Pointing et а/, 1994). Les bois archéologiques

gorgés d'eau sont donc la cible de nombreux microorganismes (bactéries et micromycètes)

susceptibles de les dégrader. L'emploi d'une ou de plusieurs méthodes biocides de diffé-

rentes natures permet, en principe, de stopper la prolifération microbienne soit par un effet

inhibiteur, soit par un effet létal.

Dans ce travail, nous avons testé l'efficacité de plusieurs biocides chimiques

couramment utilisés contre différentes espèces de micromycètes isolés à partir de bois

gorgé d'eau. L'influence du PEG a été étudiée.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Le bateau de Bouliac :

En juin 1990 à Bouliac près de Bordeaux, deux embarcations de bois gorgé d'eau

ont été exhumées. L'une datant de 1680, la plus grande, a été confiée pour traitement à

Arc-Nucléart à Grenoble. Le matériau dans lequel se trouvaient les bateaux est hétéro-

gène, il s'agit d'argile, de sable, de graviers et de blocs de pierres. Dès leur exhumation,

l'arrosage a été régulier pour éviter le dessèchement. La grande embarcation a été

démontée, les fragments ont été lavés sur place puis enrobés de linges humides et condi-

tionnés dans de la gaine étanche de polyéthylène noire pour la protection contre les rayons

solaires. Une solution de biocide (Bactolyse) est introduite puis la gaine est soudée par

thermocollage.

Les pièces seront ensuite stockées en chambre froide à +6" C au CENG, jusqu'en

février 1994 date à laquelle il est noté un développement de moisissures sur de nombreuses

piéces ornées de clous qui ont troué la gaine. Les piéces sont alors reconditionnées

(souvent dans les mémes gaines) aprés nettoyage et pulvérisation d'une solution de

Bactolyse à 1 90. Malgré ces précautions, des microorganismes réapparaissent méme

lorsque la gaine a été changée et des prélévements sont effectués en avril 1994 sur

différentes parties du bateau.

Source : MNHN, Paris

ACTIONS ANTIFONGIQUES DES BIOCIDES 149

Espèces fongiques étudiées :

Parmi les micromycétes isolés des prélèvements de bois effectués en 1994, sept

ont été étudiés : un Ascomycète : Chaetomium globosum Kunze : Fries ; ип Basidiomycète :

Pholiota abstrusa (Fries) Singer sensu Singer ; cinq Deutéromycète: cremonium persi-

стит (Nicot) W. Gams, Gliocladium virens J.H. Miller et al., Penicillium chrysogenum

Thom, Phialophora lignicola (Nannfeldt) Goidanich et Trichoderma viride Persoon : Fries.

Biocides utilisés :

Les biocides testés sont des composés à large spectre (algicides, bactéricides,

fongicides), commercialisés en solution aqueuse : Bactolyse 48 (B48) est un mélange de

deux dérivés isothiazoline et de nitrate de cuivre, Bactolyse 66 (B66) est un mélange de

deux dérivés isothiazoline et d’un dérivé bromo-nitré, Kathon CG contient les mêmes

principes actifs que B48 mais 10 fois plus dilués. Luxor D2 est un ammonium quaternaire

et JB75 est un sel de phosphonium. Le produit antifongique de référence est le sel de

sodium du pentachlorophénol (PCPNa). Les produits sont testés à des concentrations

finales de 0,01 à 3 g/l sauf le JB75 : de 1 60 g/l (g de solution commerciale dans de l'eau

distillée stérile). Ces gammes de concentrations sont préparées de manière à encadrer la

concentration d'utilisation préconisée par le fabricant (0,1 % soit | g/l pour B48, 1 à 5%

soit 10 50 g/l pour JB75).

B48, B66 et JB75 proviennent de chez JOUD, France ; Kathon CG de chez

ROHM et HAAS (Allemagne), Luxor D2 de chez VIATIK (France) et PCPNa de chez

ALDRICH (Allemagne).

Essais préliminaires :

Pour deux des espéces choisies (Gliocadium virens et Trichoderma viride), l'action

de B48 (0,25 à 3 g/l) et de JB75 (10 à 30 g/l) a été étudiée sur un milieu solide (glucose 8 00,

extrait de levure 1,5 %, agar 1,5 %). Les micromycétes ont été ensemencés en un point

central dans les boites de Pétri puis la croissance a été évaluée par mesure du diamétre des

colonies lors d'une incubation à 22° C pendant 15 jours sous un éclairage type lumière du

jour avec une photopériode de 12h/24h.

Détermination des CMI et CML :

Pour chaque espéce, des précultures sont réalisées en boite de Pétri sur milieu

malt (1,5 90) -agar (1,5 %) (MEA) pendant 8 à 10 jours à 22? C. Puis des suspensions

calibrées de spores sont préparées : 10° spores/ml dans de l'eau distillée stérile additionnée

de tween 80 (0,5 %). Les tests de détermination des concentrations minimales inhibitrices

(СМІ) sont réalisés en plaques multipuits (96 puits). Chaque puits contient 170 ml de

milieu synthétique de Galzy et Slonimski (1957) (5 g/l de glucose) additionné ou non de

20 % de PEG 400, 10 ml de suspension de spores, 20 ml de solution de biocide ; chaque

essai est répété 8 fois (une colonne) ; le blanc correspond à une colonne ne contenant que

du milieu de culture ; la colonne témoin ne contient pas la solution de biocide. Les

microplaques sont ensuite incubées à 22? C sous agitation (180 rpm) et la croissance est

évaluée par mesure de la densité optique à 620 nm à 24, 48 et 72h (spectrophotométre

Multiscan). Les concentrations minimales létales sont déterminées aprés transfert du

Source : MNHN, Paris

150 P. GUIRAUD et al.

contenu des puits à 72h de culture sur milieu MEA en boîtes de Pétri et observation du

développement de colonies ou non

RÉSULTATS ET DISCUSSION

Les 7 micromycètes étudiés ont été choisis comme représentants des différents

groupes taxonomiques présents sur les échantillons de bois archéologique gorgé d’eau et

en fonction de la fréquence de leur isolement. Toutes ces espèces sont ubiquistes, trouvées

dans le sol mais fortement liées au bois ou à se: produits.

En ce qui concerne les biocides utilisés, le РСРМа est très couramment employé

dans des domaines très divers : industrie, agriculture... mais il présente l'inconvénient de

s'accumuler dans les écosystèmes et sa toxicité n'est pas négligeable. Les 5 autres produits

testés sont présentés comme moins nocifs. Un traitement par du PEG est employé lors de

la déshydratation ménagée des objets en bois gorgé d’eau. Ce traitement consiste à

immerger les pièces de bois dans des solutions aqueuses de PEG en concentration

croissante, chaque immersion est très lente et peut durer plusieurs mois, c'est pourquoi

l'influence de ce produit sur l'efficacité des biocides a été recherchée.

290

Е во

270 == Témoin

5 во 025 gll

g 50 --й--0,5 g/l

$ 40 —-0——0,75 g/l

E 23 ти ший!

Ё эн —e—2 gll |

Е TA oyi

510 pu

Temps de culture (j)

Fig. 1. — Croissance de Trichoderma viride sur le milieu solide en présence de différentes concentra-

tions de B48.

Fig. 1. — Growth of Trichoderma viride on solid medium with variable concentrations of B48.

Source : MNHN, Paris

ACTIONS ANTIFONGIQUES DES BIOCIDES 151

Les essais préliminaires de sensibilité de Gliocladium virens et Trichoderma viride

vis à vis de B48 et JB75 réalisés sur milieu solide, montrent que ces deux micromycètes sont

capables de se développer jusqu'à 3 g/l de B48, le plus résistant étant T. viride qui est

capable d'envahir la boite de Pétri en 10 jours lorsque le milieu contient 3 g/l de B48 contre

4 jours pour la culture témoin (Fig. 1). Pour Gvirens avec la méme dose de produit, on

obtient une colonie mais qui n'arrive pas à envahir la boite et dont le développement

devient stationnaire à 6 jours. Donc à une dose correspondant à 3 fois celle préconisée, ce

produit semble peu efficace. JB75 semble donner des résultats plus cohérents avec les doses

efficaces annoncées par le fabricant. En effet, T. viride est totalement inhibé par ce produit

à la concentration de 20 g/l. À cette dose, la croissance de G virens est fortement ralentie

pour devenir nulle à 30 g/l (Fig. 2).

Les études en microplaques (milieu liquide) permettent de déterminer la CMI et

CML de chaque produit pour chaque espéce fongique. Dans ces essais, l'ensemencement

initial est moins massif que précédement et il s'agit de spores, les conditions sont donc plus

proches de la réalité.

Diamétre des colonies (mm)

ооооооосоооо

0 2 3 6 16 8 9. 10, иЗ 14 15

Temps de culture (j)

Fig. 2. — Croissance de Glyocladium virens sur milieu solide en présence de différentes concentrations

de JB75.

Fig. 2. — Growth of Gliocladium virens on solid medium with variable concentrations of JB75.

Source : MNHN, Paris.

152 P. GUIRAUD et al.

Le PEG a un effet inhibiteur très net sur certaines des espèces étudiées (Fig 3),

par contre ce produit n'a pas d'effet fongicide propre. Il a déjà été signalé que les PEG sous

forme stable (non dégradée) n'ont pas de propriétés biocides effectives bien qu'ils empê-

chent le développement bactérien. Cet effet est supposé résulter d’un phénomène de

compétition avec l'eau et les nutriments. Par contre, sous l'influence de rayonnements (UV,

gamma...) ou en présence de traces de certains ions métalliques, les PEG peuvent se

décomposer en différents produits (aldéhydes...) qui pourraient avoir une action biostati-

que ou méme biocide (Brownstein, 1981).

1,4 |

12 -

qd | —9— G. virens GS

E | —0— G. virens PEG

9 0;8 | —&— P. abstrusa GS

о 0,6 T —4— Р. abstrusa PEG

DE 1 -@-T. viride GS |

—0— T. viride PEG

0,2 «

0 + 1

0 24 48 72

Temps de culture (h)

Fig. 3. — Influence du polyéthylène glycol sur la croissance des micromycètes en milieu liquide de

Сару & Slonimski (1957).

GS : milieu de Galzy et Slonimski ; PEG : milieu de Galzy et Slonimski additionné de 20 % de PEG

400.

Fig. 3. — Effect of polyethylene glycol on growth of micromycetes in liquid medium of Galzy &

Slonimski (1957)

GS: Galzy & Slonimski's medium; PEG Galzy & Slonimski's medium with 20% PEG 400.

En présence des biocides, le PEG a des effets variables qui dépendent du biocide

€t de Геврёсе fongique. Les tableaux 1 à 3 donnent les valeurs de CMI et CML obtenues.

Le PCPNa est un inhibiteur trés efficace entre 10 et 200 mg/l selon l'espéce (moyenne 70

mg/l). Па une action fongicide entre 10 mg/l et 1 g/l (moyenne 250 mg/l), Chaetomium

globosum et Trichoderma viride sont très résistants. Pour les autres espèces, la fourchette

CMI-CML est trés réduite. La présence de PEG dans le milieu de culture inhibe assez

fortement l'activité du PCPNa sauf dans le cas de Chaetomium globosum. Les valeurs

moyennes des CMI et CML sont trés augmentées ainsi que l'écart entre CMI et CML

Source : MNHN, Paris.

ACTIONS ANTIFONGIQUES DES BIOCIDES 153

sauf pour Chaetomium globosum et Trichoderma viride. Le JB75 est un fongistatique

efficace (CMI moyenne : 4,40 g/l), par contre les valeurs de CML sont supérieures ou

égales à 50 g/l (dose maximale d'utilisation recommandée) pour plusieurs espèces. Deux

espèces sont trés sensibles et ne présentent que peu d'écart entre CMI et CML, ce sont

Pholiota abstrusa et Phialophora lignicola. Par contre Chaetomium globosum est très

resistant. La présence de РЕС augmente la résistance (CML) de Phialophora lignicola,

mais n'a aucun effet sur le comportement des autres espèces vis à vis de JB75. Luxor se

montre un fongistatique et un fongicide efficace, on note cependant une CML élevée pour

Chaetomium globosum et Penicillium chrysogenum, et globalement il y a un écart non

négligeable entre les CMI et les CML. Le PEG a un effet variable, diminuant les CML pour

Pholiota abstrusa, Gliocladium virens et Phialophora lignicola, tandis qu'il protege Tricho-

derma viride. Le Kathon CG, le B48 et le B66 donnent des résultats comparables ce qui est

logique puisqu'ils contiennent le méme type de principes actifs. Ces produits sont efficaces

aussi bien comme fongistatiques que comme fongicides et on observe un écart réduit entre

CMI et CML. Cependant les doses efficaces sont souvent supérieures à celles préconisées

par le fabricant et Chaetomium globosum se montre trés résistant. La présence de PEG

entraine une diminution de la CML pour Acremonium persicinum, Pholiota abstrusa et

Penicillium chrysogenum avec B48, pour Acremonium persicinum et Gliocladium virens avec

B66 et pour Gliocladium virens et Phialophora lignicola avec Kathon CG. Par contre, le

PEG augmente la résistance de Gliocladium virens vis à vis de B48 et celle de Penicillium

chrysogenum avec Kathon CG.

En conclusion, sur les 5 solutions biocides commerciales testées 4 se révélent des

fongistatiques et fongicides efficaces ; cependant le plus performant reste le PCPNa choisi

comme référence tandis que le JB75 est surtout un fongistatique. Les petites différences

observées entre les 3 produits à base d'isothiazolines (B48, B66 et Kathon CG) peuvent

étre attribuées à une différence de structure du principe actif, la présence d'adjuvants

différents ou bien à une différence de dosage pour Kathon CG et B48. Toutefois, dans ce

dernier cas, l'activité est peu modifiée alors que Kathon CG est dosé au 1/10 par rapport

à B48. Ceci est intéressant au plan des problèmes de toxicité, donc de retraitement et

d'élimination des résidus.

Malgré ses performances, plusieurs éléments sont en défaveur du PCPNa : sa

toxicité et une inhibition trés nette de son activité en présence de PEG. L'interférence du

PEG se produit de facon beaucoup moins systématique avec les autres biocides.

Il est important d'établir le plus précisément possible un inventaire de la micro-

flore (algues, bactéries, micromycétes) pour choisir le ou les biocides les mieux adaptés et

les doses à utiliser car certaines espéces fongiques peuvent se montrer trés résistantes aux

traitements ; par exemple Chaetomium globosum avec tous les produits ou encore Peni-

cilium chrysogenum et Phialophora lignicola avec Luxor. De plus, ce choix doit aussi tenir

compte des autres traitements infligés au pièces de bois ; en particulier l'emploi de PEG

qui peut avoir aussi bien un effet bénéfique que néfaste selon les espéces fongiques et le

biocide utilisé.

Source : MNHN, Paris

4875 ЈВ75 PEG РСРМа PCPNa PEG

CMI CML CMI CML CMI CML СМ! СМІ,

Ascomycète

Chaetomium globosum 1,0 >60,0 1,0 >60,0 0,20 1,0 0,75 0,75

Basidiomycète

Pholiota abstrusa 10 10 10 10 0,10 010 020 030

Deutéromycétes

Acremonium persicinum 3,0 5,0 10 50 0,01 0,01 020 0,50

Gliocladium virens 5,0 600 100 600 0,10 010 005 30

Penicillium chrysogenum 100 500 100 400 002 0,02 0,20 020

Phialophora lignicola 10 10 5,0 600 001 0,01 030 3,0

Trichoderma viride 10,0 600 250 600 005 050 075 10

VALEURS MOYENNES 4,40 33,85 7,60 40,85 0,07 0,25. 0,35 1,25

Tableau 1. — Concentrations minimales inhibitrices (СМП) et concentrations minimales létales

(CML) de JB75 et PCPNa (en g/l) sur 7 espèces fongiques cibles cultivées en milieu liquide de Galzy

& Slonimski (1957) avec et sans polyethylène glycol pendant 72 h à 22° C.

Table 1. — Minimal inhibitory concentrations (CMI) and minimal lethal concentrations (CML) of

1В75 and PCPNa (g/l) on 7 fungal species cultivated in liquid medium of Galzy & Slonimsky (1957)

with or without polyethylene glycol during 72 h at 22° C.

Kathon Kathon PEG Luxor Luxor PEG

CMI CML см CML CM см. см CM

Ascomycète

Chaetomium globosum 0,05 3,0 0,10 3,0 0,05 230 010 >30

Basidiomycète

Pholiota abstrusa 0,01 0,05 0,01 0,01 0,01 0,05 0,01* 0.01

Deutéromycètes

Acremonium persicinum 0,10 0,20 0,01 0,30 0,10 0,20 0,01 0,20

Gliocladium virens 0,50 0,75 0,01 0,20 0,20 0,50 0,01 0,10

Penicillium chrysogenum 0,30 0,30 0,20 0,75 0,20 3,0 0,30 3,0

Phialophora lignicola 0,10 0,10 0,01 0,05 005 3,0 0,01 0,30

Trichoderma viride 0,30 0,30 0,05 0,30 0,30 0,50 0,01 0,75

VALEURS MOYENNES 020 070 005 070 015 145 006 10

Tableau2. — Concentration minimales inhibitrices (CMI) et concentrations minimales létales (CML)

de Kathon CG et Luxor D2 (en g/l) sur 7 espèces fongiques cibles cultivées en milieu liquide de Galzy

& Slonimski (1957) avec et sans polyethylène glycol pendant 72 h à 22° С;

Table 2 — Minimal inhibitory concentrations (CMI) and minimal lethal concentrations (CML) of

Kathon CG and Luxor D2 (g/l) on 7 fungal species cultivated in liquid medium of Galzy & Slonimski

(1957) with or without polyethylene glycol during 72 h at 22° C.

Source : MNHN, Paris

ACTIONS ANTIFONGIQUES DES BIOCIDES 155

B48 B48 PEG B66 B66 PEG

CMI CML смо CML CMI CML CMI CML

Ascomycète

Chaetomium globosum 010 >30 010 >30 0,20 30 020 >30

Basidiomycète

Pholiota abstrusa 0,10 010 0,05 0,05 010 010 0,10 0,10

Deutéromycètes

Acremonium persicinum | 0,20 0,20 0,05 0,05 0,10 0,10 005 005

Gliocladium virens 020 030 020 30 020 10 0,20 0,50

Penicillium chrysogenum 0,10 0,50 020 020 0,10 010 0,05 00

Phialophora lignicola 0,05 005 0,05 005 0,05 0,05 0,05 0,10

Trichoderma viride оло 030 010 030 002 10 оло 0,75

VALEURS MOYENNES 0,12 0,65 0,10 0,95 0,10 0,75 0,10 0,65

Tableau 3 — Concentrations minimales inhibitrices (СМТ) et concentrations minimamles létales

(CML) de B48 et B66 (en g/l) sur 7 espèces fongiques cibles cultivées en milieu liquide de бару &

Slonimski (1957) avec et sans polyethylene glycol pendant 72 h à 22° C.

Table 3 — Minimal inhibitory concentrations (CMI) and minimal lethal concentrations (CMI) of

B48 and B66 (g/l) ou 7 frugal species cultivated in liquid medium of Galzy & Slonimski (1957) with or

without polyethylene glycol during 72 В at 22°С.

RÉFÉRENCES

BROWSTEIN A., 1981 — The chemistry of polyethylene glycol. Proceedings of the ICOM Water-

logged Wood Working Group Conference, Ottawa ( Canada), рр. 279-286.

COOK C. & GRATTAN D.W., 1984 — A practical comparative study of treatments for waterlogged

wood : part Ш : pretreatment solutions for freeze-drying, Proceedings of the 2nd ICOM

Waterlogged Wood Working Group Conference, Grenoble ( France), pp. 219-239.

DE TASSIGNY C. & GINIER-GILLET A., 1979 — La méthode par imprégnation/irradiation

gamma. Revue suisse d'art et d'archéologie 36 : 138-141.

GINIER-GILLET A., PARCHAS D., RAMIERE В. & TRAN Q.K., 1984 — Méthodes de

conservation développées au centre d'étude et de traitement des bois gorgés d'eau

(Grenoble — France) : imprégnation par une résine radiodurcissable et lyophilisation.

Proceedings of the 2nd ICOM Waterlogged Wood Working Group Conference, Grenoble

( France), pp. 125-137

HOFFMANN Р, 1984 — On the stabilization of waterlogged oakwood with PEG molecular size

versus degree of degradation. Proceedings of the 2nd ICOM Waterlogged Wood Working

Group Conference, Grenoble (France), pp. 95-115.

Source : MNHN, Paris

156 P. GUIRAUD et al.

JANNIERE С. & MEURGUES G., 1984 — Traitement des bois gorgés d'eau par la technique de

lyophilisation au Muséum d'Histoire Naturelle. Proceedings of the 2nd ICOM Waterlog-

ged Wood Working Group Conference, Grenoble ( France), pp. 175-179

POINTING S.B., JONES А.М. & JONES E.B.G., 1994 — The potential use of gamma irradiation

for improving the long term storage of waterlogged archeological wood. Proceedings of the

5th ICOM Group on Wet Organic Archeological Materials Conference, Portland (USA),

pp. 437-451.

YOUNG G.S. & WAINWRIGHT I.N.M., 1982 — Polyethylene glycol treatments for waterlogged

wood at the cell level. Proceedings of the ICOM Waterlogged Wood Working Group

Conference, Ottawa (Canada), рр. 107-116.

Source : MNHN. Paris

Cryptogamie, Mycol. 1997, 18 (2): 157-163 157

PRESERVATION ОЕ FUNGI

C.S. ТАМ

Centraalbureau voor Schimmelcultures,

P.O. Box 273, 3740 AG, Baarn,

The Netherlands,

fax 00 355416142; e-mail CST@CBS.KNAWNL

SUMMARY: Dehydration of cells, necessary to avoid intra-cellular crystallization during freezing, is

regulated through the cooling rate and depends on the size of the cell and the thickness of the

cell-wall. Saccharides prevent phase transitions in the membrane from the liquid-crystalline to the

gel-phase during dehydration. Proteins are protected against denaturation during slow cooling by

saccharides and amino-acids. During freeze-drying, cells are dehydrated in the cooling step preceding

drying; during drying the protectant is converted in a glass. Cryoprotectants such as glycerol,

dimethylsulfoxide, 1.2 propane-diol, ethylene-glycol, ethanol, methanol, polyethylene-glycol and

several butane-diols serve to avoid extra - and intracellular crystallization, but most of them are toxic.

Revival in 1.2 M sucrose is recommended.

KEYWORDS: fungi, cryopreservation, lyophilization

Fungi can be preserved by various methods: on agar, under mineral oil, at

ultralow-temperature and lyophilized. The latter two methods (long-term preservation)

are the least laborious because metabolism is arrested and negative effects of degeneration

and infection are minimized.

Cooling

The cooling rate is a critical parameter in both long-term preservation methods.

When cells are cooled rapidly, intra-cellular ice-crystals are produced, which is often

lethal. Production of intracellular crystals can be avoided by slow cooling (Morris, 1981).

At slow cooling rates the bulk of extracellular water crystallizes in pure ice-crystals leaving

a highly concentrated eutectic solution. Osmotic equilibrium between this solution and

the cell is maintained by cell shrinkage. Consequently the cytoplasm becomes increasingly

concentrated resulting in a depression of the freezing temperature (Fig. 1). At the optimal

cooling rate cells are frozen at a rate that intracellular freezing is just avoided completely.

This cooling rate depends on the size of the cell and the thickness of the cell-wall and can

be monitored with a cryo-microscope (Mazur, 1984; Tan ег al., 1994).

Source : MNHN, Paris

158 C.S. ТАМ

* Slow freezing

É a

Fig. 1. — Influence of the cooling rate on cells.

Freeze-drying

Lyoprotectant:

During freeze-drying, cells are suspended in a lyoprotectant. A lyoprotectant

includes а macromolecule, which serves as а bulking agent, and а saccharide. In a fluid

(liquid-crystalline) membrane, water is hydrogen-bonded to the phospholipid head

groups, yielding space for the fatty-acid acyl chains to be mobile. During desiccation a

phase transition occurs in the membrane from the liquid-crystalline to the gel phase, which

causes leakage of the membrane and therefore will result in cell damage. Saccharides

protect membranes during freezing and drying (Crowe et al., 1984, 1987, 1990) against this

transition by hydrogen-bonding to the phospholipid head groups thus replacing water

(Crowe et al., 1985a). This interaction increases head group spacing, resulting in a lower

transition temperature of the phospholipids (Crowe ег al., 1985b) (Fig.2). Disaccharides

are found to be optimal, particularly trehalose (Fig. 3) (Crowe et al., 1984; Tan et al.,

1995). Trehalose is produced in spores and conidia of yeasts and fungi to protect their

membranes and proteins at the low moisture content present in these propagules (Theve-

lein, 1984; Wiemken, 1990).

Source : MNHN, Paris

PRESERVATION ОЕ FUNGI 159

Solid 00000

№ || | ||

0 ИІ

[9 о eos ИЕ a 00000

о HoH о HoH о MO

) | à ) нусон

m e

о нон © нон 9

во perm =x

он

Liquid-crystalline Ал,

Fig. 2. — Prevention of phase-transition of the membrane during dehydration Бу saccharides.

CH,0H | он

Но сно. Ни, CCS E

“ОН H ~,“

| а C. HOEC C

HO o =.

H OH H

Fig. 3. — Structure formula of trehalose.

Source : ММНМ. Paris

160 C.S. ТАМ

T stor.

T eut.

RMC %

Fig. 4. — Phase-diagram of solution during freeze-drying.

As a result of freeze-concentration during slow cooling, proteins unfold and

hence denaturate. They can be protected against this denaturation by saccharides and

amino-acids. Proteins are stabilized because both type of compounds are preferentially

excluded (Arakawa & Timasheff, 1982; Back er al., 1979; Carpenter & Crowe, 1988) from

the surface of the protein in aqueous solution. They repel the hydrophobic parts of the

amino acid chains, thus preventing unfolding of the protein. Moreover, hydrogen bonding

between the saccharide and the protein in the final stages of desiccation is required for

stabilization of the dried proteins (Carpenter & Crowe, 1988; Carpenter et al., 1991).

Freeze-drying protocol:

In the cooling step preceding drying the bulk of extracellular water crystallizes

and the cells are dehydrated. After cooling the dehydrated cells, surrounded by the highly

Source : MNHN. Paris

PRESERVATION OF FUNGI 161

viscose lyoprotectant are embedded in ice-crystals. At the temperature of the primary

drying phase, viscosity of the lyoprotectant is so high that it is a glass. А glass is a liquid in

which the molecules are immobilized (Franks, 1990). In the primary drying phase the

ice-crystals evaporate, leaving a glass interwoven with channels. During secondary drying

water evaporates through these channels from the glass, making it even more viscose.

Because the viscosity increases, the temperature at which the glass is stable increases. By

slowly raising the temperature, evaporation of water from the glass is enhanced. Finally so

much water is evaporated that the protectant is a stable glass at room temperature (Fig.4).

A glass is an ideal formulation to store dehydrated organisms because they are protected

against outside enzyme and chemical activity and the molecules of the lyoprotectant are

arranged in an unordered structure, allowing binding to the membranes and the proteins.

The temperature-regime, that must be applied to prevent collapse of the glass during

freeze-drying, can be established with a freeze-drying microscope.

Freeze-dried organisms can be stored successfully below the glass-transition

temperature (Те) (Franks, 1990). Tg is the temperature at which the glass melts during

warming. Above Tg, water mobility increases and consequently the product deteriorates.

The Tg is determined by the composition of the protectant and the residual moisture

content and can be estimated by differential scanning calorimetry (DSC) (Hatley, 1990).

Cryopreservation

Freeze-drying has two advantages over cryopreservation. No special require-

ments are needed to store the product and its despatch does not need cooling facilities.

However, viability is much higher for cryopreservation and sterile mycelia can generally

not be freeze-dried. During cryopreservation, cells are suspended in a cryoprotectant.

Cryoprotectants have a high glass-forming tendency and the glasses produced are rather

stable (Mehl & Boutron, 1987; Boutron et al., 1986). They partly penetrate the cells where

they prevent or reduce growth of intracellular ice-crystals. Because not all the protectant

penetrates the cell, they stimulate cell shrinkage and hence lower the freezing temperature

of the cellular contents. Finally they reduce growth of ice-crystals in the medium.

Commonly used cryoprotectants are glycerol, dimethylsulfoxide, 1.2 propane-diol,

ethylene-glycol, ethanol or methanol. Other solutions having a high glass-forming ten-

dency are poly-ethylene-glycol, 1.2 butane-diol, 1.3 butane-diol and 2.3 butane-diol (Mehl

& Boutron, 1987; Boutron er al., 1986) but they are quite toxic. It is advisable to estimate

the time required for permeation of the cryoprotectant into the cell by сгуотісгоѕсору,

and in relation to this and the size of the cell and the thickness of the cell-wall, the optimal

cooling rate. Moreover, since most cryoprotectants are more or less deleterious, toxicity

must be established to determine the period and temperature of handling prior to storage

at ultra-low temperature. Organisms can best be stored below -135°C to completely stop

the growth of ice-crystals (Morris, 1981). When stored at a higher temperature, the

product must be kept below the Tg of the protectant.

Revival

Revival is an important issue in both long-term preservation methods because

sublethal damage on membranes and proteins can never be avoided completely. Cells can

be revived in water or transferred immediately onto the suitable agar-medium. However,

when survival rates are low, it is recommended to revive cells in 1.2 M sucrose to dilute the

toxic protectant and to stimulate efflux of the protectant from the cell while minimizing

Source : MNHN, Paris

162 С.5. ТАМ

osmotic expansion (Tan & Stalpers, 1996). Optionally amino-acids may be added to the

revival medium to repair denaturated proteins and to restore the energy charge.

Storage under mineral oil

When neither technicians nor equipment are available for maintenance of fungal

cultures, storage under mineral oil is a cheap and less elaborative alternative (Fennel,

1960). Cultures, growing on an agar slant are covered by paraffine oil (Paraffinum

perliquidum 60-80 (mPa. 1 cP), Brocacef B.V., Maarssen, The Netherlands). Oxygen

entrance to the cultures, and hence metabolism is retarded to approximately 10%. When

stored at 10°C and at a relative humidity of 70%, ascomycetes, basidiomycetes and

zygomycetes have to be transferred only once in ten years. Oomycetes must be transferred

every two years when stored under these conditions.

REFERENCES

ARAKAWA T. & TIMASHEFF S.N., 1982 — Stabilization of protein structure by sugars. Bioche-

mistry 21: 6536-6544.

BACK J.F., OAKENFULL D. & SMITH М.В, 1979 — Increased thermal stability of proteins in the

presence of sugars and polyols. Biochemistry 18: 5191-5196.

BOUTRON Р, MEHL Р, KAUFMANN A. & ANGIBAUD P, 1986 — Glass-forming tendency

and stability of the amorphous state in the aqueous solutions of linear polyalcohols with

four carbons 1. Binary systems water-polyalcohol. Cryobiology 23: 453-469.

CARPENTER ЈЕ. & CROWE J.H., 1988 — Modes of stabilization of a protein by organic solutes

during desiccation. Cryobiology 25: 459-470.

CARPENTER ЈЕ, ARAKAWA T. & CROWE J.H., 1991 — Interactions of stabilizing additives

with proteins during freeze-thawing and freeze-drying. Development biological standardi-

zation 74: 225-239

CROWE J.H., CROWE L.M. & CHAPMAN D., 1984 — Preservation of membranes in anhydro-

biotic organisms: The role of trehalose. Science 223: 701-703.

CROWE J.H., CROWE L.M., CARPENTER J.F. & WISTROM C.A., 1987 — Stabilization of dry

phospholipid bilayers and proteins by sugars. Biochemical journal 242: 1-10.

CROWE J.H., CARPENTER ЈЕ, CROWE L.M. & ANCHORDOGUY ТЈ, 1990 — Are freezing

and dehydration similar stress vectors ? A comparison of modes of interaction of stabili-

zing solutes with biomolecules. Cryobiology 27: 219-231.

CROWE L.M., CROWE J.H. & CHAPMAN D., 1985 — Interaction of carbohydrates with dry

dipalmitoylphosphatidylcholine, Archives of biochemistry and biophysics 236: 289-296.

CROWE L.M., CROWE J.H., RUDOLPH A., WOMERSLEY С. & APPEL L., 1985 — Preserva-

tion of freeze-dried liposomes by trehalose. Archives of biochemistry and biophysics 242:

240-247.

FENNELL D.L., 1960 — Conservation of fungous cultures, Botanical review 26: 79-141.

FRANKS Е, 1990 — Freeze-drying: from empiricism to predictability. The significance of glass

transitions. Development biological standardization 74: 9-19.

HATLEY R.H.M., 1990 — The effective use of differential scanning calorimetry in the optimisation

of freeze-drying processes and formulations. Development biological standardization 74:

105-122.

Source : MNHN, Paris

PRESERVATION OF FUNGI 163

MAZUR Р, 1984 — Freezing of living cells: mechanisms and implications. American journal of

physiology 247: C125-C142.

MEHL P. & BOUTRON P., 1987 — Glass-forming tendency and stability of the amorphous state in

the aqueous state of linear polyalcohols with four carbons II. Ternary systems with water,

12-propanediol or 1,3-butanediol or 2.3-butanediol. Cryobiology 24: 355-367.

MORRIS G.J. (ed.), 1981 — Cryopreservation. An introduction to cryopreservation in culture collec-

tions. Institute of Terrestrial Ecology, Cambridge, United Kingdom.

TAN C.S., VLUG ЏА., STALPERS ЈА. & INGEN C.W. van, 1994 — Microscopical observations

on the influence of the cooling rate during freeze-drying of spores. Mycologia 86: 281-289.

TAN C.S., INGEN C.W. van, TALSMA H., MILTENBURG J.C. van, STEFFENSEN C.L., VLUG

ПА. & STALPERS J.A., 1995 — Freeze-drying of fungi: influence of composition and

glass transition temperature of the protectant. Cryobiology 32: 60-67.

TAN C.S. & STALPERS J.A., 1996 — Vitril ion of fungi. In: Biodiversity. International biodiver-

sity seminar ECCO XIV. meeting. Ed. A. Cimerman & N. Gunde-Cimerman, National

Institute of Chemistry, Ljubljana, Slovenia, pp. 189-193.

THEVELEIN J.M., 1984 — Regulation of trehalose mobilization in fungi. Microbiological reviews

48: 42-59.

WIEMKEN A., 1990 — Trehalose in yeast, stress protectant rather than reserve carbohydrate.

Antonie van Leeuwenhoek journal of microbiology and serology 58: 209-217.

Source : MNHN. Paris

Cryptogamie, Mycol. 1997, 18 (2) : 165-168 165

ACTIVITÉ ANTIFONGIQUE D'HUILES ESSENTIELLES

EXTRAITES AU BENIN ET AU TOGO

Е BABA-MOUSSA *, К. KOUMAGLO **, А. AYEDOUN ***, К. АКРАСАМА **,

М. MOUDACHIROU ***, P. BOUCHET *.

* U.FR. de Pharmacie, Université de Reims,

51 rue Cognacq-Jay, 51096 Reims cedex, France.

** Faculté des Sciences, Université du Bénin,

B.P. 1515, Lomé, Togo

***Département de Chimie,

Faculté des Sciences,

Université Nationale du Bénin,

Calavi, Benin.

INTRODUCTION

L'utilisation des plantes supérieures pour leurs propriétés antibactériennes et

antifongiques est une pratique très ancienne en thérapeutique. Ces propriétés s'expriment

à travers diverses composantes de la plante, parmis lesquelles figurent les huiles essentiel-

les.

L'activité antifongique des huiles essentielles а fait l'objet de plusieurs travaux

(Chaumont et al., 1959 ; Misra et al., 1988 ; Oloke, 1992 ; Singh et al., 1992).

Notre étude concerne les huiles essentielles extraites de douze espéces végétales

appartenant à huit familles différentes récoltées à différentes périodes et dans diverses

régions du TOGO et du BENIN.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Les huiles essentielles ont été extraites des espèces suivantes :

Cymbopogon citratus (F), Cymbopogon giganteus (Е), Cymbopogon shoenan-

thus (F), Eucalyptus citriodora (Е), Fagara xanthoxyloides (Fr), Lippia multiflora (Е),

Melaleuca quinquenervia (F), Ocimum canum (Е), Ocimum gatissimum (F), Pimenta

racemosa (F), Steganotenia araliacea (F), Xylopia aethiopica (Fr).

Elles ont été essayées sur cinq souches de champignons sélectionnés parmis des

espèces contaminantes (Aspergillus flavus et Trichoderma harzianum), des espèces phyto-

patogènes (Botrytis cinerea) et des espèces anthropo-pathogènes (Candida albicans,

Microsporum вурзеит ).

1 L'extraction des huiles essentielles à été réalisée par la technique d'hydro-

distillation dans un appareil de type CLEVENGER.

Source : MNHN, Paris

166 F. BABA-MOUSSA et al.

Réalisation des tests antifongiques :

La recherche de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) des huiles essen-

tielles à été effectuée par une technique de dilution en milieu liquide sur plaque Nunc de

24 puits.

Chaque puits recoit 900 ul de milieu liquide de SABOURAUD, 50 ш d'huile

essentielle, 50 ul d'une suspension de spores calibrée à 4 x 107 UFC/ml (champignons

filamenteux) et 4 x 105 UFC/ml (Candida albicans). Les concentrations finales en huiles

essentielles sont comprises entre 312 ppm et 10 000 ppm.

Une plaque ne contenant que les témoins est réalisée à part, pour éviter une

interférence de la fraction volatile des huiles essentielles sur la croissance des témoins.

La croissance des champignons est observée dans les différents puits aprés

incubation à 25? C, sous agitation.

L'évaluation de l'activité antifongique de la fraction volatile (QMI ou Quantité

Minimale Inhibitrice) est effectuée par la technique des microatmosphères en milieu solide

de Kellner & Kober (1954).

RÉSULTATS ET DISCUSSION

La plupart des huiles essentielles inhibent la croissance des champignons avec

des CMI comprises entre 312 ppm et 10 000 ppm.(Tableau I). Celles de Cymbopogon

citratus, d'Eucalyptus citriodora, de Lippia multiflora et d'Ocimum gratissimum sont

actives sur toutes les espèces fongiques étudiées. L'huile essentielle de Cymbopogon

citratus, particulièrement active, inhibe la croissance de Botrytis cinerea, Candida albicans

et de Microsporum gypseum à la concentration de 312 ppm.

En revanche, celle de Fagara xanthoxyloides ne présente aucune activité inhibi-

trice.

En ce qui concerne l'activité inhibitrice de la phase volatle des H.E., les quantités

minimales inhibitrices varient de 5 ul à 15 ul.

Le pouvoir antifongique des huiles essentielles ne varie pas sensiblement quelle

que soit la technique utilisée : l'huile essentielle de Cymbopogon citratus est la plus active,

suivie de celles de Lippia multiflora, d'Ocimum gratissimum et d' Eucalyptus citriodora.

Cette concordance des résultats peut s'expliquer par le fait que l'activité des huiles

essentielles est surtout due à leurs constituants volatils.

DISCUSSION ET CONCLUSIONS

À l'exception de l'huile essentielle de Lippia multiflora peu étudiée jusqu'à

présent et qui a donné ici de bons résultats, la plupart des huiles essentielles évoquées dans

cette étude, ont fait l'objet de plusieurs travaux (Janssen et al., 1989 ; Thomas, 1989 ; Lima

et al., 1993 ; Kishore et al., 1993). Les substances responsables de l'activité antifongique de

certaines de ces huiles essentielles sont connues : il s'agit essentiellement de l'alpha alpha-

et du bêta-citral pour Cymbopogon citratus (Hmamouchi, 1990 ; Wannissorn, 1996), du

citronellol et du citronellal pour Eucalyptus citriodora (Oloke, 1992), du thymol pour

Ocimum gratissimum (Onawumi, 1989).

Notre étude confirme bien les propriétés antifongiques de ces produits. Ceux-ci

faciles à obtenir artisanalement au TOGO et au BENIN, pourraient être avantageusement

utilisés comme conservateurs, comme antiseptiques en cosmétologie (Sofowora, 1981 :

Wannissorn, 1996) ou dans le traitement des mycoses humaines et animales.

Source : ММНМ. Paris

ACTIVITÉS ANTIFONGIQUE D'HUILES ESSENTIELLES

167

Champignons Aspergillus Candida | Microsporum Trichoderma Botrytis

‘flavus FPR 023 | albicans 1Р| gypseum IP 137 | harzianum cinerea

Huiles essentielles 4872 MNHN 3416 ВАЗ

Cymbopogon citratus. 2500 312 312 2500 312

‘Cymbopogon giganteus — [210000 210000 2500 210000 5000

Cymbopogon schoenanthus 710000 1250 312 2500 210000

‘Eucalyptus citriodora 10000 1250 312 5000 625

Fagara xanthoxyloides >10000 210000 710000 710000 210000:

Lippia multiflora 2500 625. 312 5000 625

Melaleuca quinquenervia >10000 >10000 10000 >10000 625

Ocimum сапит 510000) 210000 10000 210000 210000

Ocimum gratissimun 2500 625 312 2500 625

Pimenta racemosa 2500 5000 625 2500 625

Steganotenia araliacea 210000 710000 5000 210000 5000

Xylopia aethiopica 210000 210000 5000 >10000 2500

Tableau I. СМІ des huiles essentielles en ppm après 48 h et onze jours d’incubation

Champignons Aspergillus | Candida | Microsporum Trichoderma Botrytis cinerea)

flavus FPR 023 | albicans IP| gypseum IP 137 | harzianum RA3

Huiles essentielles 4872 MNHN3416

Cymbopogon citratus. 15 5 5 5 5

Cymbopogon giganteus >15 15 5 >15 15

mbopogon schoenanthus |215 215 15 215 15

Eucalyptus citriodora 15 15 5 15 215

Fagara xanthoxyloides 215 215 215 215 515

Lippia multiflora 15 5 5 215 5

Melaleuca quinquenervia >15 >15 5 215 215

Ocimum canum. >15 215 5 215 15

Ocimum gratissimun 15 15 5 15 5

[Pimenta racemosa >15 215 5 215 >15

Sreganotenia araliacea 515 15 5 215 15

Xvlopia aethiopica 215 215 5 215 215

Tableau II. — CMI des huiles essentielles en pl après 48 h et onze jours d'incubation

Source : MNHN, Paris.

168 Е BABA-MOUSSA ег al.

BIBLIOGRAPHIE

CHAUMONT JP. & BARDEY I., 1989 — Activité antifongique in vitro de sept huiles essentielles.

Fitoterapia 60(3) : 263-266.

HMAMOUCHI M., TANTAOUI-ELARAKI A., ES-SAFI М. & AGOUMI A., 1990 — Mise en

évidence des propriétés antibactériennes et antifongiques des huiles essentielles d'Eucalyp-

tus. Plantes medicinales et phytothérapie 24(4) : 278-289.

JANSSEN A.K., SCHEFFER J.J.C., NTEZURUBANZA L. & BAERHEIM SVENDSEN, 1989 —

Antimicrobial activities of some Ocimum species grown in Rwanda. Journal of ethnophar-

macology 26 : 57-63. Ч

KELLNER W. & KOBER W., 1954 — Moglichkeiten des Werwendung atherischer Ole zur raum

Desinfektion. Arzeim Forschung 4 : 419.

KISHORE N., MISHRA А.К. & CHANSOURIA J.P. N., 1993 — Fungitoxicity of essential oils

against dermatophytes. Mycoses 36 : 211-215.

LIMA E.0., GOMPERTZ O.F., GIESBRECHT А.М. & PAULO M.Q., 1993 — In vitro antifungal

activity of essential oil obtained from officinal plants against dermatophytes. Mycoses 36 :

333-336.

MISRA N., ВАТВА S. & MISHRA D., 1988 — Fungitoxic properties of the essential ой of Citrus

limon (L.) Burm. against a few dermatophytes. Mycoses 31(7) : 380-382.

OLOKE J.K., 1992 — Fungicidal effects of the volatile oil of Aframomum melegueta. Fitoterapia

63(3) : 269-270.

ONAWUMI O.G., 1989 — Evaluation of antifungal activity of lemon grass oil. International journal

of crude drug research 27(2) : 121-126.

SINGH S.P, NEGI $., LAXMI C. & SINGH A.K., 1992 — Antibacterial and antifungal activities of

Mentha arvensis essential oil. Fitoterapia 6341) : 76-78.

SOFOWORA E.A., 1981 — Medicinal plants and traditional medicine in Africa. John Wiley and Sons

Lmt. New York, p. 71.

THOMAS O.O. 1989 — Re-examination of the antimicrobial activity of Xylopia aethiopica, Carica

papaya, Ocimum gratissimum and Jatropha curcas. Fitoterapia 60(2) : 147-157.

WANNISSORN B., JARIKASEM S. & SOONTORNTANASART T., 1996 — Antifungal activity

of lemon grass oil and lemon grass oil cream. Phytotherapy research 10 : 551-554.

Source : MNHN, Paris

Cryptogamie, Mycol. 1997 18 (2) : 169-171 160

ACTIVITÉS ANTIFONGIQUES D'EXTRAITS LICHENIQUES

HALAMA P. (1) et VAN HALUWYN C. (2).

(1) : Institut Supérieur d'Agriculture, 41 rue du Port, 59046 Lille cedex.

(2) : Faculté des Sciences Biologiques et Pharmaceutiques, 59006 Lille cedex.

Des travaux antérieurs ont mis en évidence des activités allélopathiques (Hen-

ningsson & Lundstrom, 1970 ; Gonzales et al., 1991...), antiherbivores (Slansky, 1979 ;

Hätscher et al., 1991), antibactériennes (Vartia, 1950, 1973; Rowe et al., 1989...) et

antifongiques (Виглай, 1950 ; Henningsson & Lundstrom, 1970...) d'extraits lichéniques

voire d'acides lichéniques (Gonzalez er al., 1991 ; Lawrey et al., 1994...).

Dans un objectif de recherche de composés antifongiques vis-à-vis d'espéces

fongiques phytopathogènes, nous avons testé des extraits acétoniques de 3 espèces liché-

niques : Evernia prunastri, Hypogymnia physodes et Cladonia portentosa. Les tests ont été

réalisés sur la croissance mycélienne in vitro de 8 espèces fongiques : Pythium ultimum,

Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Colletotrichum lindemuthia-

пит, Fusarium solani, Stagonospora nodorum et Ustilago maydis. Un autre test a été réalisé

sur la germination des spores de S. nodorum, C. lindemuthianum et F. solani.

Les extraits acétoniques ont été préparés par une macération (12h) des lichens

broyés (200mg/ml d'acétone) puis incorporation au milieu gélosé (V8 ou PDA) de 50 ul

d'extrait/ ml de milieu (ph 5.6).

Parmi les espèces lichéniques E. prunastri et H. physodes présentent les princi-

pales activités antifongiques (tableau 1). Ces derniéres ont été détectées vis-à-vis de

P. ultimum, P. infestans et U. maydis. On peut remarquer une certaine spécificité d'action,

dans la mesure où P. ultimum et P. infestans appartiennent aux Phycomycètes.

Parmi les 3 espéces fongiques, une inhibition totale de la croissance mycélienne

fut observée pour Р ultimum et U. maydis, et une trés forte inhibition pour P. infestans.

Des études complémentaires révélérent un effet fongicide d'E. prunastri sur P. ultimum et

U. maydis, et pour H. physodes sur Р. ultimum alors qu'un effet fongistatique d` H. physodes

fut mis en évidence vis-à-vis d’ U. maydis.

Des activités faibles ont été observées sur la germination des spores.

Dans la mesure où la chimie des lichens est relativement bien connue à des fins

taxonomiques, cette étude devrait se poursuivre par l'expérimentation des acides lichéni-

ques présents chez les lichens testés afin de préciser les composés actifs. En effet, Е.

prunastri est caractérisé par la présence d'acide évernique, d'acide usnique, d'atranorine et

de chloroatranorine. Ces deux derniers composés sont également rencontrés chez H.

physodes ainsi que l'acide physodique et physodalique. C. porrentosa ne renferme que de

l'acide usnique.

Source : MNHN, Paris.

Espèces fongiques

Lichen

Diamètre moyen (cm) des colonies сї 96 par rapport

au témoin (entre parenthèses) au jour d'incubation ( j )

1j 2j 4j 8j 10]

ЕҮЕ 0 о 5 5 E

Pythium ultimum HYP 0 0 - - 5

CLA 3.98** 6.89** - - -

(86) (86.1)

EVE - - 025** 049*+ 07388

(7.6) (12) (13.4)

Phytophthora темах HYP - - 0 0 0.16**

(3.6)

CLA - - 0.20** 1.16% 155**

(122) (23.3) (25.8)

EVE - - 3,80** - -

(57,6)

Rhizoctonia solani HYP - - 3,21** - -

(52,5)

CLA - - 3.49** - -

(573)

БУЕ - - 0,86** 262** 3.93**

(24.8) (38.4) (54.3)

Botrylis cinerea HYP - - 1.7344 3.6244 476%

(50) (53) (65.8)

CLA - - 3.99** 6.71** -

(58.6) (83.9)

ЕУЕ - - 19118 зван» 4.63**

(57.7) (59) (61.6)

Fusarium solani HYP - - 0.88** 1.5944 1.9444

(32.5) (29.8) (32.3)

CLA - - 193** 4.01** 4.84**

(70.2) та) (72.4)

EVE : 2 1515 340** 420**

(40.6) (53.9) (612)

Colletotrichum HYP - - 0.64** 15595 2.10**

lindemuthianum (18.9) (26.8) (34.2)

CLA - - 1.20** 2.91** 3.92**

(343) (49.2) (57.9)

ЕУЕ - - 145** 2.60** 3.18**

(75.1) (65.5) (68.2)

Stagonospora nodorum НУР - E 097* 165595 17455

(88.2) (62.5) (48.7)

CLA - - lire 2.30** 2.93**

(613) (59.9) (59.7)

БУЕ - - 0 0 0

Ustilago maydis HYP = - 0 0 0

CLA - - 041** 0.96** 1.1744

(71.9) (84.9) (87.9)

* Significativement différent au seuil de 5% ( test de Newman - Keuls)

** Significativement différent au seuil de 1% ( test de Newman - Keuls)

Tableau 1. — Effets des extraits lichéniques d'Evernia prunastri (EVE), Hypogymnia physodes (НУР)

et de Cladonia portentosa (CLA) sur la croissance mycelienne de 8 espèces fongiques pathogènes.

Source : ММНМ. Paris

ACTIVITÉS ANTIFONGIQUES D'EXTRAITS LICHENIQUES 171

BIBLIOGRAPHIE

BURZLAFF D.F., 1950 — The effect of extracts from the lichen Parmelia molliuscula upon seed

germination and upon the growth rate of the fungi. Journal of the Colorado- Wyoming

Academy of science 4 : 56.

GONZALEZ A.G., RODRIGUES PEREZ E.M.A. & BARRERAJ B., 1991 — Biologically active

coumponds from the lichen Ramalina hierrensis. Planta medica 57 : 1363

HATSCHER L, VEIT M., PROKSCH P, LANGE O.L. & ZELLNER H., 1991 — Feeding

deterrency and growth retarding activity of lichen substances again Spodoptera littoralis.

Planta medica 57 : 1354.

HENNINGSSON B. & LUNDSTROM H., 1970 — The influence of lichens, lichen extracts and

usnic acid on wood destroying fungi. Material and organismen 5 : 19-31.

LAWREY J.D., ROSMAN A.Y. & LOWEN R., 1994 — Inhibition of selected hypocrealean fungi by

lichen secondary metabolites. Mycologia 86 : 502-506.

ROWE J.G., SAEZ МЛ. & GARCIA M.D., 1989 — Contribution à l'étude de l'activité antibacté-

теппе de quelques lichens du sud de l'Espagne. Annales pharmaceutiques françaises 47 :

89-94.

SLANSKY F, 1979 — Effect of the lichen chemicals atranorin and vulpinic acid upon feeding and

growth of larvae of the yellow-striped armyworm Spodoptera ornithogalli. Environmental

entomology 8 : 865-868.

VARTIA К.О. 1950 — Antiboitics in lichens. IT. Annales medicinae expermerimentalis et biologiae

fennicae 28 : 7-19.

VARTIA K.O., 1973 — Antibiotics in lichens. In : Ahmadjian V. & Hale М.Е. (Ed.), The Lichens,

Academic Press, New-York, рр. 547-561.

Source : MNHN, Paris.

Commission paritaire 16-1-1986 - № 58611 - Dépôt légal 3° trimestre 1997 - Imprimerie F. Paillart

_ Sortie des presses le 31 juillet 1997 - Imprimé en France

Éditeur : A.D.A.C. (Association des Amis des Cryptogames)

Président : D. Lamy ; Secrétaire : В. Dennetiére

Trésorier : M™ E. Bury ; Directeur de la publication : H. Causse

BIBL.OU]

MUSEU!

PARI

Source : MNHN. Paris

Société Française de Systématique «n

La Société Française de Systématique réunit les systématiciens ou les personnes

intéressées par la Systématique et les informe en publiant un Bulletin. Elle convie ses

membres à des colloques annuels transdisciplinaires, au cours desquels les systématiciens

et d'autres scientifiques peuvent s'exprimer et débattre.

Cotisation annuelle: 100F

Demande d'adhésion à adresser au:

Secrétariat de la Société Française de Systématique, 45 rue Buffon, F-75005 Paris.

CCP 7-367-80 D PARIS

La Société édite aussi la série Biosystema.

Prix TTC du Biosystema (France, Etranger): 150 FF, membre SFS : 100 FF.

Biosystema | - Introduction à la systématique zoologique - (Concepts. Principes, Méthodes) par

L. Matile, P. Tassy & D. Goujet. 1987.

Biosystema 2 - Systématique Cladistique - Quelques textes fondamentaux. Glossaire. Traduction

et adaptation de D. Goujet, L. Matile, P. Janvier & J.P. Hugot. 1988

Biosystema 3 - La systématique et l'évolution de Lamarck aux théoriciens modernes. par

S. Lovirup. 1988.

Biosystema 4 - L'analyse cladistique: problème et solutions heuristiques informatisées, par

M. d'Udekem-Gevers. 1990.

Biosystema 5 - Les introuvables de J.B. Lamarck- Discours d'ouverture du cours de zoologie et

articles du Dictionnaire d'Histoire naturelle. Edition préparée par D. Goujet. 1990.

Biosystema 6 - Systématique et Ecologie, par В. Barbault, Cl. Combes, Е. Renaud, М. Le Brun

& A. Dubois. Edition coordonnée par J.P. Hugot. 1991.

Biosystema 7 - Systématique et Biogéographie Historique. Textes historiques et

méthodologiques. Traduction et adaptation de P. Janvier, L. Matile & Th. Bourgoin.

1991.

Biosystema 8 - Systématique et Société. Edition coordonnée par С. Pasteur. 1993

Biosystema 9 - Les Monocotylédones, par J. Mathez. 1993.

Biosystema 10 - Systématique botanique : problèmes actuels. Edition coordonnée par О. Poncy.

1993.

Biosystema 11 - Systématique et Phylogénie: modèles d'évolution biologique. Edition

coordonnée par P. Tassy et H. Lelièvre. 1994.

Biosystema 12 - Phylsyst: logiciel de reconstruction phylogénétique, par |. Bichindaritz,

S. Potter & B. Sigwalt +. 1994.

Biosystema 13 - Systématique et Biodiversité. Edition coordonnée par Th. Bourgoin. 1995.

Biosystema 14 - Systématique et Informatique. Edition coordonnée par J. Lebbe, en préparation.

Le Conseil de la SFS. ХП 1995

Source : ММНМ. Paris

SOMMAIRE

D. \ТРЕ. $. KOSCHINSKY, P. CLOWEZ, J. C. MUNCH., B. BOTTON &

Е BUSCOT — Recent advances in ecology and systematics of morels. .

S. BREHERET, T. TALOU, S. RAPIOR é J. M. BESSIERE — Composés vola-

tils : un outil pour la chimiotaxonomie des basidiomycetes. ............

T. RICHARD, J. GUILLOT & B. BOTTON — Immunological properties of

ms lectin isolated from the БЭХ гулд Me bi х ЭРЭЭ

lignosus .

О. REISINGER & S. BALÀZSY — Propagules fongiques de l'air et di

de la pollution industrielle..…....:............: BOE E REIN б

C. STEINBERG, V. EDEL & С. ALABOUVETTE — Rôle du mode de formula-

tion sur la survie et l'activité antagoniste d'agents de lutte biologique

contre les fusarioses de plantes cultivées ..............-,.......,....

P. REY, М. BENHAMOU, J. HOCKENHULL & У TIRILLY — Intérêt du

Pythium oligandrum dans une perspective de protection intégrée contre

Fusarium охузро! £ sp. is-lycopersici en cultures hors-sol de

P. GUIRAUD, J. L. BENOIT-GUYOD,

Action fongistatique et fongicide de six biocides utilisés dans le traite-

ment de bois уун contaminés .

E BABA-MOUSSA, К. KOUMAGLO, A. AYEDOUN, К. AKPAGANA,

M. MOUDACHIROU 4: P. BOUCHET — Activité antifongique

d'huiles essentielles extraites au Bénin et au Togo ........ ЕЕ ee:

P. HALAMA & C. van HALUWYN — Activités antifongiques d'extraits liché-

niques... ен ее i tee А e enean ы, A

Cryptogamie, Mycol. 1997, 18 (2) : 95-172

115

135

149:

155