SOMMAIRE

PONS F. et GIANINAZZI-PEARSON V. — Influence du phosphore, du

potassium, de l'azote et du pH sur le comportement in vitro de champi-

gnons endomycorhizogènes à vésicules et arbuscules.............. 87

MORENO G. y BARRASA J.M. — Agrocybe setulosa sp. nov. en España

fee lbiiacene Agaricales) TS 101

NAJIM L., CLAUZET J.P. et KADIRI M. — Contribution à l'étude de la

flore fongique microscopique du Maroc. I. — Le genre Gonatobotrys :

quelques aspects morphologiques et physiologiques . ............. 109

ROQUEBERT M.F. et MINTER D. — Modifications structurales de la

Lunes environnement = en nes dre NUL dS 121

SUBRAMANIAN C.V. and BHAT D.J. — Developmental morie

оҒАзсошусесев. ХІ. Месітіп Еега.................... 135

ANGELI-PAPA J. — La culture d'un champignon par les fourmis Attines.

Mise en évidence de phénomènes d’antibiose dans le nid. .......... 147

Source : MNHN. Paris

CRYPTOGAMIE

MYCOLOGIE

ТОМЕ 5 Fascicule 2 1984

Ancienne Revue de Mycologie. Dirigée par Roger HEIM

DIRECTEUR DE LA PUBLICATION: Madame J. NICOT

ADMINISTRATION : Mme LOCQUIN-LINARD M. et M. ZAN TTAKIS Ch

SECRÉTAIRE DE RÉDACTION : Mme M.C. BOISSELIER. ÉDITEUR : A.D.A.C.

Bibliothèque Centrale Muséum

3300

roe HINEIN BARS

CRYPTOGAMIE MYCOLOGIE

CONTENTS

(Tome 5, Fascicule 2, 1984)

PONS F. et GIANINAZZLPEARSON V. - Influence of phosphorus,

potassium, nitrogen and pH on vesicular-arbuscular endomycorrhizal

A е 87

MORENO G. y BARRASA J.M. — Agrocybe setulosa sp. nov. in Spain.

БЫНАН T 20 101

NAJIM L., CLAUZET J.P. et KADIRI M. — Contribution to a study of

microscopical fungal flora of Morocco. 1. The genus Gonatobotrys :

some morphological and physiological aspects. . ................ 109

ROQUEBERT M.F. et MINTER D. — Structural changes of the wall... . . 121

SUBRAMANIAN C.V. and BHAT D.J. — Developmental morphology

of Ascomyceten меа 22... .. 135

ANGELI-PAPA J. — Fungus-culturing by Attine ants (Attini). Antibiotic

contral ot the microflora of the nest, onas se sO 99909908 919053 147

Source : MNHN. Paris

INFLUENCE DU PHOSPHORE, DU POTASSIUM, DE L'AZOTE

ET DU PH SUR LE COMPORTEMENT IN VITRO

DE CHAMPIGNONS ENDOMYCORHIZOGENES

A VÉSICULES ET ARBUSCULES

par Frangoise PONS et Vivienne GIANINAZZI-PEARSON*

RESUME. — Le comportement des champignons endomycorhizogénes à vésicules et arbus-

cules Glomus mosseae, G. epigaeus et Gigaspora margarita, caractérisés par un bon pouvoir

germinatif des spores, n'est pas influencé in vitro de façon analogue par les modifications

du milieu, La concentration élevée en phosphore soit sous forme de KH2PO4 ou K HPO4

n'inhibe pas la germination des spores de G. margarita, alors que les fortes concentrations

diminuent la germination des spores de G. epigaeus comme la croissance de ses hyphes.

Cependant, chez G. margarita, les fortes concentrations en K; HPO4 provoquent des pertur-

bations dans la fagon dont les spores germent (augmentation du nombre de tubes germina-

tifs) et inhibent aussi la croissance des hyphes de ce champignon. De plus l'addition de

phosphore au milieu augmente la vitesse dans les hyphes des courants cytoplasmiques vers

les spores. La germination des spores et la croissance des hyphes de G. mosseae diminuent

en présence de KH3PO4, indépendamment de la concentration de ce sel, tandis que

K2HPO4 n'a pas d'effet négatif méme à des concentrations élevées. L'azote n'a un effet

inhibiteur qu'à fortes doses sous la forme de NH4NO3 uniquement chez G. epigaeus alors

qu'il ne perturbe pas la germination et la croissance des hyphes lorsqu'il est apporté sous la

forme de KNO3 ou NH4Cl. Les pH acides inhibent la germination des spores ainsi que la

croissance des hyphes de G. mosseae tandis que G. epigaeus et G. margarita ne montrent

pas une sensibilité semblable à des variations du pH du milieu.

SUMMARY. — The vesicular-arbuscular endomycorchizal fungi Glomus mosseae, G. epi-

gaeus and Gigaspora margarita are not influenced in the same way by modifications in the

agar medium used to germinate their spores. High phosphorus concentrations, in the form of

KH2PO4 or K2HPOg, do not inhibit spore germination by G. margarita whilst they decrease

both spore germination and hyphal growth of G. epigaeus. High amounts of KaHPO; do,

however, cause alterations in the pattern of spore germination of G. margarita (increased

number of germ tubes), and also inhibit hyphal growth by this fungus; furthermore, cyto-

plasmic streaming towards the spore increases in hyphae with phosphate additions to the

agar medium. All concentrations of KH¿PO4 used inhibit both spore germination and

hyphal growth of G. mosseae whilst KaHPOa has no negative effect even at high concen-

trations. High concentrations of nitrogen in the form of NH4NOs, but not KNO3 or NHaCl,

have a negative effect only on G. epigaeus. Low pHs inhibit spore germination and hyphal

growth of G. mosseae, whilst G. epigaeus and G. margarita do not show a similar sensi-

tivity to variations in pH.

Laboratoire de Phytoparasitologie, Station d'Amélioration des Plantes, LN.R. A.

B. V. 1540, 21034 Dijon Cedex.

CRYPTOGAMIE, MYCOLOGIE (Cryptog., Mycol.) TOME 5 (1984).

Source : MNHN, Paris

88 F, PONS et V. GIANINAZZI-PEARSON

MOTS CLES : P, K, N, pH, champignons endomycorhizogénes, spores.

INTRODUCTION

Les champignons endomycorhizogénes à vésicules et arbuscules (VA) sont

capables de réaliser la symbiose avec les racines d'un nombre considérable

d'espèces végétales, en particulier les plantes agricoles, Cette association se révèle

trés efficace quant à la croissance des végétaux dans les sols relativement pauvres

en éléments minéraux (MOSSE, 1972), mais son effet diminue si on compense

la mauvaise fertilité du sol par un apport d'engrais phosphatés (SANDERS &

TINKER, 1973: ASIMI & al, 1979). De nombreux travaux ont pour objet

la connaissance de la plante mycorhizée considérée dans son ensemble (MOSSE,

1978; voir GIANINAZZI & al., 1982). I] serait pourtant intéressant de considé-

rer le champignon seul dans la mesure où il est le point de départ de l'infection

dans le sol. On ne sait pas encore réaliser de cultures pures de champignons

endomycorhizogènes VA, au delà de la germination de leurs spores de conserva-

tion. Toutefois, les quelques observations faites à ce propos dans le cas de di-

verses espèces à spores germant sur différents milieux synthétiques ou contenant

des extraits de sol, indiquent que, bien qu'appartenant à une famille trés res-

treinte, ces champignons ont des exigences trés précises quant aux pHs, tempé-

rature et concentrations de phosphate du milieu (GREEN, GRAHAM &

SCHENK, 1976; DANIELS & GRAHAM, 1976; SIQUEIRA, HUBBELL &

SCHENK, 1982; HEPPER, 1983). Afin de mieux connaitre les conditions écolo-

giques qui influenceraient le comportement des champignons endomycorhizo-

génes VA dans le sol, nous avons étudié l'effet du pH et de divers sels de phos-

phate, de potassium et d'azote sur la capacité de germination des spores et la

croissance mycélienne de trois espèces de ces champignons.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Les cultures de chaque espèce de champignon sont entretenues en utilisant

comme plante-hôte l'oignon (Allium cepa L. var Hyper). Ces plantes sont myco-

rhizées dans du sol prélevé sur le Domaine d'Époisses de l'INRA de Dijon, ayant

un pH de 7.0 à 7.8 et préalablement irradié aux rayons y (1 Mrad). Les spores

de conservation des champignons endomycorhizogènes VA sont récoltées à

l'intérieur de sporocarpes attachés aux racines (Glomus mosseae (Nicol. et Gerd.)

Gerdemann et Trappe), à la surface de la terre (G. epigaeus, Daniels et Trappe),

au niveau du mycélium attaché aux racines (Acaulospora laevis, Gerdemann et

Trappe), et dans la terre entourant les racines (Gigaspora margarita, Becker

et Hall), (GERDEMANN & TRAPPE, 1974; BECKER & HALL, 1976; DANIELS

& TRAPPE, 1979). Les spores sont utilisées immédiatement sauf G. mosseae

pour lequel il est nécessaire de laisser les sporocarpes à 8°C pendant quatre

semaines à l'obscurité, afin d'obtenir un bon taux de germination des spores.

Source : MNHN, Paris.

CHAMPIGNONS V.A. IN VITRO 89

Les spores sont désinfectées dans le mélange décrit par MOSSE (1959)

(pour G. margarita nous avons utilisé 400 mg de sulfate de streptomycine/l)

pendant 15 minutes puis rincées soigneusement à l'eau distillée stérile.

Les spores sont ensuite repiquées sur eau gélosée 0,5 % (pH 6,8) (Difco Bacto

agar) seule ou additionnée de différents sels. Dans les expériences sur l'effet

du phosphore et du potassium nous avons utilisé des milieux contenant 25, 50,

100 ou 200 ppm de phosphore sous forme de KH2PO4 (pH 5,8 4 5,9) et K;-

HPO, 3H20 (pH 7,8 à 7,9). L'influence du pH est étudiée sur des milieux

contenant 50 ppm de phosphore à pH 5,8, 6,2, 6,8, 7,5 ou 7,8 obtenus par des

mélanges appropriés de KH:PO4 et K:HPO4 3H20. Pour les expériences sur

l'azote nous avons préparé des milieux avec 25, 50 et 100 ppm d'azote sous

forme KNO; , NH4NO; ou NH, Cl.

Les spores sont mises à germer à l’obscurité dans une étuve a 24°C, et pour

G. epigaeus aussi à 20°C. La germination des spores a été suivie in vitro à l'aide

du microscope optique et le comptage effectué périodiquement sur une popu-

lation de spores jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de spores qui germent. Les mesures

de la distance maximale atteinte par les hyphes, sont déterminées à l'aide d'un

micrométre oculaire. Les courants cytoplasmiques ont été aussi estimés à l’aide

d'un micromètre oculaire en mesurant la vitesse du déplacement du contenu

granulaire des hyphes (environ à mi-distance entre l'apex et la spore) sur une

longueur donnée. Les résultats ont été analysés statistiquement par la méthode

de calcul de x? ou le test «t» de Student.

RÉSULTATS

1. — POUVOIR GERMINATIF DES SPORES,

CULTIVÉES SUR EAU GÉLOSÉE

Les spores récoltées dans les conditions décrites ci-dessus sont toutes capables

de germer sur eau gélosée. Quelques caractéristiques des lots de spores étudiés

dans nos expériences sont indiquées dans le tableau 1.

Tableau 1. — Diamètre des spores et section des hyphes au début de la germination des

champignons endomycorhizogènes VA étudiés.

Table 1. — Spore and hyphae diameters of VA fungi at the beginning of spore germination.

Diamétre des spores Section des hyphes

G. mosseae 160 + 32 um 6 km

G. epigaeus 108 t орт 4-8 im

G. margarita 485 + 35 im 8-12 рт

A. laevis 221 + 21 um 6 um.

Nombre de répétitions : 30 à 40.

Source : MNHN, Paris

100 pm 100 um

Planche 1 — Premiers stades de germination des spores de champignons endomycorhizo-

genes VA sur eau gélosée. a. G. mosseae : tube de germination en forme d'ancre émer-

eant de l'hyphe d'attachement (flèche). b. G. epigaeus : forme irrégulière des premières

yphes (flèches) se développant à partir des spores. c. A. laevis : hyphes multiples émer-

geant de la paroi d'une spore. d. G, margarita : en haut, hyphes émergeant de la paroi

sporale (fléche) a cté de I’hyphe d’attachement; en bas, hyphe formant des méandres

sur Pagar.

Source : MNHN. Paris

CHAMPIGNONS V. A. IN VITRO 91

100

2, 80

о Ф

5Е 60

52 40

$252

2 4 6 8 10 12 14 16 18

Jours

Figure 1. — Germination en fonction du temps, sur eau gélosée, des spores de (-@) G.

mosseae, (-W.) G. epigaeus, (-&) G. margarita, (-v-) A. laevis.

Figure 1. — Germination with time on water agar of spores of (-€) G. mosseae, (-w) G.

epigaeus, (A) G. margarita and (-y-) A. laevis.

La germination des spores de G. mosseae, G. margarita et A. laevis débute à

partir de 2-3 jours à 24" C, tandis que les spores de G. epigaeus ne germent qu'à

partir de 6-7 jours (Fig. 1). Dans la plupart de nos expériences, les spores de

A. laevis étaient caractérisées par un taux de germination plus faible que celles

de trois autres espèces et par conséquent nous n'avons pas étudié l'influence des

modifications du milieu sur le comportement de ce champignon.

L'aspect des premiers stades de la germination sur eau gélosée de ces quatre

espèces de champignons est très varié (Planche 1). Les tubes germinatifs de С.

mosseae et G. epigaeus émergent de l'hyphe d'attachement (Planche 1a) qui les

reliait au sporocarpe, tandis qu’ils émergent directement de la paroi sporale

chez G. margarita et À. laevis. Les hyphes croissant sur le milieu ont également

une forme particulière; pendant les trois premiers jours de la germination chez

G. mosseae, les hyphes sont droites et se ramifient vers l'arrière en figurant une

sorte «d'ancre»; chez G. epigaeus, les premières hyphes sont très irrégulières et

présentent une succession de renflement et d'amincissements. Les hyphes

d'A. laevis sont droites, celles de G. margarita poussent en formant des méandres

à la surface de l'agar et s'enfoncent trés vite dans celui-ci. Il est facile de dis-

Plate 1 — Early stages in spore germination by VA endomycorrhizal fungi on water agar.

а. С. mosseae : anchorshaped germ tube emerging from hyphal attachment. b. G.

epigaeus : irregularly shaped hyphae (arrows) developing from spores. c. A. laevis :

numerous hyphae emerging from the wall of a single spore. d. G. margarita : upper,

hyphae emerging from spore wall (arrow) adjacent to the hyphal attachment; lower,

wavy hyphal growth in agar.

Source : MNHN. Paris

92 F.PONS et V. GIANINAZZI-PEARSON

tinguer ces espèces uniquement par la forme des hyphes au début de la germi-

nation (Planche 1).

De plus, après quatre à six jours ces différentes espèces de champignon

peuvent produire des vésicules sur de courtes ramifications du mycélium. Elles

sont soit sphériques et individuelles (G. mosseae, G. epigaeus, et A. laevis),

soit sphériques et hérissées et groupées par 12 A 20 environ (G. margarita).

Sur eau gélosée le développement ultérieur des hyphes est toujours plus impor-

tant chez G. margarita que chez G. mosseae et G. epigaeus (Fig. 3, 5).

| Bid

o 25 50 100 200

p.p.m. de phosphore (KH;PO,)

Pourcentage des spores germées

7721

ҚЕ

RES

NES

КЕ

p.p.m. de phosphore (K;HP0:,3H,0)

Figure 2. — Germination des spores de (@) G. mosseae, (&) G. epigaeus et (D) G. margarita

en présence des concentrations croissantes en phosphore sous forme de (a) KH3PO4 ou

(b) Ka HPO4 3H20.

Figure 2. — Germination of spores of (2) G. mosseae, (&) G. epigaeus and (C) G. margarita

ONU UNE c S Ld obe oL Sd REO Ud

(b) K3HPO4 3H30.

Source : MNHN, Paris

Longueur des hyphes (mm)

O 25 50 100 200

p.p.m. de phosphore (KH,PO,)

(b)

o 25 50 100 200

p.p.m. de phosphore (K;HP0,3H50)

Figure 3. — Croissance des hyphes issues de spores de (2) G. mosseae, (2) С. epigaeus et (2)

G. margarita placées sur des milieux à concentration croissante en phosphore sous

forme de (a) KH2PO4 ou (b) Ka HPO4 3H50.

Figure 3. — Growth of hyphae from spores of (Z) G. mosseae, (G5) G. epigaeus and (0)

G. margarita in presence of increasing concentrations of phosphorus in the form of (a)

KH2PÓg and (b) K2HPO4 3H20.

Source : MNHN, Paris

94 F.PONS et V. GIANINAZZI-PEARSON

2. — EFFET DES MODIFICATIONS DU MILIEU SUR.

LA GERMINATION DES SPORES ET LE DÉVELOPPEMENT DES HYPHES

— Concentration en phosphore et potassium

Nous avons observé que les spores de G. mosseae germent toujours mieux sur les

milieux contenant du K} HPO; que sur ceux contenant du KH;PO, (Fig. 2).

Cette différence de comportement se manifeste dès les premiers stades de la

germination (3 jours). En ce qui concerne G. epigaeus, les deux sels de phos-

phore (mono- et dipotassique) ont une influence semblable sur la germination

des spores : les fortes concentrations (200 ppm en phosphore) des deux sels

ont un effet significativement inhibiteur (P < 0,05).

Si nous considérons la croissance des hyphes de G. mosseae (Fig. 3), elle est

comme la germination des spores beaucoup plus faible sur les milieux contenant

du KH2PO4 que sur ceux additionnés de K2HPO4; il en est de méme pour la

croissance des hyphes de G. epigaeus, contrairement à la germination de ses

spores. En présence de doses croissantes de K:HPO4, le développement des

hyphes de G. mosseae est amélioré, tandis que les hyphes de G. epigaeus voient

leur croissance nettement inhibée par les fortes concentrations en phosphore

(100 et 200 ppm).

Tableau 2 : Nombre moyen de tubes germinatifs par spore de G. margarita sur des milieux

contenant des concentrations différentes en phosphore sous forme de KH PO4 ou de

K3HPO; 3H30.

Table 2. — Average number of germ tubes produced per spore by G. margarita on agar

media containing different concentrations of phosphorus as KHaPO4 or К;НРОд 3Н;0.

Témoin

KHaPO4 Kz HPO4 (eau gélosée)

ppm de phosphore : 25 50 100 200 25 50 100 200

Expérience I : а 45 1,3

Expérience II : 1% 19 TE 25 18 O TAN 3 13

* Différence significative avec le témoin, P< 0,05.

Nombre de répétition : 12.

Dans le cas particulier de G. margarita, le comptage du taux de germination

de spores donne les mémes résultats sur les milieux contenant KH; PO, ou

K,HPO, (Fig. 2). Cependant l'observation au microscope photonique révèle

des comportements distincts de germination selon le type de sel phosphaté

dans le milieu. A 100 ppm de phosphore sous forme de K¿HPO4, le nombre

de tubes de germination augmente significativement (Tableau 2), alors qu'à

200 ppm la croissance de ces hyphes est minimale (Fig. 3); les hyphes se cloi-

sonnent et meurent rapidement. Cet effet pourrait étre dü aux concentrations

plus élevées en potassium dans le milieu (505 ppm pour K3 HPO; par rapport

à 252 ppm pour KH; PO, ).

Source : MNHN, Paris

CHAMPIGNONS V.A. IN VITRO 95

— Concentration en azote

Chez G. margarita, l'apport d'azote aux concentrations 25, 50, 100 ppm

sous forme de KNOs, NH4NOs et NH4Cl ne modifie pas significativement le

taux de germination par rapport au témoin (eau gélosée) et ne s’accompagne

pas de perturbations du nombre de tubes germinatifs ni de leur aspect. Par

contre chez G. epigaeus, le taux de germination diminue légérement (P « 0,05)

avec l'augmentation de la concentration en azote, mais uniquement quand ce

dernier est présent sous forme combinée de nitrate d'ammonium (Fig. 4).

100,

Figure 4. — Germination des spores de a B9 R

G. epigaeus en présence des concen- 59 H Қ

trations croissantes en azote sous 22 60 N

forme de (2) KNO3, (2) NH4NO3, ot | Қ

(B) NH4 CI. $9 ۶

Т Py m c A

Figure 4. — Spore germination of G. $9 М

epigaeus in presence of increasing 555 М

concentrations of nitrogen in the aa 20 RÀ

$5 М

form of (2) KNOs, (Z) NH4NOs and | МІ

(0) NH4Cl. M

0 25 5О 100

p.p.m. d'azote

— pH

Les résultats obtenus sur l'influence du pH sur les différents champignons

VA sont présentés dans la Figure 5. Ils mettent immédiatement en évidence la

grande sensibilité de G. mosseae au pH du milieu : la germination et la croissance

des hyphes sont fortement inhibées à pH 5,8 (P < 0,01) alors qu'à pH 7,8,

elles ne sont pas significativement différentes du témoin (pH 6,8). Cela explique

les observations faites précédemment sur l'influence des deux sels phosphatés,

les milieux contenant du KH3PO; ont en effet un pH de 5,8 à 5,9 alors que

ceux contenant du K2HPO4 ont un pH de 7,8 à 7,9. Chez С. epigaeus, cet

effet est moins net; il semble que les spores puissent germer et atteindre un

pourcentage non significativement différent du témoin tant à pH 5,8 qu'à pH

7,5 et 7,8, bien que la germination diminue toujours à pH 6,2 et 6,8. Les raisons

de cette diminution restent à déterminer. Cependant la croissance des hyphes

de G. epigaeus est sensible au pH acide et elle est nettement meilleure à des pH

neutres ou alcalins. Le cas de G. margarita doit étre nuancé : en effet dans la

Figure 5, on ne décéle pas une influence significative du pH sur la germination

des spores et la croissance des hyphes. Toutefois, si nous prenons en considé-

ration le nombre de tubes germinatifs par spore ainsi que le nombre de ces

tubes qui sont viables (c'est-à-dire non segmentés; Fig. 6), nous remarquons

Source : MNHN, Paris

Pourcentage des

Spores germées

0222

ЕСА

ГГ

O СЕСЕ

Longueur des hyphes (mm)

Figure 5. — Germination des spores (a) et croissance des hyphes (b) de (Z) G. mosseae,

(8) G. epigaeus et (C) G. margarita sur des milieux à pH différents.

Figure 5. — Spore germination (a) and hyphal growth (b) of (Z) G. mosseae, (4) G. epigaeus

апа (0) С. margarita on agar medium at different pHs.

Source : MNHN, Paris

CHAMPIGNONS V.A. IN VITRO 97

sg! 10

ese Ta ^ 2

BO .

ERIT. ne =

„oo oS 3

$35 6 86

а= ЖЕ

285 38

AE Suas

98.

E S

242 40 ese

814 T58

Se =

au E

ooc 2 Sa

PES E

SEE

Pas

5,862 68 7578

Figure 6. — Influence du pH du milieu sur (A) la germination des spores, (-e-) le nombre

de tubes de germination formés par chaque spore et (-™) le pourcentage de tubes viables

de germination chez G. margarita.

Figure 6. — Influence of pH on (-&) spore germination, (-®) nomber of germ tubes formed

per spore and (-™) percentage of viable germ tubes of G. margarita.

qu'en général plus le nombre moyen de tubes germinatifs par spore est élevé,

plus le pourcentage de tubes viables diminue; cet effet est maximal à pH 7,5.

De plus les spores à germination multiple sont aussi celles pour lesquelles la

croissance des hyphes est minimale sur le milieu gélosé.

Tableau 3. — Vitesse des courants cytoplasmiques dans les hyphes de G. margarita à diffé

rents pH (Um/s).

Table 3. — Effect of pH on cytoplasmic streaming (m/s) in hyphae of G, margarita.

Témoin! 582. 620 68 7,5% 70

(pH 6,8)

vers ’apex 3,50 3,34 — 3,0 3487 334 3,04%

vers la spore 3,05 312% 296% 390% 9301Ж 418%

* Différence significative avec le témoin sans phosphore, P <0,05.

Nombre de répétitions pour les témoins : 19 et les traitements entre 10 et 35.

1 : Eau gélosée, 2 : 50 ppm de phosphore.

Nous avons mesuré d'autre part la vitesse des courants cytoplasmiques dans

les hyphes de G. margarita en fonction du pH du milieu (Tableau 3). Ces cou-

rants sont bidirectionnels, le courant revenant vers la spore est en général plus

rapide. Le pH n’a pas d’effet sur ces courants cytoplasmiques, mais la présence

Source : MNHN. Paris

98 F, PONS et V. GIANINAZZI-PEARSON

de 50 ppm de phosphore utilisés pour tamponner le milieu gélosé augmente

sensiblement (P < 0,05) la vitesse des courants cytoplasmiques vers la spore,

indépendamment du pH du milieu.

DISCUSSION

Dans le présent travail, nous avons pu mettre en évidence gráce au taux élevé

de germination des spores de 3 des 4 champignons endomycorhizogènes VA

étudiés, l'influence sur leur comportement de quelques facteurs du sol transposés

ici en conditions aseptiques. Comme on pouvait s'y attendre, les champignons

endomycorhizogénes VA montrent une variabilité non seulement au niveau du

taux de germination de leurs spores, de la durée nécessaire pour que débute

cette germination, et du développement général des hyphes, mais aussi au niveau

de la sensibilité de ces processus vis-à-vis des différents facteurs du milieu tels

que les éléments nutritifs (N, P, K) et le pH. Au niveau de la germination des

spores, on observe que la concentration en phosphore du milieu n’a aucune

influence sur le taux de germination de G. margarita. Par contre, la germination

des spores est inhibée à des fortes concentrations (200 ppm) chez G. epigaeus;

d'après les études de DANIELS & TRAPPE (1980) cet effet sur G. epigaeus

est probablement atténué dans le sol. En ce qui concerne G. mosseae, on ne

constate pas d'effet inhibiteur à toutes les concentrations de phosphore sous

forme de K:H PO. Ces observations concordent avec celles faites par HEPPER

(1983) qui a signalé que la germination des spores de C. mosseae n'est diminuée

qu'à partir de 930 ppm de phosphore en solution dans le milieu. Toutefois,

l'addition de phosphate soluble au milieu n'a aucun effet sur la germination de

G. mosseae seulement si le pH est maintenu au-dessus de 6,8 et l'effet inhibiteur

observé du KH; PO; doit étre attribué à l'acidification du milieu par l'addition

de ce sel. En effet, la germination des spores de G. mosseae est trés faible en

milieu acide et optimale en milieu neutre ou alcalin; cette sensibilité au milieu

acide des spores de G. mosseae avait été déjà soulignée par GREEN & al. (1976).

Quant à la croissance des hyphes, nous constatons que celle-ci est inhibée

comme pour la germination à des fortes concentrations de phosphore pour

G. epigaeus, et que pour G. mosseae l'acidification du milieu en présence de

KH; PO, inhibe non seulement la germination des spores mais aussi la croissance

des hyphes. Dans le cas de G. margarita, bien qu'on ne constate pas de modi-

fications au niveau de la germination des spores, le nombre de tubes germi-

natifs formés ainsi que leur croissance sont modifiés en présence de concen-

trations élevées de K2HPO4. L'influence particulière de ce sel sur le comporte-

ment de G. margarita n'est pas liée au pH du milieu car pour des concentrations

identiques en phosphore la croissance des hyphes à pH 7,8 est comparable à

celle à pH 5,8; par contre ces observations suggèrent pour la première fois la

possibilité que certains champignons VA soient sensibles aux fortes concentra-

tions en ions potassiques.

Source : MNHN. Paris

CHAMPIGNONS V. A, IN VITRO 99

Ces travaux font aussi ressortir que l'apport de phosphore à raison de 50 ppm

dans le milieu, qui ne modifie pas sensiblement la germination des spores et la

croissance des hyphes, induit une augmentation importante (jusqu'à 37 %) de

la vitesse en direction des spores des courants cytoplasmiques des hyphes de G.

margarita. La signification physiologique de ce phénoméne dans le transport

du phosphore par les hyphes est à l'étude.

Ainsi non seulement le contenu en phosphore mais aussi le pH du milieu

est un facteur important pour des champignons VA. Comme pour G. mosseae,

les hyphes du С. epigaeus poussent mieux à pH élevé tandis que chez G, marga.

rita l'augmentation du pH du milieu provoque une perturbation des processes

de germination, en augmentant le nombre d'hyphes produites par chaque spore

et en provoquant une mort plus rapide de ceux-ci. KOSKE (1982) suggère

une possible relation entre la production élevée d'hyphes de germination de

G. margarita et une plus forte probabilité d'infection de racines in vitro, Toute-

fois dans nos expériences récentes sur le trèfle in vitro (PONS & al. résultats

non publiés) nous avons remarqué que l'infection rapide et massive des racines

est possible à partir des spores n'ayant qu'une ou deux hyphes de germination.

Avec l'addition de différentes formes d'azote au milieu, seule la germination

de G. margarita n'est pas modifiée alors que celle de G. epigaeus est diminuée

lorsque l'azote est apporté sous forme de NH4 NO; à concentration de 100 ppm.

L'insensibilité de la germination à des faibles taux de NH4NO; avait été déjà

soulignée par DANIELS & TRAPPE (1980) pour G. epigaeus et par SIQUEIRA

& al. (1982) pour G. margarita.

En conclusion, cette étude réalisée sur le comportement des spores de cham-

pignons endomycorhizogènes VA démontre que les effets du milieu sont tout

aussi importants sur la croissance des hyphes que sur la capacité des spores

à germer. Cela montre la nécessité de prendre en considération ces deux aspects

dans les études sur l'influence des facteurs du milieu sur le comportement des

champignons endomycorhizogènes VA. De plus l'illustration par cette étude de

la variabilité qu'on peut attendre de ces champignons, souligne davantage la

nécessité de bien connaître l'influence des facteurs physico-chimiques du sol

sur des phases successives du cycle de ces micro-organismes pour en assurer un

meilleur contrôle dans la pratique culturale.

BIBLIOGRAPHIE

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Source : MNHN. Paris

AGROCYBE SETULOSA SP. NOV. EN ESPANA

(BOLBITIACEAE, AGARICALES)

por G. MORENO & J.M. BARRASA*

RESUME. — Nous proposons comme espéce nouvelle Agrocybe setulosa, récoltée sur pátu-

tages avec Sphagnum sp. (tourbiéres) de Canencia (Madrid). Nous comparons cette espèce

avec A. splendida Clg. et A. arvalis (Fr.) Sing.

SUMMARY. — A new species is proposed, Agrocybe setulosa, collected on meadow-land

with Sphagnum sp. (peat bog) from Canencia (Madrid). This species is compared with A.

splendida Clg. and A. arvalis (Fr.) Sing.

RESUMEN. — Se proponen Agrocybe setulosa, como una especie nueva para la ciencia,

recogida en pastizales con Sphagnum sp., (turberas) de Canencia (Madrid). Se compara con

A. splendida Clg y A. arvalis (Fr.) Sing.

MOTS CLES : Agaricale, Agrocybe, Espagne, systématique.

INTRODUCCION

El genero Agrocybe Fayod (1889) es incluido en la familia Bolbitiaceae Singer

(1948), que agrupa Agaricales con esporada ocracea y cuticula himeniforme,

familia que es admitida por diferentes micologos como MOSER (1980), BON

(1980) y WATLING & GREGORY (1981). Otros autores como KUHNER

(1978) no la admiten y la tratan como subfamilia o tribu dentro de la familia

Strophariaceae.

Para la definicion y limites del genero seguimos a BON (1980).

MATERIAL Y METODOS

El material estudiado dos colectas procede de pastizales humedos en contacto

con turberas (Sphagnum sp.) recogidas en la provincia de Madrid. El estudio se

ha realizado en agua y rojo congo amoniacal.

* Dpto Botanica, Universidad de Alcala de Henares, Madrid, España.

CRYPTOGAMIE, MYCOLOGIE (Cryptog., Mycol.) TOME 5 (1984).

Source : MNHN, Paris

102 G. MORENO y J.M. BARRASA

Las fotografias se han efectuado en un microscopio Nikon modelo Optiphot

con sistema incorporado de fotografia automatico.

El material se encuentra archivado en el herbario particular de los autores

H.GM-JB, actualmente depositado en el departamento de Botanica de la Uni-

versidad de Alcala de Henares, distribuimos isotypus y paratypus a diversos

centros cientificos mencionados mas adelante.

СИС

a / 5ym

cn.

1 dh d

10pm 5 5pm

Fig. 1. — Agrocybe setulosa Moreno & Barrasa. a : Pileocistidios; b : Pleurocistidios; c

Esporas; d : Basidio. (Holotypus).

Fig. 1. — Agrocybe setulosa Moreno & Barrasa. a : piléocystides; b : pleurocystides; c :

spores; 4: basides. (Holotype).

Source : MNHN. Paris

AGROCYBE SETULOSA 103

RESULTADOS

Agrocybe setulosa Moreno & Barrasa, sp. nov.

Fig. 1, a-d; Fig. 6-17.

Species distinguitur pilis longis, subfulvis parietibusque crassis praeditis.

Pileus — cuius diameter est 0,5-1,5 cm longus — e convexo in plano convexum

expansus in maturitate, in qua etiam color castaneus subruber in ochraceum

temperatiorem vertitur. Lamellae colore albo, cremae vel ochraceae, adnatae

vel subdecurrentes. Stipes 24 cm altus, 0,1-0,2 cm latus, cylindraceus, pallidiore

colore quam pileus erat, ochraceo subfulvo, leviter incrassatus ad b.

praebet rhizomorphos albos frequentes. Caro concolorata. Eius od

nondum innotuerunt.

asim, quae

or et sapor

Fig. 2 a 5. — Agrocybe arvalis (Fr.) Sing. Pileocistidios, esporas y cistidio faciál (material

enviado por el prof. Watling).

Fig. 2 à 5. — Agrocybe arvalis (Fr.) Sing. Piléocystides, spores et cystide faciale (matériel

envoyé par le Prof. Watling).

Source : MNHN, Paris.

Fig. 6 a 13. — Agrocybe setulosa Moreno & Barrasa. Pileocistidios (6 y 7, paratypus); Cuti-

cula himeniforme (8 y 9, paratypus); detalle base pileocistidios (9-10, paratypus); Caulo-

cistidios (11, 12 y 13, holotypus).

Fig. 6 à 13. — Agrocybe setulosa Moreno & Barrasa. Piléocystides (paratype : 6-7); cuticule

hyméniforme (paratype détail de la base des piléocystides (paratype : 9-10);

caulocystides (holotype : 11-13).

Source : MNHN. Paris

AGROCYBE SETULOSA 105

Sporae longae 13-15 m, latae 7-8 um, ellipticae, quarum porus germinativus,

medio in apice situs, diametrum praebet 1 m longum. Basidia tetrasporica, longa

3540, lata 10-13 um. Adsunt pleurocystidia frequentissima, ampullacea, apici-

bus subcapitatis praedita, fibulata, longa 50-80, lata 7-20 um, quorum apex

longus 6-15 um, hyalina tenuibusque parietibus. Cheilocystidia similia. Cuticula

hymeniformis, cellulis. claviformibus. praedita, quarum. diameter est longus

8-13 um. Cystidia pilei frequentissima singulariaque in modum pilorum longo-

rum tenuium et angustorum, longorum 80-300, latorum 8-15 um, flavescentium,

pariete duplici 1,5-2 um lato, Caulocystidia valde frequentia, quorum forma et

magnitudo similes sunt cystidiorum pilei,

Habitat : Inter Poaceae iuxta Sphagnum sp. (turbarium), Canentiae (in

provincia Matriti), leg. Laura Barrio, 28-IX-82, H.GMJB 2904 Holotypus.

Sombrero de 0,5-1,5 cm de diametro, al

| principio convexo para pasar en la

madurez a forma plana convexa, de color

marrón rojizo a ocráceo más claro en la

madurez. Láminas de color blanco-cremoso a ocráceas, adnatas a subdecurrentes,

Pie de 24 x 0,1-0,2 cm, cilindrico de color más claro que el sombrero, ocráceo

amarillento, débilmente ensanchadado en la base en donde presenta abundantes

rizomorfos blancos, Olor y sabor no estudiados.

Esporas de 13-15 x 7-8 (9) jm, elípticas con poro germinativo apical y

central, de aproximadamente 1 um de diámetro. Basidios tetraspóricos 35-40 x

10-13 um. Pleurocistidios presentes muy abundantes, lageniformes con ápice

subcapitado, fibulados, miden de 50-80 x 7-20 um, ápice de 10-15 um, hialinos

y de paredes finas. Cheilocistidios semejantes. Cuticula himeniforme con celulas

claviformes de 8-13 um de diámetro. Pileocistidios muy abundantes y caracte-

rísticos, en forma de largos pelos delgados y estrechos, de 80-300 x 8-15 um,

amarillentos, de doble pared x 1,5-2 um. Caulocistidios muy abundantes y seme-

jantes en forma y tamaño a los pileocistidios.

Hábitat : Entre Poaceae cerca de Sphagnum sp. (turbera), Canencia (Madrid)

30TVL32, leg. Laura Barrio, 28-1X-82, H.GM-JB 2904 Holotypus.

Sobre hierba, en pastizales altitudinales con Sphagnum sp., 1970 m, Laguna

de Pefialara (Madrid), 30TVL1921, leg. J.M. Barrasa, 9-X-82, H.GM-JB 2905

Paratypus. Isotypus en herbario Watling (Edinburgh) e Isoparatypus herbario

Bon (Saint Valery-sur-Somme).

Observaciónes : Especie caracterizada por sus pileo y caulocistidios (Fig. 6-7,

9-13) de forma diferente a los pleuro y cheilocistidios (Fig. 14-16) es priximo

a Agrocybe arvalis (Fr.) Sing., del que se diferencia por presentar éste último

pleurocistidios con el ápice dividido a modo de dedos de un guante “digitiformes

asi como en su tamaño esporal, 9-10 x 5-6 um (MOSER, 1980). (Fig. 2-5).

Recientemente ha sido descrita una especie con pleurocistidios y esporas

muy semejantes a la nuestra en tamaño y morfología, A. splendida Clg., de la

que se diferencia claramente por presentar sus pileo y caulocistidios isomorfos

con los pleuro y cheilocistidios que son de paredes finas, lageniformes con ápice

subcapitado (CLEMENGON, 1977).

Source : MNHN, Paris

106 G. MORENO y J.M. BARRASA

Fig. 14 a 17. — Agrocybe setulosa Moreno & Barrasa. Pleurocistidios (14, holotypus);

‘Cheilocistidios (15 y 16, holotypus); Esporas (17, holotypus).

Fig. 14 à 17. — Agrocybe setulosa Moreno & Barrasa. Pleurocystides (holotype : 14);

‘cheilocystides (holotype : 15-16); Spores (holotype : 17).

A. pediades (Pers. ex Fr.) Fay., A. arenicola (Berk.) Sing., A. semiorbicularis

(Bull. ex Fr.) Fay., A. arenaria (Peck) Sing., carecen de pleurocistidios, razón

por la que se diferencia del nuevo taxon propuesto.

Podemos diferenciar las especies con pleurocistidios descritas en Europa de

la Seccion pediadeae (Fr.) Sing. por la siguiente clave.

1. Sin pleurocistidios

Y. Con pleurocistidios ....-.........

2. Esporas 5-6 um, pleurocistidios digitiformes N:

2. Esporas 7-10 um, pleurocistidios lageniformes, äpice sin dividir .... . . >: 3

3. Cistidios heteromorfos, pleuro y cheilocistidios hialinos de paredes finas

distintos de los pileo y caulocistidios de paredes gruesas y amarillentas.

Esporas de 73 UM e t A. setulosa

3. Cistidios isomorfos, pleuro, cheilo, pileo y caulocistidios de paredes finas

E E A. splendida

Source : MNHN, Paris

AGROCYBE SETULOSA 107

AGRADECIMIENTOS

Nuestro más sincero agradecimiento a los profesores BON y WATLING por sus comen-

tarios científicos, así como por el envio de exsiccatas del genero Agrocybe, principalmente

A. arvalis. Al profesor ROMAGNESI por el envio de A. arvalis. Al profesor S. MARINER-

BIGORRA por la realización de la descripción latina. Al profesor CALONGE por poner a

nuestra disposicion la bibliografia del Real Jardin Botanico de Madrid.

BIBLIOGRAFIA

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Source : MNHN. Paris

109

CONTRIBUTION A L'ÉTUDE DE LA FLORE FONGIQUE

MICROSCOPIQUE DU MAROC

I. — Le genre Gonatobotrys :

quelques aspects morphologiques et physiologiques

par L. NAJIM, J.P. CLAUZET et M. KADIRI*

RÉSUMÉ. — Deux espéces de Gonatobotrys, le G. simplex et le G. africana sp. nov. ont

été isolées pour la premiére fois au Maroc; dans la région d'Oulmes au Moyen Atlas, à

800 m d'altitude. Ces deux espèces se distinguent d’une part, entre elles, par leurs carac-

tères morphologiques mais présentent toutefois quelques similitudes sur le plan physiolo-

gique; d'autre part, elles possédent quelques particularités qui les différencient des espèces

déjà décrites, en particulier pour le G. africana. Ces deux espèces se développent fréquem-

ment en mycoparasites, dans nos régions, sur 'Alternaria alternata. Des tentatives de culture

pure en l'absence de l'hóte (isolement monospore) et l'étude de leur ultrastructure ont

permis d'apporter quelques précisions sur la systématique de ces espèces qualifiées de

parasites biotropiques obligatoires.

SUMMARY. — Two species of Gonatobotrys, G. simplex and G. africana sp. nov., have

been isolated for the first time in Morocco, in the Middle Atlas region at Oulmes, at 800 m

of altitude. On one hand, these two species will be distinguished, one from the other, by

their morphological characters, however, they present some physiological similarities; on

the other hand, they have some particularities that differentiate them from already descri-

bed species, particularly for G. africana. These two species develop frequently as myco-

parasites, in our region on Alternaria alternata. Tentatives in pure cultures in absence of

the host (monospore isolation) and study of their ultrastructure permit to carry some

precisions on the systematic of these species qualified as obligatory biotropic parasites.

MOTS CLÉS : Gonatobotrys, morphologie, physiologie, systématique.

INTRODUCTION

Le genre Gonatobotrys dont la systématique a été révisée récemment par

divers auteurs (ALI, 1975; WALKER & MINTER, 1981), comprend deux

espéces : Gonatobotrys simplex et G. complex. Le Gonatobotrys complex a été

* Laboratoire de Mycologie, Faculté des Sciences, av. Ibn Batota, B.P. 1014. Rabat (Maroc).

CRYPTOGAMIE, MYCOLOGIE (Cryptog., Mycol.) TOME 5 (1984).

Source : MNHN. Paris

110 L. NAJIM, J.P. CLAUZET et M. KADIRI

décrit pour la premiére fois par WALKER & MINTER (1981). WHALEY &

BARNETT (1963) ont montré que le G. simplex est un parasite biotropique

de contact. Par ailleurs, HOCH (1977), dans une étude ultrastructurale concer-

nant les relations entre ce champignon et l'un de ses hôtes, Alternaria tenuis,

a montré l'existence de plasmodesmes au niveau de la zone de contact,

C'est en faisant un relevé systématique des espèces fongiques microscopiques,

dans les vergers de Rosacées, dans la région d'Oulmés (Moyen-Atlas) que nous

avons pu observer pour la premiere fois le genre Gonatobotrys au Maroc. Ces

champignons ont été isolés en même temps que leur héte : Alternaria alternata,

Les précédents travaux de recensement de la flore fongique aérienne au Maroc

n'ont pas fait mention de ce champignon car ils se limitaient essentiellement

à la région de Rabat (CHABERT, 1968; CHABERT & NICOT, 1968) dont

l'environnement est trés différent de celui de la région d'Oulmés. Deux espéces

de Gonatobotrys, le G. simplex et G. africana sp. nov., sont trés fréquentes

dans cette région du Maroc et leur hôte préférentiel est l'Alternaria alternata.

Des cultures pures de Gonatobotrys sur lame ou sur de la cellophane ont

permis de distinguer les deux espèces de G. simplex et G. africana et d'apprécier

certaines de leurs affinités physiologiques avec les différentes souches d’Alter-

naria alternata. Dans le présent travail, nous montrons l'existence des deux

espèces de Gonatobotrys, leurs particularités physiologiques et morphologiques

et les différentes variations qui se présentent.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Origine de la souche :

Les échantillons de Gonatobotrys sp. que nous avons observés, proviennent

de la région d'Oulmés au Moyen-Atlas (150 km à l'Est de Rabat; 800 m d'alti-

tude) où ils ont été récoltés en compagnie de leur hôte (de mars à juin 1981),

soit directement sur les pommes en voie de pourrissement, soit par capture des

spores sur des boîtes de Pétri contenant un milieu de culture pauvre : extrait

de malt : 10 g/l; agar : 20 g/l et ouvertes dans les vergers de la région à 0,80 m

du sol, pendant 24 h.

Culture pure et stockage des souches :

Un extrait cellulaire a été obtenu à partir de culture de mycélium d'Alternaria

alternata en milieu liquide (extrait de malt à 2 %), maintenue en agitation.

Au bout d'une dizaine de jours, le mycélium est recueilli, lavé, et déshydraté

à l'éruve à 80"C. Le résidu sec est ensuite broyé dans un mortier en présence

de tampon phosphate 0,15 M pH 6,8 à raison de 10 ml par mg de poids sec.

Cette suspension est alors filtrée et stérilisée à l'autoclave. L'extrait ainsi obtenu

est étalé à la surface du milieu de culture au moment de l'ensemencement à

raison de 1 ml par boite de Pétri.

Nous avons utilisé deux types de milieu de culture : un milieu constitué

Source : MNHN. Paris

GONATOBOTRYS 111

d'extrait de malt (20 g/l), et d’agar (20 g/l) et un milieu comparatif mis au point

par WHALEY & BARNETT (1963) : glucose (5 g/l), extrait de levure (5 g/l),

et agar (20 g/l).

En ce qui concerne le stockage des deux espèces de Gonatobotrys nous

avons procédé de deux manières différentes : la première est de les maintenir

sur leur hôte vivant à une température de 3°C et de faire des repiquages tous

les deux mois. La deuxième méthode est très délicate et présente toutefois,

quelques risques, elle consiste à maintenir les deux souches en culture pure

sur un milieu additionné d'extrait cellulaire de l'hôte. Cette dernière méthode

permet d'obtenir un temps de stockage assez long, allant jusqu'à cinq mois.

Les cultures sont auparavant incubées pendant deux à trois jours à la tempé-

rature ambiante (23 + 1°C) avant d'étre transférées dans l'enceinte réfrigérée

(3°C) pour la conservation.

Des cultures de ces différentes espèces ont été envoyées au Centraalbureau

voor Schimmelcultures Baarn, pour étre conservées et cataloguées.

Microscopie électronique à balayage :

De petits carrés de gélose supportant la culture ont été fixés au permanganate

à 1 % dans un tampon à pH 6.8. Plusieurs lavages à l'eau distillée ont précédé

une déshydratation progressive à Pacétone (25 %, 50 %, 75 %, 95 % et 100 %).

Après avoir été séché par la méthode du point critique, le mycélium est déposé

sur des supports en aluminium et métallisé avec une fine couche d’or.

RÉSULTATS ET DISCUSSIONS

1 - Aspects morphologiques

Le genre Gonatobotrys se caractérise par des colonies de couleur blanchâtre

et devenant parfois orange en vieillissant. Le mycélium est formé de filaments

rampant sur lesquels se différencient des conidiophores dressés, portant à inter-

valles plus ou moins réguliers des cellules conidiogènes; les conidies sont hya-

lines, non reliées en chaine (PL. I, fig. 2 et 3; PL. III, fig. 2 et 3).

WALKER & MINTER (1981) ont décrit deux espèces de Gonatobotrys,

le G. simplex et le G. complex, qu'ils distinguent par le nombre de cellules

par conidie. En effet, le G. simplex présente des conidies unicellulaires (Pl. 1,

fig. 1 et 3) alors que le G. complex présente des conidies bicellulaires.

Nous avons constaté que l'une de nos souches est plus proche morpholo-

giquement du G. complex décrit par WALKER & MINTER (1981), mais en

différe par un ensemble de caractères qui font d'elle une nouvelle espèce :

Gonatobotrys africana sp. nov. (Pl. IV).

— Les conidiophores du G. africana isolé au Maroc sont beaucoup plus

ramifiés que ceux du G, simplex et les ramifications se forment souvent au

niveau des cellules conidiogénes (Pl. III, fig. 4; Pl. IV).

Source : MNHN. Paris

Source : MNHN, Paris

GONATOBOTRYS 113

— Les cellules conidiogènes du G. africana isolé au Maroc ont une forme

beaucoup moins régulière, moins sphérique que celles du G. simplex, mais

aussi que celles de l'holotype de G. complex décrit par WALKER & MINTER

(1981) (PI. I, fig. 2; PL. III, fig. 2 et 3).

— Chez le G. africana, nous n'avons pas observé d'hétérogénéité conidienne

et en particulier ces longues conidies de 30 à 40 microns, décrites par WALKER

& MINTER (1981), représentant 25 % des conidies d'aprés ces auteurs (commu-

nication personnelle).

— Enfin, signalons la présence, avec une fréquence relativement faible toute-

fois, de conidies bicellulaires produites par le G. simplex; par contre, la présence

de conidies unicellulaires (10 7) produite par G. africana isolé au Maroc semble

étre liée à l'ontogénie conidienne.

En conclusion, s'il ne semble faire aucun doute que le G. simplex isolé au

Maroc correspond à l'holotype G. simplex Cda var. levellei Sac. (VALKER &

MINTER, 1981), il n'en est pas de méme pour le G. africana; en effet, le type

de ramifications, la forme des cellules conidiogènes, l'homogénéité morpholo-

gique des conidies, nous font penser que la souche isolée au Maroc correspond

à une espèce différente de celle de l'holotype G. complex Jane WALKER &

MINTER.

Gonatobotrys africana Larbi NAJIM, Jean-Paul CLAUZET et Mohamed KADIRI

sp. nov. (Pl. IV)

Espéce récoltée 4 Oulmés, Moyen-Atlas en présence d’Alternaria alternata,

dans des vergers de Rosacées. Des cultures, en présence de l'hôte ont été en-

voyées au Centraalbureau Voor Schimmelcultures à Baarn, pour y être cata-

loguées et conservées.

Planche I : Gonatobotrys simplex. — Fig. 1 : Microscopie photonique; aspect général du

thalle. Fig. 2 : M.E.B., conidiophores (Cd), les cellules conidiogénes (Cc) sont hérissées

de minuscules denticules provenant de la chute des conidies. Fig. 3 : Cellules conidio-

gènes (Ce) se différenciant au sommet du conidiophore (Cd), et devenant intercalaire par

suite de la croissance apicale du conidiophore, tout en continuant à produire des coni-

dies (C). Fig. 4 : Germination de conidies de G. simplex (Cg) en l'absence de l'hôte ét de

l'extrait cellulaire, montrant une conidie initiant un microcycle et une autre conidie ne

produisant que des «bourgeons» lui donnant un aspect «lévuriformey. Fig. 5 : Relations

entre G. simplex (G) et l'un de ces hótes, Alternaria alternata (A), G. simplex émet de

trés courtes ramifications terminées par des cellules de contact (fléches) caractérisant ce

mode de parasitisme.

Plate I : Gonatobotrys simplex. — Fig. 1 : general aspect of thallus. Fig. 2 : SEM, conidio-

phores (Cd), denticulate conidiogenous cells (Cc). Fig. 3 : Conidiogenous cells (Cc)

at top of conidiophore (Cd), intercalated by apical growth of conidiophore, and always

producing conidia (C). Fig. 4 : Germinating conidia (Cg) in absence of the host or of

the cellular extract : one conidium is initiating a microcycle, and another one is only

producing buds. Fig. 5 : Relationships between G. simplex (G) and one of its hosts,

Alternaria alterata (A). Arrows : contact cells produced by G. simplex.

Source : MNHN, Paris

L.NAJIM, J.P. CLAUZET ct M. KADIRI

114

whor

зот

Source : MNHN. Paris

GONATOBOTRYS 115

Les colonies sont blanches, ou parfois légérement orange dans les parties

âgées. Le mycélium est large et hyalin, de 3 à 5 um de diamètre, septé et relati-

vement trés ramifié. Les conidiophores ont 5 à 7 um de diamètre et 1000 à

2000 um de hauteur, ils sont dressés et trés ramifiés comparés au G. complex

décrit par WALKER & MINTER (1981). Les ramifications sont rares au niveau

des ampoules conidiogénes dont le diamétre est de 7 a 12 Lm, et qui sont

espacées plus ou moins réguliérement sur le conidiophore.

Les conidies sont dans leur grande majorité bicellulaires (90 %), mais on

trouve aussi des conidies unicellulaires (10 %) de taille légèrement plus réduite

que les premières, Dans les conidies bicellulaires, la taille de la cellule apicale

(extréme) est toujours de taille réduite ou au plus égale à celle de la cellule

basale (ou proximale). La taille des cellules conidiennes est le caractére essen-

tiel qui permet de distinguer le G. africana du G. complex, oà la cellule basale

(proximale) de la conidie est la plus réduite par rapport à la cellule apicale.

Les conidies (5 x 14 um) du G. africana sont régulièrement disposées sur l'am-

poule conidiogène et insérées sur celle-ci par de longs denticules (3 à 5 um),

qui sont d'autant plus longs que les conidies qu'ils portent sont aux premiers

stades de développement.

Le G. africana se distingue aussi de l'Arthrobotrys car les conidies sont au

maximum bicellulaires, et ne présentent jamais de trappes; par contre, il déve-

loppe des cellules de contact en présence de l'Alternaria alternata.

Gonatobotrys africana Larbi NAJIM, Jean-Paul CLAUZET et Mohamed KADIRI

sp. nov. (Pl. IV).

Species in Oulmés, Medio in Atlante, in Alternariis alternatis in quibusdam

Rosacearum Pomariis inventa.

Coloniae ejus albae, aliquando autem in provectioribus aetate partibus sub-

flammeae. Mycelium latum perlucidumque, in diametro 3 ad 5 um, septatum

et, si dici potest, maxime ramosum.

Conidiophori in diametro 5 ad 7 um, in altitudine autem 1000 ad 2000 um,

erecti maximeque ramosi si cum G. complici, A. WALKER & MINTER descripta

(1981), comparatur.

Rami pauci in partibus ampullas conidiogenas ferentibus. Hae ampullae, in

diametro 7 ad 12 um, in conidiophoris magis vel minus paribus intervallis incor-

poratae sunt.

Planche Il : G. simplex. — A : Aspect des conidiophores. 1, 2 et 3 : différents stades de déve-

loppement des conidies. 4 : Ampoule conidiogéne aprés la chute des conidies. Ac :am-

poule conidiogéne. Cd : conidiophore. Cc : cellule conidiogéne. C : conidie. d : denticule,

B : détail de quelques conidies.

Plate II : G. simplex. — A : Conidiophores. 1, 2 et 3 : different stages in development of

conidia. 4 conidiogenous bulbs. B : Some conidia.

Source : MNHN. Paris

116 L.NAJIM, J.P. CLAUZET et M. KADIRI

GONATOBOTR YS 117

Pleraeque conidiae bicellulariae aliquae unicellulariae, hae leviter parviores

quam illae. In bicellulariis conidiis, cellula in apice posita plerumque minor

quam altera im basi posita : aliquando autem. magnitudine. aequa, nunquam

major. Cellularum conidiarum amplitudo propria distinctio est qua G. africana

a G. complici differt, cujus conidiae cellula in basi posita minor quam altera

in apice.

G. africanae conidiae paribus intervallis in ampulla conidiogena longis denti-

culis inseratae : hi autem denticuli eo longiores, quo conidiae minus evolutae

sunt.

Differt etiam ab Arthrobotrys, G. africana quod ejus conidiae ut maxime

bicellulariae sunt, et nunquam foveas ferunt. Cellulae autem. ad contactum

ei crescunt, si adsunt Alternariae alternatae.

Clef pour les espèces du genre Gonatobotrys

1 Conidie unicellulaire .................... Gonatobotrys simplex

1 Cellules conidiennes dissymétriques ou au plus égales 2

2. Cellule proximale réduite ...... Gonatobotrys complex

2 Cellule proximale développée ...

+ Gonatobotrys africana

II- Aspects physiologiques

Les souches de G. simplex que nous avons observées ont été récoltées en

compagnie d’Alternaria alternata et de Cladosporium herbarum comme cela a

été déjà décrit par WHALEY & BARNETT (1963) et WALKER & MINTER

(1981), mais aussi en présence du Stemphylium et sa forme parfaite, le Pleo-

spora herbarum. Par contre nous n'avons pas observé, durant nos recherches,

l'association Gonatobotrys - Paecilomyces (WHALEY & BARNETT, 1963;

WALKER & MINTER, 1981).

Au Maroc l’Alternaria alternata et le Cladosporium herbarum sont les espèces

les plus fréquemment parasitées.

Le G. africana que nous avons observé parasite les mêmes espèces que le G.

simplex et selon le méme processus : le parasite émet, en direction de l'hóte, de

courts filaments terminés par une cellule de contact (WHALEY & BARNETT,

1963) (Pl. 1, fig. 5). C’est au niveau de l'interface entre les cellules de contact

du parasite et les cellules de l'hóte que HOCH (1977) a montré l'existence de

plasmodesmes.

Planche ll : Gonatobotrys africana. — Fig. 1 : Microscopie photonique; aspect général

du thalle. Fig. 2 : M.E.B., cellules conidiogénes (Cc) dont la surface est hérissée de

denticules formées à la chute des conidies (C). Fig. 3, 4 et 5 : Cellules conidiogènes

(Ce) de forme irrégulière et réparties à intervalles réguliers sur le conidiophore (Cd),

d’où partent parfois des ramifications (fig. 4).

Plate III : Gonatobotrys africana. — Fig. 1 : General aspect of the thallus. Fig. 2 : SEM,

denticulate conidiogenous cells. Fig. 3, 4 and 5 : Irregular conidiogenous cells regularly

distributed on the conidiophore, with some ramifications (fig. 4).

Source : MNHN, Paris

GONATOBOTRYS 119

WHALEY & BARNETT (1963) ont montré que le G. simplex ne peut se

développer en l'absence d'une substance, qu'ils ont appelé facteur de croissance

ou «mycotrophéine», que le parasite trouve naturellement dans les cellules

de l'hóte, Ces auteurs ont montré, dans le méme rapport, que ce facteur de

croissance est produit, plus ou moins intensément, par beaucoup d'espéces

fongiques, en particulier une espéce qui n'est pas parasitée par G. simplex :

Arthrobotrys musiformis. C'est cette espéce qu'ils ont utilisée pour réaliser

un extrait cellulaire, contenant le facteur de croissance,

d'ajouter au milieu de culture afin d'obtenir G. simplex.

A la différence de WHALEY & BARNETT (1963), nous avons pu obtenir

le développement de certaines conidies de G. simplex et G. africana en l'absence

de facteur de croissance, mais seulement dans le cas où les conidies repiquées,

du G. simplex ou du G, africana, proviennent de culture effectuée en présence

de l'hôte ou de l'extrait cellulaire de l'hôte. On observe alors que certaines

de ces conidies produisent un filament formé de 4 à 5 cellules et terminé par une

cellule conidiogéne, réalisant ainsi un microcycle (Pl. 1, fig. 4). Si on repique

les conidies ainsi formées, celles-ci ne se développent qu’en présence de l'hôte

ou de l'extrait cellulaire de l'hôte. Il semble donc, que lorsque le Gonatobotrys

sp. est cultivé en présence de facteur de croissance (provenant de l'hôte ou d'ùn

extrait cellulaire), certaines conidies formées emmagasinent une quantité mini-

male de cette substance, leur permettant d'assurer une fois repiquées, un déve-

loppement végétatif réduit mais toutefois conidiogène de type microcycle

(PL. I, fig. 4). D’autres conidies, par contre, parviennent seulement à émettre

quelques bourgeons leur donnant un aspect lévuriforme (Pl. 1, fig, 4): ces coni-

dies n'ont vraisemblablement pas accumulé suffisamment de substance de

croissance durant leur formation,

qu'il est nécessaire

Le développement du G. simplex ou de G. africana en présence d'extrait

«'Alternaria sp. est très comparable au développement de ces espèces en présence

de leur hôte naturel. Toutefois, nous avons pu constater que ce développement

devient d'autant moins important (tant sur le plan de la croissance végétative

que sur le plan de la sporulation) que le nombre de repiquage sur le milieu

additionné d'extrait augmente. I] semble donc que le contact avec l'hôte favorise

la capacité de développement du parasite,

Enfin, nous avons pu constater qu'un milieu «riche» (extrait de levure, glu-

cose, agar) favorise plutôt la croissance végétative, alors qu'un milieu plus

«pauvre» (extrait de malt, agar) favorise la sporulation.

Planche IV : G. africana. — A : Aspect des conidiophores. 1, 2, 3 et 4 : différents stades de

développement des conidies. 5 : Ampoule conidiogéne aprés la chute des conidies. Ac :

ampoule conidiogéne. Cc : Cellule conidiogéne. Cd : Conidiophores. C : Conidies. d

denticule. B : Détail de quelques conidies.

Plate IV : G. africana. — A : Conidiophores. 1, 2, 3 and 4 : different stages in development

of conidia. 5 : Conidiogenous bulbs. B + Some conidia,

Source : MNHN, Paris

120 L. NAJIM, J.P. CLAUZET et M. KADIRI

REMERCIEMENTS

Nous remercions la FIS (Fondation Internationale pour la Science) pour le soutien finan-

cier qu'elle apporte à ce projet. Nos remerciements vont aussi à M. AMBLARD de GUER-

RY, pour la partie latine de ce texte.

Nous remercions également MM. M. BEN CHERKI et S. KHAMOUSS pour leur assis-

tance technique.

BIBLIOGRAPHIE

ALI ML, 1975 — The family Moniliaceae in Egypt. 1. Gonatobofrys simplex Corda. Publ.

Cairo Univ. Herb. 6 : 1-6.

CHABERT J., 1968 — Les spores de champignons dans l'air de Rabat (Maroc) : Aperçu

floristique et écologique. Applications allergologiques et pathologiques possibles. Bull.

Soc. Sci. Nat. Phys. Maroc 48 : 1-48.

CHABERT J. et NICOT J., 1968 — Notes d’Aérobiologie. Il. Micromycétes de l'air de

Rabat; contribution à l'établissement d'un catalogue mycologique du Maroc. Bull.

Soc. Mycol. France 84 : 475-483.

HOCH H.C., 1977 — Mycoparasitic relationships : Gonatobotrys simplex parasit on Alter-

naria tenuis. Phytopathology 67 :309-314.

WALKER J.C. and MINTER D.W., 1981 — Taxonomy of Nematogonum, Gonatobotrys,

Gonatobotrym and Gonatobotriella. Trans. Brit. Mycol. Soc. 77 : 299-319

WHALEY J.W. and BARNETT H.L., 1963 — Parasitism and nutrition of Gonatobotrys

simplex. Mycologia 55 : 199-210.

Source : MNHN, Paris

121

MODIFICATIONS STRUCTURALES DE LA PAROI

LIÉES A L'ENVIRONNEMENT

par Marie-France ROQUEBERT* et David MINTER**

RÉSUMÉ, — L'ultrastructure de la paroi des hyphes végétatives de quelques champignons

est étudiée sous diverses conditions de développement : en milieu aérien, à la surface ou

dans le milieu gélosé et en milieu liquide. Dans ces deux dernières situations, les strates

externes peuvent être dissociées et même disparaître. Des modifications analogues sont

mises en évidence entre les cellules constitutives des enveloppes de quelques ascomes et

conidiomes. Les incidences de cette propriété sur la morphogenése sont discutées.

SUMMARY. — The wall ultrastructure of vegetative hyphae of various fungi was studied.

The hyphae had developed aerially, on or in agar, and in liquid culture. In the last two

cases external wall layers became dispersed or even disappeared. Similar changes to layers

are demonstrated for component cells of ascomatal and conidiomatal walls, and the rele.

vance of these features interpreting morphogenesis is discussed.

MOTS CLEFS : Paroi, ultrastructure

La paroi des champignons est une structure qui sépare la cellule de l'extérieur

et aide au maintien de la morphologie. Elle limite l'effet des variations physiques

ou chimiques du milieu ambiant sur le contenu cellulaire et c'est par son inter-

médiaire que s'effectue l'absorption des éléments nutritifs contenus dans le

La faculté d'adaptation que ce rôle protecteur suggére conduit à penser

que la structure pariétale est susceptible d’être modifiée en réponse à des change-

ments externes,

Chez les champignons conidiens, la morphogenèse et le bourgeonnement

en particulier, impliquent la participation de la paroi (ROQUEBERT, 1981).

Une modification structurale de celle-ci peut donc avoir une incidence sur le

déroulement des processus morphogénétiques.

* Laboratoire de Cryptogamie, M.N.H.N., 12 rue Buffon, 75005 Paris. L.A. 257 - CNRS.

** C.M.L., Kew, Surrey TW9 3 AF, Grande Bretagne.

CRYPTOGAMIE, MYCOLOGIE (Cryptog., Mycol.) TOME 5 (1984)

Source : MNHN, Paris

ULTRASTRUCTURE DE LA PAROI 123

Dans la nature, le développement des champignons débute en milieu à très

forte teneur en eau. Le passage à la forme reproductrice s'effectue généralement

chez les champignons filamenteux en conditions aériennes. La constatation de

cette nécessité biologique nous a conduit à étudier et à comparer les structures

pariétales des éléments végétatifs de quelques Hyphomycètes observés en

milieu aérien et en milieu à forte teneur en eau libre, tels qu'un milieu gélosé

et un milieu liquide , D'autre part, les fructifications closes, ascomes ou coni-

diomes, sont constituées de cellules étroitement juxtaposées dont les parois

contigués tendent à s'unir en une sorte de tissu dont la cohésion est assurée

par une substance mucilagineuse (KORF, 1973) Aux fins de comparaison

nous examinerons aussi les parois cellulaires à l'intérieur de ces deux types de

conceptacles,

L'influence de certains composants chimiques du milieu (métabolites ou anti-

biotiques) sur la structure de la paroi a été étudiée pour quelques champignons

(BURNETT, 1979). La présence de sorbose par exemple dans le milieu de

culture de Neurospora crassa entraine un épaississement considérable de la

paroi et l'apparition d'une strate externe, dense, de texture fibreuse (SHATKIN

& TATUM, 1959) Les données concernant l'action des facteurs physiques

(action de la température, du CO;, de l'oxygène, du pH, de l'eau, etc.) concer-

nent principalement les champignons dimorphiques (MOONEY & SYPHERD,

1976; COLE & NOZAWA, 1981). Mais les résultats portent sur le déterminisme

du dimorphisme et sur les modifications de la constitution chimique plus que sur

l'organisation des constituants pariétaux entre eux.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Nous avons examiné les filaments mycéliens de deux Hyphomycètes hyalins :

Aspergillus tamarii Kita et Stilbothamnium nudipes Haum., et un dématié :

Cladosporium herbarum (Pers.) Link.

Les champignons sont cultivés sur milieu à base de Malt gélosé à une tempéra-

ture de 22°C. Après huit jours de développement, des fragments cubiques de

culture contenant du mycélium intramatrical et du mycélium appliqué à la

surface sont découpés et plongés dans le fixateur. D'autre part, sur la méme

culture, du mycélium aérien, superficiel, est prélevé en zone subpériphérique et

Planche 1. — Coupes transversales dans des hyphes de S. nudipes. 1. Mycélium aérien. La

paroi est composée de trois strates A, B et C, elle-même constituée de deux sous-unités

2. Mycélium appliqué à la surface du milieu gélosé. On note le décollement de A et

l'extension d’un matériel fibreux (mf) sous-jacent. 3. Mycélium intramatrical. Extension

considérable du matériel fibreux et disparition des strates A et B.

Plate 1. — Transverse section of S. nudipes hyphae. 1. Aerial mycelium. The wall is compo-

sed of three layers, A, B and C, its being made of 2 sub-layers. 2, Mycelium on the sur.

face of agar. Note the way layer A is separating with an extension of the underlying

fibrous material (mf), 3. Immersed mycelium, showing considerable extension of the

fibrous material, and disappearance of layers A and B.

Source : MNHN, Paris

124 M.F. ROQUEBERT et D. MINTER.

Source : MNHN Paris

ULTRASTRUCTURE DE LA PAROI 125

fixé à son tour. Lors de l'inclusion, nous avons orienté les petits blocs de culture

de fagon perpendiculaire au plan de coupe afin de localiser plus aisément la

situation du mycélium par rapport a la gélose nutritive. Nous avons aussi cultivé

ces champignons en milieu liquide à base de jus de carotte et séparé le mycélium

par centrifugation. Enfin, nous avons étudié des coupes dans des acervules de

Marssoniella juglandis (Lib.) Hónel emend. Roquebert et Fayret, prélevés direc-

tement à la surface des feuilles de Juglans regia. Les techniques de fixation et

d'inclusion pour ce type de matériel ont été exposées dans un précédent article

(ROQUEBERT, 1981).

Pour les Ascomycetes, Hypoderma rubi (Pers.) D.C, ex Chev., Lophoder-

mella suleigena (Rostrup) Höhnel et Lophodermium conigenum (Brunaud)

Hilitzer, les échantillons ont été placés pendant 24 heures dans un bain de

glutaraldéhyde à 3 % dans un tampon phosphate 0,05 M (pH 7,2), puis trans-

férés dans le tampon pur durant 24 heures, et enfin dans le tétroxyde d'Osmium

à 1 % dans le tampon, pour une durée d’une heure. Après déshydratation dans

l'acétone (5 minutes par bain de dilution décroissante et 2 bains d'acétone

pure) le matériel est inclus dans une résine TAAB après une série de bains

résine/acétone prolongés, un jour pour les 4 premiers et 48 heures pour la résine

pure. Il est ensuite mis à polymériser pendant 18 heures à 70°C puis coupé et

coloré pendant 10 minutes dans une solution saturée d'acétate d'Uranyle, dans

V'acétone, puis dans le citrate de plomb durant 25 minutes (REYNOLDS, 1963)

RESULTATS

1, La paroi des hyphes aériennes a une structure comparable chez les

champignons hyalins et dématiés (PL. 1 et 2). Elle est composée d'une fine

pellicule externe opaque aux électrons (A) étroitement appliquée à une mince

strate sombre, homogène, d'épaisseur régulière, (B); celle-ci limite une couche

beaucoup plus épaisse, perméable aux électrons, de texture fibrillaire, la couche

Planche 2, — 1. Hyphe végétative de À. tamarii en milieu liquide, Vers l'extérieur de la

cellule le matériel fibreux (mf) se dissocie en fibres laches (f). — 2, 3 et 4. Mycelium de

C. herbarum. 2. Hyphes intramatricales. On note la disparition de la strate A et la pré-

sence d'une substance amorphe renfermant des granules opaques, qui unit les hyphes

entre elles (flèches). 3. Hyphe aérienne avec une paroi complete (A, B et C) pigmentée.

4. Hyphe appliquée à la surface de la gélose, (ma : milieu aérien, mg : milieu. gélosé).

La paroi de la face exposée au milieu aérien est dense et complète tandis que celle de

la face située dans la gélose se dissocie en une couche lâche renfermant des granules

opaques.

Plate 2. — 1. Vegetative hypha of A. tamarii in liquid medium, Fibrous material (mf) is

becoming dispersed in loose strands (f) towards the cell exterior, — 2, 3 and 4. Mycelium

of C. herbarum. 2. immersed hyphae. Note disappearance of layer A, and presence of

amorphous material containing opaque granules and uniting the hyphae (arrows). 3.

Acrid hyphae withipamentediand complete (A, Band C wall). 4. Hypha on the surface

of agar. (ma : aerial environment; mg : agar environment), The wall on the side exposed

to air is dense and complete, while that on the agar side is separated out into a loose

cushion containing opaque granules.

Source : MNHN, Paris

Source : MNHN. Paris

ULTRASTRUCTURE DE LA PAROI 127

C. Souvent on distingue à l'intérieur de C deux strates concentriques définies

par l'orientation des fibrilles constitutives qui sont rectilignes vers l'extérieur

tandis qu'elles sont ondulées vers le plasmalemme dont elles suivent les inden-

tations (PI. 1, fig. 1 et 2).

Dans le cas des champignons dématiés, des granulations que nous supposons

de nature pigmentaire en raison de leur absence dans le mycélium hyalin, se

superposent à cette structure fondamentale (Pl. 2). Leur densité est croissante

de l'intérieur vers l'extérieur de la paroi où elles s'agrégent au niveau de A en

une croûte très sombre, d'épaisseur irrégulière, tandis que B, plus claire, est

d'aspect homogène et d'épaisseur à peu prés constante. Enfin, la structure de

la couche C est soulignée par la présence de petits grains opaques régulièrement

disposés sur les fibrilles constitutives, La pigmentation est donc surtout visible

dans les strates les plus externes, une mince zone hyaline persistant presque

toujours au niveau du plasmalemme.

Cette structure pariétale peut être altérée suivant l’état physique du milieu,

liquide ou gélosé, et, dans ce dernier cas, suivant la localisation des hyphes par

rapport au substrat.

— Sur une hyphe de S. nudipes prélevée au contact du milieu gélosé, on peut

observer que la pellicule externe A est, par endroits, décollée de la paroi fonda-

mentale par suite de l'extension d'un matériel intercalaire de texture fibreuse

(Pl. 1, fig. 2).

— Autour du mycélium intramatrical, cette nouvelle enveloppe prend une

extension considérable. Elle est constituée d'un réseau aux mailles láches qui

s'étend parfois jusqu'à la couche profonde de C (Pl. 1, fig. 3), tandis que la

pellicule externe a complétement disparu (Pl. 1, fig. 2).

— En milieu liquide, le gonflement est tel que les fibrilles finissent par se

désolidariser et se trouvent rejetées dans le milieu ambiant (PI. 2 fig. 1). La

désagrégation des constituants externes de la paroi peut donc conduire à une

hyphe privée d'une partie de son enveloppe protectrice et dont la limite externe

devient difficile à localiser (Pl. 2, fig. 1). La paroi des hyphes dématiées subit

le méme type de désagrégation et de dispersion des composants externes. La

figure 4, (Pl. 2), montre une coupe dans une hyphe appliquée à la surface du

milieu de culture. La partie aérienne dece filament a une structure typique.

Par contre, dans la partie située dans la \gélose on note la désagrégation des

constituants pariétaux externes, visualisés par la dispersion des grains de pig-

Planche 3, — Coupe dans le conidiome de Marssoniella juglandis. 1 et 2. Présence d'une

substance fibreuse (mf) unissant les cellules du conidiome. ph : phialide. 3. Cellule

sporogéne dont la paroi montre par endroits des granulations sombres (g) externes, une

formation réticulée lâche (tête de flèche) ou encore est complètement dénudée (tête

de flèche noire).

Plate 3. — Sections of the conidioma of Marssoniella juglandis. 1 and 2 : Fibrous material

(mf) uniting the conidioma component cells. ph: phialide. 3, Sporogenous cell with a

wall showing in different places opaque granules (g), loose reticulation (arrowhead)

and complete denudation (black arrowhead).

Source : MNHN, Paris

ULTRASTRUCTURE DE LA PAROI 129

ment au sein d'une gaine réticulée láche. En certains points, la paroi se trouve

ainsi complétement dépourvue de son revétement externe et peut, localement,

perdre son aspect pigmenté. Contrairement à ce que l'on observe dans les hyphes

hyalines, la couche B reste cependant identifiable dans la plupart des cas ob-

servés.

Lorsque les hyphes sont juxtaposées dans le milieu, elles sont liées entre elles

par une sorte de réseau láche qui pourrait résulter de la fusion des enveloppes

externes, désagrégées, de chacune d'elles, Dans le cas des champignons dématiés

on observe, au sein de cette gaine commune, des granulations pigmentaires

éparses (Pl. 2, fig, 2).

2. Conidiomes

Une texture analogue se retrouve entre les phialides contiguës à l'intérieur

des acervules de Marssoniella juglandis. Les parois portent des granulations

sombres disposées de facon trés hétérogéne ou en sont méme, le plus souvent,

totalement dépourvues et peuvent alors apparaitre hyalines (Pl. 3, fig. 3). Les

appareils sporogénes et les hyphes qui constituent le stroma de l'acervule sont

unis entre eux par un matériel fibrillaire plus ou moins láche selon la proximité

des cellules (Pl. 3, fig. 2).

3. Ascomes

Au cours de leur agrégation et de la maturation du stroma, les cellules des

ascocarpes de certaines Rhytismatacées (Hypoderma rubi, Lophodermella

sulcigena, Lophodermium conigenum) subissent une transformation pariétale

dans le méme sens. En effet, lorsqu’elles sont jeunes et vivantes, elles sont

entourées dune paroi où l'on peut encore distinguer une épaisse couche ©

limitée à la périphérie par une strate opaque aux électrons nettement distincte

par endroits. Au cours de la maturation du stroma, cette couche externe se

désagrège d'abord au niveau des méats, libérant dans les espaces intercellulatres

des granules opaques qui confluent avec ceux des cellules voisines, Dans un

stroma mür, la limite extérieure des parois cellulaires est impossible à distinguer:

Planche 4. — Coupes longitudinales à travers le clypeus de quelques espéces de Rhytisma-

tacées. 1. Lophodermella sulcigena : cellules vivantes dans un jeune clypeus montrant

une couche fibreuse élargie, avec des granules de matériel opaque (fm), et des dépôts

commençant à cimenter les cellules adjacentes. 2. Lophodermium conigenum : identique

à l'exemple 1. 3. Hypoderma rubi : cellules lysées dans un clypeus ágé. On notera

que celui-ci est maintenant une structure inerte composée principalement de dépôts

opaques formant un (ciment.

Plate 4. — Vertical transverse sections of the clypeus of various species of the Rhytisma-

taceae. 1. Lophodermella sulcigena : living cells in young clypeus, showing enlarged

fibrous layer with granules of opaque material (fm), and opaque deposits beginning

to cement adjacent cells. 2. Lophodermium conigenum, a similar exemple to 1. 3

Hypoderma rubi : dead cells in old clypeus. Note how no cellular contents remain

and the clypeus is now an inert structure composed principally of opaque deposits

forming a «cement».

Source : MNHN, Paris.

130 M.F. ROQUEBERT et D. MINTER

les cellules, vidées de leur contenu, sont entourées d'une fine paroi lamellaire,

la couche C, qui se fond vers l'extérieur dans le «ciment» dense qui occupe

tous les espaces intercellulaires et unit ainsi les cellules entre elles (Pl. 4).

DISCUSSION

Les observations que nous venons d'exposer montrent que la structure de

la paroi des hyphes (hyalines ou pigmentées) est susceptible d'être modifiée

selon son environnement. Ce changement de structure peut aller jusqu'à la

disparition des composants externes, laissant la paroi limitée à une mince enve-

loppe, la couche C, autour du plasmalemme.

Les causes éventuelles de cette transformation et ses incidences sur la mor-

phogenése doivent alors étre considérées.

D’après les conditions culturales dont nous avons pu observer les effets,

plusieurs facteurs peuvent être mis en cause : la diminution de l'oxygénation,

le taux d'humidité ambiante, ou l'état fonctionnel de la paroi dans les échanges

entre le milieu et la cellule.

Le comportement de la paroi des hyphes immédiatement appliquées à la

surface de la gélose tendrait à montrer que la désagrégation est plutót liée à

l'activité absorbante de la paroi et à une oxygénation moindre. En effet, la face

inférieure est désagrégée tandis que la face supérieure, exposée à l'air et sans

contact direct avec le milieu nutritif, a une structure complète et ténue, Dans

ce cas, le facteur humidité ne semble pas responsable du changement structural

puisque son taux n'est pas sensiblement différent aux 2 niveaux. L'ambiance de

la bofte de Pétri que nous avons considérée comme «condition aérienne» a, en

effet, une humidité relative équivalente à celle du milieu gélosé (95-96 % selon

CAHAGNIER, com. pers). Pourtant, en milieu liquide, la désagrégation est

trés importante (Pl. 2, fig. 1). Il pourrait s'agir d'une sorte de solubilisation de

certains composants des strates externes, sans doute polysaccharidiques, la

partie protéique n'étant pas touchée par ce phénomène. Le réseau de fibres

protéiques se trouve ainsi relaché et s'étale vers l'extérieur.

Des modifications structurales analogues à celles que nous avons décrites

ont été mises en évidence dans les hyphes de Bipolaris maydis (EVANS &

STEMPEN, 1980; EVANS & al., 1981). Les auteurs interprétent les figures de

dispersion des composants externes et leur agrégation en une couche compacte

irrégulière comme les phases successives caractérisant les hyphes jeunes puis

les hyphes âgées. Cependant le matériel étant prélevé, pour les hyphes jeunes

en périphérie de la culture, donc intramatrical ou superficiel, et pour les hyphes

âgées au centre du thalle où la proportion de mycélium aérien est beaucoup

plus forte, on peut penser que les figures de EVANS & al. reflètent le même

phénomène que les nôtres et relèvent de là même interprétation. Dans le même

sens, WHEELER & GANTZ (1979), ont montré que, sur feuille d'avoine, les

hyphes de Bipolaris maydis peuvent être entourées d'une gaine fibrilleuse épaisse

lorsqu’elles sont sous la cuticule foliaire ou en suspension dans une goutte d'eau

distillée.

Source : MNHN, Paris

ULTRASTRUCTURE DE LA PAROI 131

Dans le cas des champignons dimorphiques, l'expression du dimorphisme

est liée aux conditions de développement et s'accompagne généralement de

modifications sensibles dans la structure et la composition pariétales (COLE &

NOZAWA, 1981). Des 1962, BARTNICKI-GARCIA & NICKERSON avaient

observé que la formation des blastospores chez Mucor rouxii (Amylomyces

rouxii), en milieu liquide, s'accompagnait d'un épaississement considérable

de la paroi, GARRISSON & al. (1975) ont établi que, en milieu liquide, les

hyphes de Sporothrix schenkii bourgeonnent directement des blastospores.

Elles sont alors entourées d'un matériel microfibrillaire láche, dense aux élec.

trons, analogue à celui que nous avons observé. Selon les auteurs, cette sub-

stance réticulée est de méme nature (mucoside acide) que celle qui constitue

la couche pariétale externe homogène et dense, de la forme levure obtenue

en milieu gélosé.

Cette faculté de désagrégation que possède la paroi végétative en réaction

aux conditions de développement peut avoir des conséquences sur la morpho-

genèse.

La poussée des formations endogènes (bourgeonnement, ramification) peut

s'extérioriser de façon différente selon l'épaisseur et la consistance plus ou moins

plastique de l'enveloppe qu'ils ont à franchir. L'incidence de la plasticité parié-

tale sur le mode de conidiogenése a déjà été soulignée (MADELIN, 1979: RO-

QUEBERT, 1981) en invoquant l'état de maturation de l'enveloppe pariétale,

Si l'on considére que, comme la paroi intramatricale, une paroi jeune est essen-

tiellement constituée d'une couche C, on peut supposer des effets comparables

au moment du bourgeonnement. Ainsi, par exemple, pourrait s'expliquer le

fait que l'on n'ait jamais pu observer de conidies en chaines (conidies séches)

ou de trétoconidies dans l'ambiance humide d'un coelome et la relative fre-

quence des formes levure d'Hyphomycètes cultivés en milieu liquide.

Directement ou indirectement l'hyphe est à la base de toutes les structures

différenciées (conidiophores, conidiomes, ascomes). LATHAM (1974) a pu

constater, en microscopie optique, que les conidiophores de Cristullariella

pyramydalis sont ramifiés quand le champignon est incubé à 96 % d'humidité

relative alors qu'ils sont normalement simples sur leur hôte naturel, Par ailleurs,

on observe dans la paroi des hyphes qui participent à la genèse des conidiomes

de Marssoniella et des ascomes des Rhytismatacées une évolution analogue à

celle des hyphes intramatricales : dispersion des composants des strates externes

dont le terme ultime est l'agrégation des corpuscules libérés en une sorte de

ciment dense unissant entre elles les cellules dont la paroi est limitée à la couche

C lamellaire. GOURBIERE & MORELET (1980) ont pu montrer que la forma-

tion des pycnides de Rhizosphaera pini et Rhizosphaera kobayashit obtenues

en culture débute par l'apparition d'une gaine mucilagineuse autour d'hyphes

submergées hyalines (alors que les hyphes dressées sont pigmentées). A l'inté-

rieur de la masse de mucilage ainsi constituée s'organisent les filaments conidio-

gènes qui limitent ensuite une cavité centrale. DI COSMO & COLE (1980)

ont rapporté une observation dans le même sens lors de l'analyse en microscopie

optique et à balayage, des premiers stades de la formation des pycnides de

Source : MNHN, Paris

132 M.F. ROQUEBERT et D. MINTER

Chaetomella acutiseta qui, à l'état mûr, sont encore recouvertes par le mucilage

solidifié.

La juxtaposition des cellules constituant la paroi d'un coelome, à la surface

ou dans le milieu, s'accompagne donc de modifications structurales de la paroi

analogues à celles d'une hyphe solitaire immergée. Une situation naturelle,

physiquement déterminée, pourrait étre indispensable à l'accomplissement de

tel ou tel type de morphogenése.

Nous avons étudié les modifications de la structure pariétale en phase végé-

tative. On peut aussi se demander si la paroi des spores, des endospores en

particulier, est sensible de la même façon. En effet, elles sont contenues dans

un ensemble clos et humide qui pourrait être assimilable aux conditions intra-

matricales. Cependant la genèse pariétale est différente, du moins dans le cas

des ascospores (PARGUEY-LEDUC & JANEX-FAVRE, 1981; BELLEMERE

& al, 1981), qui se différencient à l'intérieur de la double membrane du sac

ascal. Les données actuelles ne semblent pas montrer de figures comparables

à celles que nous venons d'exposer. Cependant, l'origine des enveloppes mucila-

gineuses présentes autour de certaines d'entre elles (Lophodermium par exemple)

serait intéressante à analyser.

Nous tenons à remercier Mesdames E. BURY et M. DUMONT, ainsi que Miss G. GOD-

WIN, pour leur collaboration technique.

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by of Neurospora crassa

Source : MNHN, Paris

Source : MNHN. Paris

DEVELOPMENTAL MORPHOLOGY OF ASCOMYCETES

XI. NECTRIA KERA

by C.V. SUBRAMANIAN and D. Jayarama BHAT*

SUMMARY. — Study of the developmental morphology of new species : Nectria kera

Subramanian & Bhat (Hypocreale), and its anamorph Cylindrocarpon sp.

RÉSUMÉ. — Etude de l'organogénése d'une espéce nouvelle d'Hypocréales : Nectria kera

Subramanian & Bhat, et de son anamorphe Cylindrocarpon sp.

MOTS CLÉS : Ascomycète, Hypocréale, organogenèse, Nectria.

This paper is the eleventh in a series on the developmental morphology of

Ascomycetes and deals with Nectria kera sp. nov. Our observations are based

on a study of a fungus isolated from spathe of Cocos nucifera L., collected at

Kandy, Sri Lanka, and it belongs to the Coccinea-group (BOOTH, 1959) of the

genus Nectria; it differs from other known species of the genus to warrant

placement in a new taxon. Single ascospore isolates when inoculated on steri-

lized pieces of Cocos nucifera and incubated in Roux-tubes mature perithecia

developed after six weeks. For studying the various stages in the development

of the anamorph and teleomorph, methods described earlier (SUBRAMANIAN

& BHAT, 1978) were followed.

Nectria kera sp. nov. (Fig. 24-27; Plate II, d-h)

Perithecia superficialia, solitaria vel 2-8 aggregata, globosa ad pyriformia,

rubra vel latericia, papillata, ostiolata, 290-520(390) x 220-410(320) um, stro-

mati pseudoparenchymati debilique insedentia, leavitunicata, sicca intacta.

Paries peritheciale, sectione longitudinale, 2045 um latum, constanter. duobus

fere distinctis stratis : stratum externum et stratum internum. Stratum extemum

15-25 um latum, cellulis 2-3 seriebus, crassitunicates, oblongis ad globosis,

10.3-14.5 x 11.2 um constantibus; stratum vero intemum 10-25 um latum,

* Centre of advanced study in Botany, University of Madras, Madras - 600 005, India.

CRYPTOGAMIE, MYCOLOGIE (Cryptog., Mycol.), TOME 5 (1984).

Source : MNHN, Paris

136 C.V. SUBRAMANIAN and D.J. BHAT

110

A ЫН ІЗ

20р

Fig. 1-13 : Nectria kera. — 1. portion of a vegetative hypha; 2-9. stages in the development

of phialide and conidium; 10. conidiophore bearing phialides and conidia; 11. conidia;

12. section through a sporodochium; 13. stages in the development of chlamydospore.

Fig. 1-13 : Nectria kera. — 1l. fragment d'hyphe végétative; 2-9. développement d'une

phialide et d'une conidie; 10. conidiophore portant des phialides et des conidies; 11. co-

nidies; 12. coupe à travers une sporodochie; 13. développement d'une chlamydospore.

Source : MNHN, Paris

NECTRIA KERA 137

cellulis 5.6-14.0 x 3.24.2 um, tenuitunicatis, angustis, elongatis constantibus;

papillae peritheciales breves atque hyphis non ramosis, crassis, parallele dispo.

sitis, 50-70 um altae; 90-100 um latae.

Asci unitunicate, clavati, brevistipitati, tenuitunicati, 8-sporati, 60-85(68.5) x

10.0-14.0 um, apicibus rotundatibus atque simplicibus. Ascosporae ellipsoideae,

1-septate, aeque bicellulatae, ad septa leaviter constrictae, hyalinae, manifeste

verrucosae, 18.0-24.5(22.5) x 6.5-9.0(8.2)um; supra biseriatum, infra vero uni-

seriatum dispositae in ascus.

Typus : In Spathe Cocos nucifera L., collectis Kandy, Sri Lanka, 25-10-1975

a C. V. Subramanian et positus in MUBL Herbario sub numero 2401.

Status conidialis : Cylindrocarpon sp.

CULTURAL CHARACTERS

Ascospores germinating overnight on potato dextrose agar, malt extract agar,

and in distilled water producing one or two germ tubes from each cell. Colony

on potato dextrose agar pale, attaining a diam. of 2.5-3.0 cm in 12 days, with

even margin, with reverse light brown; colony on malt extract agar floccose,

dense, attaining a diam. of 3.5-4.5 cm in 12 days, with uneven margin, with

surface yellow and reverse purple. On potato dextrose agar mycelium white

initially, later becoming pale brown; aerial hyphae septate, branched, up to

2.04.2 jim wide (Fig. 1); in old cultures adpressed mycelium becoming thick.

walled, pigmented, and with elongated swollen cells 14.0-26.0 pim wide, Coni-

diophores developing on aerial hyphae, 20-35 jum long, branched or unbranched,

septate, with dense cytoplasm, producing phialides laterally and terminally

(Fig, 10; Plate 1, a). Phialides cylindrical to subcylindrical, slightly swollen at

the base, narrowed towards the tip, with a distinct collarette, 12.5-17.5 x 3.0-

4.0 um (Fig. 8), producing only macroconidia,

Macroconidia of nearly uniform width throughout, curved, distinctly dorsi-

ventral, with smoothly rounded ends, without foot-cell, hyaline, 3-5 septate

(Fig. 11; Plate I, g), measuring

3-septate conidia

4-septate conidia ..

5-septate conidia ....

- 30.042.5(37.5) x 5.2-5.6 um

35.5-45.5(42.5) x 5.5-6.0 um

50.0-65.5(58.5) x 5.8.6.2 um

Chlamydospores (Fig. 13) terminal on vegetative hyphae, intercalary in coni-

dia, subglobose to globose, 13.5-15.5 ym in diam.

In old cultures, phialides aggregating on plectenchyma composed of thick-

walled hyphae and forming sporodochia (Fig. 12); sporodochia 50-90 um high,

170-210 um wide, surmounted by cream coloured macroconidia.

The noteworthy features of this fungus are the possession of red and semi-

translucent perithecia, perithecial wall being pseudoparenchymatous and com-

posed of irregularly arranged cells of variable shape and size (not filiform or

elongated as in Nectria mammoidea) in the outer tegion, large ascospores with

Source : MNHN, Paris

138 C.V. SUBRAMANIAN and D.J. BHAT

Plate I. — Nectria kera :a. a conidiophore with phialides and conidia; b-f. stages in the deve-

lopment of conidium; g. conidia; h. an ascogonium surrounded by hyphae; i. section

through e colled ascogontumisurtounded by hyphas, Jic sections ehtough perlthechil

centrum showing apical paraphyses.

Planche I. — Nectría kera : a. conidiophore avec phialides et conidies; b-f. stades de dévelop-

pement d’une conidie; в. conidies; h. ascogone entouré d'hyphes; i. coupe à travers un

ascogone enroulé, entouré d’hyphes; j-k. coupe à travers un jeune périthéce montrant

des paraphyses apicales.

Source : MNHN, Paris

NECTRIA KERA 139

distinct verrucosities in the epispore, and the absence of microconidia. The

fungus was isolated from spathe of Cocos nucifera. When inoculated on same

substrate mature perithecia are formed after six weeks,

The possession of red or semi-translucent perithecia, and thick-walled, pseu-

doparenchymatous perithecial wall are features of the Coccinea-group of the

genus Nectria (BOOTH, 1959). Compared to the five species so far known in

the Coccinea-group (Nectria coccinea (Pers.) Fr., N. galligena Bres., N. ditissima

Tul., N. punicea (Schmidt ex Fr.) Fr. ex Rabenh., N. hederae Booth and N.

fuckeliana Booth) the perithecia and the ascospores are larger in our fungus

and the latter being distinctly verrucose. Mostly species of Nectria in the Cocci-

nea-group occur on hosts belonging to either dicots or Gymnosperms. Our

fungus is isolated from a monocot (palm). There is no other taxon which com-

bines the unique features of our fungus and we are therefore accomodating

it in the genus Nectria as a new species.

DEVELOPMENT OF THE ANAMORPH

In slide culture macroconidia develop in 5-6 days after inoculation. Conidio-

phores arise as lateral branches on the vegetative hyphae. Phialides may be

the terminal cells of the conidiophores or may arise laterally on the conidio-

phore. During the formation of a lateral phialide, a lateral bud arises on the

conidiophore and elongates (Fig. 2). When it attains its full size, a basal septum

delimits it from the conidiophore, The wall of the phialide is uniform in thick-

ness except at the neck where it is slightly thickened.

The development of the conidium is as follows. Initially, the phialide is cy-

lindrical in shape and rounded at the tip. Early in the development of the cor.

dium, the tip of the phialide buds out a small protuberance (Fig, 3). With

further development, the protuberance elongates and swells (Fig. 4-6; Plate 1.

b-c); As the conidium initial elongates its contents become granular and the

conidium initial slightly bends in the middle (Plate 1, d-£). When the conidium

becomes fully mature, a septum is laid down in the neck region of the phialide

delimiting the conidium (Fig. 7). The liberated conidium is smoothly rounded

at both ends. The mature conidium is 4-5 celled, each cell being uninucleate

(Fig. 11, 12). As the first conidium is liberated, a second conidium initial ap-

pears in the opén end of the phialide and develops into a second conidium

(Fig. 9). This process is repeated so that a number of conidia are produced

from a phialide in a basipetal sequence.

The chlamydospores usually develop in old cultures. The development of

the chlamydospore is as follows (Fig. 13). The apical part of the terminal cell

of a vegetative hypha gradually swells and is delimited from a subtending cell

by the formation of a septum, The swollen apical cell is the developing chlamy-

dospore and the contents of this cell and the subtending cell are granular,

Mature chlamydospores are globose, thick-walled and contain dense cytoplasm.

Source : MNHN, Paris

140 C.V. SUBRAMANIAN and D.J. BHAT

Fig. 1418. — Nectria kera :14-16. stages in the development of ascogonium and young

perithecial centrum; 17-18. sections through young perithecial centra showing apical

paraphyses.

Fig. 14-18. — Nectria kera : 14-16. développement d'un ascogone et d'un primordium de

périthéce; 17-18. coupes à travers de jeunes périthéces montrant des paraphyses api-

cales.

Fig. 19-22. — Nectria kera : 19. section of perithecial centrum showing apical paraphyses.

Note the well differentiated inner and outer regions of perithecial wall; 20. longitudinal

Source : MNHN, Paris

NECTRIA KERA 141

section of a perithecium showing apical paraphyses filling the entire centrum cavity; 21,

section of perithecium showing

the development of asci iaverspersed with apical para.

Physes. Note also formation of ostiole lined with periphyses; 22. portion of centum

Showing asci interspersed with apical paraphyses (enlarged).

Fig. 19-22. — Nectria kera : coupes à travers des périthéces. 19. paraphyses apicales. On re-

marque la différenciation d'une couche interne et d'une couche externe dans la paroi du pes

thece; 20. paraphyses apicales remplissant la c

avité centrale; 21. développement des

asques mélés aux paraphyses apicales. On note la formation d'un ostiole bordé de péri.

physes; 22, détail de 21 .

Source : MNHN. Paris

Plate II. — Nectria kera : a. section through a perithecial centrum showing apical paraphyses

in the form of a palisade-like layer; b-d. longitudinal sections of young perithecia showing

apical paraphyses (d = portion of c, enlarged); e-f. longitudinal sections of mature

perithecia; g. asci; h. ascospores.

Planche II. — Nectria kera : a. coupe à travers un jeune périthèce montrant des paraphyses

apicales groupées en palissade; b-d. coupes longitudinales d'un jeune périthéce montrant

des paraphyses apicales (d = détail de c); e-f. coupes longitudinales de périthèces mûrs;

g. asques; h. ascospores.

Source : MNHN, Paris

NECTRIA KERA 143

DEVELOPMENT OF THE TELEOMORPH

The first indication of perithecial development observed by us is the appea-

rance of an ascogonium containing 4-5 cells surrounded by thick-walled vege-

tative hyphae presumably developed from the base of the ascogonium (Plate 1,

h). A fully developed ascogonium is a coil of swollen multinucleate cells whose

cytoplasm is dense and more deeply staining than the surrounding hyphal

cells (Fig. 16). Each cell of the ascogonial coil contains 2-6 nuclei (Fig. 14).

The cells of the hyphae surrounding the ascogonium now divide to produce

a pseudoparenchymatous envelope of about 4-6 layers of cells of which the

outer most layer becomes slightly thick-walled and inner cells remain thin-

walled (Fig. 15; Plate I, i). At this stage the ascogonium becomes coiled and

its cells become swollen and multinucleate. The thin-walled cells surrounding

the ascogonium continue to divide and later differentiate into an inner zone

of thin-walled pseudoparenchymatous cells and an outer zone of somewhat

larger thick-walled pseudoparenchymatous cells and these two zones together

constitute the wall of young perithecium (Fig. 17). In further development, a

cavity is formed around the ascogonium presumably due to disintegration of

cells in that region. At the apex of the cavity so formed, the thin-walled cells

become «meristematic» and produce a palisade of darkly staining, thin-walled,

septate, cylindrical filaments which grow down into the cavity (Fig. 18, 19;

Plate 1, j-k). These are the apical paraphyses. Cells of the apical paraphyses

are uni- or binucleate.

During the downward growth of the apical paraphyses, the ascogonial cells

are pushed down and the apical paraphyses ultimately touch the base of the

perithecial cavity (Fig. 20; Plate II, a). The cells immediately below the asco-

gonium become enlarged and vacuolated, Asci are produced at the base of the

perithecial cavity and grow upward interspersed with apical paraphyses (Fig,

21, 22; Plate II, b-d). Apical paraphyses eventually disintegrate (Fig. 23; Plate

IL, c) and mature perithecium is aparaphysate (Fig, 24; Plate II, e).

The formation of the ostiole takes place at the time the asci start growing

upward (Fig. 20, 21; Plate II, a-b). Cells of the inner region of the perithecial

wall at the morphological apex of the perithecium grow upwards and develop

an ostiolar neck. By dissolution of cells in its core a narrow canal develops.

The ostiolar canal extends from the centrum cavity to the exterior. The cells

in the ostiolar neck are thick-walled and are in the form of unbranched hyphae

with rounded tips (Fig. 25), The cells lining the ostiolar canal produce slender

periphyses.

DISCUSSION

The anamorph of Nectria kera is a Cylindrocarpon-state. The first step in

the development of the perithecium is the formation of a coiled, septate asco-

gonium, the cells of which are multinucleate. The perithecial centrum belong

Source : MNHN, Paris

144 C.V. SUBRAMANIAN and D.J. BHAT

Fig. 23-27. — Nectria kera : 23. longitudinal section of a young perithecium; 24. longitudi-

nal section of a mature perithecium; 25. longitudinal section of ostiolar region (en-

larged); 26. three asci and group of eight ascospores; 27. ascospores.

Fig. 23-27. — Nectria kera : 23. coupe longitudinale d'un jeune périthéce; 24. coupe

longitudinale d'un périthéce már; 25. détail de la région ostiolaire; 26. asques et asco-

spores; 27. ascospores (détail).

Source : MNHN, Paris

NECTRIA KERA 145

to the Nectria-type (LUTTRELL, 1951) with apical paraphyses. Thus Neciría

kera is a good hypocreaceous fungus. We have so far informations on the deve-

lopmental morphology of as many as nine species of the genus Nectria, and N.

kera is in conformity with all those, including N. cinnabarina (Tode ce Fr.)

Fr. which is the type species of the genus.

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Source : MNHN. Paris

147

LA CULTURE D'UN CHAMPIGNON

PAR LES FOURMIS ATTINES

Mise en évidence de phénoménes d'antibiose dans le nid

par J. ANGELI-PAPA*

RÉSUMÉ. — Les fourmis de la tribu des Attines, communément appelées fourmis manioc,

maintiennent dans leurs nids la monoculture d'un champignon qu'elles exploitent comme

source de nourriture. Par quels processus le champignon cultivé reste-t-il dominant dans

les conditions naturelles ? Nous avons montré que l'inhibition de la microflore bactérienne

est due au maintien d'un pH voisin de 5,0 (sécrétions acides des fourmis). En outre, les

champignons cultivés par les genres Acromyrmex et Atta manifestent des phénoménes d'anti

biose vis-à-vis des bactéries. Cette activité antibiotique amplifie l'action précédente.

SUMMARY. — Attine ants (leaf-cutting ants) cultivate a single fungus in their nests and

utilize this fungus as their food source. How the ants succeed in maintaining their fungus

culture in spite of contamination in natural condition ? We have show that the main reason

of the inhibition is due to the acidity of pH (pH — 5,0 acid secretions). The fungus asso.

ciated with the genera Acromyrmex and Affa are a source of antibiotics; this antibiotic

activity complete the precedent action.

MOTS CLES : Attines, Champignon, Flore microbienne, Antibiose.

INTRODUCTION

La culture d’un champignon est une des pratiques les plus remarquables des

fourmis de la tribu des Attines, bien connues dans les régions tropicales améri-

caines (WEBER, 1979). Sur les fragments végétaux transportés et emmagasinés

dans les nids souterrains, les fourmis maintiennent la monoculture d'un champi-

gnon qu'elles exploitent comme source de nourriture (QUINLAN & CHERETT,

1979). La vie de la société et l'extension des espéces repose sur la réussite de

la culture.

* Ce travail a été réalisé au Centre de Recherches des Antilles Guyane, Petit Bourg, Guade-

loupe, 97170.

Adresse actuelle : Muséum National d'Histoire Naturelle, Laboratoire de Cryptogamie,

12 rue Buffon, 75005 Paris.

CRYPTOGAMIE, MYCOLOGIE (Cryptog., Mycol.) TOME 5 (1984).

Source : MNHN, Paris

148 J. ANGELI-PAPA

Par quel mécanisme ce champignon cultivé reste-t-il dominant dans le milieu

contaminé que représente le nid ? En effet, il existe dans cet écosystème de

nombreux champignons compétiteurs (ANGELI-PAPA J., non publié) et une

flore bactérienne importante (PAPA F. & PAPA J., 1982). Le nid héberge

également des levures, mais celles-ci ne semblent pas entrer en compétition

avec le champignon cultivé (CRAVEN & al., 1970).

Lors d'une étude précédente (PAPA J. & PAPA F., 1982) nous avons montré

que le maintien dans le nid d'un pH voisin de 5,0 était capable d'inhiber la crois-

sance des bactéries. A cet effet majeur pourrait s'adjoindre l'action d'autres

composés chimiques possédant des propriétés inhibitrices. Ces substances pour-

raient être apportées par les végétaux, la fourmi ou les champignons.

CHERRETT (1972) a constaté que la fourmi effectue un choix de récolte

parmi les végétaux de l'environnement. Si le choix n'a pas d'influence directe

sur le développement du champignon, il est permis de penser qu'il peut exercer

une action vis-à-vis des compétiteurs bactériens.

L'hypothèse d'un contrôle possible par un antibiotique a été émise dès

1954 par SUTER. Par la suite, WEBER (1955) a suggéré qu'il pouvait s'agir

d'un agent chimique présent dans la salive des fourmis. Les travaux de MARTIN

& al. (1969) qui tentaient de vérifier cette hypothèse ont abouti à un échec.

Aucun antibiotique n'a pu être décelé chez les fourmis ni dans la eulture de leur

champignon. Les travaux de MASCHWITZ & al. (1970), de SCHILDKNECHT

(1971), SCHILDKNECHT & KOOK (1971) et SCHILDKNECHT & al. (1973)

apportent des preuves expérimentales à l'hypothése d'un contróle chimique.

Des glandes métathoraciques d'Afta sexdens, ces chercheurs isolent la myrmi-

cacine (ou acide hydroxydecanoïque), l'acide phénylacétique, l'acide indoly-

lacétique. Ces acides carboxyliques formés en petites quantités dans les glandes

et émis de manière continue dans le nid pourraient, selon ces auteurs, jouer

un rôle protecteur en inhibant la croissance des microorganismes étrangers.

Enfin, le champignon peut jouer un róle de prévention dans la contamination

du nid. HERVEY & NAIR (1979) ont apporté un argument en faveur de cette

théorie en isolant un antibiotique, la lipochlorine, à partir du champignon

cultivé par une espèce primitive, Cyphomyrmex costatus.

Le but de ce travail est de complèter ces recherches en essayant de préciser

le rôle joué par les divers partenaires du nid que sont les végétaux, la fourmi

et son champignon vis-à-vis des compétiteurs bactériens.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

1.- MÉTHODE

Souches bactériennes utilisées

Pour mettre en évidence l'activité inhibitrice, nous avons utilisé huit souches

bactériennes. Six d'entre elles sont des souches provenant de la collection de

Source : MNHN. Paris

CHAMPIGNONS - FOURMIS ATTINES 149

l'institut Pasteur et deux ont été isolées en Guadelou

pe. Leurs caractéristiques

sont résumées dans le Tableau 1.

Provenance Стат Désignation Référence Marquage

+ Bacillus subtilis 53.174 B.S.

Sarcina lutea 5345 S.L.

Institut AE Staphylococcus aureus Oxford А.268 5.0.

Pasteur - Pseudomonas aeruginosa A.13 Р.Р,

= Serratia marcescens A.173 S.M.

= Escherichia coli K 12 C.600 K.12

- Chromobacterium violaceum

as aS Salmonella panama

Tableau I. — Caractéristiques des souches bactériennes utilisées.

Table I. — Characteristics of the utilized bacterial strains.

Les germes tests provenant d'une culture de 24 heures sont mis en suspension

dans un bouillon nutritif gélosé à 2 g p. 1000. Leur densité est calculée de

manière à obtenir, aprés culture, des colonies séparées, La suspension est utilisée

soit en étalement de surface, soit sous forme de gouttes.

Choix et provenance des végétaux

Les différents échantillons de feuilles et fleurs étudiés pour leur activité

inhibitrice ont été prélevés sur plusieurs espéces habituellement récoltées dans

l'environnement par Acromyrmex octospinosus. Il s'agit de : Hibiscus (Hibiscus

rosasinensis), Flamboyant (Delonix sp.), Citronnier (Citrus sp.), Manioc (Ma-

nihot sp.), Igname (Discorea trifida), Mapou (Cordia sp.).

Récolte des fourmis

Il s'agit d'Acromyrmex octospinosus, seule. espéce présente en Guadeloupe.

Souches de champignons

Provenance Espéce fourmi Référence Marquage

7801 A1

Я ; 7802 A2

Guadeloupe Acromyrmex octospinosus | 7802 Ke

7805 А7.

Atta cephalotes 7901 A3

8009 A16

Sua Atta sexdens 7902 A4

8008 A15

Tableau II, — Caractéristiques des souches de champignons utilisées.

Table II. — Characteristics of the utilized fungal strains.

Source : MNHN, Paris

150 J. ANGELI-PAPA

VFGETAUX

A a

€ MILIEU GÉLOSE A 20x DE VEGETAL

pelos

хатої

Steritisation à l'autociave

j Broyage

ДОНЕМ Centrifugation

Stérilisation par filtration sur membrane

10,5.25.125 & d'EXTRAIT de. FOURM I

бақан

MISSE | мішіреге 2454

_ Sn IS 714

ES =a

RE ыа

gélose

du champignon ЕН

ги Suspension bacterienne

Inhibition nulle

мс

Қ kae ай

inhibition

inhibition.

++ totale

Fig. 1. — Méthodes d'étude- Préparation des milieux de culture à base de végétaux, de

fourmis et de champignons. Évaluation de l'inhibition.

Fig. 1. — Methods - Preparation of the several cultural media : natural media with leaves

extracts, ants extracts and fungi extracts. Evaluation of the inhibition.

Source : MNHN. Paris

CHAMPIGNONS - FOURMIS ATTINES 151

Elles ont été isolées de nids de différentes espèces de fourmis champignon-

nistes. Leurs caractéristiques figurent dans le Tableau ll. Ces souches provien-

nent des département frangais de Guadeloupe et de la Guyane. Les souches

d'Acromyrmex en provenance de Guadeloupe ont été isolées dans différents

lieux du département. Un article antérieur (BARBIER & al., 1981) a précisé

leur identité sur le plan immunologique.

2..MÉTHODES D'ÉTUDE

Outre la gélose témoin, différents milieux sont préparés à partir de végétaux,

fourmis et champignons (Voir schéma, fig. 1).

Gélose témoin : agar 15 g, CINa 8,5 g, eau 1000 ml.

Végétaux : Les jeunes feuilles et fleurs récoltées, lavées, sont broyées fine-

ment. Ce broyat est utilisé pour la fabrication d’un milieu gélosé où sa concen-

tration est de 20 %. (200 g de feuilles pour 1 litre d'eau)

Fourmis : Les fourmis proviennent d’un nid d'Acromyrmex octospinosus;

seuls les éléments adultes sont utilisés dans notre expérience.

Champignons : Les différentes souches de champignons sont cultivées sur le

milieu suivant : glucose 10 g, malt 3 g, levure 3 g, peptone 5 g, eau distillée

1000 ml, agar 15 g. L'inoculum est déposé sur une membrane millipore de poro-

sité 0,45 mu qui couvre la surface du milieu (Fig. 1). Après 30 jours de culture

la membrane et le champignon sont enlevés et la gélose sous-jacente est seule

utilisée dans nos essais. La moitié du milieu est enlevée stérilement et remplacée

par la gélose témoin. Le milieu final est ensemencé en surface par une couche

de gélose molle contenant des bactéries.

La lecture des différents essais est effectuée après une incubation de 48 h

à l'étuve à 37°C.

RÉSULTATS

1- Milieux végétaux

La suspension bactérienne se développe uniformément à la surface de tous les

milieux préparés avec différents végétaux. Aucune inhibition n'est à signaler.

2- Milieux à base de fourmis

De méme, sur ces milieux, aucune inhibition n'est à signaler.

3- Action des différentes souches de champignon.

Les résultats obtenus figurent sur le Tableau III. Toutes les préparations

obtenues après culture des souches fongiques associées à Acromyrmex octo-

spinosus, Atta sexdens, et Atta cephalotes inhibent les différentes souches

bactériennes. L'activité antibactérienne dépend, comme l'indique le Tableau III,

Source : MNHN, Paris

152 J. ANGELI-PAPA

Champignons bactériennes

utilises

Tableau III. — Action des substances émises par les champignons (souches cultivées par

Acromyrmex octospinosus, Atta sexdens et Atta cephalotes) sur différentes souches

bactériennes. - Évaluation de l'inhibition : voir fig. 1.

Table III. — Activity of the substances, produced by the fungus cultivated by Acromyrmex

octospinosus, Atta sexdens and Atta cephalotes on different bacterial strains. - Evalua-

tion of the inhibition : see fig. 1.

de la souche de champignon utilisée ainsi que des souches bactériennes. Les

facteurs présents dans le milieu, après culture d'un champignon, agissent à la

fois sur les bactéries gram positif et gram négatif.

DISCUSSION ET CONCLUSION

En dehors de l'action inhibitrice provoquée par les sécrétions acides des

la possibilité d’une action supplémentaire causée

par les différents partenaires du nid. Dans les conditions de notre expérience,

les végétaux, quoique sélectionnés par les fourmis, n’exercent aucune influence

sur le ralentissement du développement bactérien. Il en est de méme pour les

milieux à base de fourmis.

fourmis, nous avons étudi

Comme l'avaient précédemment remarqué HERVEY & NAIR, à propos de

Cyphomyrmex costatus, les différentes souches de champignons cultivés par

Source : MNHN, Paris

CHAMPIGNONS - FOURMIS ATTINES 153

Acromyrmex octospinosus, Atta sexdens et Atta cephalotes exercent une action

inhibitrice certaine vis-à-vis des différentes souches bactériennes utilisées. Il est

cependant permis de penser que cette action reste faible puisqu'elle n'a pas été

décelée par MARTIN & al. (1969), ni dans notre étude antérieure du nid (PAPA

J. & PAPA F., 1982). L'activité antibactérienne dépend en partie des méthodes

d'investigation. Nous avons employé une méthode utilisant la libération de

substance durant les 30 jours de culture mycélienne, ce qui a permis la mise

en évidence de l'inhibition. La présence d'antibiotique dans le milieu de culture

est ainsi démontrée; cette action antibiotique, du fait de la faible concentration

reste probablement bactériostatique (comme les résultats de l'étude microbio-

logique du nid l'avaient montré, PAPA F. & PAPA J., 1982; aucun effet léthal

ne se manifestant dans le nid).

П пе faut pas négliger, dans le maintien de la dominance, certains caractéres

de technique culturale qui tendent à privilégier le champignon cultivé, La loca-

lisation du nid dans le sol assure des conditions d'environnement constantes

(température 25°-27°, humidité 80 %, taux de CO: élevé) qui favorisent la

croissance végétative du champignon. La fabrication du substrat (QUINLAN &

CHERRETT, 1977) où interviennent les sécrétions salivaires et les liquides

fécaux, l'inoculation par bouturage mycélien sans phase de latence, l'importance

de linoculum de masse permettent un envahissement extrémement rapide

du substrat.

En résumé, l’inhibition des bactéries dans le nid se réalise de la manière

— Inhibition majeure par un pH maintenu constamment au voisinage de 5.

— Action de facteurs de sécrétion contenus dans les glandes métathoraciques

(SCHILDKNECHT, 1971)

— Action d’antibiotiques émis par le champignon cultivé.

L'identification de ces substances antibiotiques émises par les champignons

nécessiterait des études supplémentaires . Le fonctionnement de cet équilibre

biologique favorisant la prédominance du champignon cultivé est remarquable.

Il est assuré par la présence active des fourmis et les propriétés bactériostatiques

particulières du champignon cultivé par les Attines.

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Source : MNHN. Paris

Dépót légal n» 12153 - Imprimerie de Montligeon

Sorti de presses le 15 septembre 1984

Source : MNHN. Paris

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NO 2 (1942). Les matières colorantes des champignons, par 1.

Pastac. 88 pages : 15 F.

NO 3 (1943). Les constituants de la membrane chez les champignons

par R. Ulrich. 44 pages : 15 Е.

NO 7 (1959). Les champignons et nous (Chroniques) (Il), par G.

Becker. 94 pages : 25 F.

NO 8 (1966). Catalogue de la Mycotheque de la Chaire de Crypto-

gamie du Muséum National d’Histoire Naturelle. (1) Micro-

mycétes, Macromycetes (premiere partie). 68 pages ; 25 F,

No 9 (1967). Table des Matieres (1936-1965) 85 p. 20 F. - (1966-

1975) 40p. 10 F.

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