SOMMAIRE

M. BRUNETEAU et P. RICCI — Elicitation et résistance induite ........

P. RICCI, Ph. BONNET, M. PONCHET, P.M. MOLOT et M. BRUNETEAU

— Recherche et intérét d'éliciteurs fongiques dans les interactions de

trois espéces végétales avec des champignons phytopathogénes du genre

РОН ее RE ETSI INE ce:

V. GIANINAZZLI-PEARSON, S. GIANINAZZI, J. DEXHEIMER, D. MO-

RANDI, A. TROUVELOT et E. DUMAS — Recherche sur les mécanis-

mes intervenant dans les interactions symbiotiques plante-champignons

endamycorbizopénes VA а

G. GAY — Róle des hormones fongiques dans l'association ectomycorhi-

J.L. HILBERT et F. MARTIN — Modifications des profils polypeptidiques

lors de l'établissement de la symbiose ectomycorhizienne ...........

J. MUGNIER — Exemples d'études d'organismes parasites des racines dans

des cultures de racines transformées par Agrobacterium rhizogenes

G. TURIAN — Polarité de croissance-différenciation des hyphes fongiques

ES A E O ER PNE UN

B. BOTTON and M. KHOURY — Coremium and rhizomorph differentiation

in Sphaerostilbe repens. I. — Interactions between aggregated organs

during morphogenesis of the thallus .

N. ARPIN et M.L. BOUILLANT — Métabolites secondaires fongiques :

diversité de structures mais unité de fonction, la protection .........

C. ANDARY, M.J. BOURRIER et R. HAUPERT — Róle des polyols et des

acides aminés dans la différenciation des Bolets ...,.............

О ОСА За

СОМТЕМТ$

M. BRUNETEAU et P. RICCI — Elicitation and induced resistance (In

reno ео В AMAT Me MEN A EM WU ME RC RE n

P. RICCI, Ph. BONNET, M. PONCHET, P.M. MOLOT et M. BRUNETEAU

— Fungal elicitors involved in the interaction between three plant species

and phytopathogenic fungi of the genus Phytophthora (In French) .

V. GIANINAZZI-PEARSON, S. GIANINAZZI, J. DEXHEIMER, D. MO-

RANDI, A. TROUVELOT et E. DUMAS — Studies on mechanisms

involved in symbiotic plant/fungal interactions in VA endomycorrhi-

Zed Tgp Tench) Ae Meine RON RE ENTRER CURSEUR

G. GAY — Role of fungal hormones in ectomycorrhizal symbiosis (In

I OBL IAS REP NNNM qM

J.L. HILBERT et F. MARTIN — Changes in Protein Patterns induced by

the Ectomycorrhizal Symbiosis (In French) ....................

J. MUGNIER — Studies on soil-borne plant pathogens in root organ cultures

transformed with Agrobacterium rhizogenes (In French) ...+... +++»

G. TURIAN — Polarized growth-differentiation of fungal hyphae (models)

(In French) ag ;

B. BOTTON and M. KHOURY — Coremium and rhizomorph differentiatio:

in Sphaerostilbe repens. L. — Interactions between aggregated organs

during morphogenesis of the thallus ........,..... ..........

N. ARPIN et M.L. BOUILLANT — Secondary fungal metabolites : structu-

ral diversity but unity of function, the protection (In French) ........

C. ANDARY, M.J. BOURRIER et R. HAUPERT — Polyols and amino-

acids contribution in Boletes differentiation (In French) ..

Bibliography

Source

191

201

211

233

239

267

277

289

173

191

267

277

289

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CRYPTOGAMIE

LE PÉRIODIQUE FRANCAIS CONSACRÉ A LA CRYPTOGAMIE

CRYPTOGAMIE est un périodique édité par l'A.D.A.C. (Association des Amis des

Cryptogames), dont le siége est au Laboratoire de Cryptogamie du Muséum

National d'Histoire Naturelle. Les chercheurs de tous pays y publient leurs tra-

vaux en francais, allemand, anglais et espagnol, aprés accord des Comités de

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toire Naturelle. Research workers from the whole world publish their papers in

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MYCOLOGIE

TOME 9 Fascicule 3 1988

Ancienne Revue de Mycologie. Dirigée par Roger HEIM

Conférences présentées

lors de la 4éme Rencontre Nationale

du Réseau Mycologie

Lyon, 23-24 octobre 1987

Bibliothéque Centrale Muséum

ШШ

3 3001 00226858 8

DIRECTEUR SCIENTIFIQUE : Madame J. NICOT

SECRÉTAIRE DE RÉDACTION : Mme M.C. BOISSELIER. ÉDITEUR : A.D.A.C

Publié avec le concours du Muséum National d'Histoire Naturelle

CRYPTOGAMIE, MYCOLOGIE est indexé par : Biological Abstracts, Current Contents,

Publications bibliographiques du CDST (Pascal)

Source : MNHN, Paris

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Cryptogamie, Mycol. 1988, 9 (3) : 173-189 173

ÉLICITATION ET RÉSISTANCE INDUITE

par Maud BRUNETEAU* et Pierre RICCI**

RÉSUMÉ. — Au cours des interactions plantes-parasites, des molécules appelées élici-

teurs et provenant de l'un ou de l'autre partenaire interviennent comme signaux pour

déclencher chez le végétal des mécanismes actifs de défense. L'effet caractéristique de

ces éliciteurs est d'induire une protection de la plante à l'égard d'infections ultérieures.

Selon les cas, cette protection est localisée aux tissus directement traités ou s'étend

de maniére systémique à l'ensemble de l'organisme.

SUMMARY. — Elicitors are signal-molecules which are produced during the interactions

plant-parasite by either of the partners. They trigger off self-defense mechanisms of the

vegetal and induce a protective effect against further infections. This effect in either

located in the tissues directly implicated or spreads the whole organism in a systemic

way.

MOTS CLES : interactions, éliciteurs, signaux, protection, systémique.

INTRODUCTION

Les plantes subissent au cours de leur vie toutes sortes d’agressions dont

celles de nombreux parasites qui provoquent chez le végétal des états patho-

logiques plus ou moins graves,

Le devenir de l'interaction entre plante et parasite se décide dans les pre-

miéres heures qui suivent la phase de pénétration et au cours desquelles se

manifestent localement d'importantes modifications biochimiques et histo-

logiques. Ces modifications peuvent aboutir à créer un état de résistance lo-

cale ou s'étendant de maniére systémique (DE WIT, 1985). Ces deux compo-

santes peuvent d'ailleurs être simultanément présentes dans la réponse de la

plante.

On admet actuellement que les réactions de défense des plantes sont

induites par la reconnaissance du «non soi» qui peut avoir lieu soit au cours

* Laboratoire de Biochimie Microbienne, Université Claude Bernard, Lyon I, CNRS

UA 1176,43 Bd du 11 Novembre 1918, F-69622 Villeurbanne Cedex.

** LN.R.A, Villa Thuret, BP. 2078, F-06606 Antibes Cedex.

Source : MNHN, Paris

174 M. BRUNETEAU et P. RICCI

de l'infection (KUC, 1982 a, b, c), ou étre provoquée artificiellement par un

prétraitement de la plante avec des composés appelés éliciteurs.

Pendant longtemps les phénomènes de la résistance induite chez les végé-

taux ont surtout été envisagés sous leur aspect défense. Ce n'est que depuis

quelques années seulement qu'a été entrepris l'isolement à partir d'agents

pathogènes de substances responsables du déclenchement chez la plante d'un

état de résistance induite ou de phénomènes corrélatifs de cette résistance.

Nous proposons dans le présent article de décrire la nature des effecteurs

de la résistance induite et des inducteurs de résistance connus actuellement.

Nous rapporterons aussi les résultats de nombreux travaux qui permettent

d'avoir une approche du niveau et du mode d'action primaire de ces éliciteurs

et de leur attribuer un róle éventuel dans les interactions höte-parasite.

LES EFFECTEURS DE LA RÉSISTANCE INDUITE

Une plante réagit activement aux tentatives d'infection par un ensemble

de mécanismes qui aboutissent à la résistance induite. Les premiéres mani-

festations de cette fonction de défense générale de la plante consistent le

plus souvent en une synthése d'éthyléne (ESQUERRE-TUGAYE & al., 1980;

TOPPAN & ESQUERRE-TUGAYE, 1984), en une synthése d’enzymes ly-

tiques susceptibles de lyser les parois fongiques, chitinase, ß (1,3) glucanase

(HAMMERSCHMIDT & KUC, 1982; ROBY & al., 1987; KUROSAKI & al.,

1987a), en une synthése d’inhibiteurs protéasiques. Cette activité métabo-

lique s'accompagne souvent également d'une synthése et d'une accumulation

localisée de métabolites secondaires, phénolamides et phytoalexines

(STOESSL, 1965, 1967; PONCHET & al., 1982, 1984; MANSFIELD, 1982;

BOUILLANT & al., 1983), d'une modification locale de la composition des

parois végétales avec accumulation de callose, cellulose, lignine, cutine

(HACHLER & HOHL, 1982), de glycoprotéines riches en hydroxyproline

(ESQUERRE-TUGAYE & LAMPORT, 1979; ESQUERRE-TUGAYE & al.,

1979).

Ces effecteurs de résistance s’opposent A la progression des microorga-

nismes pathogènes. Parmi ces mécanismes, les plus étudiés sont la synthèse

et l'accumulation des phytoalexines; PAXTON (1981) définit les phyto-

alexines comme étant des composés antimicrobiens de faible masse molécu-

laire synthétisés et accumulés dans les plantes aprés exposition à des micro-

organismes. Ce sont des produits issus du métabolisme secondaire des végé-

taux, trés divers selon les espéces dans leur nature et leur voie de biosynthése

(Fig. 1).

Les phytoalexines ne sont pas seulement des agents antimicrobiens, elles

sont également phytotoxiques pour la plante qui les produit (SMITH, 1982;

ZERINGUE, 1987); AMIN & al. (1987) ont démontré que l'effet phyto-

toxique de la 6-méthoxy-melléine, phytoalexine accumulée chez la carotte,

se traduit par une inhibition de la phosphorylation des protéines solubles

par inactivation du systéme calmoduline-calcium.

Source : MNHN, Paris

ÉLICITATION ET RÉSISTANCE INDUITE 175

co,

photosynthèse

sucres

cycle dés pentoses glycolyse

acide phosphoénolpyruviqu

—acide "shikimique

ide pyruvique

acétyl CoA.

ac.aminés ALCALOIDES | D

aromatiques r

1 i

i ac.amines_ Cycle de Krebs б

ac.cinnamiques. malonyl CoA :

ac.mévalonique

phénylpropanoides !

ac.gras ie

stéroides

| caroténoïdes

FLAVONOIDES STILBENES PHENANTHRENES POLYKETIDES POLYACETYLENES TERPENOIDES

Exemples :

glycéollineI resvératrol orchinol 6-méthoxymelléine safynol capsidiol

(soja) (arachide,vigne) (orchis) ^ (carotte) (carthame) (piment)

Figure 1 — Nature chimique et voies de biosynthèse des phytoalexines (d’après RICCI, 1986).

Figure 1 — Chemical nature and biosynthesis pathways of phytoalexines (from RICCI, 1986).

LES INDUCTEURS DE RÉSISTANCE.

DÉFINITION ET NATURE CHIMIQUE

L'implication de la synthése et de l'accumulation des phytoalexines dans la

résistance a été démontrée dans de nombreuses interactions (MANSFIELD,

1982; FABRE & al., 1986) et les phytoalexines sont des marqueurs métabo-

liques trés souvent utilisés pour définir si une substance est biologiquement

active dans le processus de l'élicitation.

Ainsi à l'origine KEEN & al. (1972) ont introduit le terme d'éliciteur pour

désigner les substances capables de déclencher la production de phytoalexines

dans une plante, en l'absence de l'organisme pathogéne vivant. Toutefois comme

le note STOESSL (1982), les phytoalexines ne sont aucunement les agents

Source : MNHN, Paris

176 M. BRUNETEAU et P. RICCI

x PLANTE INDUCTION

MATURE DE L'ELICITEUR. ORIGINE PAE REFERENCES

NATURE DE L'ELICITEUR REFERENCES.

ELICITEURS POLYSACCHARIDIQUES

B(1-3)(1—6)-D-GLUCANES PHYTOPHTHORA MEGASPERMA SOJA GLYCEOLLINE SHARP & al. (19840)

SACCHAROMYCES CEREVISIAE SOJA —— GLYCEOLLINE MANN & ALBERSHEIM (1978)

RHIZOBIUM JAPONICUM HARICOT PHaseoLLINeE pupmas (1980)

B(1=3) єт B(1-0)-5- COLLETOTRICHUN

HARICOT PHASEOLLINE ANDERSON (1978)

GLUCANES LINDEMUTHIANUN

GLUCOHANNANE PHYTOPHTHORA MEGASPERMA SOJA GLYCEOLLINE KEEN 4 YOSHIKAWA (1983)

CHLTOSANE FUSARIUM SOLANI POIS PISATINE MADICER & BECKMAN(1980)

(POLYGLUCOSAMINE B(1—4)

ELICITEURS GLYCOPROTEIQUES

GLYCOPROTEINES THERMOSTABLES

CONTENANT

R MANNOSE ET GLUCOSE PHYTOPHTHORA MEGASPERMA sova GLYCEOLLINE KEEN a LEGRAND (1980)

PHYTOPHTHORA PARASITICA OEILLET DIANTHALEXINE

DIANTHRAMIDE A FABRE & al. (1986)

X MANNOSE ET GALACTOSE COLLETOTRICHUM

Lass

JAR IUM MELON ETHYLENE TOPPAN & ESQUERRE-TUCAYE

(ae)

X MANNOSE, GLUCOSE ET DE WIT 4 ROSEBOOM(ISBO)

Ыс CLADOSPORIUN FULVUM TOMATE RISHITINE E s

lI GLYCOPROTEINES THERMOSENSIRLES

À ACTIVITE ENZYMATIQUE

X ENDOPOLYGALACTURONASE RHIZOPUS STOLONIFER RICIN CASBENE Lee & west (1981)

% POLYGALACTURONIQUE ERWINIA CAROTOVORA sova GLYCEOLLINE DAVIS 8 at. (1982)

LYASE

Tableau 1 — Éliciteurs Polysaccharidiques et Glycoprotéiques.

Table I — Polysaccharidic and Glycoproteic Elicitors.

Source : MNHN, Paris

ÉLICITATION ET RÉSISTANCE INDUITE 177

d'un mécanisme de défense unique et méme, dans certains cas, elles ne jouent

aucun róle dans la résistance induite (MOLOT & al., 1986) ce qui fait qu’actuel-

lement nous préférons définir un éliciteur comme une substance intervenant

dans une interaction hóte-parasite et capable d'induire chez le végétal un état

de résistance ou de déclencher des phénoménes corrélatifs de cette résistance

(RICCI & BRUNETEAU, 1984; RICCI, 1986).

Les éliciteurs actuellement connus, peuvent étre classés en éliciteurs exogénes

et en éliciteurs endogènes. Parmi les éliciteurs exogénes, il faut distinguer ceux

qui sont d'origine biotique et abiotique.

Éliciteurs exogènes biotiques

Les éliciteurs exogènes biotiques regroupent les composés fongiques et

bactériens isolés de la paroi ou du filtrat de culture. Ce sont soit des polysaccha-

rides, soit des glycoprotéines, soit des lipides.

De trés nombreux glycanes montrent une activité inductrice de phytoalexine

(Tabl. I). Une seule structure est actuellement connue, il s’agit d’un heptaglu-

coside isolé de la paroi de Phytophthora megasperma (Fig. 2) (SHARP & al.,

1984 a, b).

8-D-Glcp 1-6 BD Glcp 1-6 0DGlcp 1-6 BD-Gicp 1-6 B-D-Gicp

3 3

\ 1

1 1

ВО бер 8D-Glcp

Figure 2 — Structure de l'heptaglucoside fongique isolé de Phytophthora megasperma.

(d'aprés SHARP & al., 1984 b).

Figure 2 — Structure of the fungal heptaglucoside from Phytophthora megasperma. (from

SHARP & al., 1984b).

Des glycopeptides inducteurs de glycéolline, phytoalexine accumulée chez

le soja ont également été extraits de la paroi de Phytophthora megasperma

(KEEN & LEGRAND, 1980). Des glycopeptides isolés de Cladosporium fulvum

élicitent l'accumulation de rishitine chez la tomate (DE WIT & ROSEBOOM,

1980; РЕ WIT & KODDE, 1981). Chez le melon, la synthèse d'éthylène est

stimulée par des fractions phosphoglycopeptidiques isolées du mycélium de

Colletotrichum lagenarium (TOPPAN & ESQUERRE-TUGAYE, 1984; ROBY &

al, 1985). FABRE & al. (1986) ont isolé de la paroi de Phytophthora parasi-

tica des éliciteurs glycopeptidiques qui induisent chez l'œillet une protection

vis-à-vis du parasite, corrélée à l'accumulation de dianthalexine et de dian-

thramide A (Tabl. I).

Ont également été isolées d'autres glycoprotéines dont le pouvoir éliciteur

est lié à une activité enzymatique : activité endopeptidasique (SWINBURNE,

1975), ou encore activité s'exerçant au niveau des composés pectiques (LEE &

WEST, 1981; DAVIS & al., 1982, 1984) (Tabl. I).

Source : MNHN, Paris

178 M. BRUNETEAU et P. RICCI

Les éliciteurs lipidiques (Tabl. IT) ont été surtout isolés du mycélium de

Phytophthora infestans. Ce sont des fractions lipoconjuguées contenant des

acides gras insaturés en Co, l'acide arachidonique et l'acide eicosapentaénoique

(BOSTOCK & KUC, 1980; BOSTOCK & al., 1981; KURANTZ & OSMAN,

1983). Dans la paroi fongique, ces acides pourraient amidifier les groupements

aminés des résidus glucosamine (GARAS & KUC, 1981).

NATURE DE L'ELICITEUR ORIGINE M PLANTE INDUCTION:

a == SWR DE REFERENCES

ACIDES GRAS INSATURES EN Coy

x ACIDE 5,8,11,14,17 KURANTZ & OSMAN (1983)

CIS-EICOSAPENTAENOTOUE r

x ACIDE 5,8,11,14

CIS-EICOSATETRAENOTQUE

Bostock & KüC (1980)

GLYCOLIPIDES

GLEN эбен „бск

1 | 1

Ан ан а

1 ie)

RCo

R-CO = ACIDES GRAS INSATURES EN Cop

canas a RUC (1981

TRIGLYCERIDES

Cy ~ CH — Ch;

IS IE

9 9 9 KURANTZ & OSMAN (1983)

пе

R-CO = ACIDES GR NC

0 = ACIDES GRAS INSATURES EN Cop

PHOSPHOLIPIDES

х CERAMIDE AMINOETHYL PHOSPHONATE

YR CREAMER 4 aosTocK (1986)

e Jane

CH5- (CHCH = CH-CH-CH 0-7 — Сн -Сну- Ну

HM б

со

R- CO 7 AcibE 5,8,11,14

CIS-EICOSATETRAENOTQUE

Tableau II — Éliciteurs Lipidiques

Table II — Lipidic Elicitors.

Récemment des éliciteurs phospholipidiques ont été isolés du mycélium de

Phytophthora infestans (CREAMER & BOSTOCK, 1986) et de Phytophthora

capsici (LHOMME & al., 1986).

Ainsi la nature chimique des éliciteurs exogénes biotiques présente une grande

diversité.

Source : MNHN, Paris

ÉLICITATION ET RÉSISTANCE INDUITE 179

Dans le cas d'éliciteurs glycoconjugués l'intégrité de la molécule ou une partie

seulement est indispensable pour l'expression de son activité élicitrice.

L'activité des fractions glycopeptidiques isolées de Colletotrichum lagenarium

ou de Phytophthora megasperma dépend de la partie polysaccharidique; dans le

cas des glycopeptides isolés de Cladosporium fulvum, l'activité élicitrice de

rishitine chez la tomate dépend de la partie protéique. En ce qui concerne les

éliciteurs de dianthalexine et de dianthramide A chez l'oiillet, l'intégrité de la

molécule glycopeptidique est nécessaire pour l'expression de son activité bio-

logique.

Par ailleurs la structure des composés fongiques, biologiquement actifs,

intervenant dans le système Phytophthora megasperma-soja, semble avoir une

incidence dans la réaction d’élicitation puisque les diverses fractions élicitrices

différent par leur niveau d'activité (KEEN & al., 1983).

L'incidence de la composition et de la structure des composés fongiques dans

le phénoméne d’élicitation a également été observée récemment par HAMDAN

& DIXON (1987). Ces auteurs ont noté que l'induction de l'activité des enzymes

intervenant dans la biosynthése des phytoalexines dépendait du taux de mannose

présent dans les fractions actives isolées du filtrat de culture de Colletotrichum

lindemuthianum.

Éliciteurs exogènes abiotiques

L'accumulation de phytoalexines a été depuis longtemps observée lorsqu'une

plante est soumise à l'action d'un traitement physicochimique (BAILEY, 1982).

Cette élicitation dite «abiotique» (YOSHIKAWA, 1978) provoque des dom-

mages cellulaires ou une nécrose consécutive à un effet de blessure ou de cyto-

toxicité (ISHIGURI & al., 1978). RICCI & ROUSSE (1983) ont démontré que

l'induction de phytoalexines par un herbicide sélectif n'a lieu que chez les

plantes pour lesquelles ce composé est phytotoxique.

Éliciteurs endogènes

L'existence d’éliciteurs constitutifs (HARGREAVES & BAILEY, 1978) ou

endogènes (HAHN & al., 1981) a été démontrée par les travaux de HARGREA-

VES & BAILEY (1978), de HARGREAVES & SELBY (1978) et de LYON

& ALBERSHEIM (1982). Elle a été confirmée par les travaux de DIXON & al.

(1983). Ces auteurs ont montré que la plante peut relarguer à partir de ses

propres tissus des substances ayant une activité élicitrice sur elle-même. Un

éliciteur endogéne du soja extrait de la paroi végétale par hydrolyse acide ou

hydrolyse enzymatique (DAVIS & al., 1982, 1984) est un polysaccharide pec-

tique, un a-D-dodécagalacturonide (NOTHNAGEL & al., 1983).

MODE ET NIVEAU D'ACTION DES INDUCTEURS DE RÉSISTANCE

Le mode et le niveau d'action des éliciteurs chez le végétal sont assez mal

définis actuellement.

Source : MNHN, Paris

180 M. BRUNETEAU et P. RICCI

Certains éliciteurs exogénes peuvent avoir un effet cytotoxique qui aboutit

à la libération d'un médiateur d'origine végétale, l'éliciteur endogéne (Fig. 3).

Il parait trés vraisemblable que les mécanismes de défense des plantes puissent

s'orienter sous la dépendance de fragments polysaccharidiques de leur propre

paroi cellulaire, fragments qui se comportent comme des substances de régu-

lation. ALBERSHEIM & DARVILL (1985) les appellent les oligosaccharines.

ELICITEUR EXOGENE [SIGNAL PRIMAIRE)

PAROI

EFFET HYOROLYSE

CYTOTOXIQUE ENZYMATIQUE

ELICITEUR ENDOGENE ACCES ÉLICITEUR EXOGENE MODIFIE

D DIRECT

SIGNAL SIGNAL

SECONDAIRE SECONDAIRE

MEMBRANE PLASMIQUE

Figure 3 — Voies d'accès de l'éliciteur exogène de la paroi à la membrane de la cellule

végétale.

Figure 3 — Access ways of the exogenous elicitor from the cell wall to the membrane of

the plant cell.

La découverte d'éliciteurs endogénes dans des tissus nécrosés a conduit

BAILEY (1982) à proposer l'hypothése selon laquelle l'élicitation passerait

obligatoirement par une nécrose cellulaire. Récemment BONNET & al. (1985,

1986) ont isolé du milieu de culture de diverses espéces de Phytophthora incom-

patibles pour le tabac des inducteurs de nécrose foliaire, qui élicitent en méme

temps une protection de cette plante vis-à-vis de son parasite, Phytophthora

nicotianae. Il n'est pas certain que cette situation soit générale.

La cible finale de l'éliciteur, éventuellement via certains médiateurs, est le

généme. L’élicitation à pour effet d’activer les gènes codant pour les enzymes

de la voie de biosynthése des phytoalexines (LAWTON & al., 1983 a, b).

Le chitosane, éliciteur chez le pois confronté a Fusarium solani, accèderait

au noyau de la cellule-hôte et HADWIGER & BECKMAN (1980) supposent

qu'il interférerait directement avec le matériel génétique. Mais les cibles pri-

maires de l'éliciteur peuvent être aussi des récepteurs portés par la membrane

plasmique de la cellule végétale.

L'existence de récepteurs membranaires n'a été que partiellement démontrée

par YOSHIKAWA & al. (1983) puis récemment par SCHMIDT & EBEL (1987).

La transmission du message à travers la membrane pourrait alors résulter

d’une interaction avec un effecteur membranaire, ce qui suppose l'existence de

Source : MNHN, Paris

ÉLICITATION ET RÉSISTANCE INDUITE 181

messagers secondaires. Il est. postulé à l'heure actuelle que ces messagers pour-

raient étre l'éthyléne et le calcium.

Рано! CELLULAIRE

MEMBRANE PLASMIQUE

X дом mann 7 \ \

+ 4 mco

| ама

Chitinase

Modification

Е Ide la |

composition

cat ett cal de la

parol

teur Exogène ЕР, EF :Etfecteur membranaire

EM:Eliciteur exogéne Modifié par hydrolyse x ET: Ethyléne

enzymatique —— EM,:Heptaglucoside ou EL

dodecagalacturonide ET

S oa PAL:Phénylalanine Ammonia -Lyase

E protéine PE Prothine sative RCH дао бика a Hyd rare

rome: Y CCL:4-Coumaroy! CoA Ligase

Récepteur M inhibiteur FS : Flavanone Synthase

Figure 4 — Mode d’action primaire des éliciteurs (d’après KÖHLE & al., 1985).

Figure 4 — Mode of action of the elicitors (from KOHLE & al., 1985).

De nombreux travaux de l'équipe d'ESQUERRE-TUGAYE (TOPPAN & al.,

1982; TOPPAN & ESQUERRE-TUGAYE, 1984; ROBY & al., 1985) ont montré

qu’un effet primaire des éliciteurs est de stimuler chez la plante la production

d’éthylène, considéré comme un signal dans la synthèse protéique.

STAB & EBEL (1987) ont montré pour leur part que la réponse à l'éliciteur

était calcium dépendante. Ce dernier peut alors jouer un rôle de messager se-

condaire activant des systèmes enzymatiques impliqués dans la biosynthèse

des métabolites secondaires (ZOOK & al., 1987).

Selon les travaux de KUROSAKI & al. (1987 b) le calcium interviendrait

dans la synthèse de la 6-méthoxy-melléine, phytoalexine induite dans les cellules

de carotte, corrélativement avec l'AMP-cyclique. En revanche, chez le soja,

HAHN & GRISEBACH (1983) n'observent aucune corrélation entre l'élicitation

de glycéolline et le taux d'AMP-cyclique.

On peut aussi supposer une intervention de la calmoduline chez l'ceillet; la

chlorpromazine, un inhibiteur de la calmoduline, bloque l’elieitation des phyto-

alexines par les glycopeptides de Phytophthora parasitica (FERRARIS, 1987).

Source : MNHN, Paris

182 M. BRUNETEAU et P. RICCI

RÓLE ÉVENTUEL DES ÉLICITEURS

DANS L'INTERACTION HÔTE -PARASITE

Il est bien acquis aujourd’hui que des substances isolées de champignons ou

bactéries pathogènes induisent chez les plantes des mécanismes de défense et,

qu'apportées antérieurement à une inoculation, elles puissent assurer une protec-

tion. En revanche, il n'a pas été démontré en général que ces éliciteurs inter-

viennent effectivement au cours des interactions plantes-parasites, mais c'est là

une hypothése raisonnable.

Dans une telle interaction, éliciteurs microbiens libérés par les enzymes de

la plante (KEEN & YOSHIKAWA, 1983; WOODWARD & al., 1980; HADWI-

GER & al, 1981; GALLIARD, 1978) et éliciteurs endogénes libérés par les

enzymes du parasite (DAVIS & al., 1982, 1984) ou par suite de l'action nécro-

tique de ses phytotoxines pourraient concourir de manière additive voire syner-

gique (DAVIS & al., 1986) à induire la mise en place de mécanismes multiples

contribuant à créer dans les tissus du végétal un état de résistance à l'infection

(Fig. 5). La résistance effective dépendrait d’une part de la rapidité d'installation

du parasite, d'autre part d'une régulation des modalités de réponse de la plante

à l'éliciteur.

extraction ELICITEUR

BIOTIQUE

PARASITE

ELICITEURS

ABIOTIQUES

physiques

chimiques

eli.end

inhibition

MBRUNETEAU.PRICCL 1984

Figure 5 — Rôle des éliciteurs dans l'interaction hôte-parasite (d’après RICCI & BRUNE-

TEAU, 1984).

Figure 5 — Role of the elicitors in host-parasite interaction (from RICCI & BRUNETEAU,

1984).

MNHN.

ÉLICITATION ET RÉSISTANCE INDUITE 183

Ainsi, la capacité des isolats de Phytophthora parasitica à infecter l'osillet

dépend essentiellement de leur aptitude à coloniser les tissus avant l'apparition

des phytoalexines (RICCI, 1986). Pour éviter la résistance qu'ils induisent chez

la plante, d'autres parasites en réduisent les effets, par exemple en détoxifiant

les phytoalexines (VAN ETTEN, 1982), ou dépriment la capacité de réaction

du végétal par émission d'une pathotoxine.

Il a aussi été proposé que les éliciteurs pourraient étre directement des sup-

ports de la spécificité parasitaire. L’interaction compatible correspondrait a la

non-reconnaissance de «l'éliciteur spécifique» par la plante sensible (KEEN,

1982). Dans les feuilles de tomates infectées par Cladosporium fulvum on trouve

des protéines qui portent la spécificité parasitaire du champignon : elles n'in-

duisent de nécrose que chez les variétés de tomate incompatibles avec la race

de C. fulvum utilisée; ces protéines peuvent étre considérées comme des élici-

teurs de nécrose spécifiques (DE WIT & al., 1984, 1985).

Une situation comparable pourrait exister, au niveau de la spécificité d'hôte

cette fois, dans les interactions tabac-Phytophthora : P. nicotianae est la seule

espèce à n'induire ni nécrose foliaire ni protection chez cette plante (BONNET,

1985).

De ce point de vue cependant, la plupart des éliciteurs actuellement isolés

doivent être considérés comme aspécifiques (DARVILL & ALBERSHEIM,

1984). Ce qui n'empéche pas qu'ils soient reconnus par la plante avec une grande

spécificité chimique : dans le cas de l'heptaglucoside de Phytophthora mega-

sperma (Fig. 2), la position des deux ramifications (1,3) conditionne l'activité

élicitrice chez le soja (SHARP & al., 1984 c).

CONCLUSION

La caractérisation de molécules naturelles capables d'induire chez les plantes

un état de résistance ouvre des perspectives passionnantes pour la compréhension

du parasitisme comme pour la lutte phytosanitaire.

L'utilisation directe des éliciteurs comme agents de traitement préventif

des cultures a évidemment été tentée. Elle se heurte cependant à des difficultés

pratiques : complexité, diversité et dégradabilité des motifs actifs, difficulté de

pénétration, caractère généralement local, temporaire et partiel de la protection

obtenue. Elle n’est peut-être pas sans inconvénient non plus si on songe aux

possibles effets physiologiques non intentionnels des éliciteurs ou au risque de

voir les populations parasitaires s'adapter aux mécanismes de défense de la plante

d'autant plus vite que ceux-ci seront exposés en permanence.

Mais les éliciteurs sont aussi des révélateurs de la nature et de l'intensité du

potentiel de défense d'un végétal. A ce titre, ils peuvent constituer des outils

précieux pour identifier les traitements chimiques et culturaux capables de

limiter les risques d'infection parasitaire, ou pour la sélection de nouvelles sour-

ces de résistance.

Source : MNHN, Paris

184 M. BRUNETEAU et P. RICCI

Enfin, c'est sárement de l'élucidation du mode d'action des divers éliciteurs

sur la cellule végétale et sur la plante entiére que découleront les progrès les

plus significatifs. La connaissance que nous en avons aujourd’hui est encore

fragmentaire et imprécise.

Il faut souligner en particulier que la plupart des expériences sont réalisées

avec des extraits éliciteurs bruts ou seulement partiellement purifiés. L'isole-

ment et la caractérisation complète des motifs éliciteurs, l'obtention de prépa-

rations élicitrices chimiquement définies pour les essais biologiques constituent

une étape indispensable que le Biochimiste et le Phytopathologiste doivent

franchir de concert.

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RECHERCHE ET INTÉRÉT D'ÉLICITEURS FONGIQUES

DANS LES INTERACTIONS DE TROIS ESPECES VÉGÉTALES

AVEC DES CHAMPIGNONS PHYTOPATHOGENES

DU GENRE PHYTOPHTHORA

par Pierre RICCI*, Philippe BONNET*, Michel PONCHET*,

Paul Michel MOLOT** et Maud BRUNETEAU***

RESUME — Chez des champignons du genre Phytophthora, on a recherché des éliciteurs

capables d'induire chez l'eeillet, le piment ou le tabac une protection vis-a-vis de P. parasi-

tica, P. capsici ou P. nicotianae, respectivement. On a ainsi identifié une fraction parictale

glycopeptidique active sur œillet, des éliciteurs lipidiques (en particulier, un sphingophos-

pholipide à inositol) protecteurs du piment et des protéines élicitrices chez le tabac. La

comparaison des trois systèmes a révélé que les éliciteurs présentent une certaine spécifi-

cité selon la plante-cible, en méme temps que des modes d'action différents. Chez l'œillet, la

protection localisée est liée à l'accumulation de phytoalexines N-benzoylanthraniliques.

L'effet des éliciteurs lipidiques chez le piment n'implique pas l'intervention du capsidiol et

peut s'étendre à la plante entière. La protection du tabac par des protéines extracellulaires

de Phytophthora spp. s'accompagne d’une réaction de type hypersensible et paraît caracté-

ristique des espèces incapables de coloniser cette plante.

SUMMARY — In fungi belonging to the genus Phytophthora, we have looked for elicitors

able to protect carnation, pepper or tobacco against P. parasitica, P. capsici or P. nicotianae,

respectively. We have thus identified a cell wall glycopeptidic fraction active on carnation,

lipidic elicitors (especially an inositol-containing sphingophospholipid) which protect

pepper and proteins with elicitor activity on tobacco. A comparison of the three systems

indicated that elicitors are rather plant-specific and diverse in their mode of action. In car-

nation, local protection depends on the accumulation of N-benzoylanthranilic phytoalexins.

Pepper protection by the lipidic elicitors does not involve capsidiol and can be systemic.

Extracellular proteins from Phytophthora spp., together with protecting tobacco, induce an

hypersensitive-like reaction which appears characteristic of the Phytophthora species unable

to colonize tobacco.

MOTS CLÉS : Phytophthora, Dianthus caryophylius, Capsicum annuum, Nicotiana taba-

cum, éliciteurs, résistance induite, phytoalexines.

* Station de Botanique et de Pathologie végétale, Villa Thuret, I.N.R.A., В.Р. 2078, 06606

Antibes Cedex, France.

** Station de Pathologie végétale, I.N.R.A., B.P. 94, 84140 Monfavet, France.

*** Laboratoire de Biochimie microbienne, Université Claude Bernard - Lyon 1, 43 Bd du

11 novembre 1918, 69622 Villeurbanne Cedex, France.

Source

MNHN, Paris

192 RICCI et al.

INTRODUCTION

Le concept d'éliciteur de réactions de défense chez les plantes a reçu ses

premières vérifications expérimentales dans les années soixante-dix (cf. BRUNE-

TEAU & RICCI, 1988). Ces expériences concernaient des maladies des Légu-

mineuses, en particulier l'interaction entre le soja et Phytophthora megasperma,

et il se révéla que les motifs actifs impliqués étaient des polysaccharides. On a

eu tendance à considérer par la suite qu'il devait en étre de méme pour tous les

éliciteurs en général et que les mêmes molécules, ou des molécules voisines,

devaient étre actives chez des plantes diverses (DARVILL & ALBERSHEIM,

1984). Pour vérifier la validité de cette conception, il était important d'étendre

la recherche d'éliciteurs à d'autres systémes biologiques.

Nous rapporterons ici un ensemble de travaux dans lesquels nous nous som-

mes attachés à identifier des éliciteurs provenant de champignons du genre

Phytophthora, actifs sur trois espèces végétales : l’ceillet (Dianthus caryophyllus

L.), le piment (Capsicum annuum L.) et le tabac (Nicotiana tabacum L.). Tout

en démontrant que les molécules élicitrices sont en réalité de nature chimique

différente selon la plante-cible, ces recherches ont éclairé, dans chacun des

systèmes étudiés, un aspect particulier des mécanismes de défense mis en jeu.

L'intérét de l'étude des éliciteurs s'en trouve ainsi diversement illustré.

RÉSULTATS

Choix d’un critère commun d’élicitation.

Dans une première étape, il était nécessaire de choisir une définition opéra-

toire de l’activité élicitrice, applicable aux trois systèmes envisagés. Le critère

communément retenu est l'induction de phytoalexines (BLOCH & al., 1984),

ce qui n’est pas entièrement satisfaisant lorsque ces métabolites résultent de

voies de biosynthèse différentes chez les plantes à comparer (STOESSL, 1982).

Dans le cas présent, ce seul critère ne pouvait convenir. En effet, si l'infection

du piment par Phytophthora capsici s'accompagne d'une accumulation de capsi-

diol, cette phytoalexine ne joue pas un rôle essentiel dans la résistance au cham-

pignon (MOLOT & al., 1981). Il en est de même chez le tabac (où le capsidiol

et d'autres sesquiterpènes antifongiques ont été signalés) vis-à-vis de P. nicotia-

nae (BUDDE & HELGESON, 1981).

Pour les besoins de notre étude, nous avons donc considéré qu'une molécule

avait une activité élicitrice chez une plante lorsqu'elle était capable de la pro-

téger contre une inoculation ultérieure par une espéce de Phytophthora patho-

gène pour cette plante. Un protocole expérimental d'appréciation du pouvoir

éliciteur a été défini pour chaque interaction. Le principe en est toujours le

même : la molécule ou la fraction à tester est appliquée en solution ou en sus-

pension dans l'eau sur un organe blessé. Pour l'œillet, il s’agit de boutures non

encore enracinées et fraîchement recoupées dont la base trempe dans la prépa-

ration élicitrice; pour le piment, de cotylédons détachés en survie, flottant sur

Source : MNHN, Paris

ÉLICITEURS EXTRAITS DE PHYTOPHTHORA 193

l'eau, qui reçoivent une goutte de 25 ul de préparation au centre du limbe;

dans le cas du tabac, une goutte de 20 ul est apportée sur la tige, fraîchement

décapitée, d'un plant de 2 à 3 mois. Un jour plus tard (2 jours dans le cas du ta-

bac), on apporte au même site un inoculum calibré d'un isolat agressif. On ob-

serve ensuite les symptómes révélateurs d'une invasion de l'organe par le champi-

gnon, en comparaison avec des plantes témoins inoculées aprés apport d'eau

stérile au lieu et place de l'éliciteur.

En considérant de la sorte des «éliciteurs de protection», nous étions assurés

d'impliquer des mécanismes de défense efficaces et nous évitions toute hypo-

thése a priori sur la nature de ces mécanismes. Comme nous le verrons plus loin,

c’est en utilisant une fraction inductrice de protection que nous avons pu, à

l'inverse, démontrer l'existence et l'importance de phytoalexines chez l’eillet.

Diversité chimique des motifs éliciteurs.

Dans les cultures d’ceillet, les boutures récemment plantées sont parfois

détruites par P. parasitica qui provoque une pourriture du collet. Nous avons

montré qu'on peut étudier ce système, de façon simplifiée, sur des boutures

non encore enracinées (RICCI, 1986). En traitant à l’eau chaude, selon AYERS

& al. (1976), des parois purifiées de P. parasitica, nous avons obtenu un extrait

pariétal hydrosoluble (EP) qui, dans le test précédemment décrit, assure une

protection compléte de ces boutures à partir d'une concentration de l'ordre de

20 à 100 ug/ml. Nous avons d'abord recherché les motifs responsables de cette

activité parmi les polysaccharides neutres contenus dans l'extrait pariétal (EP),

par analoge avec les résultats publiés chez le soja (AYERS & al., 1976) et le

haricot (ANDERSON, 1978). Des chromatographies d'échange d'ions, d'affini-

té et d’exclusion ont abouti à la séparation de trois catégories de 81-3 Р glu-

canes différant par leur masse moléculaire et leur degré de ramification en 1-6

(FABRE & al., 1984). Appliqués à l'œillet, ils se sont montrés trop peu élici-

teurs pour pouvoir rendre compte de l'activité de EP (FABRE & al., 1986).

Dans un autre domaine cependant, ces glucanes ont révélé une activité anti-

tumorale intéressante (BRUNETEAU & al., 1988).

Dans les différents types de fractionnement de EP que nous avons utilisés,

le pouvoir éliciteur sur œillet a toujours été associé à des fractions glycopepti-

diques riches en mannose (résult. non publ.). Cette activité est d'ailleurs sensible

non seulement à l'oxydation périodique (d’où l'implication d’un motif poly-

saccharidique), mais aussi à l’action de la pronase, ce qui indique qu’une partie

protéique est indispensable (FABRE & al., 1986).

Considérons maintenant le cas du piment qui est également sujet à une

pourriture des racines et du collet, due cette fois à P. capsici. Une activité

élicitrice de protection (dans le test sur cotylédons en survie) a été trouvée

chez l'agent pathogène, dans un extrait mycélien d'une part, dans des filtrats

de culture d'autre part (MOLOT & al., 1980). Dans le premier cas, le motif

actif a pu être isolé et caractérisé (LHOMME & al., 1986) : il s'agit d'un sphingo-

phospholipide à inositol dont la structure exacte vient d’être élucidée (LHOM-

ME, com. pers.). Dans le second cas, il a été démontré que l'activité était liée,

Source : MNHN, Paris

194 RICCI et al.

là aussi, à une fraction lipidique. Ce résultat n'est pas sans rappeler le róle de

certains acides gras insaturés dans l'élicitation chez la pomme de terre (cf.

BRUNETEAU & RICCI, 1988). Pour autant, il ne faudrait pas généraliser à

toutes les Solanacées : ce n'est pas à des lipides qu'a abouti la recherche d'éli-

citeurs actifs chez le tabac.

La maladie du «black shank» du tabac correspond à un envahissement du

collet et de la base de la tige par P. nicotianae. Le prétraitement de tiges de

tabac décapités avec des filtrats de culture d’autres Phytophthora, non parasites

du tabac (xénoparasites), les protège contre une inoculation ultérieure par P.

nicotianae (BONNET & al., 1986). A partir de l'espèce xénoparasite P. crypto-

gea, la molécule élicitrice a été complétement purifiée : il s’agit d’une protéine

de masse moléculaire proche de 10000 d (BONNET & al., 1985) que nous avons

appelée cryptogéine. Des résultats très récents indiquent que l'effet protecteur

sur tabac observé avec le filtrat de culture de P. capsici est également lié à une

protéine de masse moléculaire voisine. Ni phosphore, ni sucre n'ont été détectés

dans ces éliciteurs purifiés (BILLARD & al., 1988).

Ayant ainsi étudié chaque système séparément, nous avons ensuite comparé

l'activité des différents éliciteurs sur les trois plantes-hótes (RICCI & al., 1986).

Comme on peut le voir sur le tableau I, il n'y a qu'un cas d'élicitation croisée :

la cryptogéine, active sur le tabac, a aussi un effet protecteur chez le piment.

En revanche, les f-glucanes extraits de la paroi de P. parasitica n'ont aucune

Espéce fongique Source Nature de la Activité protectrice sur :

fraction. Oeillet Tabac Piment

P. parasitica paroi B-glucanes € 0 0

" " glycopeptides ++ 0 0

P. capsici mycélium — phospholipide 0 0 ++

т filtrat de lipoconjugués 0 0 +

culture

" " glycopeptides Е ++ 0

P. cryptogea filtrat € ++ ++

Tableau I — Induction de protection de trois espèces végétales vis-à-vis de l'infection par des

Phytophthora par application de fractions élicitrices extraites de Phytophthora spp.

(daprès RICCI & al., 1986).

Table I — Induction of protection in three plant species against infection by Phytophthora

with elicitor fractions extracted from Phytophthora spp. (from RICCI & al., 1986).

Source : MNHN, Paris

ÉLICITEURS EXTRAITS DE PHYTOPHTHORA 195

action et la fraction glycopeptidique qui élicite les phytoalexines de l'œillet ne

protège ni le piment, ni le tabac. De même, les polysaccharides et glycoconju-

gués extraits du mycélium de P. capsici ont très peu d'action sur le piment

Enfin, des trois plantes envisagées, seul le piment réagit à des composés lipidi

ques. En effet, dans la préparation extracellulaire de P. capsici signalée anté-

rieurement comme élicitrice à la fois sur piment et tabac (RICCI & al., 1986),

un fractionnement ultérieur a permis de séparer une fraction lipidique active

seulement sur piment et une fraction glycopeptidique élicitrice de protection

chez le tabac (résult. non publ.).

Comme on ne dispose habituellement, pour les essais d'élicitation, que d'ex-

traits fongiques bruts contenant ces différents types de molécules, l'opinion

s'est répandue que les éliciteurs ont une activité universelle. Nos expériences,

conduites avec des molécules pures ou des extraits purifiés, montrent au con-

traire que chaque espèce végétale reconnaît des motifs particuliers comme

signaux déclenchant ses mécanismes actifs de défense.

Protection et production de phytoalexines chez l’œillet.

Les boutures d'eillet trempées dans l'extrait éliciteur EP à concentration

suffisante se comportent comme totalement résistantes à une inoculation par

P. parasitica pratiquée après 16 à 24 heures de traitement. Ces boutures ne

développent aucun symptôme d'invasion et,tant par réisolement à partir de

coupes transversales que par observation histologique, il n'est pas possible de

mettre en évidence le parasite à l'intérieur des tissus, alors méme que l'éliciteur

EP est dépourvu d'effet direct sur les zoospores ou le mycélium du champignon

(RICCI, 1986).

L'analyse des tissus de la base des boutures ayant été en contact avec l'élici-

teur a révélé laccumulation de molécules nouvelles. Les deux composés majori-

taires (Fig. 1), baptisés dianthalexine (BOUILLANT & al., 1983) et méthoxy-

dianthramide S (précédemment, dianthramide A : PONCHET & al., 1984),

peuvent être considérés comme résultant de la formation d'une liaison amide

entre un dérivé de l'acide anthranilique et un dérivé de l'acide benzoique. Ces

‘COOH

j KX

a b HO

Figure 1 — Structure des deux principales phytoalexines de l'œillet : la dianthalexine (a) et

la méthoxydianthramide S (b) (d'aprés BOUILLANT & al., 1983; PONCHET & al.,

1984, 19884).

Figure 1 — Structure of the two main phytoalexins of carnation : dianthalexin (a) and

methoxydianthramide S (b) (from BOUILLANT & al., 1983; PONCHET & al., 1984,

19883).

Source : MNHN, Paris

196 RICCI et al.

deux composés sont, en fait, les représentants prépondérants d'une famille de

dérivés N-benzoyl- (ou N-cinnamoyl-) anthraniliques particuliers aux Caryophyl-

lacées (PONCHET & al., 19882).

La plupart de ces molécules ont été synthétisées chimiquement (HAUTE-

VILLE & al., 1988), ce qui a facilité l'étude de leur activité antifongique. Elles

interférent avec la croissance mycélienne de P. parasitica; elles sont particuliére-

ment efficaces sur les zoospores, dont elles provoquent la lyse ou dont elles

inhibent la germination à partir d'une concentration de l'ordre de 10 ug/ml

(RICCI, 1986).

Ces molécules antifongiques s'accumulent également au cours de l'interaction

entre la plante et le champignon vivant (RICCI, 1986); elles présentent donc

tous les caractéres de phytoalexines (PAXTON, 1981). Nous avons vérifié par

ailleurs que, aprés application d’éliciteur et quelles que soient les conditions

du traitement, il existe une corrélation entre le taux de boutures protégées et

la quantité de phytoalexines accumulées (RICCI, 1986). Il apparaît ainsi que la

production de phytoalexines constitue, concurremment avec la protection, une

mesure fiable de la réponse de l'ocillet à l'élicitation.

Dans ce cas précis, la recherche d’un éliciteur a donc contribué à révéler des

phytoalexines de nature chimique nouvelle. Comme leur activité antifongique

ne se limite pas aux Phytophthora (PONCHET & al., 1988b), c'est un mécanisme

de défense de portée sans doute assez générale qui a été ainsi mis en évidence

chez l'œillet.

Elicitation et protection systémique chez le piment,

Le sphingophospholipide qui protége le piment constitue, avec l'heptaglu-

coside éliciteur de glycéolline chez le soja et les acides arachidonique et eicosa-

pentaénoique actifs sur pomme de terre, l'un des rares motifs éliciteurs com-

plétement caractérisés (BRUNETEAU & RICCI, 1988). Son mode d’action

demeure en revanche mystérieux.

L'utilisation de préparations purifióes a permis en tout cas d'établir que la

protection du piment par les éliciteurs lipidiques mycélien ou extracellulaire

n'implique pas le capsidiol. Cette phytoalexine ne s'accumule qu’aprés inocula-

tion et n'est pas plus abondante dans les tissus protégés que dans les tissus non

élicités (MOLOT & al., 1985).

Un autre aspect remarquable de leur action est son caractère systémique sur

plantule entière. Lorsqu'un cotylédon non détaché, mais dont l'extrémité a

été excisée, est trempé dans une préparation du phospholipide mycélien, on

constate que le feuillage de la jeune plante est partiellement protégé vis-à-vis

d'une pulvérisation ultérieure de zoospores de P. capsici. Les mêmes plantules

de piment, ainsi traitées par l'éliciteur, produisent des exsudats racinaires qui ont

une activité dépressive sur la sporocystogénése du parasite (MOLOT & al., 1987).

On ignore pour l'instant si ces effets résultent d’une migration de l'éliciteur

lui-même ou s’il y a propagation d’un signal endogène dans la plante.

Source : MNHN, Paris

ÉLICITEURS EXTRAITS DE PHYTOPHTHORA 197

Elicitation et spécificité parasitaire chez le tabac.

La protection du tabac par les filtrats de culture des Phytophthora xéno-

parasites présente un caractère singulier : elle s'accompagne de manifestations

nécrotiques foliaires, plus ou moins intenses, à distance du point d'application

de Véliciteur. Les mémes nécroses s'observent lorsque le tabac est inoculé par ces

Phytophthora (BONNET, 1985). L'obtention de cryptogéine purifiée a permis

de démontrer que nécroses foliaires et protection sont provoquées par la méme

molécule élicitrice; il y a simultanément production de protéines b (BONNET,

1988). L'association de ces diverses manifestations rappelle le faciès classique

de la réaction d'hypersensibilité, telle qu'elle s'observe dans l'interaction entre

Nicotiana tabacum et le Virus de la Mosaïque du Tabac, et ses répercussions

sur la résistance à P. nicotianae (Mc INTYRE & DODDS, 1979). Les protéines

du type cryptogéine sont peut-être à considérer comme des éliciteurs d'hyper-

sensibilité.

Par ailleurs, les seuls filtrats de culture auxquels il n'a pas été trouvé d'acti-

vité nécrosante et protectrice proviennent d'isolats du parasite : P. nicotianae

(BONNET, 1985). Il est donc permis de se demander si un facteur important

du pouvoir pathogéne spécifique de l'agent du «black shank» à l'égard du tabac

ne serait pas une absence ou une réduction de la production d’éliciteurs. En

évitant d'être reconnu par le végétal, le parasite échapperait à un déclenchement

précoce des mécanismes de défense. Cette hypothèse correspond précisément

au modèle «éliciteur-récepteur» proposé par КЕЕМ (1982) pour expliquer la

spécificité parasitaire.

Pour tenter de vérifier cette hypothèse, une situation favorable se présente :

la comparaison entre P. nicotianae et P. parasitica. Il s'agit en effet d'espèces

très proches; pour certains auteurs, la première ne serait même qu'une «forme

spéciale» de la seconde, inféodée au tabac (ERWIN, 1982). S'il se confirmait en

tout cas qu'elles sont interfertiles, il serait possible de vérifier génétiquement

la corrélation inverse qui semble exister entre production d'éliciteur protéique

et pouvoir pathogène à l'égard du tabac.

CONCLUSION

Il ressort de cette étude que le concept d'éliciteur recouvre une réalité tout

aussi diversifiée que celui, par exemple, de phytoalexine. Les molécules à activité

protectrice diffèrent par leur nature chimique, leur localisation chez le parasite

(pariétale ou extra-cellulaire) et leur mode d'action sur la plante (locale ou sys-

témique, via les phytoalexines ou d'autres réactions cellulaires).

Cette diversité ne refléte pas seulement celle des agents pathogénes, mais

au moins autant celle des plantes-cibles. Chaque espéce végétale semble avoir, en

amont de ses dispositifs de défense, un système de reconnaissance des signaux

d'alerte (un mode de perception du «non-soi») qui lui est propre.

Il est probable également que, selon le critère retenu pour définir l'élicita-

tion, on découvre des aspects quelque peu différents de ce système de reconnais-

Source : MNHN, Paris

198 RICCI et al.

sance. Le critére de l'induction de protection, s'il n'est pas le plus commode sur

le plan opératoire, est sans doute le plus significatif pour le Phytopathologiste.

Enfin, il n’est pas impossible que des parasites aient acquis une aptitude a

échapper à la reconnaissance par une plante donnée et que ce mécanisme puisse

expliquer certains aspects de la spécialisation parasitaire.

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RECHERCHE SUR LES MÉCANISMES INTERVENANT

DANS LES INTERACTIONS SYMBIOTIQUES

PLANTE-CHAMPIGNONS ENDOMYCORHIZOGÈNES VA

par V. GIANINAZZI-PEARSON*, S. GIANINAZZI*, J. DEXHEIMER**,

D. MORANDI*, A. TROUVELOT* et E. DUMAS*

RÉSUMÉ — Comme la plupart des plantes forment des endomycorhizes à vésicules et

arbuscules (VA), il est vraisemblable que des systèmes de compatibilité plante-hóte / cham-

pignons VA aient été développés au cours de l'évolution. Dans cet article, nous discutons

l'existence de phénomènes de reconnaissance, du contrôle de l'hôte sur le développement

du champignon VA et de la mise en place d'une compatibilité fonctionnelle permettant les

échanges nutritifs entre les deux symbiotes.

SUMMARY — Since the large majority of plant species form vesicular arbuscular (VA)

endomycorrhizae, it is highly probable that compatibility systems have been specifically

developed by the mycorrhizal associates during their evolution. This paper discusses evi-

dence for recognition phenomena and host control over fungal development in VA endo-

mycorrhizae, together with the role of these processes in the establishment of functional

compatibility, characterized by nutrient exchange, between the symbionts,

MOTS CLES : endomycorhizes VA, interactions symbiotiques, infection endomycorhi-

zienne, compatibilité.

INTRODUCTION

Lorsqu'on considére les différentes relations plante/microorganismes, il est

remarquable de constater que la presque totalité des espéces végétales forme le

méme type d'association symbiotique, à savoir les endomycorhizes à vésicules

et arbuscules (VA) (GIANINAZZI-PEARSON, 1984). On peut alors se demander

si, au cours de leur évolution, les plantes et les champignons VA n'ont pas déve-

loppé spécifiquement des systémes de compatibilité réciproque assurant leur

développement dans les différents écosystémes colonisés.

* Station d'Amélioration des Plantes, INRA, BV 1540, 21034 Dijon Cedex, France.

** Laboratoire de Biologie des Ligneux, BP 235, 54500 Vandceuvre-les-Nancy Cedex,

France.

Source : MNHN, Paris

202 V. GIANINAZZI-PEARSON et al.

cellules

externes

уте

parench

cortical

Source : MNHN, Paris

INTERACTIONS PLANTES / CHAMPIGNONS VA 203

L'utilisation raisonnée en pratique culturale des associations endomycorhi-

ziennes pour optimiser la croissance des végétaux nécessite de bien comprendre

les mécanismes qui permettent l'établissement et le fonctionnement de cette

symbiose. Pour que des endomycorhizes se forment, il doit exister entre le

champignon et la plante-hôte des phénomènes de reconnaissance réciproque qui

assurent l'intégration morphologique et la compatibilité fonctionnelle entre les

deux partenaires (GIANINAZZI-PEARSON & GIANINAZZI, 1988). Vu la

complexité structurale et physiologique des associations endomycorhiziennes

(GIANINAZZLPEARSON & GIANINAZZI, 1986), les phénomènes de recon-

naissance entre les deux symbiotes peuvent se situer à plusieurs niveaux de

l'interaction entre les deux organismes, à savoir, avant, durant et aprés le con-

tact initial. C'est ainsi que nous étudions les interactions au niveau cellulaire

et moléculaire entre les deux partenaires pour préciser les mécanismes qui dé-

terminent la mise en place et le contrôle de l'infection endomycorhizienne

ainsi que la compatibilité fonctionnelle entre plante et champignon. En parti-

culier, nous essayons de répondre à un certain nombre de questions fondamen-

tales :

— Y-a-til des phénoménes de reconnaissance entre les deux symbiotes ? Des

signaux sont-ils échangés entre les cellules des deux organismes ? Et quelles sont

les molécules spécifiques impliquées ?

— Quelle est la nature morphologique et biochimique des interfaces entre

plante et champignon VA ? Et quel rôle jouent-elles dans les échanges entre

les deux partenaires ?

I. — MISE EN PLACE DE LA SYMBIOSE

AU NIVEAU TISSULAIRE ET CELLULAIRE

Chez les endomycorhizes VA, la rencontre entre le champignon et une racine

semble se faire au hasard. Les hyphes, une fois entrées en contact avec la surface

racinaire de l'hôte, se différencient d'une façon plus ou moins marquée, en

appressorium, traduisant ainsi la reconnaissance des cellules hôtes par l’endo-

phyte. La pénétration qui s'en suit est intercellulaire ou intracellulaire, les deux

Planche 1 — A : pénétration de Glomus mosseae dans une racine d'Allium porrum; on y ob-

serve la formation d’un appressorium (ap) et des hyphes (h) traversant les cellules ex-

ternes et formant des arbuscules (a) dans les cellules internes du parenchyme. — B :

représentation schématique de la localisation d’activité ATPasique plasmalemmique (*)

de la plante-hóte dans les cellules d'une racine infectée (M) ou non (NM) par un champi-

gnon endomycorhizogéne VA.

Plate 1 — A : Infection of an Allium porrum root by Glomus mosseae; an appressorium

(ap) is formed at the root surface, hyphae (h) cross the outer cells and arbuscules (a)

develop in the parenchymal cells of the cortex. — B: Diagrammatic representation of

host plasmalemma-bound ATPase activity (*) in cells of an endomycorrhizal (M) and

nonmycorrhizal (NM) root.

Source : MNHN, Paris

V. GIANINAZZI-PEARSON et al.

204

Source : MNHN, Paris

INTERACTIONS PLANTES / CHAMPIGNONS VA 205

processus étant facilités par l’action lytique du champignon VA (KINDEN &

BROWN, 1975; GIANINAZZI-PEARSON & al., 1981; JACQUELINET-JEAN-

MOUGIN & al., 1988). Dans le cas d'une pénétration intracellulaire, l'hyphe

traverse les cellules des couches externes de la racine linéairement ou en formant

une simple boucle. Ensuite au niveau du parenchyme cortical, le champignon

prolifére et forme des arbuscules intracellulaires (Pl. 1). Cette modification

morphologique, spécifiquement induite dans les cellules du parenchyme cortical,

aboutit à la formation d’un haustorium endocellulaire où la paroi modifiée

du champignon (BONFANTE-FASOLO, 1982) est en contact étroit avec le

plasmalemme de la cellule-hôte (DEXHEIMER & al., 1979). Les bases molécu-

laires de cette induction ne sont pas connues, mais il est évident que les molé-

cules ou signaux responsables doivent être communs à la plupart des espèces

végétales. Ces observations jointes au fait que le champignon VA ne franchit

jamais le cylindre central ni le méristème racinaire traduisent l'existence d'un

contrôle de l'infection par la plante-hôte au niveau tissulaire.

La réaction de la plante à la pénétration fongique, au niveau des cellules

externes de la racine, semble se limiter à la prolifération du plasmalemme autour

de l'hyphe et au dépôt, par cette membrane, de matériel pariétal contre la paroi

fongique (BONFANTE-FASOLO, 1984). Dans les cellules du parenchyme

cortical, la réaction de la cellule-hôte à la pénétration du champignon est dans

un premier temps semblable à ce qui se passe dans une cellule externe; ensuite

avec le développement de l'arbuscule, l'aspect de la cellule-hôte change complé-

tement pour ressembler à celui d'une cellule juvénile : la vacuole est très frag-

mentée et son volume extrêmement réduit, alors que le volume du cytoplasme,

le nombre d'organites et la surface des systèmes membranaires (plasmalemme et

réticulum endoplasmique) augmentent considérablement. Simultanément et

avec la progression du champignon VA dans la cellule, le dépôt de matériel

pariétal dans l'interface devient de plus en plus faible jusqu'à étre réduit à quel-

ques fibrilles éparses (BONFANTE-FASOLO & al, 1981). Le champignon

semble donc interférer avec l'activité de la cellule-héte pour empécher le dépot

Planche 2 — Visualisation en microscopie optique de protéines b codées par la plante (GIA-

NINAZZI, 1984), par la technique d'immunomarquage avec amplification à l'argent

(VANDERBOSCH, 1986), dans les racines de Nicotiana tabacum var. Xanthi-nc infec-

tées par Glomus mosseae (résultats non publiés). — A, B : incubation de coupes semi-

fines avec un anticorps monoclonal anti-b; (CARR & al., 1987) et localisation d'immu-

nomarquage dans les cellules contenant des arbuscules vivants («afgms). C, D : témoin

sans incubation avec l'anticorps; absence d'immunomarquage dans les cellules infectées

«ә

Plate 2 — Light microscope localisation of plant-coded b-proteins (GIANINAZZI, 1984),

using the silver enhancement technique (VANDERBOSCH, 1986), in roots of Nicotiana

fabacum var. Xanthi-nc infected by Glomus mosseae (unpublished results). — A, B :

immunolabelling in cells with living arbuscules ( in a root section incubated with

anti-b; monoclonal antibody (CARR & al., 1987). — C, D : control section incubated

without antibody; absence of immunolabelling in infected cells (<1).

Source : MNHN, Paris

206 V. GIANINAZZI-PEARSON et al.

de ce matériel et ainsi échapper à son contróle. Ces interactions champignon

VAI cellule-hôte présentent aussi l'avantage de rapprocher au maximum les deux

protoplastes (fongique et végétal) en favorisant ainsi des échanges nutritionnels

réciproques entre les deux symbiotes. Toutefois cette situation est limitée dans

le temps, au bout de quelques jours l'arbuscule meurt encapsidé par ce matériel

glycoprotéique et la cellule-hôte retrouve graduellement son aspect normal

(JACQUELINET-JEANMOUGIN & al, 1988). Le champignon poursuit son

développement en infectant d'autres cellules de la racine, mais l'infection n’est

pas synchronisée au niveau tissulaire et on peut retrouver les différentes étapes

dans une même section de la racine.

Ces observations font ressortir l'existence de phénomènes de reconnaissance

réciproque entre champignon VA et plante : la morphologie du champignon

ainsi que sa structure pariétale changent avec son développement dans les tissus

racinaires; l'hóte réagit à cette colonisation et met en place des processus pour

la limiter.

II. — MÉCANISMES DE CONTRÔLE

DE L'INFECTION MYCORHIZIENNE

Bien qu’on ne sache pas encore comment la plante exerce un contrôle sur le

développement du champignon, nous avons constaté que l'infection VA induit

chez la plante-hôte l'apparition de molécules considérées comme indicatrices

des phénomènes de résistance aux microorganismes. En effet, nous avons montré

chez le soja (MORANDI & al., 1984) que le champignon VA provoque dans les

racines une augmentation de la teneur en phytoalexines et en certains isoflavo-

noides analogues, composés dont l'action antimicrobienne est connue (BAILEY

& MANSFIELD, 1982). De plus, nous venons de mettre en évidence, dans les

cellules infectées de mycorhizes de tabac, la présence de protéines b (Pl. 2)

connues pour étre associées à la localisation d'une infection fongique au niveau

des parties aériennes (GIANINAZZI & al., 1980).

III. — COMPATIBILITÉ FONCTIONNELLE

L'intégration morphologique qui résulte de la cohabitation des deux parte-

naires endomycorhiziens permet la mise en place d'échanges bidirectionnels

entre macro et microsymbiote. L'interface vivante qui se développe au niveau

de l'arbuscule entre le plasmalemme de l'hóte et la paroi de l'endophyte est

considérée comme une structure essentielle à l'état symbiotique de l'associa-

tion endomycorhizienne VA. Comme cette interface fonctionnelle doit jouer

un róle trés important non seulement dans l'échange des métabolites, mais

aussi au niveau des phénoménes de reconnaissance entre plante et champignon

VA, nous nous efforgons de la caractériser au niveau moléculaire (GIANI-

NAZZLPEARSON & al., 1984). Ainsi nous avons montré que dans une cellule

corticale renfermant un arbuscule, le plasmalemme - hóte synthétisé autour du

Source : MNHN, Paris

INTERACTIONS PLANTES / CHAMPIGNONS VA 207

champignon est, d'une part, morphologiquement et cytochimiquement iden-

tique au plasmalemme normal (DEXHEIMER & al., 1985) et, d'autre part,

doté de certaines activités enzymatiques (phosphatase neutre, ATPase) géné-

ralement absentes des cellules non-infectées du parenchyme cortical, mais

typiques des cellules juvéniles et non différenciées (JEANMAIRE & al., 1985;

GIANINAZZI-PEARSON & GIANINAZZI, 1988).

Les phosphatases neutres sont considérées comme des marqueurs biochimiques

de sites de production de polysaccharides pour l'édification des parois (GOFF,

1973; JEANMAIRE & al., 1985). Il est donc particulièrement intéressant de

constater une activité phosphatasique neutre très intense le long du plasma-

lemme de l'hôte en contact avec l'arbuscule, y compris autour des jeunes hyphes

où le dépôt pariétal est très réduit ou absent. Cela conforte l'hypothèse que le

champignon VA interfére activement avec les processus de production du maté.

riel pariétal, ce qui pourrait libérer des oligosaccharides qui joueraient alors le

rôle de messagers chimiques cellulaires, comme il est proposé pour d'autres

interactions plante/microbe (McNIEL & al., 1984).

La présence d’une activité ATPasique sur le plasmalemme est considérée

comme une indication de l'existence de phénomènes actifs de transports trans-

membranaires (SMITH & SMITH, 1986). Au niveau des cellules du parenchyme

cortical, cette enzyme est spécifiquement localisée sur le plasmalemme de la

plante-héte entourant les branches de l'arbuscule, alors que, contrairement aux

phosphatases neutres, elle est absente lorsque les hyphes sont mortes. De méme

nous n'avons jamais observé une activité ATPasique intense sur le plasmalemme

autour des hyphes colonisant les cellules externes de la racine alors que l'enzyme

est trés active au niveau du plasmalemme non invaginé (Pl. 1B) (GIANINAZZI-

PEARSON & GIANINAZZI, 1988). Cette localisation spécifique, autour de l'ar-

buscule vivant, de l'activité ATPasique plasmalemmique de l'hôte met en évi.

dence, encore une fois, l'existence de phénomènes de reconnaissance entre plante

et champignon VA. De plus la présence d'une enzyme fonctionnelle liée au

transport transmembranaire sur le plasmalemme, là oà l'apoplaste entre les

deux symbiotes est réduite au minimum, permet de penser que les cellules

infectées du parenchyme cortical acquièrent la capacité d'absorber des éléments

nutritifs du sol via le champignon endomycorhizogéne VA et d'expliquer, du

moins partiellement, la meilleure croissance des plantes endomycorhizées.

CONCLUSIONS

De l'ensemble de ces travaux, il ressort clairement que de nombreux méca-

nismes doivent intervenir dans les interactions symbiotiques plante-champignon

endomycorhizogéne VA . Toutefois certains de ces mécanismes mis en route ont

été observés aussi lors de l'infection par des champignons pathogènes (dépôt

pariétal, stimulation de la production de phytoalexines, accumulation de pro-

téines b), alors que d’autres apparaissent comme spécifiques à l'association

symbiotique endomycorhizienne. En particulier le maintien de l'intégrité struc-

Source : MNHN, Paris

208 V. GIANINAZZI-PEARSON et al.

turale et physiologique du plasmalemme de la cellule-hóte, contraste avec les

altérations observées dans le cas des infections par des pathogénes biotrophes

(MANNERS & GAY, 1983; WOODS & GAY, 1987). La connaissance de cette

membrane et des modifications qu'elle subit en présence du symbiote fongique

est donc essentielle à la compréhension des phénomènes impliqués dans la spéci-

ficité symbiotique des associations endomycorhiziennes VA. Cela parait d'autant

plus vrai que chez des plantes non hótes, les infections par les champignons VA

ne comptent pas d'arbuscules (HIRREL & al., 1978; OCAMPO & al., 1980;

PLENCHETTE & TROUVELOT, 1986) et les rares cas de pénétrations intra-

cellulaires par ces champignons n'ont été trouvé que dans des cellules mortes

(GLENN & al., 1985; GIANINAZZI-PEARSON & GIANINAZZI, 1988).

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RÓLE DES HORMONES FONGIQUES

DANS L'ASSOCIATION ECTOMYCORHIZIENNE

par Gilles GAY*

RESUME — L’aptitude des champignons ectomycorhiziens à libérer des hormones ainsi que

le rôle de ces substances dans l'établissement et le maintien de l'association symbiotique

sont précisés dans cet exposé. La plupart des champignons ectomycorhiziens libèrent de

l'acide indole-3-acétique (АТА) lorsqu'ils sont cultivés en présence d'un précurseur, le

tryptophane. L'AIA d'origine fongique est en grande partie responsable de l'hyperramifi-

cation caractéristique des systèmes racinaires portant des mycorhizes. Outre son effet rhizo-

géne, ce métabolite pourrait affecter la perméabilité membranaire des cellules de la racine

hôte, le fonctionnement de leur génome ainsi que la mise en place de leur paroi.

Certains champignons ectomycorhiziens libérent aussi des gibbérellines, des cytokinines

ou de l'éthylène. L'aptitude à produire ces métabolites n'a toutefois été observée que pour

un nombre limité de champignons et leur rôle dans l'association symbiotique est encore

mal connu,

SUMMARY — The capability of ectomycorrhizal fungi to release hormones and the func-

tion of these metabolites in the ectomycorrhizal symbiosis are reviewed. Most ectomycor-

thizal fungi release indole-3-acetic (IAA) when cultivated in the presence of a precursor

containing the indole ring (e.g. tryptophan). Fungal IAA enhances branching of the invaded

root systems and is mainly responsible for the typical morphology of ectomycorrhizas.

Moreover, AA released by ectomycorrhizal fungi is symbiotic association might affect the

permeability of host cells. It might also modify genome transcription and translation and

induce an impaired host cell wall organisation.

Some ectomycorrhizal fungi also release gibberellins, cytokinins or ethylene. As yet,

this capability has been detected in a limited number of fungi. Hence, the function of these

metabolites in the ectomycorrhizal symbiosis has never been studied in depth,

MOTS CLES : mycorhize, champignon, acide indole-3-acétique, cytokinine, éthyléne,

hormone.

ABRÉVIATIONS : AIA : Acide indole-3acétique, AIB : Acide indole-3-butyrique, АТР

acide indole-3-propionique, ANA : acide naphtaléne acétique.

* Université Claude-Bernard. Lyon 1, Institut de Chimie et de Biologie Moléculaires et

Cellulaires, Unité de Mycologie associée au CNRS (UA 1127), Bátiment 405, 43 Boulevard

du 11 Novembre, 69622 Villeurbanne Cedex.

Source : MNHN, Paris

212 С. САУ

INTRODUCTION

L'association ectomycorhizienne est une symbiose racinaire faisant intervenir

deux partenaires, une plante supérieure et un champignon. Cette association

symbiotique concerne surtout les essences forestières des zones tempérées.

Le champignon, en général un basidiomycète ou un ascomycète, envahit princi-

palement les racines absorbantes de l'arbre qui sont transformées en ectomyco-

rhizes. Celles-ci sont caractérisées par l'absence de poils absorbants et par la pré-

sence d’un manchon mycélien pseudo-parenchymateux qui entoure totalement

la racine : c'est le manteau fongique. A partir de la zone interne du manteau,

des hyphes s'insinuent entre les cellules du parenchyme cortical de la racine hóte

oà elles forment un réseau trés dense appelé réseau de HARTIG, mais elles ne

pénétrent jamais à l'intérieur des cellules de l'hóte. Sous l'influence du champi-

gnon, les systémes racinaires colonisés émettent de nombreuses ramifications

qui sont elles aussi transformées en mycorhizes. Cette stimulation par le champi-

gnon de l'activité rhizogéne de la plante est à l'origine de l'hyperramification

caractéristique des systémes racinaires colonisés par des champignons ectomyco-

rhiziens.

L'effet bénéfique de l'association ectomycorhizienne sur la croissance et la

nutrition minérale de la plante hôte a été mis en évidence par HATCH dés 1937.

Depuis cette date, de nombreux auteurs (cf. HARLEY, 1969; HARLEY &

SMITH, 1983; GIANINAZZI & al., 1982; GIANINAZZI-PEARSON & GIANI-

NAZZI, 1986) ont montré que l'infection ectomycorhizienne stimule l'absorp-

tion des éléments minéraux (principalement l'azote et le phosphore) et leur

intégration dans le métabolisme de la plante. L'association symbiotique est de

même bénéfique pour les champignons mycorhiziens. Ceux-ci ont en général une

aptitude très faible à dégrader la cellulose ou les composés pectiques. Ils trou-

vent donc dans les exsudats racinaires de la plante hôte les hydrates de carbone

simples dont ils ont besoin. De nombreux autres composés organiques (acides

aminés, vitamines, etc...) contenus dans les exsudats racinaires sont également

utilisés par les champignons, certains d'entre eux étant probablement indis-

pensables au déroulement complet de leur cycle et notamment de leur fructi-

fication (MELIN, 1963; DEBAUD & GAY, 1987).

Les aspects nutritionnels de l'association ectomycorhizienne ont fait l'objet

de nombreuses études physiologiques et biochimiques et sont maintenant

relativement bien compris. Par contre, les mécanismes impliqués dans l'établis-

sement et le maintien de l'association symbiotique ont été peu étudiés. Les

métabolites fongiques susceptibles d'intervenir à ce niveau sont, soit des sub-

stances impliquées dans les phénoménes de reconnaissance entre les deux parte-

naires, soit des composés ayant un róle de régulateur de croissance ou exergant

une action de type hormonal sur le développement des tissus de l'hóte. Des sub-

stances affectant la libération de métabolites par les cellules de l'hóte ou permet-

tant aux champignons mycorhiziens d'étre compétitifs vis-à-vis des saprophytes

ou des pathogènes pourraient aussi être impliquées. Parmi ces différentes sub-

stances, les hormones ont été les plus étudiées. Certains champignons ectomyco-

Source : MNHN, Paris.

HORMONES FONGIQUES ET ECTOMYCORHIZES 213

thiziens en culture pure libèrent en effet des cytokinines, des gibbérellines ou de

l'éthylène. La production de ces metabolites, qui pourraient intervenir dans

certaines séquences morphogénétiques de l'établissement de l'association sym-

biotique, n'a toutefois été observée que pour un nombre limité de champignons.

Par contre, pratiquement tous les champignons ectomycorhiziens liberent de

Vauxine ou acide indole-3-acétique (AIA) lorsqu'ils sont cultivés en présence

de tryptophane.

C'est pourquoi l'aptitude des champignons ectomycorhiziens à produire des

hormones et notamment de l'AIA a tout d'abord été précisée dans ce travail.

Le róle de ces métabolites dans l'établissement et le maintien de l'association

symbiotique a ensuite été envisagé à la lumière des connaissances actuelles

concernant le mode d’action des hormones et leur influence sur la croissance

des végétaux supérieurs.

PRODUCTION ET RÔLE DE L'AIA FONGIQUE

DANS L'ASSOCIATION ECTOMYCORHIZIENNE

Le rôle de l'AIA en tant que médiateur de l'activité mycorhizogène des

champignons a été étudié à la suite des travaux de Mc DOUGALL & DUFRE-

NOY (1944) mettant en évidence l'hyperauxinie des ectomycorhizes. Ce méta-

bolite peut étre produit par de nombreux microorganismes, qu'il s'agisse de

bactéries ou de champignons. Il n’est donc pas surprenant de constater que

pratiquement tous les champignons ectomycorhiziens libèrent de l'AIA lorsqu'ils

sont cultivés en présence d'un précurseur de l'auxine, le tryptophane (MOSER,

1959; ULRICH, 1960; HORAK, 1963, 1964; TOMASZEWSKI & WOJCIE-

CHOWSKA, 1975; STRZELCZYK & al, 1977; GAY & al, 1982; EK & al.,

1983; ROUILLON & al, 1986 ). Cette production nécessite le plus souvent

un apport de quantités importantes de précurseurs contenant le noyau indole.

Elle est extrémement dépendante des conditions de culture (GAY, 1986, 1987),

de l'espéce fongique et méme de la souche étudiée (GAY & DEBAUD, 1987).

SLANKIS fut le premier à étudier le róle de l'auxine fongique dans les ecto-

mycorhizes. П а notamment montré (1948) que des racines excisées de pin,

cultivées en présence de Suillus luteus ou de Suillus variegatus, forment de

nombreuses racines latérales courtes présentant la morphologie caractéristique

des ectomycorhizes : elles sont en effet dépourvues de poils absorbants, renflées

ct ramifiées dichotomiquement. Les filtrats de culture de ces champignons

produisent le méme effet, ce qui conduit SLANKIS à considérer que des régu-

lateurs de croissance sont libérés dans le milieu de culture par le champignon

et qu’ils affectent la croissance des racines de pin. En effet, différentes auxines

(АТА, АТВ, АТР, ANA) ont des effets similaires à ceux des filtrats de culture et

Peuvent provoquer les modifications morphologiques caractéristiques des ecto-

mycorhizes (SLANKIS, 1949, 1950, 1951). Selon cet auteur, la production

ФАТА par le champignon serait donc indispensable à l'établissement et au main-

Hen de l'asociation symbiotique. Il a noté à ce propos (SLANKIS, 1967)

Source : MNHN, Paris

214 G.GAY

qu'une augmentation de la teneur en azote des milieux de culture empéche la

formation des mycorhizes de pin et provoque la disparition des mycorhizes

préexistantes. Il a établi un parallèle entre cette observation et le fait qu’un

apport d'azote inhibe la production d'AIA par des champignons mycorhiziens

en culture pure (MOSER, 1959). Ce rapprochement l'a amené à conclure que

l'inhibition de la synthése d'AIA fongique par de fortes teneurs en azote pourrait

être responsable de l'absence fréquente de mycorhizes sur des sols riches en cet

élément. Cette hypothèse, qui n'a pas reçu de preuve expérimentale directe,

constitue l'une des rares tentatives d'explication de l'influence des facteurs du

milieu sur l'établissement de l'association symbiotique. Les résultats sur lesquels

elle est basée sont cependant difficiles à comparer car ils concernent des cham-

pignons différents, cultivés dans des conditions elles aussi différentes.

L'hypothèse de SLANKIS (1967) concernant le rôle de l'AIA fongique dans

l'association ectomycorhizienne a été contestée par RITTER (1968). Le fait

que la production d'AIA par les champignons mycorhiziens en culture pure

soit toujours faible et nécessite de fortes quantités de précurseur (tryptophane

ou composés contenant le noyau indole) a conduit cet auteur à considérer que,

dans la mycorhize, l'AIA fongique n'est pas produit en quantité suffisante pour

affecter la physiologie de la racine hóte. L'exemple du champignon ectomyco-

rhizien Hebeloma hiemale montre qu'il est difficile d'extrapoler à la mycorhize

les résultats obtenus avec un champignon en culture pure (GAY, 1987). En

effet, l'action rhizogène de H. hiemale sur des microboutures de Pinus halepensis

est maximale en présence de concentrations très faibles en tryptophane (com-

parables à celles des exsudats racinaires des plantes hôtes), bien que de telles

concentrations ne permettent qu'une production d'AIA à peine décelable par

ce champignon en culture pure. Ceci montre que le faible taux de conversion

du tryptophane en AIA par le champignon en culture pure ne signifie pas,

comme le pensait RITTER. (1968), que le champignon soit incapable de produire

dans la mycorhize des quantités d'AIA physiologiquement actives.

De plus, les champignons mycorhiziens ont une croissance mycélienne lente

et sont généralement cultivés sur des milieux riches en glucose, azote et phos-

phore. Ces milieux, favorables au métabolisme primaire du champignon, per-

mettent une bonne croissance mycélienne mais conduisent à une forte sous-

estimation du métabolisme secondaire du champignon et notamment de son

aptitude à produire de l'AIA (GAY, 1986, 1987). La production d'AIA fongique

est en effet d'autant plus importante que les conditions de culture sont défavo-

rables à la croissance mycélienne. Cette observation va dans le sens de l'hypo-

thése de SLANKIS (1973) selon laquelle l'absence de mycorhizes sur des sols

riches en éléments nutritifs serait due à l'inhibition de la synthése d'auxine

fongique. L'étude du couple symbiotique Hebeloma hiemale X Pinus halepensis

montre à ce propos que les concentrations en azote et en phosphore des milieux

de culture affectent dans le même sens l'aptitude du champignon à produire

de ГАТА et sa capacité à stimuler l'activité rhizogàne de la plante hóte. Ceci

indique que les variations de l'effet rhizogéne de H. hiemale en fonction des

conditions de culture sont probablement dues à des modifications de son apti-

tude à synthétiser de l'AIA.

Source : MNHN, Paris

HORMONES FONGIQUES ET ECTOMYCORHIZES 215

Les données actuelles concernant le mode d'action de l'auxine montrent,

comme le soulignait déjà SLANKIS (1961), que la présence d'un excés d'AIA

dans les mycorhizes peut affecter profondément leur physiologie et leur méta-

bolisme de sorte que les mycorhizes ne doivent pas étre considérées seulement

comme le résultat de simples modifications morphologiques et structurales des

racines non infectées mais aussi comme des structures reflétant un état physio-

logique particulier. En effet, outre son action rhizogéne, l'AIA fongique pour-

rait provoquer une augmentation de l'apport et de l'excrétion au niveau des

mycorhizes des produits de la photosynthèse et de composés susceptibles de fa-

voriser la croissance du champignon. L'AIA libéré par le champignon pourrait

de même perturber la mise en place des parois de l'hôte et provoquer une dimi-

nution de leur rigidité comparable à celle observée par DUDDRIDGE & READ

(1984) au niveau du réseau de HARTIG de mycorhizes de pin. Cette diminution

de rigidité des parois cellulaires de la plante hôte pourrait favoriser la pénétration

des hyphes du réseau de HARTIG. L'AIA fongique exercerait ainsi un effet

sensibilisateur sur les tissus racinaires en augmentant leur réceptivité à l'infection

mycorhizienne. L'auxine libérée par le champignon dans la mycorhize pourrait

enfin affecter le fonctionnement du génome de la plante hôte et induire no-

tamment la synthèse de nouvelles protéines caractéristiques de l’état symbio-

tique.

L'ensemble de ces résultats montre que l'AIA pourrait étre un des détermi-

nants du pouvoir symbiotique des champignons ectomycorhiziens. Ils n'indi-

quent cependant pas que l'AIA est le seul composé responsable de l'effet myco-

rhizogène des champignons. D'autres métabolites secondaires d'origine fongique,

parmi lesquels des hormones autres que l'AIA, pourraient aussi être détermi.

nants, sinon nécessaires, pour la réalisation de certaines étapes de l'établissement

de l'association symbiotique.

PRODUCTION DE CYTOKININES ET DE GIBBÉRELLINES

PAR LES CHAMPIGNONS ECTOMYCORHIZIENS

GOGALA (1967) a signalé la présence de gibbérellines dans les milieux de

culture et les fructifications de Boletus edulis, mais cette observation n'a jamais

été vérifiée depuis. De même, MILLER (1971) a montré, en utilisant le test cal

de soja, que le champignon ectomycorhizien Rhizopogon roseolus produit des

Cytokinines (transzéatine, trans-ibosyl zéatine, isopentyladénine) alors que

22 espèces d'hébélomes et 6 rhizopogons différents ne semblent pas en produire

(CRAFT & MILLER, 1974). La production de cytokinines par les champignons

&ctomycorhiziens semble donc beaucoup moins fréquente que celle de AIA. En

ce qui concerne leur rôle potentiel dans l'association ectomycorhizienne, on sait

que les cytokinines, à des concentrations élevées, induisent des déviations

morphologiques comparables à celles notées dans le cas des ectomycorhizes.

Elles inhibent la croissance en longueur des racines et la formation des poils

absorbants; elles stimulent par contre la formation des racines latérales. Dans

Source : MNHN, Paris

216 G.GAY

les ectomycorhizes, les cytokinines pourraient aussi provoquer une rupture

du contact entre les cellules corticales adjacentes, ce qui favoriserait la pénétra-

tion des hyphes du réseau de HARTIG. Elles pourraient aussi jouer un róle

important en interagissant avec les auxines ou d'autres hormones.

RÔLE DE L'ÉTHYLÈNE DANS L'ASSOCIATION ECTOMYCORHIZIENNE

Certains champignons ectomycorhiziens sont capables de produire de l'éthy-

lène lorsqu'ils sont cultivés en présence de méthionine (GRAHAM & LINDER-

MAN, 1981). L'effet morphogéne de ce composé au niveau des systémes raci-

naires de pins est comparable a celui de l'AIA. En effet, des systémes racinaires

de Pinus radiata traités par de l'acide chloroéthane sulfonique (qui libére de

l'éthyléne) forment des racines courtes, dichotomes, ressemblant à des ecto-

mycorhizes (WILSON & FIELD, 1984). RUPP & MUDGE (1985) ont obtenu

des résultats comparables en traitant des racines de Pinus mugo par de l'éthé-

phon qui libère aussi de l'éthylène. Un traitement par de l'ANA produit les

mêmes symptômes alors que le thiosulfate d'argent (inhibiteur de l'action de

Péthylène) réduit de 35 % la réponse à l'auxine. Ceci indique, selon ces auteurs,

que la production d'éthyléne induite par РАМА pourrait être responsable, au

moins en partie, de la ramification dichotome consécutive à un traitement

par cette auxine.

En ce qui concerne le rôle de l'éthylène dans l'établissement de l'association

ectomycorhizienne, RUPP & MUDGE (1985) ont montré que la formation des

mycorhizes de Laccaria laccata et de Pisolithus tinctorius s'accompagne d’une

augmentation de la production d’éthyléne alors qu'un apport d'éthéphon ou de

thiosulfate d’argent n’affectent pas le taux de mycorhization de ces champi-

gnons. Ces auteurs en concluent que l'éthyléne endogéne de la plante peut

affecter la formation des mycorhizes et étre responsable des changements de

morphologie des racines colonisées. Comme le suggéraient RUPP & MUDGE,

la forte production d’éthyléne notée lors de la formation des mycorhizes pour-

rait étre une conséquence de la modification du métabolisme auxinique des

racines colonisées. On sait en effet que de nombreuses modifications de la phy-

siologie des systèmes racinaires consécutive à un traitement par l'AIA sont en

fait induites par l’éthylène produit par la racine en réponse au traitement hormo-

mal. C’est pourquoi la production et le rôle de l'AIA et de l'éthyléne dans une

mycorhize sont probablement liés.

DISCUSSION

Les phytohormones contrólent presque tous les aspects de la croissance et du

développement des plantes supérieures, particuliérement ceux dépendant de fac-

teurs environnementaux. Les résultats présentés ici indiquent qu’elles sont aussi

impliquées dans l'établissement de la symbiose ectomycorhizienne. Les connais-

Source : MNHN, Paris

HORMONES FONGIQUES ET ECTOMYCORHIZES 217

sances actuelles concernant le mode d'action des auxines montrent que, outre

son effet rhizogéne, l'AIA fongique pourrait affecter profondément la physiolo-

gie des racines infectées. De plus, l'hyperauxinie des mycorhizes ainsi que la pro-

duction par le champignon de cytokinines ou de gibbérellines induit probable-

ment des modifications de la balance hormonale de la plante, susceptibles d'af-

fecter la physiologie non seulement du systéme racinaire mais aussi de la partie

aérienne. En effet, de nombreuses modifications de la physiologie de la plante

Caractéristiques de l'association ectomycorhizienne correspondent à des proces-

sus sous contrôle hormonal : pour qu'une amélioration de l'absorption minérale

s'accompagne d’une augmentation de l’activité photosynthétique de la plante

conduisant à un enrichissement en hydrates de carbone des exsudats racinaires

(HARLEY & SMITH, 1983), il faut que différentes modifications métaboliques

sous contrôle hormonal aient lieu simultanément. La question fondamentale

est donc de savoir si une production, même faible, d'hormones par le champi-

gnon dans la mycorhize peut affecter la balance hormonale de la plante et étre

à l'origine de telles modifications. L'utilisation de mutants, soit incapables de

produire des hormones, et notamment de ГАГА, зо surproducteurs, devrait

permettre d'apporter des éléments de réponse à cette question.

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MODIFICATIONS DES PROFILS POLYPEPTIDIQUES

LORS DE L'ÉTABLISSEMENT DE LA SYMBIOSE

ECTOMYCORHIZIENNE

par Jean-Louis HILBERT et Francis MARTIN*

RÉSUMÉ. — Dans le but de mettre en évidence (i) les modifications induites dans l'expres-

sion des génes fongiques et racinaires et (ii) les éventuels polypeptides spécifiques de l'état

symbiotique, l'lectrophorése bidimensionnelle a été appliquée aux protéines solubles et

membranaires du mycélium de Pisolithus tinctorius, des racines mycorhizées et non myco-

rhizées d'Eucalyptus globulus. Le niveau d'expression de 30 % des polypeptides fongiques

et de plus de 50 % des polypeptides racinaires caractérisés, est modifié au cours de l'établis-

sement de la symbiose ectomycorhizienne. Les changements observés consistent en une

diminution prononcée ou une augmentation de la concentration de nombreux polypeptides

accumulés dans le mycélium ou la racine en culture pure. Quatre polypeptides (E15, E24,

E27, E28), pour lesquels nous proposons le terme générique d'ectomycorhizines, ont été

identifiés uniquement dans les ectomycorhizes. Ces polypeptides peuvent étre synthétisés

de novo dans les tissus symbiotiques ou apparaître comme de nouvelles isoformes, consé-

quence de modifications post-transcriptionnelles. L'abondance des ectomycorhizines rend

probable leur róle dans le développement de la symbiose.

ABSTRACT. — In an effort to examine the changes in protein patterns and for the presence

of any «symbiosis-specific» genes, that are expressed specifically during the ectomycorrhizal

development, the polypeptide content of Eucalyptus-Pisolithus ectomycorrhizas, unin-

fected Eucalyptus globulus short roots, and free-living Pisolithus tinctorius mycelia have

been compared. Analysis of the soluble and membrane proteins by sodium dodecylsulfate

and two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis showed that the majority of the

polypeptides observed in mycorrhizas are already synthesized in either uninfected roots or

free-living mycelia. The levels of approximately 30 76 of the fungal polypeptides and more

than 50 % of the plant polypeptides resolved on gels are regulated during the development

of ectomycorrhizas. Most of the changes detected involve a decrease or an increase in the

concentration of proteins synthesized in free-living mycelia or root cells. Four polypeptides

are ectomycorrhiza-specific in that they are present in ectomycorrhizas, but not in free

living mycelia nor non-infected short roots. We suggest the name of ectomycorrhizins for

this class of «ectomycorrhiza-specificy polypeptides, It seems likely that they have a role

in the development of the symbiosis.

MOTS CLÉS : ectomycorhizes, électrophorése bidimensionnelle, Eucalyptus, Pisolithus,

ectomycorhizines.

* Laboratoire de Microbiologie Forestiére, INRA, Centre de Recherches Forestiéres de

Nancy, Champenoux, BP 35, 54280 Seichamps, France.

Source : MNHN, Paris

222 J.L. HILBERT et F. MARTIN

INTRODUCTION

De l'association entre le systéme racinaire des végétaux ligneux et certains

champignons du sol résulte la formation d'actomycorhizes, organes symbiotiques

jouant un róle primordial dans la nutrition de la plante (LE TACON, 1985). Les

recherches effectuées ces dernières années sur le métabolisme primaire des

champignons ectomycorhiziens (MARTIN & al., 1987) et des ectomycorhizes

(BLEDSOE & ZASOSKI, 1983), ont montré que la participation des différents

partenaires à la symbiose modifie de nombreuses étapes de leur métabolisme

primaire (MARTIN, 1986; MARTIN & al., 1987). L'établissement et le dévelop-

pement de la symbiose nécessitent l'intervention de mécanismes de reconnais-

sance (HARLEY & SMITH, 1983), des modifications dans les échanges cellu-

laires (HARLEY & SMITH, 1983) et les teneurs en catalyseurs enzymatiques

(MARTIN & al., 1987). L’approche immunologique a ainsi permis de démontrer

que la biosynthése de la glutamate déshydrogénase à NADPH et de la glutamate

oxaloacétate transaminase fongiques était réprimée dans l'ectomycorhize de

Hétre (CHALLOT, 1987). Au contraire, l'activité des phosphatases (MOUSAIN

& SALSAC, 1982; LACAZE, 1983) et des catalyseurs de la voie des hexoses

monophosphates (NASMYL, 1987) est fortement stimulée dans les tissus sym-

biotiques. Enfin, la mycorhization par Rhizopogon vinicolor des racines de

Pseudotsuga douglasii conduit à la mise en place de mécanismes de résistance

dont la manifestation est identique à celle observée lors de l'attaque des tissus

végétaux par un champignon pathogène avec accumulation de tannins et de

phytoalexines (COLEMAN & ANDERSON, 1985) dont la biosynthèse suppose

Fi duction de biocatalyseurs spécifiques (COLLINGE & SLUSARENKO, 1987).

Ces remaniements enzymatiques et métaboliques multiples ne peuvent résulter

que de modifications importantes dans l'expression des genes des partenaires

symbiotiques. La mise en place d'un nouveau métabolisme azoté et carboné

dans Pectomycothize suggère également l'existence de gènes spécifiques qui

gouverneraient la synthèse de protéines spécifiques de l'état symbiotique.

"existence de protéines spécifiques d'un état symbiotique a été largement

démontrée et étudiée chez les associations du type Légumineuses-Rhizobium

(LEGOCKI & VERMA, 1980; STROZYCKI & al., 1985) oà une quinzaine de

polypeptides ont été caractérisés et pour certains leur rôle déterminé (VERMA

E al. 1979; GOVERS & al., 1985). Dans le cas des relations plantes-pathogenes

l'apparition de polypeptides spécifiques de l'état infecté a également été observé

los de l'infection par des virus, bactéries et champignons (GIANINAZZI, 1985;

COLLINGE & SLUSARENKO, 1987).

Dans le but de mettre en évidence (i) les modifications induites dans l’expres-

sion des gènes fongiques et racinaires et (ii) les éventuels polypeptides spéci-

fiques de létat symbiotique, les profils électrophorétiques des racines non

mycorhizées, du mycélium extramatriciel et des ectomycorhizes ont été com-

parées.

Source : MNHN, Paris

ECTOMYCORHIZINES DE L'ASSOCIATION PISOLITHUS-EUCALYPTUS 223

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Matériel végétal

La synthése axénique d'ectomycorhizes a été réalisée à partir d'Eucalyptus

globulus Kirp et de Pisolithus tinctorius souche Cocker et Couch en employant

la technique du «sandwich paper» (CHILVERS & al., 1986). Des graines d'Eucalyp-

tus globulus sont désinfectées 20 mn à l'aide d'une solution d'hypochlorite de

sodium à 20 % et mises à germer 3 jours sur papier absorbant. Les germinations

exemptes de contamination sont transférées dans une boîte de Pétri (100 mm.

diam.) et alimentées par 20 ml de milieu gélosé de Shemakanova pendant 3

jours. Le champignon est placé sur un carton absorbant sur milieu gélosé

renfermant de l'extrait de pomme de terre. Lorsque le mycélium recouvre le

carton, les deux partenaires sont mis en contact. Aprés 4 semaines de développe-

ment en conditions axéniques les ectomycorhizes obtenues sont récoltées et

conservées à — 70°C.

La température de la chambre de croissance est maintenue à 22°C le jour et

16°C la nuit. L’hygrométrie est de 80 % de saturation. La photopériode est de

10 h avec une intensité lumineuse de 200peinstein/m? dans la bande des radia-

tions visibles (400-700 nm).

Extraction des protéines

L'extraction des protéines est effectuée à 4°C par broyage de matériel, dans

un potter, en présence d'un tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,5 contenant du

phénylméthylsulfonylfluorure 1 mM, du dithiothréitol 5 mM, de l'acide ascor-

bique 1 mM, de l'éthylénediaminetétraacétate 1 mM et du Triton X100 0,1%,

aprés addition de polyvinylpyrrolidone insoluble à raison de 10 46 (p / p). Aprés

centrifugation à 10000 g pendant 30 mn, le surnageant renfermant les pro-

téines solubles est prélevé. Un dosage de la quantité de protéines est réalisé à

l'aide du réactif préconisé par Biorad d’après la technique de BRADFORD (1976)

La quantité de protéines désirée par échantillon est ensuite mise à précipiter

45 mn à — 20°C par addition de 5 volumes de mélange acide trichloroacétique

10 % (p/v), B-mercaptoéthanol 0.07 76 (v/v) dans de l'acétone. Une centrifuga-

tion de 30 mn à 10000 g permet de recueillir les protéines sous forme d'un culot

protéique. Celui ci est rincé par 5 volumes du mélange 6-mercaptoéthanol 0.07 %

(v/v) dans de l’acétone, afin de débarrasser le culot de l’excès d’acide trichloro-

acétique. Une nouvelle centrifugation de 15 mn à 10000 g est affectuée, puis le

culot protéique est séché au dessicateur une nuit afin d'éliminer l'acétone.

Les protéines sont solubilisées dans le tampon de lyse préconisé par O'FARRELL

(1975) et dont la composition est la suivante : urée 9,5 M, Nonidet P40 2 %

(v/v), ampholines 2 % (v/v) et B-mercaptoéthanol 5 % (v/v).

Électrophorése

— Électrophorèse bidimensionnelle

Première dimension : les gels sont coulés dans des tubes de 1mim de diamètre

sur une longueur de 12,5 cm. Ils contiennent en composition finale 3,5 % d'acry-

Source : MNHN, Paris

ECTOMYCORHIZINES DE L'ASSOCIATION PISOLITHUS-EUCALYPTUS 225

lamide, 0,24 % de methylene bisacrylamide, 9,2 M d'urée, 4 % d’ampholines

(3/4 de Pharmacia 5-8, 1/4 de LKB 3,5-10) et 2 % de Nonidet P40. Les solu-

tions d'électrodes sont de l'acide phosphorique 10 mM et de la soude NaOH 20 mM.

Les paramètres électriques de l'isofocalisation sont une puissance de 1 W pour

8 gels, voltage toujours limité à 1200 V, intensité non limitée. L'électrop horése

est arrétée aprés passage de 21000 V.H.

Un dépôt d'environ 150 ug de protéines par gel est effectué. Aprés l'isoclec-

trofocalisation, les gels sont extrudés des tubes par pression a l'aide d'une se-

ringue et sont mis en agitation douce 15 mn dans 5 ml d’un tampon d’équili-

bration préconisé par O'FARRELL (1975) mais dont nous avons supprimé le f-

mercaptoéthanol qui provoque des artéfacts lors de la révélation argentique

(TASHEVA & DESSEV, 1983). La composition de ce tampon d’équilibration

est la suivante : Tris HCl 62,5 mM pH 6,8, sodium dodécyl sulfate 2,3 %, glycé-

rol 10 % (m/v), bleu de bromophénol : 150 jl d'une solution à 0,05 %.

Deuxiéme dimension : le gel de séparation des protéines est coulé entre deux

plaques de verre (140 x 150 x 1 mm). La concentration finale est de 15 % en

acrylamide-bisacrylamide. Il n'y a pas de gel de concentration des protéines. Le

gel de 1ère dimension, après passage dans le tampon d'équilibration, est déposé

sur le gel de séparation. Il n'y a pas de gel de soudure. Le tampon d'électropho-

rése est celui de LAEMMLI (1970) : Tris 0,025 M, glycine 0,192 M, SDS 0,1%.

Les conditions électriques sont de 1 W par gel pendant 10 mn puis de 6W

jusqu'à la fin de la migration, voltage et intensité non limités.

— Electrophorése monodimensionnelle

Les protéines sont préparées comme pour l'électrophorése bidimensionnelle,

cependant leur solubilisation est effectuée par reprise du culot protéique dans du

tampon de LAEMMLI (1970) : Tris-HCl 0,0625 M pH 6,8, glycérol 10 %, so-

dium dodécyl sulfate 2 %, mercaptoéthanol 5 %, bleu de bromophénol 0,01%.

L'ensemble est chauffé 4 100°C pendant 5 mn. Le gel de séparation des pro-

téines est de composition identique à celui utilisé pour la 2ème dimension lors

de l’électrophorèse bidimensionnelle. Aprés polymérisation il est recouvert

d'un gel de concentration des protéines de concentration finale à 5 % en acryla-

mide-bisacrylamide. Le gel de concentration est coulé après insertion d’un peigne

Figure 1 : Profil électrophorétique monodimensionnel des protéines solubles de Pisolithus

tinctorius (A), d'Eucalyptus globulus (C) et des ectomycorhizes obtenues à partir de

leur association (B). (V) — polypeptides dont l'accumulation est réduite dans la myco-

тре. (>) = polypeptides dont l'accumulation est augmentée dans la mycorhize (-eE) —

polypeptides spécifiques dela symbiose. Le puit S contient les protéines standards de

poids moléculaire dans l'ordre suivant 14,4; 20,1; 30,0; 43,0; 67,0 et 94,0 КР.

Figure 1 ; Silver-stained SDS-gel of polypeptides of Pisolithus tinctorius (A), Eucalyptus

globulus (C) and their ectomycorthizas (B). Extracted proteins were boiled in an SDS-

containing solution and proteins equivalent to 150 pg bovine serum albumin in the

protein assay were loaded into each lane. Lane S shows protein markers of the following

molecular weights : 14.4; 20.1; 30.0; 43.0; 67.0;94.0 kD.

Source : MNHN, Paris.

226 J-L. HILBERT et F. MARTIN

Figure 2 : Électrophorégramme bidimensionnel des protéines solubles extraites à partir du

mycélium libre de Pisolithus tinctorius. Lêre dimension : isofocalisation (IEF) dans un

gradient de pH variant de 7 (droite) à 5 (gauche); 2ème dimension : gel de polyacryla-

mide 15 % en présence de sodium dodécyl sulfate.

Figure 2 : Silverstained two-dimensional gel of polypeptides of free-living mycelia of

Pisolithus tinctorius. Proteins were loaded into the basic end of a tube gel for the first

dimension electrophoresis (isoelectrofocusing). The gel was run, equilibrated, and loaded

onto the second sodium dodecyl sulfate-dimension (15 % acrylamide).

qui permettra la formation des puits dans lesquels seront déposés les échantillons

protéiques. De 4 à 5 ug de protéines sont déposés par puit. La révélation des

protéines est effectuée par coloration argentique d'après MORRISSEY (1981).

RÉSULTATS ET DISCUSSION

La chromatographie par électrophorèse dénaturante des protéines solubles et

membranaires du mycélium de Pisolithus tinctorius (Fig. 1A), des racines myco-

rhizées (Fig. 1B) et non mycorhizées (Fig. 1C) d'Eucalyptus globulus permet

l'observation d'une centaine de polypeptides dans les tissus des partenaires

étudiés isolément et dans les ectomycorhizes.

La comparaison de ces profils polypeptidiques met en évidence des modi-

fications quantitatives et qualitatives importantes dans l'accumulation des pro-

Source : MNHN, Paris

ECTOMYCORHIZINES DE L'ASSOCIATION PISOLITHUS-EUCALYPTUS 227

Figure 3 : Électrophorégramme bidimensionnel des protéines solubles extraites à partir des

racines courtes latérales d'Eucalyptus globulus non associés à Pisolithus tinctorius.

Figure 3 : Silver-stained two-dimensional gel of polypeptides of non-mycorrhizal short

roots of Eucalyptus globulus.

téines. La composition polypeptidique des ectomycorhizes (Fig. 1B), prélevées

4 semaines aprés l'infection, est trés proche de celle des hyphes fongiques culti-

vées isolément (Fig. 1A) suggérant que le contenu protéique des mycorhizes

est essentiellement d'origine fongique. Il s'agit là d'une confirmation biochi-

mique des multiples observations microscopiques (KOTTKE & OBERWINKLER,

1986) soulignant la richesse relative en organites du cytoplasme fongique cons-

tituant le réseau de Hartig et la vacuolisation intense des cellules corticales de

la racine mycorhizée. Toutes les ectomycorhizes étudiées (Pinus nigra-Hebeloma

crustuliniforme, Picea abies-Hebeloma sp., ... [HILBERT, EL ABRAS & MAR-

TIN, résultats non. publiés]) présentent la méme caractéristique que celle des

mycorhizes de Pisolithus-Eucalyptus.

Si la plupart des polypeptides du mycélium en culture pure sont synthétisés

dans les ectomycorhizes, plus de 20 % d'entre eux voient leur concentration

fortement diminuée (Fig. 1A-B) indiquant des modifications dans leur taux

de renouvellement et/ou leur biosynthèse. Ces protéines pourraient contrôler

des processus dont l'activité est fortement limitée par l'établissement de la

mycorhize tels que la croissance hyphale et la biosynthése des parois. Certains

Source : MNHN, Paris

228 J.L. HILBERT et F. MARTIN

Figure 4 : Électrophorégramme bidimensionnel des protéines solubles extraites à partir des

ectomycorhizes résultant de lassociation entre Pisolithus tinctorius et Eucalyptus

globulus. Es, E24, E21, Ez8 : polypeptides spécifiques de la symbiose (= ectomyco-

thizines).

Figure 4 : Silveratained two-dimensional gel of polypeptides of short roots of Eucalyptus

lobulus infected by Pisolithus tinctorius E15, E24, E27, F28 : symbiosis-specific poly-

peptides (=ectomycorrhizins).

polypeptides racinaires sont également accumulés en moindre quantité dans

les organes symbiotiques (Fig. 1B-C), mais la faible abondance des protéines

végétales limite l'observation du phénomène.

Enfin, l'infection des racines courtes d'E. globulus par P. tinctorius induit.

l'accumulation de polypeptides n'existant pas dans les cellules fongiques et raci-

naires cultivées séparément. Deux polypeptides, dont les poids moléculaires

sont respectivement de 12kD (annoté E1, Fig. 1B) et 30 kD (annoté E, Fig. 1B),

s'accumulent en grande quantité.

L'étude des modifications quantitatives et qualitatives de tissus aussi riches

en polypeptides que les ectomycorhizes nécessitait une technique électropho-

rétique plus résolutive que l'électrophorèse dénaturante. L'électrophorése

Tension nelle a donc été développée et appliquée aux protéines solubles et

membranaires du mycélium de Pisolithus tinctorius (Fig. 2), des racines myco-

thizées (Fig. 4) et non mycorhizées (Fig. 3) d’Eucalyptus globulus. La carte

Source : MNHN, Paris

ECTOMYCORHIZINES DE L'ASSOCIATION PISOLITHUS-EUCALYPTUS 229

polypeptidique du mycélium permet l'observation de 135 spots parfaitement

résolus (Fig. 2). La majorité de ces polypeptides sont neutres et acides et ont un

poids moléculaire inférieur à 30 kD. Les polypeptides des racines non mycorhi-

zées (Fig. 3) sont moins nombreux et sont pour l'essentiel de haut poids molé-

culaire et neutres.

L'essentiel des polypeptides observés dans les mycorhizes (Fig. 4) est égale-

ment détecté dans le mycélium de Pisolithus tinctorius ou dans la racine non

infectée et préexistent donc dans les tissus non symbiotiques. Le profil polypep-

tidique des organes symbiotiques est composé majoritairement de polypeptides

d'origine fongique confirmant ainsi les données de l'électrophorèse dénaturante

(Fig. 1). Le développement des ectomycorhizes est toutefois accompagné par

la diminution et l'apparition de nombreux polypeptides. Il est à noter une dimi-

nution plus prononcée des polypeptides racinaires que des polypeptides fon-

giques. Sur les 135 polypeptides fongiques résolus, 30 % sont exprimés de façon

différente dans la symbiose; 17 voient leur concentration diminuée : il s'agit de

molécules de faible poids moléculaire et ayant un point isoélectrique acide

(quadrant 4, Fig. 2 et 4). La quantité d'au moins 4 polypeptides augmente.

Dans les tissus de la plante, 125 polypeptides sont caractérisés sur les racines

courtes latérales non infectées. La majorité d'entre eux voie leur concentration

fortement diminuée (e. g., HP1, HP2, HP3; quadrant 2, Fig. 3 et 4) dans les ecto-

mycorhizes. L'établissement de la symbiose se manifeste clairement par la

répression de la biosynthése de nombreuses protéines fongiques et racinaires.

Les ectomycorhizes se caractérisent donc par une simplification des profils

polypeptidiques.

Enfin, 4 polypeptides (E15, E24, E27, Ezs) (Fig. 4) sont spécifiques de la

symbiose P. tinctorius - E. globulus, étant présents dans les ectomycorhizes et

absents du mycélium en culture pure et des racines non infectées. Leur: poids

moléculaires et points isoélectriques sont respectivement de 15 kD (5,8), 24 kD

(6,9),27 kD (6,5) et 27,3 kD (6,6). Ces polypeptides sont abondants et les pro-

priétés physico-chimiques voisines de E24, E27, et Ezg suggèrent une parenté

entre ces 3 poly peptides.

CONCLUSION

Les niveaux d’expression de 30 % des polypeptides fongiques et de plus de

50 % des polypeptides racinaires caractérisés par électrophorése bidimension-

nelle, sont modifiés au cours de l'établissement de la symbiose ectomycorhi-

zienne. Les changements observés consistent en une diminution prononcée ou

une augmentation de la concentration de nombreux polypeptides accumulés

dans le mycélium ou la racine en culture pure. La répression qui affecte la bio-

synthése des polypeptides, d'origine fongique et racinaire, confirme les observa-

tions biochimiques (MARTIN & al., 1987) et microscopiques (DEXHEIMER &

al., 1986) démontrant les modifications induites chez les symbiotes par l'établis-

sement de l'ectomycorhize. Quatre polypeptides (E15, E24, E25, Eos), pour

Source : MNHN, Paris

230 J-L. HILBERT et F. MARTIN

lesquels nous proposons le terme générique d'ectomycorhizines, ont été identi-

fiés uniquement dans les ectomycorhizes. Ces polypeptides peuvent être synthé-

tisés de novo dans les tissus symbiotiques ou apparaitre comme de nouvelles

isoformes, conséquence de modifications post-transcriptionnelles. La compar-

timentation de ces polypeptides spécifiques n’a pas été déterminée et, de ce fait,

lappartenance des génes codant pour les ectomycorhizines à l'un ou l'autre

des génomes reste à déterminer. Des études sont en cours afin de caractériser (i)

la nature (glycoprotéines, protéines membranaires, enzymes, ...) et les fonctions

des ectomycorhizines et (ii) leur mécanisme d'induction. L'abondance des ecto-

mycorhizines rend probable un róle dans le développement de la symbiose.

Elles constituent un outil remarquable dans l'étude de la physiologie du déve-

loppement de la symbiose ectomycorhizienne et permettra, en particulier, de

tester l'existence de médiateurs chimiques assurant l'échange d'informations

entre les symbiotes.

REMERCIEMENTS

Les auteurs remercient Mrs F. Lapeyrie et F. Le Tacon (Laboratoire de Microbiologie

Forestière), ainsi que le Professeur B. Botton (Laboratoire de Physiologie Vegetale et

Forestière) pour les discussions et encouragements prodigués au cours de la présente étude.

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EXEMPLES D'ÉTUDES D'ORGANISMES PARASITES

DES RACINES DANS DES CULTURES DE RACINES

TRANSFORMÉES PAR AGROBACTERIUM RHIZOGENES

par Jacques MUGNIER*

RÉSUMÉ — Des racines transformées par Agrobacterium rhizogenes sont inoculées avec

des organismes parasites des racines. Les réponses tactiques et tropiques et les modes de

colonisation des parasites sont étudiés.

SUMMARY — Roots transformed by Agrobacterium rhizogenes were inoculated with soil-

borne parasites. Taxic and tropic responses and infection developed by the parasites were

analysed.

MOTS CLES : racines transformées, Agrobacterium rhizogenes, parasites des racines.

LES RACINES DU HAIRY-ROOT

Le terme de «hairy-root» (chevelu racinaire) apparait dans la littérature dés

le début du siècle (HILDERBRAND, 1934) pour désigner le développement de

masses de racines à la base des troncs de pommier. Le syndrome du hairy-root

est causé par une bactérie du sol, Agrobacterium rhizogenes Riker, laquelle est

capable d'infecter un grand nombre de dicotylédones (DE CLEENE & DE LEY,

1981). Le hairy-root est analogue sur de nombreux points avec la maladie du

«crown-gally causée par Agrobacterium tumefaciens (Sm. & Town.) Conn. Dans

les deux cas, les bactéries possèdent un grand plasmide (le «rootinducing»

plasmide chez A. rhizogenes) dont un segment, le T-DNA (ADN transféré),

est intégré dans le génome des cellules de la plante infectée (CHILTON & al.,

1982). Les cellules qui ont reçu le T-DNA se différencient en méristèmes raci-

naires (Fig.1, 2) et les racines induites peuvent se développer indéfiniment dans

des milieux nutritifs stériles, sans l'addition d'hormones de croissance (TEP-

FER & TEMPÉ, 1981). Ce phénomène, bien qu’imparfaitement élucidé, est dû

à la présence d’auxines endogènes, et d’autres précurseurs d'hormones, issus

du produit de l'activité des gènes du T-DNA (WHITE & al., 1985).

* Rhóne-Poulenc Agrochimie, 69263 Lyon Cédex 9, France.

Source : MNHN, Paris

234 J. MUGNIER

Figures 1-2 — Symptéme du hairy sur les disques de racines de navet (1) et de panais (2)

inoculés avec Agrobacterium rhizogenes (photo de ARK & THOMPSON, 1961; avec

la permission de la Société Américaine de Phytopathologie).

Figures 1-2 — Hairy roots emerged from turnip (1) and parsnip (2) root disks inoculated

with Agrobacterium rhizogenes (photo by ARK & THOMPSON, 1961; with the permis-

sion of the American Phytopathological Society).

Figure 3 — Racines transformées d’arachide (Arachis hypogaea L.) cultivées dans le milieu

liquide de Murashige & Skoog (boîte de Pétri de 14 cm et 15 jours d’incubation).

Figure 3 — Transformed roots of peanuts (Arachis hypogaea L.) in the Murashige & Skoog

liquid medium (Petri dish, 14 cm in diam., 15 days).

PARASITES DES RACINES ET RACINES TRANSFORMÉES 235

Les racines cultivées dans le milieu M & S de MURASHIGE & SKOOG (1962)

possèdent les mêmes caractéristiques morphologiques que celles de racines

normales. Elles ont des morphotypes très précis, du type à fines racines et nom-

breux poils absorbants, au type à grosses racines (MUGNIER, 1988a; Fig. 3).

De nombreux phénomènes physiologiques qui caractérisent des racines

normales sont retrouvés dans les racines du hairy-root, comme la production

d'alcaloïdes (HAMILL & al., 1987; FLORES & al., 1987) ou de polyacétylénes

(thiophénes) impliqués dans les réactions d'élicitation (FLORES, 1987; FLO-

RES & al., 1988).

LES CULTURES BICOMPARTIMENTEES

Les essais d’infection des racines transformées sont réalisés dans des boites

de Pétri bicompartimentées où le parasite n'est pas nourri par le milieu de cul,

ture des racines. Le système, illustré à la figure 4, est composé d’un comparti-

ment a contenant le milieu M & S gélosé, et d’un compartiment b contenant

de l'eau gélosée ou non. Les racines placées sur le milieu nutritif poussent par

dessus la barrière séparant les deux compartiments et dans le compartiment b

où les inoculums de parasites sont placés.

L'étude des associations est différente selon la nature des parasites; il peut

s'agir d'un parasite obligatoire qui n'a jamais été cultivé au laboratoire sur milieu

synthétique (Plasmodiophorales, mycorhizes A arbuscules et à vésicules) ou d'un.

parasite cultivé au laboratoire, comme par exemple Pythium ou Rhizoctonia.

Figure 4 — Racines transformées de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) dans une boite

de Pétri bicompartimentée (9 cm) aprés 6 jours d'incubation. Le compartiment a сон.

tient le milieu gélosé de Murashige & Skoog, et le compartiment b de l'eau gélosée.

Figure 4 — Six days growth of transformed roots of tomato (Lycopersicon esculentum Mill. )

in a 9 cm Petri dish. Compartment a contains the Murashige & Skoog agar medium,

compartment b contains water agar.

Figure 5 — Agrégation de zoospores de Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp au niveau

d'une blessure faite sur une racine transformée de muflier (Anthirrhinum majus L.),

10 secondes aprés la blessure (Echelle = 0,2 mm).

Figure 5 — Masses of encysted zoospores of Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp at a

wounding site of a transformed root of snapdragon (Antirrhinum majus L.), 10 seconds

after the wounding (Scale = 0.2 mm).

Figures 67 — Infection d'une racine transformée de moutarde (Brassica hirta Moench) par

Rhizoctonia solani groupe d'anastomose 2-1. 6. Développement des hyphes sur la surface

de la racine. 7. Pénétration intercellulaire d'un hyphe (Échelle = 10 um),

Figures 6-7 — Infection of a transformed root of mustard (Brassica hirta Moench) by Rhi-

Zoctonia solani anastomosis group 2-1. 6. Hyphal growth on the root surface. 7. Hyphal

penetration in a cell lumen (Scale — 10 Jim).

Source : MNHN, Paris

236 J. MUGNIER

LES PARASITES OBLIGATOIRES

La culture associée de champignons parasites obligatoires et aussi l'élevage

de nématodes endoparasites sont présentés.

Les Plasmodiophorales

Les cycles de développement de Plasmodiophora brassicae Woron., l'agent de

la hernie des Cruciféres, et de Polymyxa betae Keskin, associé à la rhizomanie de

la betterave à sucre, ne sont qu'imparfaitement connus, mais certains stades tels

que les cystosores de P. betae sont facilement reconnaissables.

Les cystosores ont été observés dans les tissus de racines transformées de

betteraves inoculées par P. betae (MUGNIER, 1987; YACOUB, 1987).

Les champignons mycorhiziens à arbuscules et à vésicules

Ces champignons, plus généralement qualifiés de symbiotes obligatoires, sont

capables de mycorhizer les racines transformées (MUGNIER & MOSSE, 1987;

BECARD & FORTIN, 1988).

Les nématodes endoparasites

PAUL & al. (1988) réussissent l'élevage d'Heterodera schachti Schmidt dans

des cultures de racines transformées de betterave à sucre et MUGNIERY (comm.

pers.) celui de Meloidogyne spp. et de Globodera spp. dans des cultures de ra-

cines transformées de leurs hótes respectifs. Des expériences similaires ont été

effectuées avec Н. schachtii et M. incognita dans des cultures de racines trans-

formées (MUGNIER, 1988b).

LES AGENTS DES NECROSES RACINAIRES ET DES FONTES DE SEMIS

Les espèces de champignons pathogènes les plus fréquemment isolées des

racines ou des collets de plantes malades, et cultivées sur des milieux nutritifs,

appartiennent aux genres Fusarium, Pythium et Rhizoctonia.

Pythium et autres Pythiaceae produisant des zoospores

Les zoospores de Pythium et aussi d'Aphanomyces et de Phytophthora,

inoculées à des racines transformées de leurs hôtes répondent à un stimulus

chémotactique émis par la racine transformée. Elles nagent vers les zones d'exu-

dation situées au niveau de la zone d'élongation derrière l'apex et de la zone où

émerge une racine latérale, s’y accumulent puis s’y enkystent. La réponse chémo-

tactique est aussi obtenue par une blessure faite sur la racine (Fig. 5). Un tube

germinatif émerge de la zoospore enkystée et forme sur l'épiderme de la racine

un appressorium par lequel le champignon pénètre à l'intérieur des tissus.

Fusarium oxysporum

Les tests d'infection de racines transformées par des Fusarium oxysporum,

agents des vascularioses, ont été réalisés avec des racines de Dianthus caryophyl-

Source : MNHN, Paris

PARASITES DES RACINES ET RACINES TRANSFORMÉES 237

lus L., Lycopersicon esculentum Mill., Cucumis sativus L., Tagetes erecta L.,

Linum grandiflorum Desf. inoculées respectivement avec les formes spéciales de

F. oxysporum, dianthi, lycopersici, melonis, callistephi et lini. Dans tous les cas,

aucun tube germinatif ou hyphe des différentes formes spéciales n’a infecté

un poil absorbant ou l'épiderme des racines, et par conséquent les tissus vascu-

laires. La raison de la résistance des racines transformées à Р. oxysporum n’est

pas connue.

Rbizoctonia solani

L'espéce regroupe treize formes intraspécifiques, classées selon leur groupe

d'anastomose (AG), leur spécificité d'hôte et la morphologie des cultures (OGO-

SHI, 1987). La forme parfaite (Thanathephorus cucumeris Frank) est obtenue

au laboratoire (MUGNIER & CAMPOROTA, 1988).

Les différentes formes intraspécifiques, et aussi des cultures issues de basi-

diospores, ont été inoculées à des racines transformées de leurs hôtes respectifs.

Par exemple, des isolats AG 2-1 ont été inoculés à des racines de Crucifères,

AG 2-2 à des racines de betterave, AG 3 à des racines de pomme de terre, AGs

1 et 4 à différentes espèces de racines transformées. Le processus de l'infection

des racines est celui observé dans des infections naturelles, et est composé par

les phases suivantes :

1. croissance végétative du mycélium,

2. développement d'hyphes à la surface de la racine (Fig. 6).

3. formation d’appressoria simples ou lobés, et éventuellement de coussinets

d'infection,

4. pénétration intercellulaire (Fig. 7),

5. colonisation inter- et intra cellulaire des tissus.

Toutes ces phases sont observées pour les cultures hétérokaryotiques et les

cultures dérivées de basidiospores quand elles sont associées à une racine-hôte

Téceptive. Par contre, quand R. solani est inoculé à des racines non hôtes, le

processus de l'infection est arrêté à une des phases pré-infectives 1 ou 2.

Ces quelques exemples montrent que les cultures de racines transformées

permettent d'étudier, dans des boîtes de Pétri, le développement d'infections

réussies par des parasites du sol. Elles offrent aussi la possibilité d'étudier d'au-

tres aspects physiologiques et nutritionels des systèmes racinaires, afin d'appor-

ter des réponses aux problèmes qui leur sont posés dans le sol.

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POLARITÉ DE CROISSANCE-DIFFÉRENCIATION

DES HYPHES FONGIQUES (MODÈLES)

par G. TURIAN*

RÉSUMÉ — La polarité (mono-) d'émergence du tube germinatif conidien chez Neurospora

crassa paraît dépendre d'une dépolarisation localisée électrique du plasmalemme consé-

cutive au positionnement de mitochondries à ce niveau. Cette polarité d'émergence peut

être perturbée par une dépolarisation généralisée de la membrane plasmique imposée

Par un protonophore tel que le 2,4-dinitrophénol. Les apex des hyphes en croissance mono-

polaire montrent une «tache» apicale réductrice et acide centrée sur l'agrégat micro-vésicu-

laire du «Spitzenkörper». Les apex des hyphes tortueux d'un mutant colonial (col-3)

sont dépourvus de cette zone acide, présente seulement à l'origine de ramifications. Le

cytoplasme apical est enrichi en protéines contractiles, actine et myosine, pouvant contri-

buer, avec une force électrochimique, à la propulsion polarisée des vésicules de paroi amor-

cée le long de microtubules.

SUMMARY — Polarity (mono-) of germ tube outgrowth from a conidium in Neurospora

crassa appears to depend upon localized depolarization of the plasmalemma following

mitochondrial positioning at that level. Outgrowth polarity can be disturbed by a generali-

zed depolarization of the plasmalemma with a protonophore such as 2,4-dinitrophenol.

Monopolarly growing hyphae show a reductive and acidic apical «spot» spatially centered

on the microvesicular aggregate of the «Spitzenkérper». Apices of contorted hyphae of a

colonial mutant (col-3) are devoid of that acidic zone which is only present at the inception

of its branchings. The apical cytoplasm is enriched in the contractile proteins, actin and myo-

sin, which may contribute, with the electrochemical force, to the polarized driving of wall

vesicles initiated along microtubules.

MOTS CLÉS : hyphes, croissance, polarité, Neurospora.

Les processus de croissance et différenciation des hyphes fongiques sont

étroitement intriqués et cela dés l'émergence de ces derniers comme tubes ger-

minatifs à partir de spores achevant leur stade dit de gonflement («swelling

stage», GOTTLIEB, 1978). Ce stade de type isodiamétrique peut étre bloqué

par des inhibiteurs spécifiques de la synthése des protéines, en particulier la

cycloheximide (KATZ & ROSENBERG, 1971); il peut donc étre considéré

comme résultant d’une croissance pratiquement pure («isometrical growth»,

* Laboratoire de Microbiologie générale, Département de Biologie végétale, Université de

Genéve, CH-1211 Genéve 4, Suisse.

Source : MNHN, Paris

240 G. TURIAN

BARTNICKLGARCIA, 1973), plutôt que d'une simple inhibition aqueuse. Ce

gonflement par croissance isodiamétrique de la spore fongique est d'ailleurs

plus ou moins accentué selon les espèces : accroissement du diamètre sporal

de 2-3 fois chez Aspergillus niger, etc., pratiquement nul chez Botrytis cinerea,

etc. (cf. HAWKER, 1966). Le stade de croissance isodiamétrique est plutót

modéré chez les conidies de Neurospora crassa (environ 2 fois le diamètre

sporal).

Figure 1 — Macroconidjes de Neurospora crassa germées après incubation de 6 h A 25°C

en présence de 107 M de 2,4-dinitrophénol en milieu synthétique liquide de Vogel.

Noter l'élargissement des tubes germinatifs (*) sur les conidies exagérément gonflées.

М.О. «in vivo» (Échelle : 10 Jim).

Figure 1 — Macroconidia of Neurospora crassa germinated after 6 h of incubation at 25°C

in liquid Vogel's synthetic medium containing 10^ M of 2,4-dinitrophenol. Notice the

widening of the germ tubes (*) on overswollen conidia. M.O. «in vivo» (Bar : 10 Hm).

Le stade de croissance isodiamétrique peut étre prolongé lors de l'incubation

de conidies de Neurospora crassa A 46°C, induisant la synthèse de «heat-shock

proteins» dont certaines sont associées à la voie oxydative alternative (cyano-

insensible, MICHEA-HAMZEHPOUR & TURIAN, 1984) Un «gonflement»

isodiamétrique peut être aussi produit en présence de doses subléthales (104 M)

du découplant classique, le 2,4-dinitrophénol ou 2,4-DNP. La aussi, une énergie

de source alternative à celle de la respiration, présumément glycolytique, pour-

rait suppléer pour les synthèses protéiques (SANDERS & SLAYMAN, 1982).

Le 2,4-DNP est connu pour son effet dépolarisant sur les membranes plasmiques

(PALL, 1977) et, de ce fait, tend à généraliser la dépolarisation plasmalemmique

normalement localisée au seul site d'émergence du tube germinatif (TURIAN &

Source : MNHN, Paris

POLARITÉ HYPHALE 241

al., 1985b). La conidie «gonflée» en présence de doses sublethales de 2,4-DNP

pourrait étre considérée comme étant ainsi devenue tout entiére un énorme

tube germinatif; cela expliquerait la modulation de cet effet par des doses inter-

médiaires de 2,4-DNP, à savoir un élargissement plus ou moins notoire de la

base d’émergence du tube germinatif (Fig. 1). Aux faibles doses, de 10-5 - 10% M

de 2,4-DNP ou d'autres découplants tels que le dicoumarol à 10% M ou le

CCCP à 107 M, la phase de croissance sphérique est par contre raccourcie au

profit d’une émergence du tube germinatif prématurée (2 h à 25°C) par rapport

au témoin (moyenne de 2,5 h à 25°C), ce que nous avons attribué à une acti-

vation de l'ATPase mitochondrienne (TURIAN & MICHEA-HAMZEHPOUR,

1983) produisant un efflux de protons au-delà de la membrane interne des

mitochondries dans le cytosol proximal ainsi acidifié. En nous fondant sur

diverses observations électro-microscopiques d’une proximité aléatoire ou diri-

gée par microtubules d'un lot de mitochondries au niveau d'une zone plasmalem-

mique de la conidie sphériquement gonflée (PL. 1-1), nous avons pu suggérer

une possibilité de dépolarisation locale de la membrane plasmique, processus

alors électif du site d'émergence du tube (TURIAN & GEISSLER, 1984). A ce

propos, il est utile de rappeler que toutes les spores fongiques ne nécessitent

pas d'élection d'un póle germinatif par positionnement mitochondrien aléatoire

ou génétiquement orienté par microtubules interposés. La plupart des Ascomy-

cètes et Basidiomycètes présentent, en effet, un pore préexistant dans la paroi

de leurs spores d’origine sexuée. Ce terme de pore germinatif est d'ailleurs ap-

proximatif car il n'y a pas d'ouverture complète à son niveau maïs plutôt une

modification chimique locale de matériaux de la paroi (MARCHANT, 1979).

En fait, il y a là une différenciation secondaire de la paroi comme dans les basi-

diospores de Coprin présentant un capuchon sporal repoussé lorsque le tube

germinatif émerge. Cependant, comme il y a aussi attraction vésiculaire à ce

point d'émergence au travers de la matiére porale, le méme mécanisme décrit

plus loin devrait aussi y présider aux mouvements des vésicules de parois au tra-

vers de la zone d’exclusion des mitochondries.

Le site d'émergence peut étre considéré comme une zone de redifférenciation

par rapport à la spore précédemment dédifférenciée dés le déclic inducteur de

sa croissance sphérique, le plus probablement l'imbibition aqueuse initiale

(GOTTLIEB, 1978). Cette redifférenciation comprend l'apparition de «taches»

cytosoliques réagissant acide aux indicateurs de pH, colorants ou fluorescents

(TURIAN, 1983), et correspondant à des zones apicales pratiquement dépour-

vues de ribosomes et rapidement envahies de vésicules (Pl. I-2,3). Elles sont qua-

lifiées de restrictives ou d'exclusion pour les mitochondries, lesquelles, dés

l'émergence des tubes germinatifs, régressent à une position subapicale; elles

s'y alignent dans l'axe du tube puis de l'hyphe végétatif par des microtubules

avec lesquels elles sont parfois en contact intime (NAJIM & TURIAN, 1979;

HEATH & HEATH, 1978). Le système endomembranaire de Golgi chez les

Oomycètes (GROVE, 1978), mais essentiellement réticulaire endoplasmique

chez les autres Fungi (GOODAY, 1983) est générateur de vésicules de types

divers : vésicules dites de paroi («wall vesicles»), microvésicules agrégées en

«Spitzenkórper» chez les Septomycétes (Pl. I-3), vésicules enveloppées («coated

Source : MNHN, Paris

242 G. TURIAN

Source : MNHN, Paris

POLARITÉ HYPHALE 243

vesicles») entourées d'un triskelion (CAESAR-TON THAT & al., 1987). Le

probléme de la migration apicale et de l'exocytose des vésicules de paroi n’est

pas résolu. Proposition a été faite (BARTNICKI-GARCIA, 1973) d'une migra-

tion self-électrophorétique en direction du póle apical positif. Cette proposition

rejoindrait celle concernant l'entrée des boucles de courant électrique positif.

découvertes au site de germination des zygotes d'algues fucoides (JAFFE, 1979;

NUCCITELLI, 1982). Ces derniers résultats ont été confirmés chez les champi-

gnons par la détection d'une acidité différencielle dans l'apex d'hyphes divers à

l'aide d'indicateurs de PH tels que le vert de bromocrésol (TURIAN, 1978,

1979; Mc GILLVIRAY & GOW, 1987) et de sondes fluorescentes, 5-méthyl

esculétine (TURIAN, 1981) ou orange d'acridine (TURIAN, 1983; TURIAN &

al., 1985a-b).

Les mesures de l’école de Franklin Harold (KROPF & al., 1983, GOW & al.

1984) à l'aide d'une électrode vibrante ont confirmé l'entrée de courant positif.

dans les apex des hyphes fongiques. Le problème majeur reste cependant de

savoir ce qui contribue à la séparation des pompes expulsant des protons —

H'-ATPase membranaire à localisation subapicale — des canaux perméants

(«leaks» ou «channels») admettant l'entrée de protons acidifiants au niveau

de la membrane plasmique apicale. Ayant récemment observé cytochimique-

ment, par réaction à la diamino-benzidine (DAB), une déficience oxydative

Planche I — Electro-micrographies de stades d’émergence et d’élongation de macroconidies :

1. Site d'émergence présumé (fléche épaisse) du tube germinatif d’une conidie de Neuro-

spora crassa élu par le positionnement de mitochondries sous le plasmalemme; matiére

électro-dense (flèche mince) intermédiaire entre les membranes mitochondrienne et plas-

mique (Échelle : 1 Him; fixation-coupe, cf. TURIAN & GEISSLER, 1984). 2. Tube en

émergence de macroconidie de N. crassa montrant la zone apicale d'exclusion des ribo-

somes (flèche noire) correspondant à la zone d'acidité maxima détectée par le virage à

l'orange-rougeâtre de la fluorescence verte de l'orange d'acridine (flèche blanche) (É-

chelle noire : 1 Um; échelle blanche : 5 Um; fixation-coupe, cf. TURIAN & al., 1985a)

3. Apex hyphal de Monilia fructigena en élongation avec ses deux types principaux de

vésicules : vésicules de paroi (vp) et microvésicules (v) agregees en «Spitzenkörper»

(Echelle : 3 im). Encart : hyphes colorées au bleu de méthyléne réduit (tache blanche)

au niveau du «Spitzenkôrper» (Échelle : 104m; M.E. inédit avec Dr. L. NAJIM, M. O.

selon TURIAN, 1978).

Plate I — Electron micrographs of germinating conidia at their outgrowth and elongation

stages : 1. Presumed outgrowth site (thick arrow) of the conidial germ tube in Neuro-

spora crassa, elected by the positioning of mitochondria below the plasmalemma, elec-

tron dense patch (thin arrow) between the mitochondrial and plasmalemmic membranes

(Bars : 1 Um; fixation-sectioning, see TURIAN & GEISSLER, 1984). 2. Outgrowth tube

from a macroconidium of N. crassa showing the apical zone of ribosomal exclusion

(black arrow) corresponding to the zone of maximal acidity detected by the switch to

reddish orange of the green fluorescence of acridine orange (white arrow) (Black bar :

1 Hm, white bar : 5 Hm; fixation-sectioning, see TURIAN & al., 19853). 3. Elongating

hyphal apex of Monilia fructigena showing its two major types of vesicles : wall vesicles

(vp) and microvesicles (v) aggregated into «Spitzenkórper» (Bar : 3 Um). Insert : hyphae

stained with methylene blue reduced (white spot) at the level of the «Spitzenkórper»

(Bar : 10 Hm; E.M. unpublished with Dr. L. NAJIM, O.M. according to TURIAN, 1978)

Source : MNHN, Paris

244 G. TURIAN

(cytochrome oxydase) au niveau des mitochondries frontales de tubes germi-

natifs de conidies de N. crassa, nous avons suggéré une possibilité de carence

de livraison d'ATP aux pompes dans cette zone fronto-apicale (TURIAN & al.,

1988). La déficience oxydative des mitochondries pourrait elle-méme étre rela-

tive à leur découplage présumé lors de leur contact électif avec la membrane

plasmique. La matière électro-dense interposée entre les crêtes des mitochondries

et la membrane plasmique (Pl. 1-1) pourrait refléter la présence de composés

lipidiques découplants à ce niveau.

La contribution des vésicules au rapide allongement hyphal est sans doute

celle d’enzymes hydrolytiques (glucanases, chitinase, cellulase) et synthétisants

(glucanes-, cellulose-, chitine-synthétases). A ce niveau apical, les travaux du

groupe de Michel FEVRE (Univ. Lyon) tendent en outre à démontrer l'absence

de polyméres élaborés dans les vésicules, les polysaccharides étant assemblés à

l'interface plasmalemme-paroi en formation continue.

Le plus généralement, les conidies et autres spores fongiques non cloisonnées

n'émettent qu'un tube germinatif — germination monopolaire — à l'instar de la.

conidie de N. crassa. Cependant, des conidies telles que celles de Monilia - Scle-

rotinia, en particulier de Monilia fructigena, émettent en majorité et successi-

vement deux tubes germinatifs en figure bipolaire le plus souvent selon leur

axe conidiogénique (TURIAN, 1985). Une telle contingence démontre un con-

tróle génétique des sites d'émission du ou des tube(s) germinatif(s). Cette consta-

tation est renforcée, d'une part, par l'obtention récente de mutants morpholo-

giques déviant de la mono à la pluripolarité de germination (mutant «amycelial»

de N. crassa, TURIAN & CAESAR, 1987) et d’autre part, par le retour a la mo-

nopolarité d'un mutant résistant à l'agent anti-microtubule benomyl (ROSSIER

& TURIAN, 1987) connu pour son effet phénotypique de germination multi-

polaire chez diverses moisissures (RICHMOND, 1975; TURIAN & al., 1985b).

Ces considérations nous ramènent à notre hypothèse de départ, à savoir le

rôle directeur des mitochondries dans le déterminisme de la polarité de germi-

nation et d'allongement des hyphes. Des mesures récentes d'intensité de fluo-

rescence du colorant-laser Rhodamine 123 dans les mitochondries, reflet de leur

niveau de potentiel de membrane, a révélé une forte intensité dans les mitochon-

dries frontales des «monotubes» émergeant de conidies du type sauvage de N.

crassa, avec un maximum dans les mitochondries frontales (TURIAN & CAE-

SAR, 1987; CAESAR-TON THAT & al., 1988) interprété comme résultant de

leur efflux protonique par activation de la mit-ATPase. Ces activités sont toutes

fortement affaiblies dans les mitochondries de «polytubes» émis soit par des

conidies du mutant «amycelial» (TURIAN & CAESAR, 1987) soit par des

conidies germées en présence de benomyl (CAESAR-TON THAT & al., 1988).

Notre interprétation de ces interrelations, à la lumière des données actuelles,

est que l'intensité d'activité génératrice d'ATP et donc d'un fort courant proto-

nique des mitochondries positionnées par des microtubules intacts détermine

la dominance apicale d'un seul tube s’il n'y a qu'un lot de mitochondries (N.

crassa) ou de 2 tubes émergeant aux antipodes sporaux, s'il y en a 2 séparés

par une vacuole centrale (M. fructigena, cf. TURIAN, 1985).

Source : MNHN, Paris

POLARITÉ HYPHALE 245

Figure 2 — Hyphes vésiculeux d'un mutant colonial (col-3) de N. crassa prélevés sur la marge.

d'une colonie dense de 10 j à 25 C sur milieu synthétique agarisé. Au centre (c), ultra-

structure sur coupe mince (avec N. OULEVEY, fixation OsO4-glutaraldéhyde) révéla-

trice d'une pauvreté relative en petites mitochondries contrastant avec un hyper-dévelop-

pement du système endomembranaire (flèches) (Échelle : 1 т). L'absence de zone

d'exclusion acide à l'apex des hyphes est corroborée par : a. La coloration rouge grenat

(= grise en noir-blanc) uniforme avec l'indicateur de pH jaune d'alizarine S (10^ a-

queux); ce dernier n'est jaune et donc acide qu'au seul site d'émergence d'une ramifi-

cation (flèche); les granules foncés (violet) seraient ceux des mitochondries (relativement

plus alcalines que le cytosol). b. La coloration uniformément verdátre (grise en noir-

blanc) du vert de bromocrésol (10 aqueux), sans virage apical au jaune révélateur

d'une acidification locale (TURIAN, 1983) (Échelle : 5 um).

Figure 2 — Vesicular hyphae of a colonial mutant (col-3) of N. crassa taken from the margin

of a dense colony grown for 10 days at 25 C on the agarized synthetic medium. Center

(c), ultrastructure from a thin section (with N. OULEVEY, OsOa glutaraldehyde fixa-

tion) revealing only a few small mitochondria contrasting with the hyper-developed

endomembrane system (arrows) (Bar : 1 Jim). The absence of an acidic exclusion zone at

the tip of the hyphae is corroborated by : a. The generalized pink red (= grey in the

black-white photograph) staining with the pH indicator alizarin yellow S (10% in water);

this stain is yellow (acid pH) only at the outgrowth site of a branching (arrow); the dark

granules (violet) could correspond to mitochondria (relatively more alkaline than the

cytosol). b. The uniformly greenish staining (grey here) of the bromocresol green (10

in water), without apical turning to acidic yellow (TURIAN, 1983) (Ваг : 5 Шт).

Source : MNHN, Paris

246 G. TURIAN

La dominance apicale exercée dans les hyphes en croissance élongative a été

considérée par LARPENT (1962) comme résultant d’un drainage sélectif de

nutriments vers les apex. Cet effet de «sink» est sans doute important pour

fournir des précurseurs à l’énergétique mitochondrienne régénératrice de l'in-

dispensable ATP protogène. Celle-ci assure, parallèlement à l'effet proglyco-

lytique du glucose (TURIAN, 1972) le maintien d’une croissance élongative de

P'hyphe cylindrique c'est-à-dire à forte polarité axiale. Lorsque l’énergétique est

déficiente comme dans le cas du mutant «amycelial», c'est une croissance vésicu-

laire des hyphes pseudo-levuriformes qui se substitue à la croissance normale.

Cette déviation morphogène est reflétée par un positionnement défectueux

des mitochondries hypodéveloppées et, parallèlement, la perte du gradient acido

apical (TURIAN, 1976); cette uniformisation se manifeste par la disparition du

virage au jaune des réactifs de pH (vert de bromocrésol, sulfo-alizarine, etc.)

dans l'apex des courts hyphes vésiculeux et contournés de divers mutants colo-

niaux dont col-3 (Fig. 2).

Dans la course élongative des hyphes, l'état physico-chimique apical parait

aussi jouer un rôle moteur important. LANGERON avait déjà déclaré, en 1945,

que Phyphe fongique pouvait être considéré comme «une amibe canalisée

par les parois rigides dans un long tube». Nous-mêmes avons considéré le cyto-

plasme apical comme un pseudopode de cette amibe, et comme tel, y avons

distingué un ectoplasme bordant un endoplasme plus fluide, siège des courants

basifuges et acropètes (TURIAN, 1978). Mc KERRACHER & HEATH (1987)

ont repris ces idées en les plaçant sur le plan macromoléculaire des protéines

contractiles telle l'actine. Celle-ci capuchonne l'apex et a été isolée de Neuro-

spora crassa (SIKORA & MARZLUF, 1982). Cette protéine contractile avait

déjà été soupçonnée comme étant responsable de la gélification de l'apex ultime

où elle serait présente comme actíne polymérisée ou F-actine par déplacement

acide de l'équilibre thixotropique (sol = gel), par rapport à la zone sous-apicale

endoplasmique relativement alcaline (TURIAN, 1979). L'actine a été repérée

cytochimiquement dans les tubes germinatifs d’urédospores (HOCH & STA-

PLES, 1983) par la même méthode la phalloidine (phalacrine) - Rhodamine

utilisée pour sa détection dans les bourgeons de la levure Saccharomyces

cerevisiae (KILMARTIN & ADAMS, 1984; ADAMS & PRINGLE, 1984) ainsi

que dans les tubes germinatifs de conidies de N. crassa par les méthodes d'ex-

traction au glycérol et de formation d'«arrow-heads» de méromyosine (TURIAN

& al., 1985b).

En outre, pour assurer la motricité du cytoplasme apical, il est prévisible

d'associer l'actine à son partenaire contractile habituel, la myosine, présente

tant dans les systémes musculaires que non musculaires (FULTON, 1984).

Une premiére tentative dans cette direction a révélé une activité Ca?* - ATPasi-

que et myosine-kinase dans des extraits d'hyphes en croissance de N. crassa

(VAN TUINEN & al, 1986) et, tout récemment, une bande protéique re-

pérée au méme Rf qu'un témoin de myosine animale de 105 kdaltons en co-

électrophorése SDS-PAGE d'extraits similaires (HOANG- VAN & TURIAN,

1987).

Source : MNHN, Paris

POLARITÉ HYPHALE 247

Il est en outre à prévoir que ces systèmes endogènes répondent à des signa-

lisations externes par le canal de récepteurs membranaires périphériques encore

à découvrir chez les champignons. On y suspecte actuellement la présence chez

ces derniers du systéme inositide-triphosphate et de ses médiateurs de trans-

duction interne pour contróler les teneurs en calcium cytosoluble par l'intermé-

diaire de la protéine kinase C récemment identifice dans des extraits d’hyphes

de N. crassa (FAVRE & TURIAN, 1987). Dans ce contexte, il faut relever le

róle du calcium, complexé avec la protéine calmoduline dans le maintien de

l’elongation cylindrique normale des hyphes (ORTEGA PEREZ & TURIAN,

1987).

La structure polarisée (monopolarité apicale) de l'hyphe végétatif en crois-

sance élongative se maintiendra jusqu'à son écroulement ou dissipation lors de

la transition fondamentale apex à différenciation végétative > apex à différen-

ciation sporogène, suite à une induction par facteurs externes (inanition, lux,

etc.) sur une base de compétence génétique comme le prouve l'existence de

nombreux mutants stériles (aconidiens, etc.). Cette transition, un modele de dif-

férenciation cellulaire (COLE, 1986), a pu étre anticipée (développement micro-

cyclique) chez diverses moisissures (Aspergillus niger, Neurospora crassa, Tricho-

derma viride, Penicillium urticae, etc.) par action de chocs thermiques et/ou

de stress nutritionnel (carence en azote, GUIGNARD & al., 1984).

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Source : MNHN, Paris

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COREMIUM AND RHIZOMORPH DIFFERENTIATION

IN SPHAEROSTILBE REPENS.

I. — INTERACTIONS BETWEEN AGGREGATED ORGANS

DURING MORPHOGENESIS OF THE THALLUS!

by B. BOTTON* and M. KHOURY**

ABSTRACT — The Ascomycete Sphaerostilbe repens Berk. & Br. grown on agar medium

gave rise to coremia and rhizomorphs distributed in two series or waves separated by vege-

tative mycelium. The first group appeared at the centre of the colony, then as the mycelium

grew, the second group differentiated at the periphery of the colony. During morphogene-

sis of the thallus, inhibitory correlations occurred between aggregated organs in the course

of differentiation. By using transplanting, or diffusion barriers created by inserting obstacles

or cutting trenches in the agar medium, and by triggering aggregation at different sites on

the colony, the ensuing distribution of coremia and rhizomorphs showed that these organs

inhibited primordia development in their vicinity. The inhibition occurred between aggre-

gated organs produced within a wave as well as between waves of organs. When the distance

between the mycelial margin and aggregated organs increased, the mycelium gradually

and temporarily lost its aggregating capability which was recovered when hyphal apices

were sufficiently distant from the aggregating centers. The inhibition ascribable to a wave

was directed both centrifugally and centripetally. These numerous correlations obviously

regulate the observed pattern of coremium and rhizomorph development in the colony and

some possible interpretative hypotheses are proposed.

RESUME — L’ascomycéte Sphaerostilbe repens Berk. & Br. cultivé sur milieu gélosé diffé-

rencie des corémies et des rhizomorphes qui se répartissent en deux vagues séparées par du

mycélium végétatif; l’une est localisée au centre du thalle et l'autre à sa périphérie, Lors de

la morphogenése, le thalle est le siège de corrélations d’inhibition entre organes agrégés.

En utilisant les techniques de bouturage, de barrières de diffusion (obstacles, fossés creusés

dans la gélose) et en provoquant la différenciation des organes à différents emplacements sur

le thalle, il est possible de montrer que la différenciation des organes agrégés inhibe à proxi-

mité la formation de nouvelles structures. Cette inhibition se manifeste entre les organes agré-

gés formés au sein d'une même vague et entre les vagues d'organes agrégés elles-méme. Les

extrémités mycéliennes qui s'éloignent d’une vague au cours de la croissance, perdent tem-

porairement leur capacité à s'agréger puis la retrouvent lorsqu'elles sont suffisamment éloi-

gnées des centres d'agrégation. L'inhibition imputable à une vague peut s'exercer aussi bien

en direction centrifuge qu’en direction centripéte. Ces corrélations multiples régulent mani-

festement la distribution des corémies et des rhizomorphes sur le thalle et quelques hypo-

théses explicatives possibles sont évoquées.

1. Part of an invited paper presented at the «4éme Rencontre Nationale du Réseau Myco-

logie» held in Lyon, France, 23-24 October 1987.

* Université de Nancy I, Laboratoire de Physiologie Végétale et Forestiére, BP 239, 54506

Vandeeuvre-les-Nancy Cedex, France.

** Am Klufterhaf 8, Postfach 20 11 35. D 5300 Bonn 2, F.R.G.

Source : MNHN, Paris.

252 B. BOTTON and M. KHOURY

KEY WORDS : aggregated organ, Ascomycete, coremium, differentiation, morphogenesis,

pattern control, rhizomorph, Sphaerostilbe repens.

INTRODUCTION

Several factors combine to decide the time and place of origin of aggregated

organs in a fungal colony. External parameters such as nutritional and physical

factors play significant roles in the initiation and development of aggregated

structures.

The successive phases of morphogenesis are also controlled by internal

correlations which can very often be interpreted as a trophic intercellular com-

petition or an internal circulation of hormonal substances or excretions. The

soundness of both has been verified in fungi and seem capable of regulating

developmental phenomena of numerous parts or organs within a mycelium.

According to BUTLER. (1961) the dominance of the axis over the ramifi-

cations might be controlled by internal competition. The experiments carried

out by LARPENT (1966) and FEVRE (1972) confirmed this and showed that

the apices of the axes were powerful enough to convert a significant amount of.

metabolites for their own use. In the genus Doratomyces, there also exists a

trophic competition between vegetative hyphae, ascendant filaments of coremia

and rhizoids which grow in the opposite direction (BRETON, 1974).

The intervention of morphogenetic substances or excretions controlling

morphogenesis is also suggested. Indeed, the development of excised coremia of

Doratomyces purpureofuscus required the presence of mycelium which seemed

able to produce molecules provided to the reproductive organs (BRETON, 1978).

It has been shown experimentally that there exist branching factors in Neuro-

spora crassa (ROBERTSON, 1959), Ascobolus immersus (CHEVAUGEON,

1959) and Podospora anserina (NGUYEN VAN HUONG, 1962; CHEVAUGEON

& NGUYEN VAN HUONG, 1969).

According to GOUJON (1967) the initiation of sclerotia buds in Corticium

rolfsii depends both on the synthesis of inductors and on the trophic competi-

tion produced by the filament apices located at the margin of the colony. The

same interpretations have been put forward to explain localizations and rhyth-

mic appearances of basidiocarps on thalli of Basidiomycetes where a competition

occurs between primordia of fruit bodies during the process of differentiation

(SINDEN & al., 1962; INGOLD & NAWAZ, 1967; MANACHERE, 1971).

However, in Coprinus congregatus, the carpophores successively exert an inhi-

bitory and a stimulatory effect on the producing mycelium according to whether

they are at the juvenile or mature stage (MANACHERE, 1971, 1977; ROBERT,

1978).

It seems obvious that the importance of the competitions for nutrients and

the interventions of morphogenetic factors are common characteristics involved

in initiation and development of differentiated organs in fungi.

Source : MNHN, Paris

INTERACTIONS BETWEEN AGGREGATED ORGANS 253

The Ascomycete Sphaerostilbe repens gives rise to aerial coremia and rhizo-

morphs immersed in the culture medium. These two types of structures are

anatomically continuous and their ensemble has been named «aggregated units»

(GUILLAUMIN, 1970; BOTTON, 1983a-b).

During growth of the fungus, a first series or wave of aggregated organs is

formed in the centre of the colony. After 3 1/2 days, thizomorphs and coremia

stop differentiating and the colony extends radially exclusively as undifferen-

tiated mycelium. A second series of organs differentiates from the seventh

day of culture on. This second group is composed of several circles of aggregated

units formed progressively as the hyphae elongate (Fig. 1).

Fig. 1 — Top view on agar medium of a 13-day-old thallus of Sphaerostilbe repens. A first

series of aggregated units has been formed in the centre of the culture, then separated

by about 10 mm of undifferentiated mycelium, a second series of organs is being formed

at the periphery of the colony as filament elongation proceeds. Rhizomorphs which

elongate more rapidly than mycelium are being extended beyond the hyphal margin.

(Scale= 10 mm).

Fig. 1 — Vue de dessus d’un thalle de Sphaerostilbe repens ágé de 13 jours cultivé sur milieu

gélosé. Une première série d'unités agrégées s'est différenciée au centre de la culture, puis

séparée par environ 10 mm de mycélium végétatif, une deuxième série d'organes se

forme à la périphérie de la colonie au fur et à mesure que les hyphes s'allongent. Les

rhizomorphes qui s'accroissent plus vite que les hyphes dépassent le mycélium à sa péri-

phérie. (Échelle = 10 mm).

Source : MNHN, Paris

254 B. BOTTON and M. KHOURY

The aim of the present work was to study the interactions that could arise

between aggregated organs and subsequently between the different series of ag-

gregated organs during morphogenesis of the fungus.

MATERIALS AND METHODS

Organism and culture methods

Sphaerostilbe repens Berkeley and Broome (strain C.B.S. 275.60), supplied

by the Centraalbureau voor Schimmelcultures of Baarn (Holland), was kept

on a 2 % malt agar medium. The fungus was cultivated in Petri dishes on a syn-

thetic agar medium whose composition in g/l was as follows : sucrose, 45;

tartaric acid, 2.64; NH4NO3, 3; (NH4 )2 SO4, 0.2; KH» POq, 0.6; K2 CO3, 0.4;

MgSOq.7 H20, 0.85; FeSO4.7 H20, 0.086; ZnSOs.7 H20, 0.04; MnSOq.H2 0,

0.008; CaCl;.2 H5O, 0.014, Agar (Difco), 20. The pH was adjusted to 5.4 with

NaOH before autoclaving at 120°C for 20 min. After autoclaving the pH was

5.3. Cultures were inoculated by spores harvested from coremia. The inoculum

contained 103 spores in suspension in 10 ul of distilled water. Sphaerostilbe

repens was grown in the dark at 28°C.

Experimental procedures used to study the pattern of aggregated organ

development

Interactions between primordia of aggregated units were analyzed by remo-

ving small areas of the colony which were examined as concerns their capability

of giving rise to coremia and thizomorphs. The central zone of the thallus where

the aggregated organs normally form was divided into cubic portions of 1 x 1

x 1 mm which were deposited on a new agar medium. The mean lag period for

differentiating coremia was determined by periodically examining the explants

under a binocular lens. This technique was also used to estimate the aggregative

capacity of the vegetative mycelium.

Interactions between series of organs were studied by interrupting the conti-

nuity of the hyphae. Obstacles such as coverglasses were inserted in the deve-

loping colonies and the number of coremia formed at obstacles was determined.

Similarly, diffusion barriers were created by removing circular strips of agar

with the overlying hyphae. Each trench extended to the plate bottom. Aggre-

gation was estimated by the number of coremia differentiated along the trench

edges.

Differentiation of the central wave was inhibited by placing 35 mm diameter

plastic discs on 32-houi-old thalli. In these conditions, hyphae turned into im-

mersed mycelium» unable to aggregate (EL-KHOURI & BOTTON, 1982).

Once apices reached the edge, they differentiated coremia and rhizomorphs

along the discs which were removed at several developmental stages in order

to induce organ differentiation in the central part of the colonies.

Source : MNHN, Paris.

INTERACTIONS BETWEEN AGGREGATED ORGANS 255

Simultaneous differentiation of the central organs and of an experimental

wave at the periphery of the colony was obtained by placing a glass plate (50 x

50 x 3 mm) on а 32-hour-old thallus. Aggregation was triggered by removing

glass plates at different times before the hyphae had reached the edges of the

plates.

Techniques of measurement

Production of aggregated units was determined as the average number of

organs per unit area of an agar culture by using the following technique : cylin-

ders of the colony were punched out wiht a cork borer of cross section 78 mm?.

With a hand microtome the samples were cut horizontally by a razor blade in

order to separate agar and rhizomorphs from overlying mycelium and coremia.

The aggregated units were then distinguishable by their thizomorph cross sec-

tions which were counted under a binocular lens.

Production of coremia was simply determined by counting them under a

binocular lens from a cylinder of the colony punched out with a cork borer

of cross section 28 mm?.

RESULTS

Interactions between aggregated organs during the process of differentiation

In the central area of the thallus, numerous aggregated units (up to one

hundred or so) differentiate simultaneously over approximately 28 mm?. It

seems obvious that the distribution of these organs does not occur at random

but results from interactions between primordia.

The central zone was cut into cubes of 1 mm’, the organ regeneration of

which was observed after transfer into a new medium. The time required for

aggregation of the first coremium (aggregate of mycelium clearly erected) was

determined on each transplant by observation every two hours under a binocular

lens.

In control cultures, aggregation occurred, on the average, after 42 hours of

incubation. When the transplants were transferred after 20 hours of incubation,

the greatest number differentiated at the 47th hour of incubation with a conti-

nuous distribution on both sides of this modal class (Fig. 2). When the trans-

plants were transferred after 30 hours of incubation, the distribution curve level-

led off from 47 to 51 hours and when the transfer was performed at the 38th

hour of incubation the curve became clearly bimodal with one peak of aggre-

gation at the 47th hour and the other at the 51st hour of incubation (Fig. 2).

Although no sign of aggregation was distinguishable at any time of trans-

plantation, a difference of behaviour progressively appeared and by the 38th

hour two populations of transplants could be separated on the basis of their

capacity to differentiate aggregated structures.

Source : MNHN, Paris

256 B. BOTTON and M. KHOURY

36 +

а зо

= 24}

= 18

ш 12}

аз 45 47 49 51 53 55 57 59

TIME OF DIFFERENTIATION (Hours)

Fig. 2 — Frequency curves of the times of aggregation of the transplants taken from thalli

at 3 different ages : 20 hours (@), 30 hours (0) and 38 hours (4).

Transplants consisted of cubic mycelial parts cut from central regions of cultures where

aggregation is expected, Coremium differentiation was observed every 2 hours with a

sample of 100 transplants cut at each time from four colonies. The number of differen-

tiated transplants at each time is indicated on the ordinate. Times on the abscissa include

the growth period of the fungus prior to the transplanting.

Fig. 2 — Courbes de fréquences des délais d’agrégation des boutures prélevées sur des thalles

âgés de 20 heures (@), 30 heures (©) et 38 heures (A).

Les boutures cubiques sont prélevées à partir de la région centrale des cultures oà l'agré-

gation doit se situer. La différenciation des corémies est observée toutes les 2 heures sur

une population de 100 boutures prélevées à chaque temps à partir de quatre colonies.

Le nombre de boutures différenciées à chacune des périodes est porté en ordonnée. Les

délais d’agrégation mentionnés en abcisse sont déterminés depuis l’ensemencement des

cultures fournissant les boutures.

These results suggest that the aggregated units in the process of differentia-

tion inhibit the surrounding regions of the thallus; consequently the former

group gave rise to coremia after an incubation period of 47 hours, while the

latter group coming from the inhibited areas differentiated 4 hours later.

Influence of a series of aggregated organs on subsequent differentiation

of the thallus

As coremia and rhizomorphs are formed first in the central region of the

thallus, they may inhibit production of new organs in their vicinity and it

seemed of importance to study the capability of hyphae to give rise to aggrega-

ted structures from the colony margin to the central aggregating zone.

Source : MNHN, Paris

INTERACTIONS BETWEEN AGGREGATED ORGANS 257

— Aggregating capability of excised transplants of vegetative mycelium

With young cultures, the best capability of the transplants to regenerate

coremia was found near the central aggregated units (Fig. 3a). Then, as hyphae

elongated, the zone next to the central area progressively lost its high morpho-

genetic potential (Fig. 3b-c) and development of coremia gradually became

restricted to a peripheral zone located at several mm from the central wave

(Fig. 3c-d). Inocula taken from the apices always exhibited a weak regenerating

capacity.

It appears that the aggregating capacity of the hyphae shifted from the cen-

tral old region to the subapical cells of the filaments to constitute the area where

the second wave of aggregated structures normally forms.

а b c

2 10 2

a L

5 2

SS CS Ad as у: o) O cuit са ыр cq UGS

REFERENCE NUMBER OF THE TRANSPLANTS

Fig. 3 — Number of coremia differentiated on transplants, depending on their origin on the

thallus, Transfers were done from 4-day-old thalli (a), 6-day-old thalli (b), 8-day-old

thalli (c) and 12-day-old thalli (d). Mycelial samples of uniform size (1x1x1mm) were

cut along radii and transferred to a new culture medium. Reference numbers correspond

to number one which represents fragments taken from hyphal apices to the last number

which represents fragments located near central waves. Coremium aggregation was deter-

mined on 6-day-old subcultures. Results are the mean of 30 transplants taken at each site.

Fig. 3 — Nombre de corémies différenciées sur les boutures selon leur emplacement d'origine

sur le thalle. Le bouturage est réalisé à partir de cultures âgées de 4 jours (a), 6 jours (b),

8 jours (c) et 12 jours (d). Les boutures de taille uniforme (1x1xl mm) sont prélevées

selon plusieurs rayons de la colonie et repiquées sur un milieu de culture neuf. Les bou-

tures sont numérotées, le numéro un constituant l’apex des hyphes et le dernier numéro

étant la bouture juxtaposée à la vague centrale. La formation des corémies a été enre-

gistrée 6 jours aprés le bouturage. Les résultats sont la moyenne de 30 boutures par

emplacement.

— Effect of a physical barrier on differentiation

When a transverse barrier such as a coverglass was placed in the culture

between the two waves of aggregated units, coremia and rhizomorphs were

Source : MNHN, Paris

258 B. BOTTON and M. KHOURY

formed preferentially at the side of the barrier exterior to the centre of the

mycelium (Fig. 4a, Fig. 5). A coverglass placed along one radius of the thallus

did not allow differentiating organs at either side (Fig. 4b). It appears thus,

that the central wave inhibits production of new organs in its proximity. Maxi-

mal inhibition was found between 6 and 9 mm from the central series of diffe-

rentiating organs. Indeed, when the obstacles were near the centre of the colony

or at some 12 mm or more from the central aggregated units, coremium diffe-

rentiation increased (Fig. 5). However, when barriers were placed at the margin

of a 15-day-old colony (at about 25 mm from the colony centre), differentiation

was the same at both sides of the barrier whatever its disposition with regard

to the hyphae. The influence of the central group of organs obviously no longer

extends to this distance.

Fig. 4 — Pattern of coremium development at barriers inserted transversally (a) and radially

(b) in a developing colony. Top view of 18-day-old thalli.

In this experiment, sterile cover glasses (5 mm width) were inserted down to the plate

bottom on 8-day-old thalli, in the vegetative mycelium which lies between central and

peripheral waves. A transverse orientation of the barrier led to coremium production

located on the external side of the obstacle (a) while a radial orientation of the barrier

was without any effect (b). (Scale = 5 mm).

Fig. 4 — Localisation des corémies à proximité des barrières placées transversalement (a)

ou radialement (b) dans un thalle en croissance. Vue de dessus des thalles âgés de 18

jours.

Dans cette expérience, des lamelles stériles de 5 mm de largeur, sont insérées jusqu'au

fond de la boîte sur des thalles de 8 jours, au niveau du mycélium végétatif localisé entre

les deux vagues d'organes agrégés. Le barrage transversal engendre une production de

corémies du côté externe (a) alors qu'un barrage dans le sens radial de la culture demeure

sans effet (b). (Échelle = 5 mm).

When a barrier was created by cutting a trench in cultures of different ages at

4 mm behind the mycelium margin, aggregated structures differentiated exclu-

sively along the outer edge within 48 hours after the strips were removed (not

shown). As the diameter of the circular channels increased, the experimental

Source : MNHN, Paris

259

в +

NUMBER OF COREMIA

> o

6 9 12 15

DISTANCE CENTRAL WAVE -BARRIER (mm)

Fig. 5 — Number of coremia differentiated at transversal barriers inserted at different posi-

tions between the central wave and the mycelium margin. Diffusion barriers were created

by inserting coverglasses in 10-day-old colonies. Coremia were numbered along the outer

side (6) and along the inner side (O) of the obstacle after 6 days of incubation.

Fig. 5 — Nombre de corémies formées au niveau des barrages transversaux mis en place en

différents endroits entre la vague centrale et l’apex des hyphes. Les barrières de diffusion

sont créées en insérant des lamelles dans des thalles âgés de 10 jours. Les corémies sont

dénombrées de long de la lamelle, sur la face externe (@) et sur la face interne (O) après

6 jours d’incubation.

EDO

5 20

u |

2 10

CULTURE AGE (days)

6 — Influence of an experimental wave of aggregated organs on the subsequent diffe-

rentiation of the thallus. A circular trench of increasing diameter stimulated aggregation

along the outer edge and resulted in rejecting the subsequent second wave provided that

thalli were less than 8-day-old. Diameter of the experimental wave along the outer edge

of the trench (@). Internal diameter of the second wave (0)

Fig. 6 — Influence d’une vague expérimentale d’organes agrégés sur la différenciation consé-

cutive du thalle. Un fossé circulaire de diamètre croissant provoque l'agrégation sur la

lévre externe située du cóté des apex et a pour conséquence de repousser dans l'espace

la différenciation de la deuxième vague pourvu que les thalles soient âgés de moins de

8 jours. Diamètre de la vague expérimentale sur la lèvre externe du fossé (@). Diamètre

interne de la seconde vague (0).

Source : MNHN, Paris

260 B. BOTTON and M. KHOURY

induced series of organs increased in diameter too, and consequently the second

wave of organs differentiated further out at an approximately constant distance

from the experimental series (Fig. 6). From the 8th day of culture on, making

a trench did not hinder differentiation of the second wave in the proximity of

the trench suggesting that between the 7th and 8th day of culture, an irreversible

change must occur in the apices.

These results indicate that the central series of organs, as well as the series

induced by wounding the colony, inhibit production of new organs in their

vicinity.

— Bidirectional translocation of the inhibition generated by aggregated organs

The previous experiments lead to believing that the central wave inhibits the

experimental wave, this latter being in turn able to inhibit the second wave of

aggregated organs. This inhibition exerted outwards the colony, is actually due

to the successive production of organs as the elongation of filaments proceeds

2 $

2 s

= =

5 so {в ?

a =

à $

ч Е

E Е

20 44

= E

5 È

2 5

Е u

3 10 4 5

2 =

7 10 13 16 19

CULTURE AGE (days)

Fig. 7 — Influence of a peripheral wave on differentiation of the central region of the thal-

lus. Plastic discs were placed on 32-hour-old thalli and were removed at several different

ages of the cultures indicated on the abscissa; 9 days later, aggregated units were counted

following the procedure described in the experimental part.

Number of aggregated units along the disc (4); number of aggregated units in the central

region of the thallus (@); time of differentiation of the aggregated units in the central

region of the thallus after removal of the disc (0).

Fig. 7 — Influence d'une vague périphérique sur la différenciation de la partie centrale du

thalle. Des disques de plastique sont placés sur les thalles âgés de 32 heures puis sont en-

levés à différents ages de la culture indiqués en abscisse; 9 jours plus tard les unités agré-

gées sont dénombrées selon le procédé décrit dans la partie expérimentale.

Nombre d'unités agrégées autour du disque (A); nombre d'unités agrégées dans la région

centrale du thalle (@); délai d'apparition des unités agrégées dans la région centrale du

thalle après l'enlèvement du disque (0).

Source : MNHN, Paris

INTERACTIONS BETWEEN AGGREGATED ORGANS 261

and one might question what the influence of the external wave is on the deve-

lopment of the central series of organs.

In order to respond to this, an experimental series of coremia and rhizo-

morphs was at first induced at the periphery of a disc and in order to allow

differentiating of central organs, discs were removed as a function of time.

As shown in figure 7, the number of aggregated organs on the experimental

wave increased with time of removing the disc and a maximum of organs was

differentiated from the 13th day of incubation on. Moreover, the later the disc

was removed, the fewer were the central aggregated units and the longer was

the time required for their differentiation. Beyond 13 days of incubation, no

organ was formed in the central region of the thallus.

The inhibitory effect of a differentiating wave can obviously be directed

towards the centre of the colony.

Simultaneous regeneration of central and peripheral waves and influence on

the differentiation of the intercalary region of the thallus

Glass plates deposited on young mycelium were removed before apices had

reached the edge and organ differentiation occurred preferentially, both in the

central area and at the margin of the colony, this latter group of aggregated

units being qualified as an experimental wave. As this procedure has been shown

to considerably stimulate organogenesis (EL-KHOURY & BOTTON, 1982)

regeneration of coremia could also be more or less induced everywhere in the

space separating the two waves, depending on the distance between them.

In control cultures, the coremium density of the central wave was high,

greater than that of the second wave (Fig. 8a). Removing the glass plates after

5 days was accompanied only by a regeneration of the central and experimental

waves with no coremia formed in the interval (Fig. 8b). When plates were

removed later, distances between the waves increased and coremium regenera-

tion occurred everywhere, although organs were fewer near the central wave

(Fig. 8c).

This technique clearly shows that aggregation can occur between differentia-

ted organs provided that organogenesis centers are distant enough from each

other.

Suppression of a series of aggregated organs and incidence on regeneration

of the other regions of the thallus

If early differentiated organs inhibit the potential aggregation sites, the eli-

mination of such organs should promote differentiation in the inhibited areas.

By using the same device as in the previous experiment, the elimination of the

future central wave at the same time as the glass plate was removed, stimulated

coremium formation in the proximity of the ablation (Fig. 8d). The elimination

of the mycelium margin led to an increase of the density of the coremia in the

median zone and particularly in the central region of the colony (Fig. 8e).

Source : MNHN, Paris.

262 B. BOTTON and M. KHOURY

NUMBER OF COREMIA ON 28 mm? AREA

зор © 1 f

20 ||| 1

10 | i

ll iit Im mm | m. mj ‚il

20 o 20 20 o 20

MYCELIUM RADIUS (mm)

Fig. 8 — Coremium distribution following simultaneous triggering of aggregation on the

whole colony. Vegetative mycelium developed for several different periods under a glass

plate. After its removal which triggered aggregation, regenerated coremia were counted

8 days later on 28 mm? areas taken along two perpendicular diameters for each culture.

Figures are the mean of 20 determinations at each site.

a) Control culture. b) Aggregation triggered on a 5-day-old thallus. c) Aggregation trig-

gered on a 9-day-old thallus. d) Aggregation triggered on a 9-day-old thallus with simul-

taneous elimination of the central region. e) Aggregation triggered on a 9-day-old thallus

with simultaneous elimination of the mycelium margin. f) Aggregation triggered on a

9-day-old thallus with simultaneous elimination of central and peripheral regions.

Fig. 8 — Distribution des corémies à la suite d'un déclenchement simultané de l'agrégation

sur tout le thalle. Le mycélium végétatif se développe pendant différentes périodes sous

une plaque de verre. Le retrait de la plaque déclenche l’aggrégation et les corémies

formées sont dénombrées 8 jours plus tard sur des surfaces de 28 mm” prises suivant

deux diamètres perpendiculaires pour chaque culture. Les chiffres sont la moyenne de

20 déterminations à chaque emplacement.

a) Culture témoin. b) Agrégation déclenchée sur un thalle âgé de 5 jours. c) Agrégation

déclenchée sur un thalle âgé de 9 jours. d) Agrégation déclenchée sur un thalle âgé de

9 jours avec élimination simultanée de la région centrale. e) Agrégation déclenchée sur

un thalle âgé de 9 jours avec élimination simultanée de la périphérie du mycélium. f)

Agrégation déclenchée sur un thalle âgé de 9 jours avec élimination simultanée des ré-

gions centrale et périphérique.

The inhibitory effect of the peripheral aggregated units thus influenced all

the thallus. The elimination of both potential waves promoted coremium diffe-

rentiation in the median zone (Fig. 8f).

Source : MNHN, Paris

INTERACTIONS BETWEEN AGGREGATED ORGANS 263

DISCUSSION

The results of this study demonstrate that in Sphaerostilbe repens aggregated

organs are not distributed sporadically but that correlations by competition

between structures in the process of differentiation regulate their distribution

on the mycelium.

Differentiation of an aggregated unit inhibits formation of new organs in the

vicinity. The inhibition occurs between organs formed within a group as well as

between waves of aggregated units themselves and is translocated centrifugally

and centripetally.

Morphogenesis in Sphaerostilbe repens and especially the characteristic

concentric series of coremia and thizomorphs produced when a colony grows

from a point inoculum can also be regulated by various other factors such as

external, chemical and physical factors (BOTTON, 1977; BOTTON, 1980),

but these may be overriden by the internal correlations. In addition to the

competition between aggregated organs, several other mutual relations have

been observed, e.g. between mycelium and rhizomorphs (BOTTON & CASALIS-

GOUGEROT, 1979) and between immersed and aerial mycelia (EL-KHOURI &

BOTTON, 1982).

Several questions have been raised by these results, especially what is the inhi-

bition ascribed to and how is the inhibition translocated ? The mechanism of

inhibition so far remains unknown; it could result either from nutrient depri-

vation by the early formed organs or from the production of inhibitory sub-

stances. In the central part of the thallus, inhibition due to the differentiating

organs is effective only over short distances (usually there exists less than one

millimiter between primordia) and it is likely that the inhibition is translocated

by filaments rather than by the external medium. Series of aggregated organs

are inhibitory over much longer distances; this was especially true for peripheral

waves which modified coremium regeneration on the whole colony including

the central wave. The removing of plastic discs during the time peripheral

aggregated units were developing, suggests that immersed mycelium might

translocate the inhibition as it was the sole type of filaments existing at that

time. This experiment in which central organs were all the more inhibited as

peripheral aggregated units were more fully developed, indicates that inhibition

was not temporary but lasted both during initiation and growth of aggregated

units. In addition, experiments using transplants lead to believing that the inhi-

bitory effect is persistent and efficient long after the building of series of aggre-

gated organs; indeed vegetative zones gave rise to weak regenerations, once

excised.

The pattern of aggregated organ development in Sphaerostilbe repens has

some similarities with Sordaria fimicola where perithecium production was

restricted along the outer edge of a trench and a diffusible central inhibitor has

been put forward to explain this (POLLOCK, 1975). However, in many fungi

including Sordaria, reproductive organs usually occur when the mycelium

reaches obstacles such as the edge of a dish and its linear growth is thus restric-

Source : MNHN, Paris

264 B. BOTTON and M. KHOURY

ted (BAHN & HOCK, 1973; LYSEK, 1976). Two major hypotheses have been

put forward : the first is that the colony margin is stimulated when it encounters

an increase in concentration of secreted metabolites as it approaches a barrier

(BUSTON & RICKARD, 1956); the second is that stimulation is a consequence

of inactivation of an inhibitory by an increased concentration of metabolites

in the apices following cessation of growth at a barrier (CHET & HENIS, 1968).

However, in Sclerotium rolfsii, inhibition of linear mycelial growth by itself

is not a major simple cause for sclerotium induction (OKON & al., 1972). In

Sphaerostilbe repens, additional experiments have not led to the conclusion

that the ceasing of hyphal elongation is a prerequisite of the formation of core-

mia and rhizomorphs (BOTTON, 1980) and further investigations are needed

to explain the formation and distribution of the aggregated organs on the co-

lony. Studies concerning the translocation and the nature of the inhibitory

effect are being published in separate papers.

ACKNOWLEDGEMENTS : Stimulating discussions with Professor J. CHEVAUGEON

University of Paris-Orsay, have helped to clarify certains aspects of this research, and the

authors are deeply grateful for his help.

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Source : MNHN, Paris

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MÉTABOLITES SECONDAIRES FONGIQUES :

Diversité de structures mais unité de fonction, la protection

par Noél ARPIN et Marie-Louise BOUILLANT*

RÉSUMÉ — Les Champignons ont une extraordinaire capacité à synthétiser les métabolites

les plus varies. L’examen des Y-glutamylanilines/hydrazines et des mycosporines — ensemble

de molécules à rôle protecteur vis-à-vis des microorganismes et des radiations ultraviolettes

respectivement — montre bien qu'une diversité structurale peut s'exprimer malgré des ori-

gines biosynthétiques similaires (voie du shikimate et glutamine). De plus, il est montré

avec l'exemple des mélanines fongiques que les Champignons utilisent diverses voies méta-

boliques pour la synthése de molécules différentes mais ayant toutes le méme róle protec-

teur évident. En conclusion il est indiqué que la variété des métabolites fongiques doit

correspondre à une nécessité écophysiologique. Les espèces qui se sont pérennisées sont

vraisemblablement celles qui ont su utiliser au mieux les sous-produits de leur métabolisme

pour les transformer, en fonction de leur environnement, en molécules protectrices, agents

de survie.

SUMMARY — Fungi show an extraordinary ability to synthesize the most various secondary

metabolites. The study of Y-glutamylanilines/hydrazines and mycosporines — all compounds

with protective effect against microorganisms and UV radiations respectively — shows

that an important structural diversity can be expressed despite similar biosynthetic path-

ways. Moreover it is known with the example of fungal melanins that fungi use several

metabolic pathways to synthesize compounds, whose protective effect is clearly apparent.

In conclusion we point out that the diversity of secondary fungal metabolites should corres-

pond to an ecophysiological need. Species that have made the best use of their own by-

products to transform them into protective molecules, according to their usual environment,

have been the most suited for the survival.

MOTS CLES : champignons, métabolites secondaires, Y-glutamylanilines/hydrazines, myco-

sporines, mélanines, fonction de protection.

INTRODUCTION

Les Champignons offrent une extraordinaire diversité tant au niveau de leurs

formes que de leurs modes de reproduction. Moins connue mais tout aussi

étonnante est leur capacité à synthetiser des metabolites secondaires : le nombre

* Laboratoire de Mycochimie (Unité associée au CNRS, 1127), Institut de Chimie et de Bio-

logie cellulaire et moléculaire, Université Claude Bernard, 69622 Villeurbanne Cedex:

Source : MNHN, Paris

268 N. ARPIN et M.L. BOUILLANT

déjà impressionnant de 3000 molécules fongiques recensées (TURNER, 1971;

TURNER & ALDRIDGE, 1983) ne représente certainement qu'une partie

infime de ce qui existe.

Bien que l'on ignore, dans la plupart des cas, les conditions précises dans

lesquelles sont produits ces métabolites secondaires, nous savons que trés sou-

vent leur apparition accompagne une phase de différenciation. L'intérét que

nous leur manifestons se justifie parce que leur synthèse correspond à l'acti-

vation de gènes qui ne s'expriment qu'au moment de la morphogenèse.

La diversité de ces métabolites secondaires peut masquer des processus

fondamentaux et généraux; aussi convient-il d'étre trés attentif à leurs modalités

de formation, autant qu'à leurs structures. L'étude comparée des mycosporines

et des y-glutamylanilines/hydrazines nous fournit un exemple de métabolites

secondaires différents bien qu'ayant une origine biosynthétique similaire.

Par ailleurs, les Champignons ont su diversifier les voies de biosynthèse

conduisant à des molécules aux caractéristiques et aux propriétés voisines;

ainsi, la polymérisation et l'oxydation de précurseurs variés concourent à la pro-

duction de différentes mélanines fongiques selon des mécanismes qui seront ici

succinctement rappelés et discutés. Nous tenterons, dans ce texte, de dégager

quelques aspects essentiels relatifs à la biosynthèse et aux rôles physiologiques

de ces métabolites secondaires.

I— LES COMPOSÉS PRÉAROMATIQUES

ET AROMATIQUES LIÉS A LA GLUTAMINE

L'analyse des structures de la mycosporine glutamine, isolée de la partie

fructifère de Morchella esculenta, et de l'agaritine, obtenue à partir des carpo-

phores d'Agaricus bisporus (Fig. 1) montre que, dans les deux cas :

— Pun des membres du couple glutamine/acide glutamique est lié à une molé-

cule cyclique, de type cyclohexénone ou aromatique, par l'intermédiaire de

son NH, en a dans le premier cas, par le carbonyle en y dans le deuxième cas.

_ la fonction carboxylique liée au cycle a subi une réduction en alcool

primaire.

Les études de biosynthèse de l’agaritine (SCHUTTE & al., 1972) et des myco-

sporines (FAVRE-BONVIN & al., 1987) ont révélé que la partie cyclique de ces

molécules est issue de la voie du shikimate, soit en amont de ce dernier — plus

précisément au niveau du déhydro-3 quinate — pour les mycosporines, soit en

aval — au niveau de l'acide p-OH benzoïque — pour l'agaritine. Les principales

étapes assurant la biosynthèse de ces composés ont été présentées sur la Fig.

2; notons que les intermédiaires entre le déhydro-3 quinate et la cyclohexénone

n’ont pas été isolés à ce jour.

Nous allons discuter brièvement des aspects biochimiques et physiologiques

relatifs à la formation de ces composés.

Source : MNHN, Paris

METABOLITES SECONDAIRES FONGIQUES 269

MYCOSPORINE GLUTAMINE

OMe

соон (Morchella esculenta)

HO 1

HOH3C NH — CH — (CH35— CONH?

a glutamine —»

€ H50H

AGARITINE

(Agaricus bisporu s)

„соон

NH- NH - Co -C H;-CH,-CH

SNH,

--— glutamine —

Figure 1 — Comparaison des structures de la mycosporine glutamine et de l'Agaritine.

Figure 1 — Comparison of mycosporine glutamine and agaritine structures.

Au plan biochimique, l'activation de la voie du shikimate a déja été observée

au cours de la morphogenése fongique; de nombreux composés, issus de cette

voie, tels les pigments des Macromycètes (grévillines, terphénylquinones, dérivés

de l'acide pulvinique. . ., (GILL & STEGLICH, 1987)) ou les alcaloïdes de type

cyclopénine-cyclopénol produits au moment de la sporulation de Penicillium

cyclopium (NOVER & LUCKNER, 1974) illustrent ce fait. La réduction du

groupement carboxylique pourrait étre concomitante à la réoxydation des

coenzymes réduits, mais la signification précise de ce processus n'est pas encore

éclaircie.

Compte-tenu du róle central joué par le couple glutamine/acide glutamique

dans le contróle du métabolisme azoté (MARZLUF, 1981; MOORE, 1984),

la fixation de ces acides aminés constitue un processus important d'immobili-

sation de PN. Il y a là un moyen de neutraliser l'NH3 toxique. Cette immo-

bilisation de l'N peut être momentanée ou prolongée. Dans certains cas, comme

celui de Pyronema omphalodes, il y a chute trés importante de la teneur en nor-

mycosporine glutamine au moment de la libération/germination des spores

(ARPIN & BOUILLANT, 1981); dans d'autres cas, plus fréquents, la mycospo-

rine glutaminol présente dans les spores n'est pas remaniée au cours de la germi-

nation (PITTET & al., 1983).

Source : MNHN, Paris

-souyzespky/sourrue [Aueanjs- pue souriodsoo tu jo our&o [eooqauÁsojq uounuo) — z am

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—

Fields пр 910A

270

Source : MNHN, Paris

METABOLITES SECONDAIRES FONGIQUES 271

En ce qui concerne l'agaritine du Champignon de couche, GIGLIOTTI &

LEVENBERG (1964) ont montré que cette molécule pouvait servir comme

donneur du résidu y-glutamyle; ils ont, en effet, isolé d'Agaricus bisporus, une

enzyme, la y-glutamyltransférase, particulièrement active dans le transfert du

groupement Y-glutamyle sur des accepteurs tels que l'eau (hydrolyse) et d'autres

amines et hydrazines. Selon RAST & al. (1981), le residu Y-glutamyle de Vaga-

ritine se fixe sur le NH; de la p-OH aniline pour donner la N-(y-L-glutamyl)

p-hydroxyaniline (GHB in Fig. 2), précurseur, via le GDHB (Fig. 2), des méla-

nines de cette espéce.

A ces aspects biochimiques de régulation, se superpose très vraisemblablement

un róle de protection vis-à-vis de l'environnement. Du fait de leur intense absorp-

tion à 310 nm, zone limite du rayonnement UV au niveau de la biosphére, les

mycosporines participent activement à la photoprotection, comme cela fut

démontré pour les spores de Glomerella cingulata (BROOK, 1981). En cédant

son extrémité y-glutamyle, l’agaritine participe indirectement à la photoprotec-

tion (formation de mélanine protégeant les spores de l’Agaricus bisporus (RAST

& al, 1981)). En outre, les hydrazines de type agaritine ont été nettement

impliquées dans un róle de défense efficace vis-à-vis des microorganismes du

milieu (STIJ VE & al., 1986).

Ainsi, selon les nécessités dues à l'environnement, les espéces fongiques, à

partir des mémes matériaux de base, ont synthétisé des métabolites secondaires

différents, chacun étant plus efficacement adapté soit à un róle de photopro-

tection, soit à un róle de défense vis-à-vis d'espéces concurrentes.

II — MÉLANINES FONGIQUES

En avant propos, il est important de préciser que ce texte ne constitue pas

une mise au point sur ce trés vaste sujet. Pour plus d'informations nous ren-

voyons le lecteur au travail de BELL & WHEELER (1986), beaucoup plus ex-

haustif, ainsi qu'à la revue sur les pigments des Champignons supérieurs de

GILL & STEGLICH (1987). Nous voulons simplement ici dégager certains

concepts concernant ces molécules qui sont un nouvel exemple de la diversité

des moyens développés par les Champignons pour aboutir à une méme fonction.

1. Le concept de mélanine

Le nom de mélanine est attribué, sans présumer de leur nature chimique,

aux pigments noirs, bruns ou gris que l'on rencontre aussi bien chez les animaux

que chez les végétaux ou les microorganismes. Il faut cependant en exclure les

pigments bruns présents chez les plantes vertes qui sont de nature anthocya-

nique, non polymérisés.

Chez les Champignons (Macro ou Micromycétes) ces pigments colorent le

plus souvent les formes reproductrices (spores), de résistance (sclérotes, chlamy-

dospores) ou les structures d'attaque (appressoriums), c'est à dire les parties

responsables de la survie de l'espèce.

Source : MNHN, Paris

272 N. ARPIN et M.L. BOUILLANT

Овтетме BrosvwTHÉTIQUE: VOIE nu SHIKIMATE

DOPA MELANINE NH,

ү aedes mensem

окш ej: Н Е

ПОРА

GDHB MELANINE

OH OH

TYROSINASE

ud wc cs

she

MH- Youu ло de

GHB GDHR POLYMERISATION

GLUTAMYL TRANSFERASE

er,

он

OH rs

POLYPHENOLOXYDASE

NH2

CATECHOL MELANINE

он

СТ а QUINONISATION / POLYMÉRISATION ————> _MELANINE

DRIGINE BIOSYNTHETIAUE: Vorr nes POLYACETATES

DHN MELANINE

OH OH OH 0 OH OH

— LI

HO OH HO OH

DHN

1,3,5,8 THN SCYTALONE

MELANINE 4—— POLYMÉRISATION/ QUINONISATION

Figure 3 — Précurseurs clés des différentes voies de biosynthése des mélanines chez les

Champignons.

Figure 3 — Keys precursors of several biosynthetic pathways of fungal melanins.

Source : MNHN, Paris

METABOLITES SECONDAIRES FONGIQUES 273

Du point de vue biochimique, elles se définissent comme des polyméres

aromatiques, susceptibles de s'associer avec d'autres macromolécules : protéines,

sucres... et de cette nature même découle leur difficulté d'étude. Leur insolu-

bilité, dans l'eau ou les solvants organiques, les rend difficiles à extraire sans

dégradation, mais l'utilisation de méthodes dégradatives conduit à des mélanges

complexes d'analyse difficile.

Chez les Champignons, il faut distinguer :

—les mélanines produites de maniére extracellulaire, que l'on retrouve dans

les milieux de culture ou dans l'environnement mycélien. Celles-ci peuvent étre

synthétisées à partir de substrats divers, endogénes (issus du Champignon lui-

méme) ou exogénes (issus du milieu), sous l'action d'enzymes extracellulaires

ou tout simplement de l'oxygéne de l'ai

Ces mélanines contribuent à la formation de l'humus; ce sont, pro parte, les

acides humiques fongiques qui constituent parfois une partie importante (jus-

qu'à 30 %) de la biomasse produite par les Champignons.

— les mélanines liées à la paroi fongique, oà elles s'accumulent, ce qui se tra-

duit en microscopie électronique par une zone opaque aux électrons. Leur

formation, exclusivement intracellulaire, explique leur spécificité. Leurs biosyn-

théses ont fait l'objet, cette derniére décennie, de nombreuses études; celles-ci

ont montré que, suivant l'espéce considérée, les Champignons utilisent diverses

voies du métabolisme secondaire pour cette synthése pigmentaire.

2. Biochimie des mélanines

La figure 3 résume les diverses possibilités rencontrées que nous commente-

rons briévement :

DOPA mélanine

C'est la melanine du monde animal oü elle a été bien étudiée. Le substrat

clé est la dihydroxyphénylalanine (DOPA), issue de la tyrosine sous l'action

de la tyrosinase. La réaction suivante est la formation d'une diquinone — la

Dopaquinone — susceptible de nouvelles transformations mais également de

polymérisation. Ce premier exemple illustre un autre fait unitaire chez les méla-

nines : dans tous les cas il y a quinonisation suivie de polymérisation des molé-

cules phénoliques. Le polymére obtenu peut étre le produit à la fois d'auto ou

d'hétéropolymérisation des différents monoméres, ce qui conduit, du simple

point de vue phénolique, à des macromolécules complexes.

Il est un fait paradoxal : contrairement à une idée depuis longtemps admise,

la DOPA mélanine n'a pas, en réalité, été démontrée comme mélanine liée à la

paroi fongique. Les Champignons possédent l'enzyme (la tyrosinase commerciale

est celle du Champignon de couche) et le ou les substrats (tyrosine, DOPA) de

cette réaction. Ils sont donc trés certainement capables de produire ce type de

mélanine, mais son existence «constitutive» n'est pas établie.

Par contre, des études récentes ont montré la présence de trois autres types

de mélanine :

Source : MNHN, Paris

274 N. ARPIN et M.L. BOUILLANT

GDHB mélanine

Bien étudié par RAST & al. (1981), la GDHB mélanine a pour substrat le

y-glutamyldihydroxybenzine (GDHB) issu, sous l'action d'une enzyme qui

pourrait étre la tyrosinase (in vitro cette enzyme réalise cette réaction), du Y-

glutamylhydroxybenzène (GHB), lui-même formé par la voie du shikimate.

Le GDHB est, comme la DOPA, susceptible de quinonisation et, avec ou sans

leur groupement glutamyle, les quinones obtenues sont polymérisées.

Ce type de mélanine colore les spores du Champignon de couche Agaricus

bisporus. STUSSI & RAST (1981) ont démontré la présence ubiquiste du GHB

dans le carpophore et méme dans le mycélium du Champignon; par contre, le

GDHB n'est présent que dans les lamelles où apparaît le pigment corrélativement

à la différenciation sporale.

Le brunissement facile des tissus fongiques lors du vieillissement, de trauma-

tismes ou de maladies (tache bactérienne) laisse supposer la formation de méla-

nines. Leur nature n'est pas connue mais il est probable qu'elles sont, comme

les mélanines extracellulaires, formées à partir des différents substrats présents

ou libérés à l'endroit de l'agression.

DHN mélanine

Les premières analyses élémentaires de cette mélanine ont révélé qu’elle con-

tient une proportion d'N bien inférieure aux deux précédentes.

L'isolement de mutants apigmentés et l’utilisation de substances chimiques

inhibitrices de mélanogenése ont permis, d’abord à BELL & WHEELER (1986),

chez Verticillium dahliae, puis à d’autres auteurs sur d’autres Champignons,

d'établir que cette mélanine a pour précurseurs toute une série de penta-acétates

de type naphtalénique, la substance la plus facilement isolée étant la scytalone.

L'originalité de cette voie de biosynthése, par rapport aux précédentes est

qu'elle utilise uniquement des unités acétyles, que les intermédiaires ne compor-

tent pas dN et qu’elle procède par une succession de réductions (réductases)

et de déshydratations (déshydratases) pour aboutir au dihydroxynaphtalène

(DHN), déjà soupçonné par ALLPORT & BU'LOCK (1960)et BU'LOCK

(1967), susceptible de quinonisation et de polymérisation.

Il semble bien établi aujourd'hui que la DHN Mélanine est fréquente chez les

Ascomycétes. La connaissance de cette voie de biosynthése s'est révélée d'un

grand intérét appliqué, car de nombreux Ascomycètes pathogènes réalisent leur

parasitisme par le biais d'appressoriums mélanisés. Lorsque la pigmentation de

ces structures est supprimée, elles perdent leur rigidité et donc leur pouvoir

de pénétration. Cette observation motive actuellement de nombreuses études

sur ce sujet.

Catéchol mélanine

Nous cterons pour mémoire ce dernier type de mélanine formé d'unités

catéchol, quinonisées et polymérisées, qui colore les téliospores d'Ustilago

maydis (PIATELLI & al., 1965) car les résultats obtenus par voie exclusivement

dégradative demandent confirmation.

Source : MNHN, Paris.

METABOLITES SECONDAIRES FONGIQUES 275

3. Structure et fonction des mélanines

La fonction de Protection des mélanines découle trés certainement de leurs

propriétés physiques et chimiques :

— elles absorbent les rayonnements, particuliérement les ultraviolets, elles

possèdent de nombreux groupements quinoniques susceptibles d'exister sous

forme de radicaux libres. En conséquence, elles rendent les Champignons résis-

tants aux diverses radiations soit en les absorbant, soit en en dispersant l'éner-

gie, les structures sous-jacentes se trouvant de ce fait protégées;

— elles peuvent à la fois jouer le rôle de réducteurs et d'oxydants; elles sont

d'une grande stabilité chimique : elles permettent donc à l'organisme de résister

aux agressions chimiques et enzymatiques des autres organismes présents, sans

négliger le fait que leur dégradation méme relargue des composés phénoliques

toxiques pour l'agresseur;

— elles sont des polymères aromatiques rigides, insolubles et hydrophobes,

donc participent probablement à la résistance à la dessiccation et à la chaleur.

En conclusion, la Protection pourrait être, comme chez les animaux, le rôle

principal et peut-être unique, des mélanines chez les Champignons.

Bien qu’en l'absence de ces métabolites de différenciation des mutants

apigmentés soient aptes à se reproduire, il semble que les mélanines soient, pour

certaines espèces, indispensables à leur survie. Elles constituent, parmi bien

d'autres, l'un des moyens mis en œuvre par le monde fongique pour sa défense.

Cette notion «d'utilisation» de métabolites secondaires, issus ou composés

parfois de produits du métabolisme primaire (tyrosine, acide glutamique..)

pour accomplir des fonctions physiologiques essentielles doit être soulignée.

Pour croître et se différencier le Champignon peut être amené à accumuler

les métabolites les plus divers, mais ces molécules ne sont rarement des «dé-

chets» sensu stricto. L’organisme les réutilise, soit comme réserves, soit pour sa

défense. Cela semble évident pour les mélanines, moins pour d'autres molécules;

il est pourtant probable que les espèces qui se sont pérennisées sont celles qui

ont su, le plus «économiquement et le plus intelligemment» possible réutiliser

leurs sous-produits comme agents de survie.

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RÓLE DES POLYOLS ET DES ACIDES AMINÉS

DANS LA DIFFÉRENCIATION DES BOLETS

par C. ANDARY*, M.J. BOURRIER** et R. HAUPERT*

RÉSUMÉ — L'étude du mannitol et de l'arabitol ainsi que celle qualitative et quantitative

des acides aminés libres chez les Bolets permet de dresser des profils biochimiques caracté-

ristiques des différentes espèces. De plus le rapport entre les deux polyols cités nous fournit

des indications supplémentaires d'ordre chimiotaxinomique. La mise en évidence de certains

métabolites azotés réagissant à la ninhydrine permet une détection trés fiable des espèces

suspectes et toxiques qui appartiennent à la section Luridi.

SUMMARY — Study of mannitol, arabitol and qualitative and quantitative amino acids

evaluation in Boletes, permit to establish a caracteristical and biochemical profile for the

different species. Moreover the two polyols ratio gives additional chemotaxonomic indica-

tions, Finally some ninhydrin reacting metabolites allow a good reliable detection for the

suspected and toxic species into Luridi section.

MOTS CLÉS : Bolets, polyols, acides aminés, chimiotaxinomie, différenciation des espèces.

INTRODUCTION

Les Bolets commercialisés sous l'étiquette «Cépes de Bordeaux» doivent

normalement correspondre a Boletus edulis Bull. : Fr. et B. aereus Bull.:Fr.

Les autres espéces comestibles, mais de valeur gastronomique inférieure, sont

parfois mélangées aux précédentes soit accidentellement soit sous forme de

fraudes.

Parmi ces dernières espèces, il faut citer Suillus luteus (L.: Fr.) S.F. Gray, S.

granulatus (L.:Fr.) Kuntze, S. collinitus (Fr.) Kuntze et Xerocomus badius

(Fr.:Fr.) Gilb. qui sont, en petits fragments, pratiquement impossible à distin-

guer les uns des autres. Il n'existe en effet aucune méthode ou norme biochi-

mique permettant le contróle spécifique et l'analyse de la qualité des différentes

espèces.

* Laboratoire de Botanique, Phytochimie et Mycologie, Faculté de Pharmacie, 34060 Mont-

pellier.

** Laboratoire Interrégional, Service de la Répression des Fraudes, 34000 Montpellier.

Source : MNHN, Paris

278 C. ANDARY, M.J. BOURRIER et R. HAUPERT

De plus, il faut savoir que certains Bolets peuvent occasionner, même après

cuisson, des troubles gastro-intestinaux parfois très violents (SINGER, 1986).

Ces bolets sont regroupés dans la section Luridi, à cóté de Boletus satanas Lenz.

La mise en évidence de la présence d'un fragment de Bolet appartenant à cette

section revêt donc toute son importance dans le cadre d'un contrôle toxicologique.

Dans un travail précédent, nous avions, par une méthode originale d'identi-

fication et de dosage des polyols acycliques, différencié B. edulis des divers

Suillus (ANDARY & al., 1979).

Poursuivant notre recherche de marqueurs biochimiques pour la différencia-

ton d'un plus grand nombre de Bolets, nous avons mis au point l'étude des

acides aminés libres par chromatographie sur couche mince a haute performance

(CCMHP). Cette analyse a été complétée par le dosage de ces acides aminés par

chromatographie liquide à haute pression (CLHP).

D'autre part la généralisation de l'étude des polyols à un plus grand nombre

d'espèces, associée à l'étude des acides aminés pour chaque espèce, a permis

l'exploitation de ces marqueurs tant pour la distinction des espèces qu'en chi-

miotaxinomie.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Espèces étudiées

(Classification selon ALESSIO & REDEUILH in BRILLOUET, 1987).

Boletinus cavipes (Opat.) Kalchbr.;

Boletus aereus Bull.:Fr.; B. appendiculatus Schaeff., B. calopus Pers.:Fr., В.

dupainii Boud., B. edulis Bull.:Fr., B. erythropus (Fr.:Fr.) Krombh., B. fechtneri

Velen., B. impolitus Fr., B. lupinus Fr., B. luridus Schaeff.: Fr., B. pulchrotinctus

Aless., B. queletii Schulz., B. radicans Pers.:Fr., B. regius Krombh., B. rhodo-

purpureus Smotl. fo. xanthopurpureus Smotl., B. rhodoxanthus (Krombh.)

Kall., B. satanas Lenz, B. speciosus Frost;

Chalciporus piperatus (Bull.:Fr.) Bat.;

Krombholziella duriuscula (Schulz. apud. Fr.) Imler;

Porphyrellus porphyrosporus (Fr.) Gilb., Strobilomyces strobilaceus (Scop.:Fr.)

Berk.;

Suillus bellinii (Izeng.) Watl., S. bovinus (L.:Fr.) Kuntze, S. collinitus (Fr.)

Kuntze, S. granulatus (L.:Fr.) Kuntze, S. grevillei (Klotzsch :Fr.) Sing., S. luteus

(L.:Fr.) S.F. Gray, S. tridentinus (Bres.) Sing., S. variegatus (Swartz.:Fr.)

Kuntze, S. viscidus (L.);

Xerocomus badius (Fr.:Fr.) Gilb., X. chrysenteron (Bull.) Quel., X. pulverulen-

tus (Opat.) Gilb.

Analyse des polyols

La méthode de détection et de dosage des polyols est réalisée sur chromato-

plaque de gel de silice à haute performance et a déjà fait l'objet d'un travail

précédent (ANDARY & al., 1979).

Source : MNHN, Paris

DIFFÉRENCIATION CHIMIQUE DES BOLETS 279

Analyse des acides aminés libres

— Analyse par chromatographie sur couche mince (CCM)

L'extraction des acides aminés est réalisée à partir de 500 mg de poudre de

Bolet à analyser. Après macération en deux fois pendant 15 mn dans 2 x 25 ml

d’eau portée à ébullition et filtration, l'extrait est concentré à l'évaporateur

rotatif (35°C) et ramené à 10 ml. Cet extrait est additionné de quelques gouttes

d'acide sulfurique à 10 % jusqu’à pH = 2-3, puis délipidé par épuisement avec

de l'éther éthylique (4 x 10 ml).

L'extrait acidifié est passé sur une résine Amberlite IR. 120 H* (Prolabo :

200 x 10 mm). Aprés lavage de la résine à l'eau, ces acides aminés fixés sont

élués par 50 ml d'ammoniaque à 10%. L'éluat est concentré à sec (évaporateur

rotatif) et repris par 1 ou 2 ml d'éthanol à 50 %. Cet extrait purifié sert à la

CCM bidimensionnelle ainsi qu'à la chromatographie liquide à haute pression.

La CCM bidimensionnelle est réalisée sur une petite plaque de cellulose

(Merck, réf. : 5552) (10 x 10 cm) en déposant la quantité d'extrait purifié de

Bolet correctement évaluée (entre 2 et 5 ul), de maniére à obtenir des taches

bien individualisées.

Les acides aminés témoins sont mis en solution à un pour mille, dans du mé-

thanol à 30 75.

Les solvants de développement sont les suivants :

- 1ère dimension : N-butanol-acétone-diéthylamine-eau (10:10:2:5)

- 2ème dimension : isopropanol-acide formique-eau (40:2:10)

Les migrations pour les deux solvants se font sur une hauteur de 7 em. Bien

insister sur le séchage du chromatogramme après la première migration.

La révélation des acides aminés est réalisée au moyen d'un réactif polychro-

matique composé de deux solutions :

- solution (a) : 10 ml d'ac. acétique +2 ml de collidine +0,1 g de ninhydrine

dissous dans 50 ml d’éthanol.

-solution (b) : 0,5 g de nitrate de cuivre (Cu(NO3)2, 3 H2 O) dissous dans

50 ml d’éthanol.

25 ml de la solution (a) sont mélangés à 1,5 ml de la solution (b) et aprés

vaporisation du mélange, les chromatoplaques sont chauffées à 110^ pendant

5 mn. Les acides aminés apparaissent colorés en violet, bleu, marron ou jaune.

— Analyse par chromatographie liquide à haute pression (CLHP)

L'extrait purifié, préparé selon la méthode développée au paragraphe pré

dent, est filtré avec une seringue porte-filtre (0,2 Hi). L'analyse et le dosage Hs

acides aminés libres sont effectués avec un analyseur automatique Chromakon

400 (Kontron). La séparation des acides aminés se fait par passage de l'extrait

sur une résine échangeuse de cations (DC 6A Durrum) et élution au moyen

de cinq tampons différents au citrate de lithium (Pierce «Pico Buffer» lithium).

Ces divers tampons passent sur la phase stationnaire à diverses températures.

Cette derniére est précédée d'une précolonne renfermant une résine (DC 3A

Source : MNHN, Paris.

280 C. ANDARY, M.J. BOURRIER et R. HAUPERT

Durum) qui fixe l'ammoniaque éventuellement présent dans les tampons.

A la sortie de la colonne de séparation, la mise en évidence des acides aminés

se fait par coloration à chaud avec un réactif à base de ninhydrine. Les chro-

mophores obtenus sont détectés et dosés simultanément à 440 nm (en parti-

culier pour la proline et l'hydroxyproline : coloration jaune) et à 570 nm (pour

les autres acides aminés). L'identification d'acides aminés présentant des temps

de rétention voisins est facilitée par l'enregistrement simultané des absorptions, à

ces deux longueurs d'onde, dont le rapport est une constante pour chaque

molécule.

La solution étalon correspondant à l'ensemble de tous les acides aminés est

obtenue par le mélange des solutions suivantes — 0,1 ml de «Standard Pan Hamil-

ton» + 0,1 ml de «Standard PB Hamilton» + 0,1 ml de solution de glutamine

+ 0,1 ml d’asparagine à 12,5 mM/l + 0,1 ml de proline à 10 mM/l + 0,1 ml de

norleucine à 5 mM/l (utilisée comme étalon interne) + 0,4 ml de tampon «ci-

trate de lithium» à pH = 2,2.

L'échantillon à analyser (0,5 ml) est mélangé à 0,1 ml de norleucine à 5 mM/l

et 0,4 m] de tampon «citrate de lithium».

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: Suillus granulatus

S. collinitus

A et M : arabitol et mannitol

Boletus edulis

B. aereus 5. bellinii

B. calopus S. luteus

B. radicans S. grevillei

B. appendiculatus S. viscidus

B. speciosus S. tridentinus

EE S. variegatus

. regius S. bovinus

. impolitus Boletinus cavipes

Xerocomus pulverulentus

’orphyrellus porphyrosporus

: Strobilomyces stro И,

: Chalciporus piperatus

Fig. 1 + Chromatographie sur couche mince de gel de silice à haute performance du man-

nitol et de l'arabitol chez les différents Bolets.

Fig. 1 — High performance thin layer chromatography of polyols in some Boletes species.

Source : MNHN, Paris

DIFFERENCIATION CHIMIQUE DES BOLETS 281

RÉSULTATS ET DISCUSSION

Les polyols

Les seuls polyols trouvés chez les Bolets sont le D-mannitol et le D-arabitol.

La méthode d'analyse préconisée nous a permis de mettre en évidence et de

POLYOLS

GENRE SECTION ESPECE x A ax

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Champignon sec

edulis 10 - 00,0

EDULES aereus 20 - 040,05

calopus ыз 26 0,25

CALOPODES radicans 104 2 0,21

satanas 70 16 0,23

Boletus lupinus 50 63 1,25

pulchrotinctus 100 80 0,8

rhodoxanthus 100 150 15

LURIDI xanthopurpureus 62 100 1,6

luridus 100 20 0,2

queletii 100 180 18

erythropus 112 10 0,09

dupainii 80. рен ië

APPENDICULATI appendiculatus 127 - 0-01

granulatus БО s EIS.

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luteus 45 63 1,4

Suillus

variegatus 14 60 4

FUNGOSI bovinus 50 15 2,5

Boletinus cavipes AO) 151 9358

badius 70 - 000,05)

Xerocomus chrysenteron 83 - 00,05

Krombholziella SCABRAE duriuscula 140 30 0,2

les chiffres entre parenthèses correspondent à des rapports rencontrés exceptionnellenent

Tableau 1 — Dosage du mannitol (M), de l'arabitol (A) et évaluation du rapport A/M chez

les différents Bolets.

Table 1 — Mannitol (M) and arabitol (A) concentration and evaluation of A/M ratio in some

Boletes species.

Source : MNHN, Paris.

282 C. ANDARY, M.J. BOURRIER et R. HAUPERT

doser ces molécules à partir d'un extrait brut de champignon d'une facon précise

et spécifique (Fig. 1 et Tabl. 1). La mise en évidence elle-même des polyols

est trés rapide (30 mn) et le dosage par spectrofluorimétrie directe sur chroma-

togramme (A ex. = 375 nm, А ёт. — 490 nm) est jusqu'à 100 fois plus sensible

que par les techniques classiques (limite de sensibilité de l'ordre de 20 nano-

grammes de polyol). Par ailleurs, le rapport arabitol/mannitol (A/M) est intéres-

sant à considérer car il ajoute une indication supplémentaire d'ordre chimique au

classement des espéces. Les polyols sont en effet de bons marqueurs chimio-

taxinomiques qui paraissent trés fiables comme l'ont montré PFYFFER & RAST

(1986).

Ainsi le genre Suillus apparait trés homogéne avec un rapport A/M toujours

supérieur à 1, ce qui correspond bien à une écologie identique pour toutes

ces espèces. En effet, les Suillus sont tous mycorhiziens inféodés aux genres Pi-

nus et Larix. La section Edules (= Boletus) se caractérise par un rapport A/M

pratiquement nul mais avec des concentrations en mannitol particulièrement

basses (10 à 20 mg/g de champignon sec). On peut, de ce fait, différencier très

aisément sur un chromatogramme une espèce de la section Edules d'une espèce

appartenant au genre Xerocomus qui possède également un rapport A/M presque

nul mais avec une concentration en mannitol plus élevée (Tabl. 1).

Si nous examinons la section Luridi, il est difficile de classer ces espèces

mais nous distinguons deux groupes :

— B. erythropus, B. luridus, B. pulchrotinctus et B. satanas avec un rapport

A/M (1.

— B. dupainii, B. queletii, B. lupinus, B. rhodopurpureus fo. xanthopurpureus

et B. rhodoxanthus, avec un rapport A/M) 1.

Une étude plus poussée serait nécessaire pour confirmer ce classement. Du

point de vue pratique certaines espéces telles que B. edulis, Xerocomus badius

et Suillus sp., à l'état de petits fragments, peuvent étre trés rapidement distin-

guées par l'analyse des polyols. Ces espéces, souvent mélangées, posent des

problémes délicats de contróle de qualité dans le domaine alimentaire du fait de

l'inégalité de leur valeur gastronomique.

Les acides aminés

La CLHP nous permet de séparer et de doser 40 molécules réagissant à la

ninhydrine : 35 acides aminés et 5 molécules apparentées (amines et dérivés

basiques) (Fig. 2). L'ordre d'élution de ces différentes molécules est le suivant:

phosphosérine (Ser (POa H )), taurine (Tau), phosphoethanolamine (Eta (PO4H2)),

urée (Ur), acide aspartique (Asp), hydroxyproline (Hypro), thréonine (Thr),

sérine (Ser), asparagine (Asp (NHz)), acide glutamique (Glu), glutamine (Glu

(МН, )), sarcosine (Sar), acide a-amino adipique (a-AAd), proline (Pro), glycine

(Gly), alanine (Ala), citrulline (Cit), acide a-aminobutyrique (@-AB), valine

(Val), cystéine (Cyst), méthionine (Met), cystathionine (Cysta), isoleucine

(Ieu), leucine (Leu), Norleucine (NLeu), tyrosine (Tyr), B-alanine (fala),

Source : MNHN, Paris

DIFFÉRENCIATION CHIMIQUE DES BOLETS 283

phénylalanine (Phe), acide f-aminobutyrique (f-AB), acide y-aminobutyrique

(1-AB), éthanolamine (EtA), ammoniaque (Amc), DL-allohydroxyproline

(A-Hypro), ornithine (Orn), lysine (Lys), 1-méthylhistidine (1-MH), histidine

(His), tryptophane (Try), carnosine (Car), arginine (Arg).

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Fig. 2 — Chromatographie par CLHP d'un mélange d'acides aminés témoins (appareil chro-

makon 400).

Fig. 2 — HPLC chromatography of an amino acids mixture.

Parmi ces acides aminés, nous avons pu en identifier 27 chez les Bolets

analysés qui représentent la quasi totalité des acides aminés libres décelables

ainsi que 3 autres composés apparentés : la glutamine, l'éthanolamine et l'ammo-

niaque. Un acide aminé : la sarcosine, retrouvée sur certains aminogrammes, ne

semblait pas être identifiée d’une façon certaine. De plus, il réagit difficilement

avec la ninhydrine. Nous avons pu par CCM bidimensionnelle et au moyen d'un

révélateur beaucoup plus sensible (réactif au nitroprussiate de sodium, MERCK,

1975), avec et sans ajout d'étalon interne de sarcosine, confirmer l'absence de

cette molécule dans les extraits. Soulignons que la technique par CCM bidimen-

sionnelle que nous avons utilisée nous permet de séparer 24 acides aminés et

amines en moins de deux heures en matérialisant très concrètement ces molé-

cules (Fig. 3). À partir des extraits de Bolets, nous avons identifié, par CCM,22

acides aminés libres et distingué 4 molécules apparentées, appelées X1, X2, X3

Source : MNHN, Paris

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Source : MNHN, Paris

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Source : MNHN, Paris

286 C. ANDARY, M.J. BOURRIER et R. HAUPERT

et X4, mais de structure inconnue. Les molécules X4 et X4 semblent caracté-

ristiques de certains représentants de la section Luridi : B. satanas, B. pulchro-

tinctus, B. lupinus et B. rhodoxanthus. Nous pourrons donc les utiliser comme

marqueurs biochimiques trés précieux pour déceler des fragments de Bolets

susceptibles d'étre toxiques (nous avons été témoin durant l'automne de l'année

1986 d'intoxications dues à B. pulchrotinctus). La molécule X;, (peu concen-

trée), semble caractéristique de B. edulis.

Fig. 3 — Chromatographie bidimensionnelle sur couche mince de cellulose d'un mélange

d'acides aminés témoins.

Fig. 3 — Two dimensional thin layer chromatography on cellulose of an amino acids mix-

ture.

D'une façon générale l'a

anine, l'acide glutamique, la glutamine, l'acide y-ami-

nobutyrique et la sérine se trouvent à des concentrations relativement élevées

chez la plupart des espèces étudiées. GENETET & al. (1984) ont montré que

chez les champignons ectomycorhyziens l’évolution de la teneur en acides

aminés libres est orientée vers la synthèse de la glutamine : glutamate et gluta-

mine sont toujours les dérivés aminés les plus concentrés. Par contre, nous

constatons que les acides aminés soufrés (cystéine et méthionine) sont très fai-

blement représentés pour l'ensemble des Bolets.

Source : MNHN, Paris

DIFFÉRENCIATION CHIMIQUE DES BOLETS 287

Notons également que certains acides aminés tels que : acide a-aminobuty-

rique, acide B-aminobutyrique, cystathionine et carnosine, n’avaient pas encore

été décelés chez les Macromycétes. La carnosine qui se trouve à de faibles

concentrations et uniquement chez Suillus collinitus et Xerocomus chrysente-

ron, est un acide aminé caractéristique du tissu musculaire. A notre connais-

sance, il n’avait pas encore été identifié chez les végétaux.

Enfin, à la lecture du Tableau 2, nous pouvons regrouper les Bolets analysés

en trois catégories en fonction de la teneur globale en acides aminés libres (sans

établir, pour autant, de relations taxinomiques) :

— B. appendiculatus, B. edulis, B. satanas : teneur en acides aminés supérieure

22%.

— S. bovinus, B. cavipes, S. collinitus, B. lupinus, B. luridus, S. luteus, B. pul-

chrotinctus, S. variegatus : teneur en acides aminés comprise entre 1 et 2 %.

— B. calopus, X. chrysenteron, B. dupainii, K. duriuscula, B. erythropus, B.

queletii, B. radicans : teneur en acides aminés inférieure à 1 %.

Signalons que B. satanas, qui est l'espèce la plus riche en acides aminés libres,

possède les taux les plus élevés en acide glutamique, en ammoniaque et parti-

culièrement en acide a-aminobutyrique.

CONCLUSION

Par des méthodes simples, sensibles et rapides, nous avons étudié des mar-

queurs appartenant aussi bien au métabolisme primaire (polyols) qu'au méta-

bolisme secondaire (acides aminés), chez les Bolets. Cette étude a permis de

signaler la présence d'acides aminés qui n'avaient pas encore été rencontrés

chez les Macromycétes (acide a- et f-aminobutyrique, cystathionine). De méme

la carnosine, acide aminé spécifique de la fibre musculaire a été trouvée pour la

premiére fois chez les végétaux.

En comparant les divers champignons analysés, nous avons pu constater que

la différenciation des espèces pouvait non seulement se faire par la combinaison

de ces deux types de marqueurs, mais aussi par la variation quantitative des po-

lyols et des acides aminés. L'ensemble de ces données biochimiques a été stocké

grâce à un programme informatisé adapté permettant une exploitation pratique

de ces marqueurs sur le plan taxinomique et également dans le domaine du con-

trôle toxicologique et de la qualité des aliments comportant des Bolets.

REMERCIEMENTS : nous tenons à remercier M. et Mme DOUMERGUE qui nous ont

aidés efficacement dans la réalisation des aminogrammes, ainsi que Paul BERTEA, qui

nous a fait bénéficier de ses excellentes connaissances sur la morphologie des Bolets et de

ses exsiccata.

Source : MNHN, Paris.

288 C. ANDARY, M.J. BOURRIER et R. HAUPERT

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Source : MNHN. Paris

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Band 103, 89 p.

Ce livre est la compilation des observations de l'auteur sur l'ensemble des

spécimens-type d'espéces appartenant aux genres Bankera, Hydnellum, Phello-

don et Sacordon, décrites d'Amérique du Nord, mais aussi d'autres régions du

globe (Europe et zones subtropicales et tropicales).

Les descriptions sont personnelles et regroupent des informations détaillées

sur les caractéres macroscopiques (généralement notées sur les échantillons-type

desséchés et parfois complétées par des observations sur le frais d'aprés les des-

criptions originales), microscopiques et macrochimiques (sur exsiccatum-type).

C'est un travail trés sérieux dans lequel chacun des 131 noms considérés est

présenté par ordre alphabétique sous son étiquette générique d'origine. Pourtant,

cette règle souffre quelques exceptions regrettables : Hydnum fuligineo-album

se trouve inséré entre Hydnellum alachuanum et Hydnum albonigrum, de méme

que Phellodon excentrici-mexicani entre Hydnum melaleucum et Hydnum

mirabile (donc a l'initiale de la deuxième partie de leur épithète composée),

alors que Hydnum albonigrum est bien rangé dans les «a». Les épithètes infra-

spéficiques sont généralement rangées dans l'ordre alphabétique intégral, sans

rappel au niveau de l'espèce à laquelle elles sont attribuées (Hydnum squamosus

ssp. maximus dans les «m», Hydnum calvatum var. odoratum dans les «o»,

Hydnum graveolens var. subzonatum dans les «s», etc...) alors que, par exemple,

Sarcodon scabrosus var. fennicus se trouve à «scabrosus», sans rappel cette fois

dans les «f».

L'étude de chaque épithéte se termine par des observations courtes, mais

précises et claires, donnant le statut actuel du taxon considéré, selon l'auteur

et aussi d'aprés les avis émis par d'autres spécialistes modernes de ces genres.

L'ouvrage s’acheve par une liste bibliographique de 51 titres.

Outre le petit défaut de rangement alphabétique sus-cité, signalons que la

page 71 et la page 70 sont identiques, à la différence d'une ligne, la derniére,

qui manque à la p. 70. Il faut également déplorer l'absence totale de schémas.

Malgré ces quelques imperfections, ce livre est indispensable à toute personne

intéressée par une étude sérieuse de ces genres de Basidiomycétes à hyménium

aculéolé. h

R. Courtecuisse

BAIRD R.E., 1986 — Study of the stipitate hydnums from the Southern Appa-

lachian Mountains. Genera Bankera, Hydnellum, Phellodon, Sarcodon. Berlin,

Stuttgart, J. Cramer, Gebrüder Borntraeger, Bibliotheca Mycologica, Band

104, 156 p., 1 fig.

Après une introduction où figure un bref historique de la dénomination

générique des «hydnes stipités», de leur attribution à différentes familles et de

Source : MNHN, Paris

290 ANALYSES BIBLIOGRAPHIQUES

leur étude en Amérique du Nord (trés insuffisante d'aprés l'auteur), une revue

des méthodes taxonomiques utilisées pour ce travail est présentée par R.E. Baird.

Outre la méthode dite traditionnelle, faisant intervenir l'examen d'échantillons

d'herbiers et d'échantillons frais, sur le plan macroscopique, macrochimique et

microscopique, ce travail fait appel à des éléments chimiotaxonomiques, par la

recherche systématique de trois terphénylquinones (atromentine, aurantiacine et

acide théléphorique) et à des informations écologiques par la recherche des

arbres (d'un diamétre supérieur à 1 inch, soir environ 2,5 cm) les plus fréquem-

ment présents dans un rayon de 20 métres autour des carpophores récoltés.

Les relations symbiotiques entre champignons et arbres ne sont pourtant que

suggérées, aucune démonstration expérimentale concrète ne venant supporter

cet élément statistique.

Parmi les caractères taxonomiques envisagés dans la littérature concernant

ce groupe, la forme et la taille des carpophores, dépendant en grande partie des

conditions atmosphériques, la taille des basides, la structure des basidiocarpes

sont rejetés comme étant très peu importants. Par contre, sont retenus la couleur

des carpophores, leur odeur et leur saveur (dans certains cas), la couleur et la

forme des spores, la présence de boucles, de cystides (caractères inhabituel dans

ce groupe), et la nature des arbres associés (statistiquement).

Suit la monographie des 4 genres Bankera, Hydnellum, Phellodon et Sarcodon

pour la zone géographique considérée. Pour chacun d'entre eux, on trouve une

clé des espéces, puis sous chaque épithéte une liste synonymique compléte, une

description macro- et micromorphologique, des informations chimiotaxonomi-

ques, chorologiques et une discussion incluant la liste des arbres associés et

l'argumentation concernant la plupart des synonymes proposés.

L'ouvrage se termine par une bibliographie de 104 titres et par des Addenda,

regroupant la liste des spécimens étudiés (plus de 1000), une planche représen-

tant les cystides reconnues chez 4 espéces et une liste cumulative des arbres

«associés».

Comme pour l'ouvrage précédent (Ibid., Band 103), nous déplorerons l'ab-

sence trés regrettable de dessins des éléments microscopiques (spores en parti-

culier) et aussi l'absence (préjudiciable à la consultation pratique du livre) d'un

index cumulatif de toutes les épithètes citées, y-compris les nombreux syno-

nymes. Seul figure en effet, en tête de l'ouvrage, un court index des 31 espèces

acceptées par l'auteur.

Malgré ces négligences, ce livre qui est le résultat d'une patiente et trés sé-

rieuse étude de ces genres d'hydnes stipités doit étre conseillé à toute personne

intéressée par le sujet.

R. Courtecuisse

Commission paritaire no 58611

Dépôt légal n» 14012 - Imprimerie de Montligeon

Sortie des presses le 20 septembre 1988

Imprimé en France

Editeur : A.D.A.C. (Association des Amis des Cryptogames)

Président : A. Couté; Secrétaire : D. Lamy

Trésorier : R. Baudouin; Directeur de la publication : H. Causse

Source : MNHN, Paris

CRYPTOGAMIE — MYCOLOGIE

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Laboratoire de Botanique, Faculté des Sciences,

Allées Jules Guesde, 31000 Toulouse (France).

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12, rue de Buffon, 75005 Paris (France).

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43, Bd du 11 Novembre 1918, 69622 Villeurbanne Cedex (France).

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Laboratoire de Cryptogamie, Muséum National d'Histoire Naturelle

12, rue Buffon, 75005 Paris (France).

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Anglais, Allemand et Espagnol sont acceptés.

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chaque tome.

Source : MNHN, Paris

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8 1966). Catalogue de ta Mycothéque de la C! рода

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Ne 9 11967). "таз: дез Мате» (1936-1965). 85 pages : 20 F. —

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д Dés sous Ja ditautlon de М. баре ЦЕМ

Tome I. Les Lactarió Russulés, par Roger Hein (1938) épuisé).

Tome I. Les Broder ii, par Henzi Romagnesi (1941). 164 pages,

Tome Il]. tas My ur Par Georges Métrod (1949). 144 pagen

Tome IV. Les Discom: scar , par Marcelle Le Gal

! (1953). coc me "iso F.

AR Les U N ilbert Bouriquet et J.P. Bassino

(1965). ip gn horstexte : 90 F. І

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