MEMOIRES

DU

MUSÉUM NATIONAL

D’HISTOIRE NATURELLE

NOUVELLE SÉRIE

TOME SIXIÈME

FASCICULE PREMIER

A. BRUNEL

LE MÉTABOLISME

DE L’AZOTE D’ORIGINE PURIQUE

CHEZ LES CHAMPIGNONS

PARIS

ÉDITIONS DU MUSÉUM

57, Rue Cuvier (V e )

Décembre 1936

MÉMOIRES

DU

MUSÉUM NATIONAL D'HISTOIRE NATURELLE

Les Mémoires du Muséum national d’Histoire naturelle

paraissent sans périodicité fixe. Chaque volume est formé d’un

nombre variable de fascicules, publiés isolément et ne contenant

qu’un seul mémoire.

Les Mémoires sont destinés à la publication de travaux d’une

certaine étendue concernant l’Histoire naturelle. Ceux qui sont

destinés à servir de thèses de doctorat peuvent être reçus aux

mêmes conditions que les travaux ordinaires.

Les auteurs reçoivent 25 tirages à part de leurs travaux, brochés

et sous couverture. Ils s’engagent à ne pas les mettre dans le

commerce.

Les travaux destinés aux Mémoires du Muséum national

d’Histoire naturelle doivent êtres remis à M. le D r R. Jeannel,

45 bis , rue de Bufïon, Paris (5°), ou à tout autre professeur du

Muséum. Dans tous les cas, leur publication est subordonnée à

une décision de l’Assemblée des Professeurs.

Le prix de l’abonnement, pour un volume, est de 150 francs .

Le montant des abonnements et les demandes de fascicules

doivent être adressés m Muséum national d'Histoire naturelle,

57 , rue Cuvier, Paris (5 e ).

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MÉMOIRES

DU

MUSÉUM NATIONAL

D’HISTOIRE NATURELLE

MEMOIRES

DU

MUSÉUM NATIONAL

D’HISTOIRE NATURELLE

NOUVELLE SÉRIE

TOME SIXIÈME

FASCICULE PREMIER

A. BRUNEL

LE MÉTABOLISME

DE L’AZOTE D’ORIGINE PÜRIQUE

CHEZ LES CHAMPIGNONS

PARIS

ÉDITIONS DU MUSÉUM

57, Rue Cuvier (V e )

Décembre 1936

MÉMOIRES DU MUSÉUM NATIONAL D’HISTOIRE NATURELLE

Nouvelle série, Tome VI, p. 1.186.

Publié le 31 décembre 1936.

LE MÉTABOLISME

DE

L’AZOTE D’ORIGINE PURIQUE

CHEZ LES CHAMPIGNONS

PAR

Arthur Brunel

SOMMAIRE

Introduction (p. 1).

PREMIÈRE PARTIE.

Chapitre Premier. — Présence de l’allantoïnase chez lés Champignons (p. 9).

Chapitre II. — Sur quelques propriétés de l’allantoïnase des Champignons (p. 29).

Chapitre III. — Recherches sur l’activité de l’allantoïnase (p. 50).

DEUXIÈME PARTIE.

Chapitre Premier. — Présence de l’uricase chez les Champignons (p. 67).

Chapitre II. — Sur quelques propriétés del'uricase des Champignons (p. 74).

Chapitre III. — Recherches sur l’activité de l’uricase (p. 80).

TROISIÈME PARTIE.

Chapitre Premier. — L’acide allantoïque chez les Champignons basidiomycètes (p. 87).

Chapitre II. — L’allantoïne chez les Champignons basidiomycètes (p. 100).

Chapitre III. — Origine des uréides glyoxyliques. Métabolisme de l’azote purique et

uréique. Application des données biochimiques à la Systématiaue (p. 115).

QUATRIÈME PARTIE.

Chapitre Premier. — Recherches sur l’allantoïnase et l’uricase de Sterigmatocystis

nigra (p. 134).

Chapitre II. — Un nouvel enzyme, l’allantoïcase (p. 143).

Conclusions générales (p. 167).

Index bibliographique (p. 179).

LE MÉTABOLISME

DE

L’AZOTE D’ORIGINE PURIQUE

CHEZ LES CHAMPIGNONS

INTRODUCTION

Tandis que la présence de l’urée et des uréides est très anciennement connue

chez les Animaux, leur découverte chez les Végétaux est beaucoup plus récente.

Déjà signalée chez les Animaux en 1709 comme « substance azotée parti¬

culière de l’urine », l’urée ou carbamide fut isolée en 1773 par Rouelle le

jeune, mais sa formule exacte ne fut déterminée qu’en 1819 par W. Prout.

En 1903, Bamberger et Landsield signalent la présence de la carba¬

mide chez les Champignons (Lycoperdon bovista L., Lycoperdon gemmatumB.);

Gazé confirme leurs résultats, puis Goris et Mascré retrouvent l’urée dans

Tricholoma Georgii Quél. et dans Agaricus campester Fr. ex Lin. Chez les

Végétaux chlorophylliens, elle n’avait pu être mise en évidence avant les

travaux de R. Fosse, car les méthodes d’analyse immédiate connues ne per¬

mettaient d’isoler cette amide que si elle se trouvait en quantités élevées.

En 1912, R. Fosse montre que le xanthydrol, alcool de la série pyranique,

précipite l’urée même à l’état de traces, et que la xanthylurée qui a pris nais¬

sance est un composé spécifique, permettant l’identification sûre de la carba¬

mide des milieux d’origine végétale ou animale. Cette nouvelle technique très

sensible permet de démontrer que l’urée est un produit physiologique de la cellule

végétale, aussi bien chez les Champignons que chez les Végétaux supérieurs.

Chez les Animaux, l’urée est fréquemment accompagnée d’un uréide de

l’acide glyoxylique : l’allantoïne, découverte par Vauquelin et Buniva

en 1799, dans le liquide amniotique de la vache. En 1881, Schultze et Bar¬

biéri l’isolent des jeunes pousses de Platanus orientalis. Depuis, l’allantoïne

a été retrouvée dans quelques plantes, mais son rôle y était totalement ignoré.

En 1926, R. Fosse démontre l’existence chez les Végétaux, à côté de l’allan-

toïne, d’un uréide très voisin n’en différant que par une molécule d’eau,

l’acide allantoïque. En 1929, R. Fosse et A. Brunel trouvent que ce nouveau

principe naturel, très répandu chez les plantes, prend naissance aux dépens

de l’allantoïne sous l’action d’un enzyme : l’allantoïnase.

La découverte de l’acide allantoïque et de Paliantoïnase est le point de départ

Mémoires du muséum, nouvelle série, Lomé VI.

1

2

INTRODUCTION

d’une série de recherches sur l’acide urique et les produits de dégradation du

noyau purique chez les Végétaux chlorophylliens. Nous allons en résumer les

principaux résultats.

1. L’Acide allantoïque

NH 2

1

CO

COOH

1

CO

NH —

CH-

1

-NH

a été découvert chez les Végétaux en 1926. R. Fosse (19) l’isole du suc d’expres¬

sion du légume vert de Phaseolus vulgaris et des feuilles d’Acer pseudoplatanus

et le caractérise à l’état de dérivé dixanthylé.

NH■CO•NH

")CHCOOH.

NH • CO •NH

11 démontre que l’acide allantoïque identifié par l’analyse élémentaire ne

provient pas, au cours des manipulations, de la décarboxylation d’un uréide

très voisin, l’acide uroxanique (20),

H-N • CO • NH. COOH __ r rp H 2 N-CONH.

\C/ ->CH • COOH,

H 2 N • CO ■ NH 7 x COOH H-N.CO NH x

qui aurait pu exister dans la plante. La présence chez les Végétaux d’un

enzyme transformant l’allantoïne en acide allantoïque, confirme pleinement

cette manière de voir.

Depuis cette découverte, l’acide allantoïque a été signalé, isolé, dosé dans

de nombreuses plantes appartenant à des familles très différentes (Légumi¬

neuses, Crucifères, Urticacées). L’acide allantoïque existe non seulement

chez les Phanérogames, mais aussi chez les Champignons, où R. Fosse et

A. Brunel (24) ont pu l’isoler (Collybia dryophila Fr. ex Bull v Coprinus

micaceus Fr. ex Bull.), et le doser chez quelques Agarics.

Comme l’asparagine, la glutamine ou l’arginine chez les Végétaux supérieurs,

comme l’urée chez les Champignons, l’acide allantoïque s’accumule dans les

plantules en quantités notables. R. Bonnet (9) avait trouvé de petites quan¬

tités d’azote allantoïque dans les graines de lupin et de lentille avant et après

germination. R. Fosse, P. De Graeve et P. E. Thomas (34) démontrent que

lors de la germination à l’obscurité des graines de Trifolium sativum , la teneur

en acide allantoïque augmente considérablement ; après douze jours, elle

atteint 17,4 gr. pour mille grammes de plante sèche ; de même, dans les

O

/

C # H*

Nch

O

/

C S H*

\th i/

^CH

INTRODUCTION 3

cultures de cette plante en pleine terre, la teneur en acide allantoïque'

croît, passe par un maximum, puis décroît lentement.

Quelle est l’origine de l’acide allantoïque chez les Végétaux chlorophyl¬

liens ? R. Fosse, A. Brunel et P. De Graeve (26) démontrent que sans

exclure la possibilité d’une transformation inverse, Pallantoïne doit engendrer

l’acide allantoïque des plantes sous l’influence d’un enzyme : l’allantoïnase.

2. L’Allantoïnase, enzyme hydrolysant l’allantoïne en acide allantoïque,

CO — NH NH ! NH 2

CO j 0 C00H j, 0

I +HO I I |

CH — NH NH — CH-NH

NH 2

I

CO

I

NH —

a été découverte par R. Fosse et A. Brunel (23) dans les graines de Légumi¬

neuses. On la trouve dans des familles très diverses (26) (Ombellifères, Sola¬

nacées, Composées, Chénopodiacées, Malvacées, Rosacées, Cucurbitacées),

chez les Muscinées (26) et aussi chez les Champignons (11).

Dans des conditions déterminées, et en milieu alcalin, l’allantoïnase de

Soja hispida, transforme intégralement Pallantoïne en acide allantoïque. Sur

cette importante propriété, repose le dosage biochimique de Pallantoïne, par

voie pondérale à l’état de dixanthylurée (27) ou par spectrophotométrie (31).

3. L’Allantoïne

NH 2 CO — NH

CO

NH — CH — NH

découverte en 1881, par Schultze et Barbiéri (63) dans les jeunes pousses

de Platanus orientalis , isolée par Schultze et Bosshard (64) des bourgeons

d’Acer pseudoplatanus et de l’écorce d ’Aesculus hippocastanum , a été ensuite

retrouvée dans quelques plantes : Phaseolus multiflorus, Symphytum officinâle,

Borrago officinalis, Stachys sylvatica (Vogl), Tabac (Scurti et Perciabosco),

Datura (de Plato), Blé (Power et Salvay). Avant les travaux de R. Fosse

et A. Hieulle la recherche et la caractérisation de l’allantoïne étaient diffi¬

ciles ; la seule méthode connue, celle deWiECHowsKi (70), ne nécessitait pas

moins de vingt manipulations longues et délicates. R. Fosse et A. Hieulle

(36) démontrent que l’allantoïne se combine au xanthydrol pour donner la

xanthylallantoïne.

O

\

X CH\

C 6 H 4/

>CH — NH • CO • NH — CH — NH

I

CO — NH

")CO.

4

INTRODUCTION

Quelques milligrammes d’allantoïne suffisent pour obtenir ce nouveau dérivé

cristallisé, fondant à 214°-215°. En présence des solutions alcalines diluées,

la xanthylallantoïne se dissout tout d’abord, puis donne naissance peu à peu

à un précipité caractéristique constitué par un xanthylallantoate alcalin.

R. Fosse et A. Hieulle mettent ainsi en évidence l’allantoîne dans le suc

cellulaire de Phaseolus vulgaris et dans les feuilles d 'Acer pseudoplatanus

(R. Fosse), dans l’urine des Animaux et dans les feuilles de Platanus orientalis

(A. Hieulle). Puis R. Fosse et ses collaborateurs établissent une méthode

rapide de recherche biochimique de cet uréide, basée sur l’action :

1° de l’allantoïnase de Soja hispida sur l’allantoïne,

NH 2 CO — NH

CO

I

NH

CO

— CH — NH

Allantoïnase

+ H-’O

NH 2 NH 2

I I

CO COOH CO

I I I

NH — CH-NH

2 ° de l’acide chlorhydrique sur l’acide allantoïque qui a pris naissance par

fermentation.

H 2 N CO - NH.

>CH•COOH

H 2 N • CO • NH X

C1H

+ H 2 0

.NH 2

2 0C<

X NH' 2

CHO

I

COOH

Dans ces conditions, la formation de l’urée [et de l’acide glyoxylique après

hydrolyse acide est caractéristique de l’allantoïne. Elle permet d’établir

la large répartition de cet uréide chez les Végétaux chlorophylliens.

Bien que possédant un carbone asymétrique dans sa molécule, l’allantoïne

était considérée comme inactive sur la lumière polarisée. En 1934, R. Fosse,

P. E. Thomas et P. De Graeve(38) démontrent, qu’au cours delà fermenta¬

tion de cet uréide sous l’action de l’allantoïnase, l’allantoïne lévogyre apparaît

à côté de l’acide allantoïque. Complétant cette importante découverte, ils

isolent l’allantoïne dextrogyre (39) des feuilles de Platanus orientalis. L’allan¬

toïne, substance prétendue indédoublable, est donc bien un composé racémique

comme l’exige sa formule dissymétrique établie par Grimaux. Son isomère

droit est un principe naturel des Végétaux comme des Animaux (68).

4. L’Uricase, enzyme qui dégrade l’acide urique en allantoïne

NH — CO

I I

CO C —NH

NH 2

CO — NH

I

CO

\ G0 Uricase CO

NH — C — NH X + O + H 2 0 — CO 2 NH _ CH — NH

a été découverte par Wiechowski (69) dans le foie et le rein de nombreux

Mammifères.

INTRODUCTION

5

Chez les Végétaux, A. Nemec (58) a pu le mettre en évidence dans quelques

plantes. D’après cet auteur, il y aurait production d’allantoïne qu’un enzyme

hypothétique scinderait en acide oxalique et urée, l’urée étant ensuite hydro-

lysée par l’uréase en carbonate d’ammonium.

R. Fosse, A. Brunel et P. De Graeve (25) ont démontré que l’acide

allantoïque prend naissance par l’action des enzymes des Végétaux sur l’acide

urique. La fermentation de l’acide urique est l’œuvre de deux enzymes,

l’uricase dégrade l’acide urique en allantoïne, que l’allantoïnase, par simple

fixation d’une molécule d’eau, transforme en acide allantoïque.

NH - CO

I I

CO C — NH.

I II >co

NH — C — NH/

Uricase

+ O + HO — CCP

NH 2 CO — NH

CO

NH — CH — NH

Allantoïnase

+ H-O ’

NH 2

1

NH 2

1

CO

COOH

1

CO .

|

NH —

CH-

1

NH

L’enzyme uricase a pu être mis en évidence dans de nombreuses graines de

Légumineuses. Nous citerons : Cicer arietinum , Dolychos lablab , F ah a vulgaris,

Melilotus alba , Phaseolus lunatus, Phaseolus multiflorus, Soja hispida, etc...

5. Si I’Acide urique

NH — CO

I I

CO C — NH.

I II >CO

NH — C — NH X

est depuis longtemps connu dans le règne animal, où cet acide a été signalé

par Scheele, en 1776, dans l’urine de l’homme, il n’en est pas 'de même

dans le règne végétal.

Il a été découvert pour la première fois chez les Champignons (spores de

1 ' Aspergillus orizeae) par Midzuho Sumi (55). Chez les Végétaux supérieurs,

Czapek (16) constate à deux reprises qu’il n’a pu être isolé ou même simple¬

ment caractérisé, quoique l’enzyme uricase se rencontre fréquemment dans

les plantes.

En 1932, R. Fosse, P. De Graeve et P. E. Thomas (33) l’isolent de Meli¬

lotus ofjîcinalis, puis de Faba vulgaris et de Trifolium sativum. Ils dosent (34)

cet acide dans de nombreuses plantes et démontrent que l’acide urique est

un principe naturel des Végétaux au même titre que l’allantoïne, l’acidp

allantoïque et l’urée,

6

INTRODUCTION

Cette découverte éclaire le rôle des nucléases végétales. La dégradation des

nucléines des plantes passe par la voie de l’acide urique et conduit à l’acide

allantoïque :

Nucléines

Acide urique

Nucléases

Uricase

Purines

Allantoïne

Purinoxydases

Allanto nase

* Acide urique

Acide allantoïque.

Que devient l’acide allantoïque ? R. Fosse, P. De Graeve et P. E. Thomas

(35) se basant sur l’extrême facilité avec laquelle cet uréide se scinde en ses

constituants, acide glyoxylique et urée

H-N • CO • NH.

>CH COOH

1PN ■ CO ■ Ntr

pH < 7

+ HO

CHO NH 2

! + 2 OC(

COOH X NH-

dès que le pH est inférieur à 7 et sur la présence de l’uréase chez les plantes,

admettent que l’acide allantoïque est dégradé jusqu’au stade ammoniac ;

l’ammoniac rentre ensuite dans le cycle des synthèses et concourt à l’édifica¬

tion des protides.

6 . Nous nous sommes proposé d’apporter une contribution à l’étude de la

dégradation de l’azote purique chez les Végétaux et de rechercher chez les

Champignons Basidiomycètes et Ascomycètes :

Les enzymes allantoïnase et uricase, les uréides glyoxyliques allantoïne et

acide allantoïque.

Le rôle de ces uréides et de ces enzymes dans le métabolisme de l’azote.

En outre, au cours de ce Travail, nous démontrerons que l’acide allantoïque

n’est pas toujours le terme ultime de la dégradation enzymatique de l’acide

urique ou de l’allantoïne. Chez certains Champignons Ascomycètes, un nouvel

enzyme I’Allantoïcase hydrolyse l’acide allantoïque formé en acide glyoxy¬

lique et urée que l’uréase transforme en carbonate d’ammonium.

NH 2 NH 2

I !

CO COOH CO

I I I

NH — CH-NH

Allantoïcase

4- H 2 0

CHO NH 2

!

+ 2 CO

I

COOH NH 2

Uréase

+¥o

C0 3 (NH*) 2 .

Nous diviserons cette étude en quatre parties :

1° Allantoïnase des Champignons.

2° Uricase des Champignons.

3° Les uréides glyoxyliques : allantoïne et acide allantoïque chez les Cham¬

pignons Basidiomycètes. Leur rôle dans le métabolisme de l’azote.

4° Un nouvel enzyme : 1 ’Allantoïcase.

INTRODUCTION

7

Je ne voudrais pas terminer cet exposé sans exprimer mes sentiments de

profonde gratitude à M. le Professeur Fosse. Pendant les huit années passées

dans son Laboratoire de Chimie du Muséum d’Histoire Naturelle, j’ai pu appré¬

cier la valeur de ses conseils éclairés et je ne saurais oublier que je lui dois

d’avoir apporté ma modeste contribution à la connaissance du métabolisme

des substances azotées chez les Champignons.

Je remercie M. le Professeur P. Allorge et M. Roger Heim de l’intérêt

qu’ils ont bien voulu attacher à mes recherches et des renseignements si pré¬

cieux qu’ils m’ont donnés en maintes circonstances.

Je tiens à adresser à M. Hasenfratz, Sous-directeur du Laboratoire de

Chimie du Muséum, qui m’a toujours réservé un bienveillant accueil et aidé

de ses conseils, l’expression de ma respectueuse reconnaissance.

Que M. le Professeur Molliard, Membre de l’Institut, et MM. les Profes¬

seurs Javillier et Combes veuillent bien nous permettre de leur présenter

nos remerciements très respectueux pour l’honneur qu’ils nous ont fait d’être

nos juges.

PREMIÈRE PARTIE

RECHERCHES SUR L ALLANTOINASE DES CHAMPIGNONS

CHAPITRE PREMIER

PRÉSENCE DE L’ALLANTOÏNASE CHEZ LES CHAMPIGNONS

A. — Récolte, choix et traitement du matériel d étude.

Les matériaux que nous avons étudiés proviennent :

1° De récoltes faites, soit au cours des excursions mycologiques du Labora¬

toire de Cryptogamie du Muséum, soit seul, dans les localités suivantes :

Forêts de Carnelle, de Coye et d’Orry-la-ville, de Chantilly, de Viliers-

Cotterets, de Compiègne ; les bois de Meudon, des Fausses-Reposes, de Meaux,

de Vincennes ; les forêts de Saint-Germain, de Sénart, de Rambouillet, de

Fontainebleau.

2° De nombreux spécimens que nous ont communiqués à l’état frais

MM. Roger Heim, H. Romagnesi, J. Duché, M rae Legal, MM. Lefèvre,

d’ Astis et de ceux provenant des expositions annuelles de champignons du

Laboratoire de Cryptogamie du Muséum d’Histoire Naturelle que M. le Pro¬

fesseur P. Allorge a mis à notre disposition.

3° De la serre tropicale du Muséum (Récoltes de Hiatula caepestipes (P.

Henn.) et de Hiatula licmophora (E. et Br.).

4° Du jardin de l’ancien Laboratoire de Cryptogamie, 63 rue de Buffon,

où nous avons récolté et étudié Coprinus micaceus Fr. ex Bull., au cours de la

végétation d’une année.

L’étude des Champignons à l’état frais conduit à des résultats difficiles

à interpréter. Il est préférable de travailler sur le végétal sec. Dans ce but, dès

l’arrivée au laboratoire, la récolte est séchée rapidement dans le vide sur

chlorure de calcium dans des cloches de grandes capacités (50-60 litres).

La dessiccation doit être totale en trente-six heures. Dans ces conditions nous

n’avons pas constaté de variations sensibles dans la composition du végétal

quant aux substances qui nous intéressent.

Les analyses portent toujours sur des échantillons moyens comprenant

10 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE 1,’aZOTE TORIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

des champignons en bon état (plusieurs exemplaires) préalablement séchés

et réduits en poudre fine par broyage au moulin et au mortier. La matière

ainsi préparée constitue la poudre fermentaire.

La recherche des enzymes doit être effectuée rapidement, car avec le temps

les propriétés uricolytique et allaijtoïnolytique des champignons s’atténuent

fortement.

Enfin, chaque fois qu’il sera possible, nous préciserons l’état de développe¬

ment du carpophore.

B. — Caractérisation de l’enzyme allantoïnase chez les Champignons.

Elle se ramène à celle de l’acide allantoique formé par fermentation aux

dépens de l’allantoïne.

N FL CO

I

CO

NH

CO

Allantoïnase

+ H-0 "

NII — CFI — NH

NH* NH*

I I

CO COOH CO

! I !

NH — CH-NH

L’acide allantoique est reconnu, soit par les très sensibles réactions de ses pro¬

duits d’hydrolyse acide

Acide glyoxylique (HO) 2 • CH — COOH (a)

et urée ILN ■ CO • NII*, (b)

soit par l’analyse élémentaire de son dérivé dixanthylé

,CJU'

O

/ \

\} I H' /

CH — NH-CO-NH

I

COOH

,C“H\

CH< )0 (p)

X C 8 H‘ X

ou de son sel d’argent.

H a N • CO • NH

CH — NH • CO • NH 2

I

COO • Ag

(d)

a) Réaction colorée glyoxylique de l’acide allantoïque. — Elle est

basée sur la formation de l’acide glyoxylique par hydrolyse chlorhydrique de

l’acide allantoique (6€)

H 2 N - CO ■ NH.

>CH - COOH

H "N - CO - NIH

4- H 2 0

CHO

I

COOH

+ 2 OC<^

NH 2

et sur la coloration rouge que donne l’acide glyoxjlique avec le réactif de

Schrvver (chlorhydrate de phénylhydrazine, ferricyanure de potassium, acide

chlorhydrique concentré). La technique suivie est celle de R. Fosse, A. Bru-

nel et P.-E. Thomas (31).

PRÉSENCE DE l’aLLANTOÏNASE CHEZ LES CHAMPIGNONS

11

Mode opératoire. — Mesurer 2 centimètres cubes du liquide à étudier,

ajouter de l’acide chlorhydrique normal pour rendre acide, puis 2 gouttes

(0,1 cc.) d’une solution aqueuse de chlorhydrate de phénylhydrazine à 1 %,

porter deux minutes au bain d’eau bouillante, refroidir et ajouter :

Acide chlorhydrique concentré pur.1,2 cc.

Solution aqueuse de ferricyanure de potassium à 5 %. II gouttes (0,1 cc.).

Une réaction colorée rouge intense se déclare quand la liqueur contient

de l’acide allantoïque, La sensibilité de cette réaction permet de déceler cet

uréide, même à la dilution de 1 /2.000.000.

b) Caractérisation de l’urée. — La formation de l’acide glyoxylique,

par hydrolyse chlorhydrique de l’acide allantoïque, est accompagnée par celle

de l’urée que l’on met en évidence par le xanthydrol.

Mode opératoire. — La liqueur à examiner (2 cc.), hydrolysée par l’acide

chlorhydrique, est refroidie puis alcalinisée par la soude concentrée ; on

ajoute un volume double d’acide acétique cristallisable (4 cc.)et 0,3 cc. d’une

solution au 1 /10 de xanthydrol dans le méthanol. On voit apparaître (dans

le cas de la présence de l’acide allantoïque dans la liqueur primitive) des

cristaux caractéristiques de dixanthylurée :

C«H'‘ C 6 H'’

o( NCH — NH • CO • NH — CH<f No.

X C S H' / X C 6 H 4/

c) Obtention de l’acide dixanthylallantoïque pur a l’analyse. —

Le liquide de fermentation est refroidi vers 0°, déféqué parle nitrate de plomb

en solution saturée, puis centrifugé ; l’excès de plomb est précipité à l’état de

sulfure par l’hydrogène sulfuré dont on chasse l’excès par un courant d’air.

Après filtration et alcalinisation, la liqueur est additionnée d’un volume égal

d’acide acétique cristallisable, puis d’une solution de xanthydrol au 1 /10

dans l’acide acétique, préparée au moment de l’emploi (2,5 % du volume

total). Il se forme un précipité floconneux d’acide dixanthylallantoïque

C 6 H 4

o( Ne H |ÔH+"h| NH • CO ■ NH

X C 6 H 4/ ’---

C 6 H V

o( X CH !ohT"h| NH • CO • NH

X C S H 4,/ ’.'

,C 6 H‘

>CH • COOH =

0 X Ne H — NH ■ CO • NH

X C 6 H 4/ \

G 6 !! 4, /

oN NCH — NH • CO • NH

X C 6 H 4/

CH COOH + 2H 2 0

que l’on recueille après un séjour de douze heures à la glacière.

12 A. BRUNEL. - MÉTABOLISME DE L'AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Purification de Vacide dixanthylallantoïque. — Cet acide quand il est humide

possède la propriété de se dissoudre dans la pyridine pure glacée et de s’en

déposer, après abandon à la température ordinaire, en une bouillie formée de

cristaux microscopiques. La solution plus ou moins complète, obtenue en tri¬

turant ce dérivé encore humide dans la pyridine glacée, est filtrée rapidement

sur filtre Schott en s’aidant du vide. La solution abandonne peu à peu un

volumineux précipité d’acide dixanthylallantoïque. Après quelques heures à

la température ordinaire, on centrifuge, on lave le précipité à plusieurs

reprises avec du méthanol puis à l’éther et on le sèche à l’étuve à 80°.

d) Identification de l’acide allantoïque a l’état de sel d’argent. —

La méthode d’isolement de l’acide allantoïque à l’état de dérivé dixanthylé

n’est pas applicable dans tous les cas. Il existe des champignons où l’acide

allantoïque est accompagné de notables quantités d’urée (Hiatula caepestipes) ;

dans ce cas l’acide dixanthylallantoïque est souillé de xanthylurée qui pré¬

cipite dans les mêmes conditions, et que la purification par la pyridine ne peut

séparer. Dans le but d’établir une méthode ne nécessitant pas l’obtention du

dérivé xanthylé et sa purification souvent délicate, nous avons cherché et

réussi à isoler l’acide allantoïque à l’état de sel argentique.

L’allantoate d’argent est très soluble dans l’eau;il ne précipite pas quand

on ajoute du nitrate d’argent à une solution diluée d’un allantoate alcalin.

Il faut avoir recours à une première précipitation par l’acétate mercurique; la

combinaison mercurique de l’acide allantoïque, reprise par très peu d’eau,

décomposée par l’hydrogène sulfuré, prixée de ce gaz par un courant d’air et

du sulfure par filtration, donne, avec le nitrate d’argent et après recristallisa¬

tion dans l’eau chaude, l’allantoate d’argent pur à l’analyse.

Mode opératoire. — Le milieu fermentaire, refroidi vers 0°, déféqué par le

nitrate d’argent en solution saturée, est centrifugé puis filtré; le filtrat est

précipité par l’acétate mercurique solide et centrifugé après trois heures de

séjour à la glacière; le dépôt d’allantoate mercurique, lavé à l’eau, repris par

le moins d’eau possible, refroidi par la glace, est décomposé par l’hydrogène

sulfuré dont on chasse l’excès par un courant d’air ; après filtration et neu¬

tralisation la liqueur est précipitée par le nitrate d’argent. On reprend le

précipité d’ailantoate d’argent par très peu d’eau, on porte le mélange à

l’ébullition pour dissoudre l’allantoale, on filtre bouillant et on abandonne à

la cristallisation à l’abri de la lumière. Après une seule cristallisation, l’al-

lantoate d’argent est généralement pur à l’analyse.

C. — Applications. Démonstration de la présence de l’allantoïnase

dans Boletus scaber Fr. ex Bull.

On prépare une macération de tubes de Boletus scaber : tubes broyés prove¬

nant d’un végétal jeune (1 partie), glycérol (1 partie), puis après douze heures

de séjour à la glacière on ajoute de l’eau (3 parties).

PRÉSENCE DE l’aLLANTOÏNASE CHEZ LES CHA&tPIGNONS 13

Expériences. — On place au bain d’eau à 39°, des milieux fermentaires ré¬

pondant à la composition :

E

T

Solution d’allantoïne à 2 % 0 .

20 cc.

Macération centrifugée de Boletus scaber.

10 cc.

—

Même macération portée à 100° pendant

30 minutes pour détruire les enzymes.

—

10 cc.

Sesqui-carbonate d’ammonium.

0,06 gr.

Chloroforme.

X gouttes.

Après deux heures de fermentation on recherche, sur les milieux E et T

préalablement refroidis,

a) La réaction colorée glyoxylique de l'acide allantoïque après hydrolyse

chlorhydrique. — On constate que le milieu fermentaire E, où les enzymes

n’ont pas été détruits, donne une forte réaction colorée rouge avec le réactif

phénylhydrazinique. Le milieu fermentaire T, où les enzymes ont été détruits

par la chaleur, ne donne pas cette réaction.

h) La présence de l'urée après hydrolyse chlorhydrique. — Seul le milieu E

donne un précipité caractéristique de dixanthylurée ; T demeure limpide.

Conclusion. — Ces expériences démontrent la formation, par fermenta¬

tion aux dépens de l’allantoïne, d’un corps donnant les réactions de l’acide

allantoïque.

c) Isolement , à l'état de dérivé dixanthylé, de l'acide allantoïque engendré par

fermentation de l'allantoïne sous l'action de Vallantoïnase de Boletus scaber.

On place au bain d’eau à 39°, en vases bouchés à l’émeri, deux milieux fer¬

mentaires de composition :

E

Solution d’allantoïne à 2 % 0 ...... 200 cc.

Macération de Boletus scaber centrifugée . 50 cc.

Même macération portée à 100° pendant

30 minutes pour détruire 1 es enzymes . —

Sesqui-carbonate d’ammonium . 0,5 gr.

Chloroforme. . 0,25 cc.

T

200 cc.

50 cc.

0,5 gr.

0,25 cc.

Après six heures de fermentation les milieux E et T sont refroidis vers 0°,

déféqués par le nitrate de plomb en solution saturée, centrifugés, privés de

l’excès de plomb par l’hydrogène sulfuré et de ce gaz par un courant d’air ;

ils sont filtrés, neutralisés par la soude concentrée et pourvus d’un volume

égal d’acide acétique cristallisable et de xanthydrol en solution acétique au

1 /10 (2,5 % du volume total). Seul le milieu fermentaire E, où les enzymes

n’ont pas été détruits parla chaleur, donne un précipité d’acide dixanthylal-

lantoïque qu’on recueille après douze heures de séjour à la glacière et qu’on

22 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQÜE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Gen. Ixocomus Quél. recherche

de l’allantoïnase.

Ixocomus bovinus (Fr. ex Lin.)Quél., granulatus (Fr. ex Lia.) Que],,

luteus (Fr. ex Lin.) Quél., piperatus (Fr. ex Bull.) Quél., varie-

gatus (Fr. ex Schwartz.) Quél. positive.

Gen. Gyroporus Quél.

Gyroporus cyanescens (Fr, ex Bull.) Qnél. positive.

Gen. Tylopilus Karst.

Tylopilus felleus (Fr. ex Bull.) Karst.. . positive.

Paxilleae

Gen, Paxülus Fr.

Paxillus atrotomentosus Fr, ex Batsch,, involutus Fr. ex Batsch. . . positive.

Gomphidiaceae, Gomphidieae

Gen. Gomphidius Fr.

Gomphidius viscidus Fr. .. positive.

Asterosporales.

Russulaceae

Gen. Lactarius Fr.

Lactarius blennius Fr., chrysorheus Fr., controversus Fr. ex Pers.,

deliciosus Fr. ex Lin., fuliginosus Fr., insulsus Fr., pallidus Fr.,

plumbeus Fr. ex Bull., subdulcis Fr. ex Bull., theiogalus Fr. nec

Quél., torminosus Fr. ex Schaefï., vellereus Fr , mitissimus Fr.,

trivialis Fr. positive.

Gen. Russula Fr.

Russula adusta Fr, ex Pers., aurata Fr. ex Wit h.,' cyanoxantha Fr.,

delica Fr., emetica Fr. ex Schaelï., foetens Fr. ex Pers., jragilis Fr.

exBu]].,/eWeaFr. ex Paul., lutea Fr. ex Huds., lepida Fr., pecti-

nata Fr., ex Bull., sardonia Fr., vesca Fr. sensu Bres. Pelt., xeram-

pelina Fr. ex Schaefï., ochracea Fr, ex Alb. et Schw., depallens

Fr. ex Pers., chamaeleontina Fr., roseipes Secr. positive.

Agaricales.

Cantharellaceae, Cantharelleae

Gen. Craterellus Fr.

Craterellus cornucopioides Fr,

positive.

PRÉSENCE DE L’ALLANTOÏNASE CHEZ LES CHAMPIGNONS

lo

Démonstration de la présence de l’allantoïnase dans PLUTEUS

PATRICIUS Schulzer. — On place au bain d’eau à 39°, en vases bouchés,

des milieux :

E

T

Solution d’allantoïne à 2 % 0 .

200 cc.

Poudre de Pluteus patricius .

Poudre de Pluteus patricius traitée par

2 gr.

—

C1H pour détruire les enzymes ....

—

2 gr.

Sesqui-carbonate d’ammonium.

0,4 gr.

Chloroforme.

0,25 cc.

L’acide allantoïque a été isolé à l’état d’allantoate d’argent; seul le milieu E

où les enzymes n’ont pas été détruits par la chaleur, donne un précipité carac¬

téristique d’allantoate d’argent.

Analyse del’allantoate d’argent après recristallisation et dessiccation à 40°.

Matière = 15,250 mgr., Argent — 5,795 mgr.

Pour

(H 2 N • CO ■ NH) 2 CH • COO ■ Ag Théorie Ag °/ 0 = 38,12

Trouvé Ag °/ 0 = 38,00

Ces expériences démontrent nettement la présence chez les Champignons

de l’enzyme hydrolysant l’allantoïne : Vallantoïnase, découverte par R. Fosse

et A. Brunel dans les graines de Légumineuses.

D. — Déterminations quantitatives de l'acide allantoïque

engendrée par fermentation de l’allantoïne.

Même à de fortes dilutions, en milieu faiblement acétique, l’acide allan¬

toïque précipite par le xanthydrol pour donner l’acide dixanthylallantoïque ;

mais ce dérivé xanthylé, impur à l’analyse, ne permet pas de détermination

quantitative. Malgré tout l’intérêt que présenterait une telle méthode nous

avons dû ramener le dosage de l’acide allantoïque à celui de ses constituants :

urée, acide glyoxylique.

Dans ce Travail nous avons employé, soit la méthode pondérale de R. Fosse,

A. Brunel et P. De Graeve (27), soit la méthode spectrophotométrique de

R. Fosse, A. Brunel et P.-E. Thomas (31).

Dosage pondéral de l’acide allantoïque a l’état de dixanthylurée.

— Basé sur la transformation totale de l’acide allantoïque en urée et acide

glyoxylique, ce dosage donne d’excellents résultats pour des teneurs supé¬

rieures à 0,15 gr. d’acide allantoïque par litre.

Mode opératoire. ■— Après des temps variables, on prélève 5 ou 10 cc. des

16 A. BRDNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

milieux fermentaires, on ajoute en présence d’hélianthine, Ci lin pour acidi¬

fier, puis on porte le titre acide à environ nj 20 (0,25-0,5 cc. de ClHn). Les

enzymes sont détruits. Les fioles servant au dosage sont placées trente minutes

au bain d’eau à 60° ; dans ces conditions, l’acide allantoïque est hydrolysé

d’après l’équation

H 2 N • CO • NH. i H 2 0 .NH 2 CHO

>CH • COOH -±-» 2 OG< + |

H-N • CO • NH X X NH 2 COOH

Après refroidissement et alcalinisation par HONa concentrée, on précipite

les protides en solution par 0,5 à 1,5 cc. d’iodomercurate acétique de composi¬

tion :

Chlorure mercurique. 2,7 gr.

Iodure de potassium. 7,2 gr.

Acide acétique cristallisable. 66,6 cc.

Eau pour amener le volume à.100 cc.

On agite et, après un repos d’une minute, on filtre sur entonnoir de Joulie

dans une éprouvette graduée, on lave le précipité de telle sorte que le volume

obtenu soit de 12-17 cc. ; on transvase dans une fiole conique à bec, on ajoute

(en rinçant trois fois l’éprouvette) un volume double d’acide acétique

(24-34 cc.), puis du xanthydrol en solution au 1 /10 dans le méthanol (1/20

du volume total). Après trois heures de condensation, le précipité de dixan-

thylurée est recueilli sur entonnoir concave. La pastille de xanthylurée, séchée

à l’étuve à 100°, est pesée directement sur la balance de précision. Du poids

de dixanthylurée UX 2 on déduit l’acide allantoïque de fermentation,

TIX 2 176

Acide allantoïque = —^— X - ^q " = UX 2 X 0,2095

ou la quantité d’allantoïne transformée en acide allantoïque.

TIX 2 158

Allantoïne = X = UX 2 X 0,188.

Dosage spectrophotométrique de l’acide allantoïque. — Tandis

que la méthode pondérale permet de doser l’acide allantoïque pour des teneurs

supérieures à 0,15 gr. par litre, la méthode que nous allons décrire permet de

doser cet uréide, même à la dilution de 1 /2.000.000. Elle présente sur le dosage

pondéral l’avantage d’être beaucoup plus rapide et plus sensible. Grâce à elle

nous avons pu étudier quantitativement l’action de l’allantoïnase de certains

champignons où l’activité de cet enzyme ne se manifeste que faiblement.

Cette méthode repose sur la mesure, en lumière monochromatique, de l’ab¬

sorption dûe au colorant rouge que développe l’acide glyoxylique avec le

PRÉSENCE DE l’aLLANTOÏNASE CHEZ LES CHAMPIGNONS

17

réactif : chlorhydrate de phénylhydrazine, acide chlorhydrique concentré,

ferricyanure de potassium. Cette absorption est proportionnelle à la concen¬

tration pour des teneurs en acide allantoïque de 1 à 15 mgr. par litre.

Mode opératoire. — On prélève un volume V de liquide fermentaire, on le

défèque par le tungstate de sodium à 10 p. 100 et l’acide sulfurique 2 n /3,

on centrifuge, on filtre sur entonnoir de Joulie dans une fiole jaugée, on lave

trois fois le précipité avec ClH/i/100, en ayant soin d’ajouter à chaque lavage,

avant centrifugation,'une goutte de tungstate et une goutte d’acide, et on amène

à un volume connu V’ avec ClHn/100.

Technique de la réaction colorée. — On place deux minutes au bain d’eau

bouillante dans un tube à essai :

Liqueur déféquée.2 cc.

Solution fraîche de chlorhydrate de phényl¬

hydrazine à 1 %.0,1 cc. (II gouttes).

puis, après refroidissement par un courant d’eau, on ajoute :

Acide chlorhydrique concentré pur.1,2 cc.

Solution fraîche de ferricyanure de potassium à

5 %.0,1 cc. (II gouttes).

On mesure au spectrophotomètre, dans une cuvette de 1 cm. d’épaisseur

pour 7 = 5.200 A, la densité d’absorption totale 8 = 2 colog. sin 9 (0 = angle

lu à l’appareil). On effectue la même mesure 5 0 = 2 colog. sin. 0 O sur un

mélange identique n’ayant pas subi l’action de la chaleur.

La différence 8 —• 8 0 = A

est la densité d’absorption de la solution colorée produite par l’acide glyoxy-

lique provenant de l’hydrolyse de l’acide allantoïque. De A, on déduit la

teneur en acide allantoïque (mgr. par litre) de la solution, en se reportant à la

courbe des densités d’absorption en fonction des concentrations en acide

V' .. . V'

allantoïque (30). Soit p cette teneur par litre, -y- la dilution, p x -y- repré¬

sentera la teneur en acide allantoïque de 1000 cc. du liquide fermentaire.

Nota. — La courbe des densités d’absorption en fonction des concentrations

en acide allantoïque est tracée une fois pour toutes à partir de l’allantoate de

potassium pur. Elle donne directement la teneur en acide allantoïque en mgr.

par litre de la liqueur ayant servi au dosage.

La défécation par le tungstate et l’acide sulfurique est quelquefois déli¬

cate ; on obtient des liquides imparfaitement déféqués, opalescents, qui lors

de la mesure de A peuvent causer de grosses erreurs. Aussi la défécation sera

étudiée avec soin pour chaque série d’expériences ; les conditions expérimen¬

tales trouvées conduiront à l’obtention de liquides absolument limpides.

Dans ces conditions, l’acide urique, l’allantoïne chimiquement pure, ne

donnent aucune réaction avec le réactif phénylhydrazinique.

2

Mémoires du muséum, nouvelle série, tome VI.

18 A. BRÜNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PÜBIQDE CHEZ LES CHAMPIGNONS

E. — Répartition de l’allantoïnase chez les Champignons.

Nous avons appliqué pour la recherche de l’allantoïnase chez les Champi¬

gnons la technique suivante dérivée du dosage spectrophotométrique de

l’acide allantoïque, technique qui tient compte de la présence fréquente de cet

uréide dans le végétal étudié.

On place au bain d’eau à 39°, dans des tubes à centrifuger, des milieux de

composition :

Solution fraîchement préparée d’allan-

toïne à 0,1 gr. + 2 gr. de sesqui-carbo-

E

T

nate d’Am. par litre.

5 cc.

))

Poudre fermentaire de champignon. . .

0,05 gr.

Solution de sesqui-carbonate d’Am. à2 °/ 00

»

5 cc.

T oluène.

V gouttes.

Y gouttes.

Expérience E. — Elle sert à la détermination de l’acide allantoïque total

qui comprend :

1° L’acide allantoïque apporté par le champignon étudié.

2° L’acide allantoïque provenant de la fermentation de l’allantoïne.

Expérience T. — Elle permet de fixer la quantité d’acide allantoïque apporté

par le végétal.

Après une heure de fermentation, l’acide allantoïque est dosé par spectro-

photométrie dans E et T.

Si A e est la teneur en acide allantoïque de E,

Si Aj est la teneur en acide allantoïque de T,

la présence de l’allantoïnase dans le champignon étudié pourra être affirmée si

As > A?.

Nous avons pu, en appliquant cette technique, constater la présence ou

l’absence de l’allantoïnase dans de nombreux champignons. La classifica¬

tion et la nomenclature suivies sont celles de M. Roger Heim dans ses « Obser¬

vations sur la flore mycologique catalane », Muséum des Sciences Naturelles,

Barcelone, octobre 1934.

PRÉSENCE DE t’ALLANTOÏNASE CHEZ LES CHAMPIGNONS

19

LISTE DES ESPÈCES ÉTUDIÉES

MYXOMYCÈTES

Gen. Reticularia Bull.

RECHERCHE

do l’allantoïaase.

Reticularia lycoperdon Bull.négative.

Gen. Lycogala Adanson

Lycogala epidendron (Lin.) Fr.négative.

ASCOMYCÈTES

Discales operculés.

Helvelleae

Gen. Gyromitra Fr.

Gyromitra esculenta Fr. ex Pers.négative.

Gen. Helvella Fr. ex Lin.

Helvella crispa Fr. ex Scop., lacunosa Fr. ex Afz., elastica Fr. ex

Bull.négative.

Pezizeae

Gen. Cyathipodia Boud.

Cyaihipodia coriurn Webbeb.négative.

«

Gen. Acetabula Fuck.

Acetabula vulgaris Fuck. négative.

Gen. Galactinia Cooke

Galactinia succosa (Berk.) Cooke.négative.

Gen. Sarcosphaera Awd.

Sarcosphaera coronaria (Jacq.) Awd.négative.

Gen. Peziza Dill.

Peziza aurantia Pers.négative.

Gen. Ciliaria Quél.

Ciliaria scutellata Lin.négative.

20 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE l’AZOTE PÜRIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Discales inoperculés.

Leotieae

Gen. Mitrula Fr.

RECHERCHE

de l’allanloïDase.

Mitrula paludosa Fr.négative.

Gen. Leotia Fr. ex Hill.

Leotia lubrica Fr. ex Pers.négative.

Tuberaceae, Tubereae

Gen. Tuber Fr. ex Micheli

Tuber melanosporum Vitt.[. négative.

BASIDIOMYCÈTES

Basidiomycètes hétérobasidiés.

Uredinaceae, Puccinieae

Gen. Puccinia Pers.

Puccinia fusca (Pers.) Wint. (sur Anemone nemorosa) . négative.

Basidiomycètes homobasidiés.

Aphyllophorales.

Clavariaceae, Clavarieae

Gen. Clavaria Fr.

Clavaria flaccida Fr., cinerea Fr., cristata Fr. ex Pers., stricta Fr.

ex Pers.négative.

m

POROIIYDNACEAE, StEREINEAE

Gen. Stereum Fr. ex Pers.

Stereum purpureum Fr. ex Pers., hirsutum Fr. ex Willd. négative.

Poraceae, Polyporeae

Gen. Polyporus Fr. ex Micheli sensu Pat.

Polyporus intybaceus Fr., umbellatus Fr. ex Pers.positive.

Gen. Leucoporus Quél.

Leucoporus Forquignoni Quél., brumalis (Fr.) Quél.positive.

Gen. Melanopus Pat.

Melanopus squamosus (Fr. ex Huds.) Pat.positive.

PRÉSENCE DE l’aLLANTOÏNASE CHEZ LES CHAMPIGNONS

il

Gen. Phaeoliis Pat. recherche

de l’allantoïnase

Phaeolus nidulans (Fr. ex Pers.) Pat. positive.

Trameteae

Gen. Lenzites Fr.

Lenzites quercina (Fr. ex Lin.) Quél., betulina Fr. ex Schaeff. négative.

Gen. Trametes Fr.

Trametes gibbosa Fr. ex Pers., rubescens Fr. ex Alb. et Schw., hispi-

da B agi.négative.

Gen. Coriolus Quél.

Coriolus versicolor (Fr. ex Lin.) Quél.négative.

Gen. Phellinus Pat.

Phellinus robustus (Karst.) Pat.négative.

Gen. Xanthochrous Pat.

Xanthochrous hispidus (Fr. ex Bull.) Pat., perennis (Fr. ex Lin.) Pat. négative.

Ungulineae

Gen. Ungulina Pat.

Ungulina fomentaria (Fr. exLin.) Put., betulina (Fr. ex Bull.) Pat. négative.

Hydnaceae

Gen. Sarcodon Quél.

Sarcodonrepandum( Fr. exLin.)Quél., imbricatum( Fr.ex Lin.)Quél. négative.

Gen. Calodon Quél.

Calodon ferrugineum (Fr.) Quél.négative.

Boletales.

Boletaceae, Boleteae

Gen. Boletus Fr. ex Dill.

Boletus edulis Fr. ex Bull., var. reticulatus (Boud. ex Schaeff.) Bat.,

var pinicola Sacc., ssp. aereus Fr. ex Bull., Boletus scaber Fr. ex

Bull., ssp. aurantiacus t Roq. ex Bull., ssp. duriusculus (Kalch.)

Quél., ssp. regius Kromb., Boletus badius Fr., luridus Fr. ex

Schaeff., erythropus Fr., calopus Fr., gentilis Quél. positive.

Gen. Xerocomus Quél.

Xerocomus subtomentosus (Fr. ex Lin.) Quél., ssp. chrysenteron Fr.

ex Bull., Xerocomus spadiceus Fr. ex Schaeff. positive.

22 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQÜE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Gen. Ixocomus Quél. recherche

de l’allantoïnase.

Ixocomus bovinus (Fr. ex Lin.)Quél., granulatus (Fr. ex Lia.) Que],,

luteus (Fr. ex Lin.) Quél., piperatus (Fr. ex Bull.) Quél., varie-

gatus (Fr. ex Schwartz.) Quél. positive.

Gen. Gyroporus Quél.

Gyroporus cyanescens (Fr, ex Bull.) Qnél. positive.

Gen. Tylopilus Karst.

Tylopilus felleus (Fr. ex Bull.) Karst.. . positive.

Paxilleae

Gen, Paxülus Fr.

Paxillus atrotomentosus Fr, ex Batsch,, involutus Fr. ex Batsch. . . positive.

Gomphidiaceae, Gomphidieae

Gen. Gomphidius Fr.

Gomphidius viscidus Fr. .. positive.

Asterosporales.

Russulaceae

Gen. Lactarius Fr.

Lactarius blennius Fr., chrysorheus Fr., controversus Fr. ex Pers.,

deliciosus Fr. ex Lin., fuliginosus Fr., insulsus Fr., pallidus Fr.,

plumbeus Fr. ex Bull., subdulcis Fr. ex Bull., theiogalus Fr. nec

Quél., torminosus Fr. ex Schaefï., vellereus Fr , mitissimus Fr.,

trivialis Fr. positive.

Gen. Russula Fr.

Russula adusta Fr, ex Pers., aurata Fr. ex Wit h.,' cyanoxantha Fr.,

delica Fr., emetica Fr. ex Schaelï., foetens Fr. ex Pers., jragilis Fr.

exBu]].,/eWeaFr. ex Paul., lutea Fr. ex Huds., lepida Fr., pecti-

nata Fr., ex Bull., sardonia Fr., vesca Fr. sensu Bres. Pelt., xeram-

pelina Fr. ex Schaefï., ochracea Fr, ex Alb. et Schw., depallens

Fr. ex Pers., chamaeleontina Fr., roseipes Secr. positive.

Agaricales.

Cantharellaceae, Cantharelleae

Gen. Craterellus Fr.

Craterellus cornucopioides Fr,

positive.

PRÉSENCE DE l’ALLANTOÏNASE CHEZ LES CHAMPIGNONS

23

Gen. Cantharellus Fr, ex Adanson

RECHERCHE

de l’allantoïnase.

Cantharellus cibarius Fr.négative.

Hygrophoreae

Gen. Hygrophorus Fr.

Hygrophorus chrysodon Fr. ex Batsch., olivaceo albus Fr. positive.

Rhodogoniosporaceae, Riiodogoniosporeae

Gen. Rhodophyllus Quél.

Rhodophyllus ( Entoloma) clypeatus (Fr. ex Lin.) Quél., nidorosus

(Fr.) Quél., rhodopolius (Fr.) Quél., icterinus (Fr.) Quel., lividus

(Fr. ex Bull.) Quél., Rhodophyllus (Leptonia) solstitialis (Fr.) Quél. positive.

Tricholomaceae, Lentineae

Gen. Lentinus Fr.

Lentinus tigrinus Fr. ex Bull., cochleatus Fr. ex Pers., degener Fr. . positive.

Gen. Panus Fr.

Panus stipticus Fr. ex Bull. positive.

Marasmihae

Gen. Androsaceus Pat.

Androsaceus vulgaris Pat. positive.

Gen. Marasmius Fr.

Marasmius alliaceus Fr. ex Jacq., oreades Fr. ex Boit., rotula Fr. ex

Bull., peronatus Fr. ex Boit., erythropus Fr. ex Pers. positive.

Collybieae

Gen. Mycena Fr.

Mycena alcalina Fr., galericulata Fr. ex Scop., inclinata Fr., pelian-

thina Fr., polygramma Fr. ex Bull., para Fr. ex Pers., calopoda

sensu Cooke nec Quél., vulgaris Fr. ex Pers. positive.

Gen. Mucidula Pat.

Mucidula radicata (Fr. ex Relh.) Boursier, mucida (Fr. ex Schr.) Pat. positive.

Gen. Collybia Quél.

Collybia butyracea Fr. ex Bull., distorta Fr., dryophila Fr. ex Bull.,

erythropoda Fr. ex Pers., fusipes Fr. ex Bull., longipes Fr., platy-

phylla Fr. ex Pers., maculata (Fr. ex Alb. et Schw.) Quél., velupi-

pes Fr. ex Curt., ambusta Fr.. .. positive.

24 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQÜE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Pleuroteae

Gen. Pleurotus Fr. pr. parte Quél.

RECHERCHE

de l’allantoïnase.

Pleurotus eryngii Fr. ex DC., var. nebrodensis Inzenga, Pleulorus

ostreatus (Fr. ex Jacq.) Quél., ulmarius Fr. ex Bul]. positive.

Gen. Acanthocystis Fayod

Acanthocysiis petaloides (Fr. ex Bull.) Fay. positive.

Gen. Phyllotopsis Gilb. et Donk.

Pkyllolopsis nidulans (Fr. ex Pers.) Singer. positive.

Omphalieae

Gen. Omphalia Fr.

Omphalia fibula Fr. ex Bull. positive.

Gen. Clitocybe Quél.

Clitocybe durantiaca Fr. exWeinm., brumalis Fr., catina Fr., cerus-

sataFr., cyathiformisFr. ex Bull., dealbata Sow., geotropa Fr. ex

Bull., infundibuliformis Fr. ex Schaeff., inversa Fr. exScop.,«e&K-

laris Fr. exBatsch., aurantiaca ssp. pallida Cooke, tabescens (Fr.

ex Bull.) Bres., odora Fr. ex Bull., viridis Fr. ex Boit. positive.

Gen. Armillariella Pat.

Armillariella mellea (Fr.) Pat. positive.

Gen. Laccaria (Berk.) Pat.

Laccarialaccata (Fr. ex Scop.) Pat., var. amethystina Quél. ex Vaill. positive.

Tricholomeae

Gen. Tricholoma Fr.

Tricholoma acerbum Fr. ex Bull., albobrunneum Fr. ex Pers.,' album

Fr. exSchaeff., argyraceum Fr.ex Bull., cartilagineumFr. ex Bull.,

columbetta Fr., equestre Fr. ex Lin., irinum Fr., pessundatum Fr.,

rutilans Fr. ex Schaeff., saponaceum Fr., sejunctum Fr. ex Sow.,

sulfureum Fr. ex Bull., terreum Fr. ex Schaeff., aggregatum Fr. ex

Schaeff., portentosum (Fr.) Quél., Georgii Quél., var. gambosum

Fr., leucocephalum Fr. ex Baria. positive.

Gen. Rhodopaxillus Maire

Rhodopaxillus nudus (Fr. ex Bull.) Maire, var glaucocanus (Bres.)

Quél. positive.

32 A. BRUNEL.

OH

MÉTABOLISME DE L'AZOTE PURIQDE CHEZ LES CHAMPIGNONS

NH

I

CO

-NH

CO

NH — CH — NH

+ KOH — HO

OK

I

NH — C-NH

I I

CO CO

I I

NH — CH — NH

4- H O

NH 2

1

NH-

1

CO

COOK

1

CO.

|

NH —

CH-

- NH

La soude, rammoniac et à un degré moindre les hydrates alcalinoterreux,

les bases organiques etc..., l’hydrolysent pour donner finalement l’acide

allantoïque.

Certains sels possèdent aussi la propriété d’hydrolyser l’allantoïne ; nous

n’envisagerons leur action qu’en rapport avec leur influence sur le milieu

fermentaire

, „ Allantoïnase . .,

Allantoïne-► Acide allantoïque.

a) Influence des carbonates de sodium.

1° Carbonate neutre de sodium. — A la concentration de 2 0 / 00 , à 39°, ce sel

hydrolyse nettement l’allantoïne ; cela concorde avec sa forte dissociation

hydrolytique, que l’on peut représenter par :

Na+Na+(CO H )— + H+OH - T=t Na+ -+- Na+ + OH" + HCO !

Na+Na+(CO')— + H+OH - vi Na+OH - + Na+(CO i H)-.

Le carbonate neutre de potassium conduit aux mêmes résultats. Les carbo¬

nates neutres de sodium et de potassium se comportent donc comme des

solutions d'hydroxydes et de bicarbonates alcalins; ces sels ne peuvent être

utilisés dans l’étude de l’hydrolyse enzymatique de l’allantoïne, leur présence

apportant une action d’ordre chimique que l’on ne peut séparer de l’action

fermentaire proprement dite.

2° Carbonate acide de sodium. — A la concentration de 2 °/ 0 o, à 39°, ce sel

est sans action sur l’allantoïne, même après cinq heures de contact, par contre r

il favorise l’hydrolyse fermentaire en augmentant le pourcentage de transfor¬

mation.

b) Influence des phosphates de sodium.

1° Phosphate trisodique. — Il réagit comme le carbonate neutre de sodium :

Na+Na+Na+(PO')-+ H+OH - t=± Na+ + OH - + Na+Na+H+(PO )-

Na+Na + Na+(PO')--h II+OH - ?=* Na+OH - 4- Na+Na+H+(PO')—

34 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE l’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Conditions expérimentales :

Solution d’allantoïne à 0,1 gr. par litre de pH variable .

Poudre de Pluteus patricius .

Durée de fermentation.

Température.. .

Chloroforme ..

5 ce.

0,05 gr.

1 heure.

39°

V gouttes.

L’acide allantoïque est dosé par spectrophotométrie ; on obtient ainsi

l’acide allantoïque total comprenant : l’acide allantoïque de fermentation et

celui préexistant dans le végétal. Un dosage préliminaire fixe la teneur en

acide allantoïque existant dans la poudre fermentaire avant l’emploi. On

retranche la quantité ainsi trouvée de l’acide allantoïque total.

Cette différence représente l’acide allantoïque résultant de l’hydrolyse

enzymatique de l’adlantoïne.

Le tableau I et la courbe I (figure 2, page 36) résument les résultats obtenus.

Tableau I

VALEUR

du /iH.

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

ALLANTOÏNE

transformée.

Total.

préexistant.

de fermentation.

5,8

6 mgr.

o

0

6,2

6 —

—

0

6,4

6,1 —

—

Traces.

6,6

11,9 —

—

5,9 mgr.

5,3 %

6,8

16,9 —

—

10,9 —

9,8 —

22,1 —

—

16,1 —

14,4 —

7,2

28,1 —

—

22,0 —

19,7 —

7,4

37,3 —

—

31,3 —

27,8 —

7,5

38,6 —

—

32,6 —

29,2 —

7,6

40,3 —

—

34,3 —

30,7 —

7,7

38,5 —

—

32,5 —

29,1 —

7,8

37,1 —

—

31,1 —

27,9 —

A 39°, l’allantoïnase de Pluteus patricius présente un pH optimum de 7,6*.

Il est remarquable que déjà à pH 6,6 on constate une nette hydrolyse de l’al-

lantoïne. L’allantoïnase de Pluteus patricius possède une grande résistance

aux variations de la réaction de milieu, elle est susceptible de manifester son

action, même dans des conditions peu favorables.

1, KisiiuN Ro (48) indique pour l'allantoïnase de Soja hispicla un pïl optimum de 7,8

pour des températures comprises entre 50-60°: il est utile de remarquer qu'à, ces tempé¬

ratures, à pli 7,3, l'allantoïne subit déjà un commencement d’hydrolyse sans interven¬

tion enzymatique.

PRÉSENCE DE L’ALLANTOÏNASE CHEZ LES CHAMPIGNONS

27

Gen. Hiatula (P. Henn.) Heim et Romagnesi

RECHERCHE

de l’allautoïnase.

Hiatula caepestipes (P. Henn.) Heim et Romagnesi, licmophora (B.

et Br.) Heim. positive.

Gen. Agaricus Fr. ex Lin. em. Sacc.

Agaricus arvensis Fr. ex Schaeff., campester Fr. ex Lin., sylvaticus

Fr. ex Schaeff., silvicola Vitt., xanihodermus Gen., exquisitus Vitt. positive.

Stropharieae

Gen. Stropharia Fr.

Stropharia aeruginosa Fr. ex Curt., merdaria Fr. ex Buxb. positive.

Gen. Hypholoma Fr.

Hypholoma appendiculatum Fr. ex Bull., var. Candolleanum Fr. ex

Weinm., Hypholoma hydrophilum Fr. exButt.,lacrymabundumFr.

ex Bull. positive.

Gen. Lacrymaria Pat.

Lacrymaria velutina (Fr. ex Pers.) Pat. positive.

Coprineae

Gen. Panaeolus Fr.

Panaeolus campanulatas Fr. ex Lin., retirugis Fr. ex Batsch., papi-

lionaceus Fr. positive.

Gen. Psathyrella Fr.

Psathyrella gracïlis Fr. ex Pers., subatrata Fr. ex Batsch. positive.

Gen. Pseudocoprinus Kühner

Pseudocoprinus disseminatus (Fr.) Kühner. positive.

Gen. Psilocybe Fr. emend. Quél.

Psilocybe sarcocephala (Fr.) Gill., foenisecii Fr. ex Pers., uda Fr . . positive.

Gen. Coprinus Fr.

Coprinus atramentarius Fr. ex Bull., fimetarius Fr."ex*Lin., lagopus

Fr., picaceus Fr. ex Bull., micaceus Fr. ex Bull., plicatilis JFr. ex

Curt., stercorarius Fr. ex Bull., comatus Fr. ex Müller. positive.

Gasterales.

SCLERODERMACEAE, ScLERODERMEAE

Gen. Scleroderma Pers. emend. Fr.

Scleroderma verrucosum Pers., aurantium Pers. ex Lin.négative.

28 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PÜRIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Lycoperdaceae, Lycoperdeae

Gen. Lycoperdon Pers. ex Tourn.

RECHERCHE

de l’allantoïnasc.

Lycoperdon echinatum Pers., perlatum Pers., piriforme Pers. ex

Schaeff., giganteum Pers. ex Batsch.négative.

Phallaceae

Gen. Ithyphallus Fr.

Ithyphallus impudicus (Pers. ex Lin.) Fr.négative.

CHAPITRE II

SUR QUELQUES PROPRIÉTÉS DE L’ALLANTOÏNASE

DES CHAMPIGNONS

A. — Influence de la température sur la réaction.

NH-

CO

— NH

NH 2

1

CO

|

1

CO

1

Allantoïnase

1

CO

1

COOH

1

CO.

1

+ HO

NH —

CH

— NH

NH —

CH-

- NH

Cette étude a été faite avec la poudre de Clitocybe infundibuliformis, en

tenant compte de l’acide allantoïque préexistant dans ce champignon.

Conditions expérimentales :

Solution fraîche d’allantoïne à 0.1 gr. par litre .... 5 cc.

Poudre de Clitocybe infundibuliformis .0,05 gr.

Durée de fermentation.1-5 heures.

Température.Variable.

Chloroforme.V gouttes.

L’acide allantoïque a été dosé par spectrophotométrie. Les résultats de ces

expériences sont résumés dans le Tableau I, dont les chiffres ont servi à cons¬

truire les courbes I et II (figure 1).

Tableau I

TEMPÉRATURE

DURÉE

de fermentation.

ACIDE ALI

Total.

.ANTOÏQUE I

préexistant.

AR LITRE

do

fermentation.

ALLANTOÏDE

transformée.

19°

1 h.

44,7 mgr.

26,1 mgr.

18,6 mgr.

16,6 %

22°

—

53,5 —

—

27,4 —

24,5 —

24°5

—

59,8 —

—

33,7 —

30,1 —

27°8

—

62,8 —

—

36,7 —

32,9 —

29°8

—

65,5 —

—

39,4 —

35,3 —

30°8

—

65,7 —

—

39,6 —

35,5 —

30 A. BRDNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

TEMPÉRATURE

DURÉE

de fermentation.

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

ALLANTOÏNE

transformée.

Total.

préexistant.

de

fermentation.

32 °5

1 h.

61,3

mgr.

26,1 mgr.

35,2

mgr.

31,5 %

35°5

—

55,3

—

29,2

—

26,2 —

37°5

—

53,7

—

27,6

—

24,7 —

39°

—

52,7

—

26,6

—

23,8 —

41o

—

51,0

—

24,9

—

22,3 —

43°

—

49,4

—

23,3

—

20,9 —

19°

5 h.

54,6

—

28,5

—

25,5 —

22°

—

62,8

—

36,7

—

32,9 —

2405

*

69,7

—

43,6

—

39,1 —

27°8

—

71,6

—

45,5

—

40,8 -

29°8

—

71,7

—

45,6

—

40,9 —

30°8

—

69,7

—

43,6

—

39,1 —

32°5

—

66,1

—

40,0

—

35,8 —

35°5

—

61,2

—

35,1

—

31,5 —

37°5

—

58,2

—

32,1

—

29,4 —

39°

—

56,1

—

30,0

—

26,9 —

410

—

56,1

—

30,0

—

26,9 —

43°

55,9

—

29,7

—

25,6 —

SUR QUELQUES PROPRIÉTÉS DE l’aLLANTOÏNASE DES CHAMPIGNONS

31

températures plus basses, ce qui est conforme à ce qu’on sait sur les variations

de l’optimum de température avec la durée de fermentation (G. Bertrand

et A. Compton).

Une nouvelle série d’expériences a été instituée pour étudier l’influence du

sesqui-carbonate d’ammonium sur l’optimum de température.

Conditions expérimentales :

Solution d’allantoïne à 0,1 gr. -f- 2 gr. de sesqui-carbo¬

nate d’ammonium par litre.5 cc.

Poudre de Clitocybe infundibuliformis .0,03 gr.

Durée de fermentation.1 heure.

Chloroforme.V gouttes.

Les résultats sont résumés dans le Tableau II et la courbe III.

Tableau II

TEMPÉRATURE

DURÉE

de fermentation.

ACIDE ALI

Total.

ANTOÏQUE P

préexistant.

AR LITRE

do

fermentation

ALLANTOÏNE

transformée.

19°

1 h.

G2,2 mgr.

26,1 mgr.

36,1 mgr.

32,3 %

22 °

—

71,6 —

—

45,5

—

40,7 —

24°5

—

78,5 —

—

52,4

—

47,0 —

27°8

—

86,5 —

—

60,6

—

54,2 -

29°8

—

90,2 —

—

64,1

—

57,3 —

30°8

—

93,2 —

—

67,1

—

60,2 —

32°5

—

97,8 —

—

71,7

—

63,1 —

35»5

—

99,2 —

—

73,1

—

65,4 —

37 u 5

—

101,4 —

—

75,3

—

67,5 —

39°

—

103,8 —

—

77,7

—

69,5 —

410

—

102,8 —

—

76,7

—

68,6 —

43°

—

101,3 —

—

75,2

—

67,4 —

45°

100,1 —

—

74,0

—

66,4 —

L’étude de la courbe III (figure 1) montre un très net déplacement de

l’optimum vers les températures plus élevées, quand le milieu fermentaire

est pourvu de sesqui-carbonate d’ammonium. De 30°, l’optimum passe à

39°-40°, se rapprochant ainsi de celui de l’uréase des Champignons supérieurs,

qui est de 38° (P. Costy) (14).

B. — Action des sels sur l'allantoïne et sur son hydrolyse enzymatique.

L’allantoïne est très sensible à l’action des bases, elle se dissout facilement

dans la potasse pour donner

1° L’allantoïne potassée,

2° L’allantoate de potassium.

32 A. BRUNEL.

OH

MÉTABOLISME DE L'AZOTE PURIQDE CHEZ LES CHAMPIGNONS

NH

I

CO

-NH

CO

NH — CH — NH

+ KOH — HO

OK

I

NH — C-NH

I I

CO CO

I I

NH — CH — NH

4- H O

NH 2

1

NH-

1

CO

COOK

1

CO.

|

NH —

CH-

- NH

La soude, rammoniac et à un degré moindre les hydrates alcalinoterreux,

les bases organiques etc..., l’hydrolysent pour donner finalement l’acide

allantoïque.

Certains sels possèdent aussi la propriété d’hydrolyser l’allantoïne ; nous

n’envisagerons leur action qu’en rapport avec leur influence sur le milieu

fermentaire

, „ Allantoïnase . .,

Allantoïne-► Acide allantoïque.

a) Influence des carbonates de sodium.

1° Carbonate neutre de sodium. — A la concentration de 2 0 / 00 , à 39°, ce sel

hydrolyse nettement l’allantoïne ; cela concorde avec sa forte dissociation

hydrolytique, que l’on peut représenter par :

Na+Na+(CO H )— + H+OH - T=t Na+ -+- Na+ + OH" + HCO !

Na+Na+(CO')— + H+OH - vi Na+OH - + Na+(CO i H)-.

Le carbonate neutre de potassium conduit aux mêmes résultats. Les carbo¬

nates neutres de sodium et de potassium se comportent donc comme des

solutions d'hydroxydes et de bicarbonates alcalins; ces sels ne peuvent être

utilisés dans l’étude de l’hydrolyse enzymatique de l’allantoïne, leur présence

apportant une action d’ordre chimique que l’on ne peut séparer de l’action

fermentaire proprement dite.

2° Carbonate acide de sodium. — A la concentration de 2 °/ 0 o, à 39°, ce sel

est sans action sur l’allantoïne, même après cinq heures de contact, par contre r

il favorise l’hydrolyse fermentaire en augmentant le pourcentage de transfor¬

mation.

b) Influence des phosphates de sodium.

1° Phosphate trisodique. — Il réagit comme le carbonate neutre de sodium :

Na+Na+Na+(PO')-+ H+OH - t=± Na+ + OH - + Na+Na+H+(PO )-

Na+Na + Na+(PO')--h II+OH - ?=* Na+OH - 4- Na+Na+H+(PO')—

SUR QUELQUES PROPRIÉTÉS DE L’ALLANTOÏNASE DES CHAMPIGNONS 33

et nepeut être envisagépourl’étude de l’hydrolyse enzymatique de l’allantoïne.

2° Phosphate disodique. — Comme le bicarbonate de sodium, le phosphate

disodique est sans action sur l’allantoïne, mais il augmente la vitesse de l’hydro¬

lyse de l’allantoïne par l’allantoïnase.

3° Phosphate monosodique. —■ Ce sel empêche toute hydrolyse enzymatique

de l’allantoïne.

c) Influence du sesqui-carbonate d’ammonium.

Dans les limites de nos expériences, à la concentration optimum de 2 0 / 0 o

à 39°, ce sel est particulièrement favorable à la marche de l’hydrolyse enzyma¬

tique. Alors qu’en sa présence, l’allantoïnase de Clitocybe infundibuliformis ,

transforme en acide allantoïque 60 % de l’allantoïne mise en expérience, en

son absence l’hydrolyse n’atteint que 23 % . C’est le sel de choix pour l’étude

de l’hydrolyse de l’allantoïne par l’allantoïnase des champignons ; mais on ne

peut à partir de ce sel préparer des solutions de p H bien défini.

C. — Recherche du pH optimum de l'allantoïnase des Champignons.

ICjeldahl (50) le premier a étudié l’action des acides et des bases sur les

processus enzymatiques ; pour chaque enzyme, conclut-il, il existe une

concentration dite optimale.

Sorensen a remplacé cette notion d’acidité ou de basicité optimale par

celle de concentration en ions hydrogène. Hudson et Paine (44), puis Mi-

chaelis et ses collaborateurs, ont montré que l’activité d’un enzyme était

sous la dépendance étroite d’un facteur physico-chimique, la concentration

en ions hydrogène du milieu. Toutefois cette généralisation n’est plus permise

aujourd’hui; il en est pour l’optimum de réaction comme pour l’optimum de

température (6), cet optimum est susceptible de varier suivant les circons¬

tances ; il dépend d’au moins six facteurs : température (13), nature du subs¬

trat (1), origine de l’enzyme (8), âge de l’enzyme (7), nature des sels du mé¬

lange tampon (53), concentration du substrat (4).

Dans nos expériences tous les facteurs, à l’exception du pH, sont maintenus

constants. Nous utilisons les solutions tampons de Clark et Lubs (12) à base

de soude et de phosphate monopotassique dont nous donnons un des types :

HONa M /5 42,8 cc. Dilution. Valeur du pH.

POH-K M/5 50,0 cc. 200 cc. 7,6

Avant d’amener le volume à 200 cc. on ajoute à chaque mélange 10 cc.

d’une solution d’allantoïne fraîchement préparée à 2 gr. par litre, soit une

concentration finale de 100 mgr. d’allantoïne par litre. L’allantoïnase pro¬

venait de Pluteus patricius Schulzer.

Mémoires du muséum, nouvelle série, tome VI.

3

34 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE l’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Conditions expérimentales :

Solution d’allantoïne à 0,1 gr. par litre de pH variable .

Poudre de Pluteus patricius .

Durée de fermentation.

Température.. .

Chloroforme ..

5 ce.

0,05 gr.

1 heure.

39°

V gouttes.

L’acide allantoïque est dosé par spectrophotométrie ; on obtient ainsi

l’acide allantoïque total comprenant : l’acide allantoïque de fermentation et

celui préexistant dans le végétal. Un dosage préliminaire fixe la teneur en

acide allantoïque existant dans la poudre fermentaire avant l’emploi. On

retranche la quantité ainsi trouvée de l’acide allantoïque total.

Cette différence représente l’acide allantoïque résultant de l’hydrolyse

enzymatique de l’adlantoïne.

Le tableau I et la courbe I (figure 2, page 36) résument les résultats obtenus.

Tableau I

VALEUR

du /iH.

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

ALLANTOÏNE

transformée.

Total.

préexistant.

de fermentation.

5,8

6 mgr.

o

0

6,2

6 —

—

0

6,4

6,1 —

—

Traces.

6,6

11,9 —

—

5,9 mgr.

5,3 %

6,8

16,9 —

—

10,9 —

9,8 —

22,1 —

—

16,1 —

14,4 —

7,2

28,1 —

—

22,0 —

19,7 —

7,4

37,3 —

—

31,3 —

27,8 —

7,5

38,6 —

—

32,6 —

29,2 —

7,6

40,3 —

—

34,3 —

30,7 —

7,7

38,5 —

—

32,5 —

29,1 —

7,8

37,1 —

—

31,1 —

27,9 —

A 39°, l’allantoïnase de Pluteus patricius présente un pH optimum de 7,6*.

Il est remarquable que déjà à pH 6,6 on constate une nette hydrolyse de l’al-

lantoïne. L’allantoïnase de Pluteus patricius possède une grande résistance

aux variations de la réaction de milieu, elle est susceptible de manifester son

action, même dans des conditions peu favorables.

1, KisiiuN Ro (48) indique pour l'allantoïnase de Soja hispicla un pïl optimum de 7,8

pour des températures comprises entre 50-60°: il est utile de remarquer qu'à, ces tempé¬

ratures, à pli 7,3, l'allantoïne subit déjà un commencement d’hydrolyse sans interven¬

tion enzymatique.

SDB QUELQUES PROPRIÉTÉS DE LALLANTOÏNASE DES CHAMPIGNONS

35

Influence de l’origine de l’enzyme. — L’influence de l’origine de la

poudre fermentaire est considérable, c’est ce que montre l’étude de l’allan-

toïnase provenant des sources suivantes :

Polyporus intybaceus Fr.

Pleurotus ostreatus (Fr. ex Jacq.) Quél.

Collybia maculata (Fr. ex Alb. et Schw.) Quél.

La détermination du pH optimum a été faite comme pour Pluteus patricius.

Les résultats sont consignés dans le Tableau II et les courbes II, III, IV

(figure 2, page 36).

Tableau II

ORIGINE

do l'enzyme.

VALEUR

du /}H.

ACIDE ALI

Total.

.ANTOÏQUE F

préexistant.

AR LITRE

de

fermentation.

ALLANTOÏNE

transformée.

P. intybaceus . .

21,0 mgr.

1,4 mgr.

19,6

mgr.

K

- . .

21,4 -

—

20,0

—

p§K t

- . .

21,9 —

—

20,5

—

lB : flæU

- . .

23,2 —

—

21,8

—

ml ; «bd! 1

- . .

22,9 —

—

21,5

—

F3 ? Wesaj!

- . .

22,2 —

_

20,8

—

» ‘TCP* 1

P. ostreatus. . .

0,0 —

0,0 mgr.

0,0

—

rm ïmê # 1

- ...

4,5 —

—

4,5

—

4,0 —

- ...

10,1 —

—

10,1

—

9,0 —

- ...

10,1 —

—

10,1

—

9,0 —

- ...

10,1 —

—

10,1

—

9,0 —

- ...

9,8 —

—

9,8

—

8,8 —

- ...

8,0 —

—

8,0

—

7,2 -

- ...

8,0 —

—

8,0

—

7,2 —

C. maculata. . .

29,8 —

17,4 mgr.

12,4

—

11,1 —

—

29,8 —

—

12,4

—

11,1 —

- ...

29,8 —

—

12,4

—

11,1 —

—

29,2 —

—

11,8

—

29,2 —

11,8

Conclusions. — L’allantoïnase de Pluteus patricius, de Polyporus intybaceus ,

présente une réaction optimale pour pH 7,6, mais déjà pour Polyporus inty¬

baceus la transformation de l’allantoïne en acide allantoïque, quand on passe

de pH. 7,3 à pH 7,6, n’augmente que faiblement. On ne peut parler de pH

optimum pour l’enzyme de Collybia maculata ; dans les limites de nos expé¬

riences la transformation est identique pour pH 7,4, 7,5, 7,6.

Pour l’allantoïnase de Pleurotus ostreatus il y a un net déplacement de l’op¬

timum vers pH 7,2 à 7,3.

Il est difficile d’attribuer ces différences de pH optimum à des propriétés

spécifiques, caractéristiques de chaque enzyme. Nous pensons plutôt que cer¬

taines impuretés (sels, substances étrangères) qui accompagnent l’enzyme

La transformation de l’allantoïne en acide allantoïque est plus élevée en

présence de sesqui-carbonate d’ammonium.

SUR QUELQUES PROPRIÉTÉS DE l’AI.LANTOÏNASE DES CHAMPIGNONS 37

Au cours de ce Travail nous utiliserons fréquemment ce sel dans la compo¬

sition des milieux fermentaires.

D. — Marche de l'hydrolyse de l’allantoïne par 1 allantoïnase

des Champignons.

Nous étudierons la marche de l’hydrolyse enzymatique :

1° En l’absence de sel,

2° En présence de 2 % 0 de sesqui-carbonate d’Am.,

3° Au pH optimum 7,6.

On place au bain d’eau à 39°, dans des tubes à centrifuger, trois séries

d’expériences E,, E 2 , E 3 :

Ei

Solution d’allantoïne à 0,1 % c .5 cc.

Poudre de P. patricius .0,05 gr.

Durée de fermentation.Variable.

Chloroforme.V gouttes.

Solution d’allantoïne à 0,1 % 0 + 2 % 0 S. carbonate

d’Am.5 cc.

Poudre de P. patricius .0,05 gr.

Durée de fermentation.Variable.

Chloroforme.V gouttes.

E :1

Solution d’allantoïne à 0,1 % 0 à p H 7,6.5 cc.

Poudre de P. patricius .0,05 gr.

Durée de fermentation.Variable.

Chloroforme.V gouttes.

Après des temps déterminés l’acide allantoïque est dosé par spectrophoto-

métrie. Les résultats sont résumés dans le Tableau I et les courbes I, II, III

(figure 3, page 38).

Tableau I

dur£ e

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

ALLANTOÏNE

de fermentation.

Total.

préexistant.

de fermentation.

transformée.

Ei 1 h.

32,6 mgr.

6 mgr.

26,6 mgr.

23,8 %

2

34,3 —

28,3 —

25,4 —

3

36,0 —

30,0 —

26,9 —

4

37,5 —

—

31,5 —

28,2 —

38 A. BRÜNEL. — MÉTABOLISME DE l’aZOTE PDRIQOE CHEZ LES CHAMPIGNONS

DURÉE

de fermentation.

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

ALLANTOÏNE

transformée

Total.

préexistant.

de fermentation.

5

38,8 mgr.

6 mgr.

32,8 mgr.

29,4 o/o

7

38,8 —

—

32,8 —

29,4 —

E, 1 h.

44,7 —

—

38,7 —

34,4 —

2

48,6 —

—

42,6 —

38,2 —

3

52,3 —

—

46,3 —

41,5 —

4

55,3 —

—

49,3 —

44,2 —

5

55,8 —

—

49,8 —

44,6 —

7

56,0 —

—

50,0 —

44,8 —

E., 1 h.

40,2 —

—

34,2 —

30,7 —

2

46,3 —

—

40,3 —

36,1 —

3

49,4 —

—

43,4 —

38,9 —

4

51,7 —

—

45,7 —

41,0 —

5

52,6 —

—

46,6 —

41,8 —

7

52,9 —

46,9 —

42,1 —

La marche de l’hydrolyse enzymatique est

rapide pendant les premiers moments de l’ac¬

tion, puis l’activité de l’allantoïnase diminue,

finit par s’annuler, et la courbe représenta¬

tive devient une droite parallèle à l’axe des x.

En présence de sesqui-carbonate d’ammo¬

nium, l’hydrolyse atteint 45 % de l’allantoïne

mise en expérience ; à pH 7,6, elle est de 42 %

et en l’absence de sels 29 % seulement.

On retrouve des courbes de même allure si

l’on s’adresse à un enzyme d’origine diffé¬

rente, enzyme de Collybia maculata ou de

Clitocybe infundibuliformis. Après cinq heures,

en milieu aqueux, à 39°, l’allantoïnase est pra¬

tiquement inactivée ; nous nous proposons

de démontrer que ce fait peut être expliqué

par la rapide destruction de l’enzyme en milieu

aqueux.

Fig. 3.

7

SUR QUELQUES PROPRIÉTÉS DE L’ALLANTOÏNASE DES CHAMPIGNONS

39

E. — Allantoïnase de Collybia maculata. Sa destruction

en milieu aqueux.

On abandonne cinq heures au bain d’eau à 39°, en tubes à centrifuger, des

milieux :

Ej

Eau.9 cc.

Poudre de Collybia maculata .0,10 gr.

Chloroforme.Y gouttes.

Après refroidissement rapide on ajoute 1 cc. d’une solution d’allantoïne

à 1 % 0 , soit une teneur finale de 0,1 % 0 en cet uréide. On prépare des expé¬

riences E 2 de composition identique à E,, mais n’ayant pas subi Faction de

l’eau à 39° pendant cinq heures. Les milieux E, et E 2 sont alors placés au

bain d’eau à 39° et après trois heures de fermentation on dose l’acide allan-

toïque dans Ei E 2 (on tiendra compte de l’acide allantoïque préexistant, que

l’on dosera dans Ei E. avant fermentation).

Résultats :

DURÉE

ACIDE ALLANTOÏQUE

PAR LITRE

ALLAN-

de

TOÏNE

fermentation.

Total.

préexistant.

fermentation.

transformée.

Expériences E x (5 h. à39°).

3 h.

20,5 mer.

18,5 mgr.

2,0 mgr.

1,8 %

3

21,7 —

—

3,2 —

2,8 —

—

3

20,0 —

—

1,5 —

1,3 —

Expériences E..

3

32,4 —

17,4 mgr.

15,0 —

13,4 —

. .

3

31,9 —

—

14,5 —

13,0 —

. .

3

33,6 —

—

16,2 —

14,0 —

Cinq heures de contact avec l’eau suffisent donc pour inactiver presque

complètement l’allantoïnase de Collybia maculata (expériences E,). Ceci

explique pourquoi l’hydrolyse enzymatique se ralentit si rapidement avec le

temps et justifie les faibles transformations que nous avons observées précé¬

demment.

Influence du sesqui-carbonate d’ammonium sur la destruction

de l’allantoïnase en milieu aqueux. — Les expériences ont été conduites

comme les précédentes, mais les milieux fermentaires sont pourvus au préa¬

lable de 2 % 0 de sesqui-carbonate d’ammonium.

40 A. BRUNEL. - MÉTABOLISME DE l’AZOTE PURIQÜE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Résultats :

DURÉE

ACIDE ALLANTOÏQUE

PAR LITRE

ALLAN-

do

de

fermentation.

TOÏNE

fermentation,

Total.

préexistant.

transformée.

Expériences ER5 h. à39°).

3 h.

3

29,8 mgr.

31,2 —

20,8 mgr.

9,0 mgr.

9,4 —

8,0 %

8,4 —

_

3

32,5 —

—

10,7 —

9,6 —

Expérience Ej.

3

43,4 —

43,6 —

17,4 mgr.

26,0 —

26,2 —

23,3 —

23,5 —

. .

3

44,4 —

27,0 —

24,2 —

L’enzyme se détruit au cours de la macération, au contact de l’eau ; la pré¬

sence de sesqui-carbonate d’ammonium le protège dans une certaine mesure

contre cette altération. En l’absence de ce

sel, pour l’allantoïnase de Collybia mandata,

la destruction est pratiquement complète

après cinq heures de contact avec l’eau ; en

sa présence l’hydrolyse enzymatique, bien

que ralentie, se manifeste encore nette¬

ment.

Une autre preuve qu’il s’agit bien d’une

destruction de l’enzyme en milieu aqueux

nous est donnée par l’expérience suivante :

ajoutons, quand la réaction se ralentit, à

la cinquième heure par exemple, une nou¬

velle quantité de poudre fermentaire ; im¬

médiatement la réaction repart. C’est ce

que montre bien le graphique suivant,

avec les points de rebroussement au moment

de la nouvelle addition de l’enzyme. Après

cinq heures de fermentation à 39°, les mi¬

lieux E, (sans sesqui-carbonate d’ammo¬

nium) et E. (avec 2 % 0 de sesqui-carbonate

d’ammonium) ont reçu 1 % de poudre

fermentaire. Le dosage de l’acide allantoïque est effectué après deux heures

de fermentation. Courbes I et II (figure 4).

SUR QUELQUES PROPRIÉTÉS DE l’ALLANTOÏNASE DES CHAMPIGNONS

41

DURÉE

ACIDE ALLANTOÏQUE

PAR LITRE

ALLAN-

de

fermentation.

Total.

préexistant.

de

fermentation.

TOÏNE

transformée.

Expérience E,.

5 + 2 h.

63,4 mgr.

34,8 mgr.

28,6 mgr.

25,6 %

Expérience E.

5 + 2 h.

77,9 —-

—

38,3 —

34,3 —

F. — Influence de la concentration en allantoïne sur la marche

de l'hydrolyse enzymatique.

Nous étudierons l’influence de la concentration en allantoïne :

a) En l’absence de sel ammoniacal,

b) En présence de 2 0 j 00 de sesqui-carbonate d’ammonium.

a) On place au bain d’eau à 39°, dans des tubes à centrifuger, des milieux

de composition :

Solution d’allantoïne de titre variable.5 cc.

Poudre d e Pluteus patricius .0,05 gr.

Durée de fermentation.1-9 heures.

Chloroforme.V gouttes.

Dosage de l'acide allantoïque. — Après des temps déterminés, les milieux

sont déféqués par le tungstate de sodium et l’acide sulfurique, centrifugés

filtrés et amenés à un volume connu (50.500 cc.), en tenant compte de la

teneur initiale en allantoïne, pour que l’acide allantoïque à doser reste infé¬

rieur à 15 mgr. par litre. Au-dessus de cette concentration, l’absorption au

spectrophotomètre serait trop forte et ne permettrait pas de faire la lecture.

Les résultats sont consignés dans le tableau I et les courbes I, II (figure 5).

Tableau I

DURÉE

de fermentation.

TITRE

do la solution

d’allantoïne.

ACIDE AL

Total.

LANTOÏQUE P

préexistant.

AR LITRE

de fermentation.

ALLANTOÏNE

transformée.

1 h.

0,05 gr.

0,0161 gr.

0,006 gr.

0,0101 gr.

18,1 %

—

0,10 —

0,0326 —

—

0,0266 —

23,8 —

—

0,25 —

0,056 —

—

0,050 —

17,9 —

—

0,50 —

0,099 —

—

0,093 —

16,7 —

—

1,00 —

0,170 —

—

0,164 —

14,7 —

—

2,00 —

0,268 —

—

0,262 —

11,7 —

9 h.

0,05 —

0,0239 —

—

0,0178 —

31,9 —

—

0,10 —

0,0398 —

—

0,0338 —

30,2 —

—

0,25 —

0,088 —

—

0,082 —

29,9 —

—

0,50 —

0,173 —

—

0,167 —

29,7 —

—

1,00 —

0,256 —

—

0,250 —

22,3 —

2,00 —

0,405 —

0,399 —

17,8 —

42 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE l’AZOTE PURIQÜE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Nous constatons que pour un titre en allantoïne inférieur à 0,5 gr. par litre

a quantité d’acide allantoïque engendrée est proportionnelle à la concentra¬

tion de l’allantoïne mise en expérience; pour des titres supérieurs la courbe

s’infléchit nettement, la proportionnalité n’existe plus. Ce fait est dû au chan¬

gement de la réaction de milieu causée par la forte proportion d’acide allan¬

toïque défavorable à la fermentation. Cette influence de la réaction de milieu

peut être mise en évidence si, au milieu fermentaire normal, on ajoute du ses-

qui-carbonate d’ammonium ou si l’on opère au pH optimum 7,6.

b) On place au bain d’eau à 39°, dans des tubes à centrifuger, des milieux

fermentaires de composition :

Solution d’allantoïne de titre variable + 2 °/ 00 de

sesqui-carbonate d’ammonium.5 cc.

Poudre de Pluteus patricius .0,05 gr.

Durée de fermentation.1-9 heures.

Chloroforme.V gouttes.

Les résultats sont résumés dans le Tableau II et les courbes I, II

{figure 6).

SCR QUELQUES PROPRIÉTÉS DE l’alLANTOÏNASE DES CHAMPIGNONS

Tableau II

43

DURÉE

de fermentation.

TITRE

de la solution

d’allantoïne.

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

ALLANTOÏNE

transformée.

Total.

préexistant.

de fermentation.

1 h.

0,05 gr.

0,0226 gr.

0,006 gr.

0,0166

gr.

29,8 %

—

0,047 —

—

0,0387

—

34,7 —

—

0,25 —

0,089 —

—

0,083

—

29,8 —

—

0,170 —

—

0,164

—

29,4 —

—

0,326 —

—

0,320

—

28,7 —

—

1,50 —

0,446 —

—

0,440

—

26,3 —

—

2,00 —

0,493 —

—

0,487

—

21,8 —

9 h.

0,05 —

0,0345 —

—

0,0285

—

51,1 —

—

0,10 —

0,0616 —

—

0,0556

—

49,9 —

—

0,25 —

0,157 —

—

0,151

—

54,1 —

—

0,50 —

0,298 —

—

0,292

—

52,4 —

1,00 —

0,620 —

—

0,614

—

55,0 —

1,50 —

0,850 —

—

0,844

—

51,1 —

—

2,00 —

1,056 —

1,050

—

47,0 —

A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE l’aZOTE PUR1QUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

La présence de sesqui-carbonate d’ammonium qui joue le rôle de tampon

dans le milieu fermentaire régularise la réaction :

.Allantoïnase

Allantoïne-►

Acide allantoïque.

Nous avons déjà vu qu’il empêche dans une certaine mesure la destruction

de l’enzyme en milieu aqueux.

Pour l’allantoïnase, conformément à l’hypothèse de Michaelis et Menten,

on peut admettre l’existence d’une combinaison enzyme-substrat premier

stade de l’allantoïnolyse, où l’allantoïnase serait inaltérable. Si nous repré¬

sentons par A l’allantoïnase, (S) le substrat, on peut envisager le cycle de

réactions :

(1) A + (S) = A(S).

(2) A(S) + H-'O -= (S • H 2 0) + A.

L’enzyme ainsi libéré (équation 2) rentre à nouveau en réaction.

G. — Influence de la concentration en poudre fermentaire

sur la marche de l’hydrolyse enzymatique.

Conditions expérimentales :

Solution d’allantoïne à 0,1 % 0 + 2 % 0 de sesqui-car¬

bonate d’ammonium.5 cc.

Teneur en poudre fermentaire de Pluleus patricius . . Variable.

Durée de fermentation.1 heure.

Chloroforme.V gouttes.

L’acide allantoïque est dosé par spectrophotométrie. Les résultats sont

consignés dans le tableau I et la courbe II (figure 7).

Tableau I

TENEUR

en poudre

fermentaire.

AC’DE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

ALLANTOÏNE

transformée.

Total.

préexistant.

de fermentation.

0,1 %

0,25 —

0,50 —

0,75 -

1,00 —

1,25 —

1,50 —

2,00 —

3,00 —

5,00 —

4,25 mgr.

9,95 —

21,35 —

32,25 —

41,90 —

46,50 —

50,30 —

55,40 —

59.80 —

66.80 —

0,6 mgr.

1.5 —

3,0 —

4.5 —

6,0 —

7.5 —

9,0 —

12,0 —

18,0 —

30,0 —

3,65 mgr.

8,45 —

18,35 —

27,75 —

35,90 —

39,00 —

41,30 —

43,40 —

41.80 —

36.80 —

3,2 %

7,6 —

16.4 —

24.9 —

32,2 —

35,0 —

37,0 —

38.9 —

37.5 —

33,0 —

SDH QUELQUES PROPRIÉTÉS DE L’ALLANTOÏNASE DES CHAMPIGNONS

4o

La transformation de F allant,oïrie en acide allantoïque est proportionnelle

à la concentration en poudre fermentaire pour des teneurs inférieures à 10 gr.

par litre. Pour les teneurs supérieures à 10 % 0 on constate un freinage progressif

de la vitesse de réaction ; on peut l’attribuer au changement de la réaction

de milieu.

II. — Essais de purification et de concentration de l’allantoïnase

des Champignons.

Deux sortes de méthodes ont été étudiées :

1° Méthode par adsorption et élution,

2° Méthode par précipitation.

1° Méthode par adsorption et élution.

Dans ces dernières années Willstaetter (71) a publié de nombreux mé¬

moires concernant la purification et la concentration des enzymes par adsorp¬

tion. Il est arrivé à des séparations et à des purifications remarquables des

enzymes pancréatiques par une série d’adsorptions sélectives sur alumine

et sur kaolin.

L’ailantoïnase des champignons est-elle purifiable par de semblables pro¬

cédés ? Nous avons étudié l’adsorption de cet enzyme par le kaolin activé

et l’alumine, préparés d’après Willstaetter et nous avons obtenu les résul¬

tats suivants :

L’adsorption de l’allantoïnase sur kaolin se fait mal, quelquefois pas du

tout (cas de l’enzyme d ’Armillariella mellea) ; la substitution de l’alumine

au kaolin comme adsorbant ne conduit pas à de meilleurs résultats. L’acti¬

vité allantoïnolytique des éluats est toujours plus faible que celle de la poudre

46 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

fermentaire dont on part. On ne peut donc envisager J a concentration et

la purification de l’allantoïnase des Champignons par les seuls procédés d’ad-

sorption.

2° Méthode par précipitation.

Parmi les solvants les plus habituellement usités pour la précipitation des

enzymes en solution aqueuse, il faut citer l’éthanol et la propanone pure. Nous

avons étudié la précipitation par

1. La propanone pure,

2. Un mélange : propanone (2 vol.), éthanol (1 vol.),

3. Éthanol à 96°.

Nous avons dû abandonner les deux premiers modes de précipitation.

Malgré le temps très court de contact, l’allantoïnase est inactivée presque

totalement par la propanone. Dans le cas du mélange « éthanol-propanone »

la centrifugation se fait mal, la liqueur reste trouble, le précipité adhère aux

parois du tube et ne se rassemble que difficilement.

La précipitation par l’éthanol n’offre pas de tels inconvénients; l’action

nocive du mélange « éthanol-eau » est beaucoup moins marquée, on obtient

un produit qui se lave bien à l’éther et qui se détache facilement.

Précipitation par l'éthanol à 96° des macérations aqueuses de poudre de cham¬

pignon. — On prépare une macération à 1 /10 e de poudre de champignon,

en présence de chloroforme. Après quatre heures d’abandon à la glacière,

on centrifuge. La liqueur trouble, fortement refroidie, est précipitée par cinq

fois son volume d’éthanol à 96° glacé ; on centrifuge très rapidement, on

lave deux fois le précipité par centrifugation à l’éther anhydre glacé et on

sèche dans le vide sur chlorure de calcium. Pour obtenir une dessiccation

rapide nous utilisons une cloche de grande capacité (50 litres) et un vide

très poussé, obtenu avec la pompe à huile de Gaiffe.

Le rendement est en général peu élevé. Nous avons obtenu :

4 % pour la poudre de Coprinus stercorarius et de Clitocybe infundibuli-

formis.

2 % pour la poudre de Pluteus patricius et de Coprinus micaceus.

1,2 à 1 % pour la poudre de Pleurotus ostreatus et de Pleurotus eryngii. La

macération aqueuse de poudre d ' Armillariella mellea ne nous a donné qu’un

très faible précipité sans activité sur l’allantoïne.

Activité des poudres fermentaires obtenues sur l'allantoïne. — Nous avons

mesuré l’activité de ces poudres sur une solution d’allantoïne à 0,1 gr. par

litre, en présence de 2 % 0 de sesqui-carbonate d’ammonium, et de 1 % de

poudre fermentaire.

A étant l’activité initiale (pourcentage d’allantoïne transformée en acide

allantoïque en une heure) des poudres de champignon, A, celle de la poudre

obtenue par précipitation alcoolique, le tableau suivant permettra de com¬

parer les résultats obtenus.

SUR QUELQUES PROPRIÉTÉS DE L’ALLANTOÏNASE DES CHAMPIGNONS

47

CHAMPIGNONS ÉTUDIÉS

A

A,

Coprinus stercorarius .

50,4

63,2

Clitocybe infundibuliformis .

48,5

59,4

Pluteus patricius .

34,4

41,2

Coprinus micaceus .

30,5

40,7

Collybia maculata .

16,7

25,8

Collybia distorta .

20,2

25,8

Pleurotus ostreatus. .

6,5

12,0

Pleurotus eryngii .

8,7

13,0

Armillariella mellea .

11,6

0

Par précipitation alcoolique des macérations aqueuses de poudre de cham¬

pignon, on obtient un précipité dont l’activité allantoïnolytique est nette¬

ment plus élevée. Cependant dans certains cas (Armillariella mellea) on est

conduit à un échec.

Une deuxième précipitation alcoolique ne conduit pas à l’obtention d’une

poudre (d’activité A.) plus riche en allantoïnase. On constate au contraire

que Ao < A x et le rendement est encore diminué. Dans ces conditions l’in¬

fluence nocive de l’éthanol inactive pratiquement l’enzyme.

/. — Sur la spécificité de l’allantoïnase des Champignons.

Le caractère de spécificité des enzymes a été reconnu en 1893 par Emil

Fisher. Pour expliquer cette importante propriété E. Fisher émit l’hypo¬

thèse que les catalyseurs biochimiques devaient posséder des radicaux défi¬

nis, caractéristiques, capables de se combiner au substrat.

Cette théorie de la combinaison préfermentaire enzyme-substrat , précisée

par Brown et développée par Y. Henri, a reçu les premières confirmations

expérimentales par Michaelis et Menten (54) dans leur étude sur la sac-

charase de levure.

Depuis, de nombreux travaux ont confirmé les résultats obtenus par ces

auteurs et montré que la possibilité d’une telle combinaison était aussi sous

la dépendance de la structure du substrat ; l’introduction, dans la molécule

attaquée par l’enzyme, de certains radicaux (CH 3 , CH 3 .CO, C 6 H 8 .CO..., etc.),

empêche toute action fermentaire.

Nous avons vu que l’action de l’allantoïnase sur l’allantoïne consistait en

I I

l’ouverture de la chaîne CO — NH du noyau glyoxalinique de cet uréide par

fixation d’une molécule d’eau. Ayant à notre disposition de la (3- ou 3-méthyl-

allantoïne de Beiirend et Zieger,

48 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PÜRIQOE CHEZ LES CHAMPIGNONS

N H- CO — N — CH 1

CO CO

I I

NH — CH — NH

a

o

nous nous sommes proposé d’étudier l’influence qu’entraîne la substitution par

le radical méthyle de l’hydrogène du groupe NH en position 3 et de voir si

la [3-méthylaUantoïne est hydrolysable par l’allantoïnase des Champignons.

Avant de commencer cette étude rappelons quelques propriétés de la

p-méthylallantoine. Comme i’allantoïne, la .3-mélhylallantoïne est hjdrolysée

par la potasse; le produit obtenu est constitué par le (S-méthylallantoate

de potassium

NH 2 CO — N — CIO

CO

I

CO

+ HOK

NH — CH — NH

NH 4

I

CO

I

NH

NH CH 1

I

COOK CO

I I

CH-NH

qui, sous l’action des acides, donne de l’urée, de la méthylurée et de l’acide

glvoxylique ;

NH 4

NH • CH’

N H 2 NH

1

CO

COOK

1

CO

+ C1H-MTO l 0+( lo

NH -

-CH-

1

- NH

| |

NH 4 NH

COOH

+ Cl K

CHO

l’acide glyoxylique pouvant être facilement caractérisé par la réaction colorée

de Fosse et Hieulle et l’urée, par sa combinaison dixanthylée.

Action de l’allantoïnase de COPRINUS STERCORARIUS sur i.a

|5-méthylallantoïne.

On place au bain d’eau à 39° des milieux de composition :

E, E 2

Solution de p-méthylallantoïne à 1 % 0 . 20 cc. —

Solution de [wnéthylallantoïne à 1 % 0 à

pH 7,3. — 20 cc.

Poudre de Coprinus stercorarius (Champi¬

gnon récolté très jeune, non sporulé). . 0,2 gr. 0,2 gr.

Chloroforme.V gouttes V gouttes.

Après 1, 2, 3 heures de fermentation, on ne décèle pas dans les milieux E,

et E» la formation d’acide [J-méthylallantoïque.

SUR QUELQUES PROPRIÉTÉS DE l’ALLAN TOÏNASE DES CHAMPIGNONS

49

L’allantoïnase de la poudre de Coprinus stercorarius ne possède donc pas

la propriété d’ouvrir la chaîne de la [B-méthylallantoïne. L’étude de Faction

des poudres fermentaires de Clitocybe infiindibuliformis , de Coprinus mica-

ceus, de Collybia maculala et de Collybia distorta conduit au même résultat.

Conclusions. — L’allantoïnase est donc bien spécifique de l’allantoïne;

elle ne possède aucune action sur la 3-métliylallantoïne.

Si l’on compare les formules de l’allantoïne (1) et de la (3-méthyl al lantoïne (2)

( 1 )

NH 2 CO

CO

NH — CH

NH

CO

NII

NH- CO — N — CH 2

( 2 )

CO

N H

CO

I

Ch — nh

on constate que l’introduction dans la molécule de l’allantoïne d’un groupe

méthyle en position (s suffit pour empêcher toute action enzymatique. Ce

fait démontre que, comme on était en droit de le supposer, la combinaison

préfermentaire allantoïne-allantoïnase se fait par l’intermédiaire du groupe-

1 I

ment CO — NII du noyau glyoxalinique de cet uréide.

Pour expliquer la différence d’action de l’enzyme sur l’allantoïne et la

p-méthylallantoïne nous émettons l’hypothèse quela fixationde l’allantoïnase

I I

se fait après énolisation du groupement CO — NH de l’allantoïne,

NH 2

I

CO

I

NH —

CO —NH

I

CO

I

CH — NH

NH 2

I

CO

OH

!

C = N

I

CO

!

NH — CH —NH

cette énolisation diminuant la stabilité de la molécule et favorisant la fixa¬

tion de l’enzyme.

Au contraire, pour la (5-méthylallantoïne, l’énolisation est impossible par

suite de l’absence d’hydrogène rattaché à l’atome d’azote voisin de CO;

la combinaison enzyme-substrat ne peut alors avoir lieu ce qui entraîne

l’absence de dégradation enzymatique.

Mémoirks du muséum, nouvelle série, lome VI.

CHAPITRE III

RECHERCHES SUR L ACTIVITÉ DE L’ALLANTOIN ASE

DES CHAMPIGNONS

A. — Activité de l'allantoïnase des Champignons.

L’activité allantoïnolytique d’une poudre fermentaire de champignon s’ap¬

précie par la quantité d’allantoïne qu’elle est susceptible de transformer en

acide allantoîque dans des conditions nettement déterminées.

A cet effet, et en nous appuyant sur les propriétés biochimiques précédem¬

ment établies de l’allantoïnase, nous avons employé une solution aqueuse

contenant 100 mgr. d’allantoïne et 2 gr. de sesqui-carbonate d’ammonium

par litre. Dans un volume V connu de solution, on introduit 1 % de poudre

fermentaire (0,1 gr. pour 10 cc. par exemple) et on maintient le tout pendant

une heure au bain d’eau à 39°. On détermine ensuite la quantité d’allantoïne

transformée. Le pourcentage A de transformation représente Vactivité allantoï¬

nolytique de la poudre fermentaire.

Il importe de faire remarquer que dans ces conditions il reste toujours

de l’allantoïne non transformée. Le nombre A exprimant l’activité sera donc

constamment inférieur à 100.

Cette activité dépend, comme nous le démontrerons, de l’état de développe¬

ment du carpophore; elle n’a donc pas une valeur absolue, mais elle permet

de préciser l’ordre de grandeur des propriétés allantoïnolytiques, caracté¬

ristiques du végétal étudié.

Mesure de A. — Conditions expérimentales généralement utilisées :

Solution d’allantoïne à 0,1 gr. et 2 gr. de sesqui-carbo¬

nate d’ammonium par litre.5 cc.

Poudre fermentaire de champignon.0,05 gr.

Température.. . 39°

Toluène.V gouttes.

1° Solution d'allantoïne à 0,1 gr. par litre. — Obtenue par dissolution à

froid, de l’allantoïne chimiquement pure et très finement pulvérisée. On n’uti¬

lisera que des solutions préparées au moment de l’emploi.

RECHERCHES SUR L’ACTIVITÉ DE l’ALLANTOÏNASE DES CHAMPIGNONS

51

2° Poudre jermentaire. — Elle est constituée par le végétal (plusieurs exem¬

plaires du champignon en bon état) séché dans le vide sur chlorure de cal¬

cium, et soigneusement broyé au moulin et au mortier. Chaque fois qu’il est

possible nous indiquerons l’état de développement du carpophore (jeune,

âgé, sporulé) et, s’il y a lieu, l’endroit de la récolte.

La détermination de A sera faite sur différentes récoltes du même champi¬

gnon et, pour éviter les erreurs dues à l’affaiblissement avec le temps des pro¬

priétés allantoïnolytiques, immédiatement après dessiccation de l’échantillon.

3 0 Dosage de Vacide allantoïque.— L’acide allantoïque a été dosé par spectro-

photométrie. Si

a t représente l’acide allantoïque total en mgr. par litre après fermentation et

ai, l’acide allantoïque par litre apporté parla poudre fermentaire, l’acide allan¬

toïque de fermentation sera donné par

Ut - Up — Uf

et l’activité A sera :

A = a? X

allantoïne

acide allantoïque

= a f X

158

176

ar X 0,897.

Le tableau suivant résume les résultats obtenus et donne l’ordre de grandeur

de l’activité allantoïnolytique des champignons étudiés.

CHAMPIGNONS ÉTUDIÉS VALEUR DE A

POLYPOREAE.

Polyporus intybaceus , sporulé.25,6

— umbellatus, sporulé.22,6

Leucoporus Forquignoni, sporulé. 5,9-4,0

— brumalis, sporulé. 7,2-5,0

Melanopus squamosus, sporulé. 7,8

Phaeolus nidulans, sporulé . . ..20,4

Boleteae.

Boletus scaber , sporulé.26-29

—- appendiculatus ssp. regius, sporulé. 7,0

— gentilis, sporulé. 9,6

Xerocomus chrysenteron , sporulé. . 8,0

— subtomentosus, sporulé.24,4

Ixocomus granulatiis , sporulé.21,2

Gyroporus cyanescens, sporulé. 3,3

Tylopilus felleus , sporulé. 9,7

Paxilleae.

Paxillus atrotomentosus, sporulé. 3,0

— inoolutus, sporulé. . 8,0

52 A. BRUNEL. - MÉTABOLISME DE L’AZOTE PÜRIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Russulaceae.

Lactarius trivialis , sporulé. 4,8

— deliciosus, sporulé. 7,5

— subdulcis, sporulé. 9,2

— theiogalus, sporulé. 8,0

— chrysorheus, sporulé. 9,2

— pallidiis, sporulé. 8,5

— fuliginosus, sporulé. 8,9

— blennius, sporulé. 7,8

Rnssula foetens, sporulé. 8,8

— emetica, sporulé. 3,7

— aurata, sporulé.15,4

— cyanoxantha, sporulé. 5,0

— fragilis, sporulé. 4,3

— sardonia, sporulé. 7,3

— delica , sporulé. 4,4

— lepida, sporulé. 4,3

— xerampelina , sporulé. 6,6

— adusta, sporulé.10,3

—- lutea, sporulé.11,4

Agaricales. Rhodogoniosporeae.

Rhodophyllus clypeatus , sporulé.11,2

— nidorosus , sporulé. 4,5

— rhodopolius, sporulé. 7,4

— icterinus , sporulé.12,0

— lividus, sporulé. 5,6

solstitialis, sporulé.48,8

Tricholomaceae. Lentineae.

Lentinus tigrinus, sporulé. 5,8

— cochleatus , sporulé. 4,8

— degener , sporulé.13,2

Panns stipticus, sporulé. 6,1

Marasmieae.

Androsaceus vulgaris, sporulé.30,6

Marasmius rotula , sporulé.20,0

-— erythropus , sporulé. 5,9

Collybieae.

Mycena alcalina , sporulé.16,1

— pur a, sporulé. 7,7

— pelianthina, sporulé.19,7

— calopoda, sporulé. 6,2

RECHERCHES SDR L’ACTIVITÉ DE l’ALLANTOÏNASE DES CHAMPIGNONS

53

— inclinata, sporulé. 8,0

— polygramma , sporulé. 9,1

Collybia butyracea, sporulé.30,0

— maculata, sporulé.16,7

— distorta, sporulé. 20,2

— platyphylla, sporulé. 4,5

— fusipes, sporulé. 1,2

— velutipes, sporulé.15,3

— ambusta, sporulé.13,1

Mucidiila radicata, sporulé. 5,9

— mucida, sporulé. 7,0

Pleuroteae.

Pleurotus eryngii, sporulé. 8,7

— eryngii var. nebrodensis, sporulé. 9,8

— ostreatus, sporulé. 6,5

— ulmarius , sporulé. 7,4

— torulosus , sporulé.10,8

Crepidoteae.

Crepidotus mollis , sporulé. 26,9-24,6

Omphalieae.

Clitocybe cyathiformis , sporulé.48,2

— infundibuliformis, sporulé. 57,0-48,5

— nebularis, sporulé.25,0

— dealbata, sporulé. 6,1

— aurantiaca, sporulé.23,8

—- aurantiaca ssp. pallida, sporulé.17,8

— inversa, sporulé. 6,4

— tabescens, sporulé.12,8

:— brumalis, sporulé.16,1

Armillariella mellea, sporulé.11,6

Laccaria laccata, sporulé.11,4

Tricholomeae.

Tricholoma acerbum, sporulé. 9,0

— portentosum, sporulé. 8,0

rutilans, sporulé. 8,8

— equestre, sporulé. 6,5

— striatum, sporulé.11,6

gambosum, sporulé. 5,6

aggregatum, sporulé. 3,7

sulfureum , sporulé.12,8

A. BRUNEL. - MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQHE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Amanitaceae. Amaniteae.

Amanita phalloides, sporulé.10,5

— verna , sporulé. 9,0

— mappa, sporulé. 7,0

— citrina , sporulé. 8,7

— vaginata , sporulé. 2,7

— vaginata var. fulva , sporulé. 2,8

— spissa, sporulé. 5,1

— muscaria, sporulé. 9,2

—■ pantherina , sporulé. 7,8

— ovoidea, sporulé.10,5

— strobiliformis, sporulé. 6,7

— solitaria, sporulé. 7,0

Lepioteae.

Lepiota cinnabarina , sporulé.15,5

— clypeolaria, sporulé. 7,8-9,1

— cristata , sporulé.35,0

— helveola, sporulé.20,0

— acutesquamosa , sporulé.39,3

Pluteae.

Volvaria, speciosa , sporulé.37,5

Pluteus cervinus , sporulé.21,0-18,0

— cervinus var. patricius , sporulé.34,5

— cervinus var. eximius, sporulé.16,1

Cortinariaceae. Cortinarieae.

Cortinarius hinnuleus , sporulé. 9,9

— elatior , sporulé. 8,1

— dibaphus, sporulé.12,2

— eoerulescens, sporulé.10,3

— cyanites, sporulé.11,7

— glaucopus, sporulé.14,4

— fulgens , sporulé.19,7

— triumphans , sporulé. 9,2

— anomalus, sporulé.11,1

— brunneus , sporulé.12,5

1nocybe fastigiata, sporulé.11,5

-—- Bresadolae , porulé.18,5

— lacera, sporulé. 21,1

— napipes , sporulé.14,3

— lanuginosa, sporulé.15,5

Hebeloma crustuliniforme, sporulé. 7,0-4,4

radicosum , sporulé.10,4

anthracophilum, sporulé.10,3

RECHERCHES SUR L’ACTIVITÉ DE l’ALLANTOÏNASE DES CHAMPIGNONS 55

Pbolioteae.

Naucoria melinoides, sporulé.48,5

Flammula conissans , sporulé. 5,0

— sapinea , sporulé. 4,7

— alnicola, sporulé. 6,4

Pholiota praecox, sporulé.34,0

— cylindracea, sporulé.28,1

— dura , sporulé.28,9

— mutabilis, sporulé. 6,0

— squarrosa, sporulé. 5,3

— adiposa, sporulé. 6,9

— destruens, sporulé. 7,1

Rozites caperata, sporulé. 12,4

Nematolomeae.

Nematoloma fasciculare, sporulé. 7,3

sublateritium, sporulé. 6,0

capnoides, sporulé. 5,0

COPRINACEAE. PRATELLEAE.

Leucocoprinus excoria tus, sporulé.41,0

excoriatus var. mastoidea , sporulé.45,0

procerus, sporulé.40,0

— naucinus, sporulé.47,9

— rhacodes , sporulé.38,0

Bialula licmophora, sporulé, âgé.15,0

— caepestipes, non sporulé.40,0

Agaricus eampester, sporulé. 4,0

— silvaticus , sporulé.13,2

— exquisitus, sporulé. 5,0

— silvicola, sporulé..’.10,2

— xanthodermus , sporulé ..14,2

Stropharieae.

Stropharia aeruginosa, sporulé. 9,2

Hypholoma appendiculatum, sporulé.13,2

— hydrophilum , sporulé.12,0

lacrymabundum, sporulé. 15,0

Lacrymaria velutina, sporulé.13,1

Coprineae

Panaeolus campanulatus , sporulé.30,0

■— retirugis, sporulé.27,9

Psathyrella subatrata, sporulé.17,0-15,0

gracilis, sporulé.14,8-14,9

Pseudocoprinus disseminatus, sporulé. 50,9-45,0

ëü

A. BRIJNEL. - MÉTABOLISME DE l’AZOTE PÜRIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Psilocybe sarcocephala, sporulé.55,6

— foenisecii, sporulé.45,5

— uda, sporulé. 10,0

Coprinus comatus , non sporulé.24,8

micaceus, non sporulé.34,0

— picaceus, non sporulé.21,4

— plicatilis, non sporulé.57,7

— stercorarius, non sporulé.64,7

— lagopus , non sporulé.65,2

— atramentarius, non sporulé.31,1

L’activité allantoïnolytique ou encore la richesse en allantoïnase des diffé¬

rents champignons étudiés est très variable.

En général, les espèces appartenant aux genres : Clitocybe, Volvaria , Pho-

liota (groupe praecox ), Leucocoprinus, Hiatula, Panaeolus, Pseudocoprinus,

Psilocybe et Coprinus, possèdent un enzyme particulièrement actif sürl’àllan-

toïne.

Au contraire, les espèces appartenant aux genres : Leucoporus , Melanopus,

Paxillus, Lactarius , Russula , Lentinus , Pleurotus, Tricholoma , Amanita > Cor-

tinarius , Flammula, Pholiota (groupe squarrosa), Nematoloma, etc., sont

pauvres en allantoïnase.

Nous allons voir que l’état de développement du carpophore a une influence

très nette sur la valeur de l’activité allantoïnolytique.

B. — Variation de l’activité de l’allantoïnase avec l’état

de développement du carpophore chez Coprinus micaceus Fr. ex Bull.

et Coprinus stercorarius Fr. ex Bull.

La notion d’activité de l’allantoïnase nous a permis de faire l’étude compa¬

rative de cet enzyme chez les Champignons. Il était intéressant de voir ce que

devient F allantoïnase et quelles sont les variations de son activité avec l’évo¬

lution du carpophore.

A priori , il est difficile de définir l’état de développement d’un champignon,

car on ne possède guère de critérium permettant de le déterminer avec préci¬

sion. Cependant, cette difficulté peut être tournée dans une certaine mesure,

en s’adressant à des champignons à spores colorées (Coprinus micaceus ,

Coprinus stercorarius) dont il est relativement facile d’indiquer les caractéris¬

tiques.

Variation de l’activité allantoïnolytique de COPRINUS MICACE US

avec l’état de développement du carpophore. — Nous avons récolté au

voisinage de Robinia pseudoacacia , quatre échantillons moyens de Coprinus

RECHERCHES SÜR L’ACTIVITÉ DE L’ALLANTOÏNASE DES CHAMPIGNONS S7

micaceus ; après séparation du péridium et du st.ipe, on procède à la dessicca¬

tion dans le vide sur chlorure de calcium pendant vingt-quatre heures, puis

au broyage au moulin et au mortier. Les poudres fermentaires provenaient

d’échantillons ayant les caractéristiques suivantes :

1. Végétal jeune, non sporulé, lamelles blanches . . . . Chapeau,

t'. — — — .... Stipe.

2. Végétal à spores naissantes, lamelles grises.Chapeau.

2'. — — — .Stipe.

3. Végétal sporulé, lamelles brunes.Chapeau.

3'. — — .Stipe.

4. Végétal mûr, lamelles déliquescentes.Chapeau.

4. — — .Stipe.

Mesure de A. — La mesure de l’activité est effectuée avec ces poudres fer¬

mentaires en suivant la technique déjà décrite. On tiendra compte, dans la

valeur de A, de la teneur en acide allantoïque de la poudre fermentaire que l’on

déterminera par un dosage préliminaire.

Les résultats sont consignés dans le tableau suivant.

ÉCHANTILLON

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

VALEUR

de A.

Total.

préexistant.

de fermentation.

1. Chapeau.

46,9 mgr.

9,2 mgr.

37,7 mgr.

33,7

2. —.

55,0 —

16,9 —

38,1 —

34,9

3. — .

52,0 —

27,0 —

25,0 —

22,3

4. — .

57,2 —

33,2 —

24,0

21,5

1'. Stipe.

24,1 —

0,0 —

24,1 —

21,6

2'. — .

26,2 —

0,0 -

26,2 —

23,4

3'. — .

17,8 —

3,9 —

13,9 —

12,4

4'. — .

33,1 —

16,8 —

16,3 -

14,6

Nous avons effectué la même série d’expériences avec Copriniis stercorarius,

les échantillons étudiés avaient les caractéristiques :

1. Champignon très jeune, carpophore à stipe non diffé¬

rencié.

2. Champignon jeune, non sporulé, lamelles blanches. . Chapeau.

2'. — — — . . Stipe.

3. Champignon sporulé, lamelles brunes.Chapeau.

3. — — — .Stipe.

4. Champignon âgé, lamelles déliquescentes.Chapeau.

4'. — — — .Stipe.

58 A. BRDNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Mesure de A. — Résultats :

ÉCHANTILLON

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

VALEUR

de A.

ToLal.

préexistant.

de fermentation.

1. Total.

54,4 mgr.

0 mgr.

56,4 mgr.

50,4

2. Chapeau .

62,3 —

4,2 —

58,1 —

52,0

3. — .

79,6 —

31,9 —

47,7 —

42,7

4. — .

75,6 —

35,8 —

38,8 —

35,6

2 Stipe.

46,1 -

0 —

46,1 —

41,2

3'. —.

46,2 —

5,7 —

40,5 —

36,2

4'. —.

44,2 —

6,3 —

37,9 —

33,9

L’étude de Coprinus micaceus et de Coprinus stercorarius pris à des stades

de développement différents permet de constater que

1° L’enzyme allantoïnase existe dans le végétal aux différents stades du

développement.

2° L’activité allantoïnolytique est maximum chez le champignon jeune,

non sporulé, puis elle diminue régulièrement, en corrélation avec l’évolution

du carpophore.

Ces faits présentent une grosse importance pour la détermination de A ;

ils montrent qu’il est indispensable de faire sa mesure sur différents échantillons

du même végétal. Nous nous sommes demandé si ces variations se retrouvent

sur des récoltes faites à des moments variés au cours de la végétation d’une

année. C’est ce que nous allons nous proposer de rechercher.

C. — Recherches sur les variations de l’activité de T allantoïnase

de Coprinus micaceus, au cours de la végétation d’une année.

Au voisinage de Robinia pseudoacacia, du printemps à l’automne 1934,

nous avons effectué de nombreuses récoltes de Coprinus micaceus à différents

stades de développement, dans le but d’étudier si l’activité de l’allantoïnase

de ce champignon présente une certaine fixité ou si, au contraire, on assiste à

des variations importantes de A au cours des récoltes faites sur la végétation

d’une année.

Le végétal récolté à l’état jeune (non sporulé) et âgé (sporulé) a été rapide¬

ment séché dans le vide sur chlorure de calcium, puis réduit en poudre fine.

Le matériel expérimental répondait aux caractéristiques suivantes :

1. Champignon jeune, non sporulé, lamelles blanches. . Chapeau.

1. — — — . . Stipe.

2. Champignon âgé, sporulé, lamelles déliquescentes. . Chapeau.

2'. — — — . . Stipe.

RECHERCHES SUR L’ACTIVITÉ DE l’aLLANTOÏNASE DES CHAMPIGNONS 59

Mesure de A. — Elle est effectuée sur ces poudres fermentaires en tenant

compte de l’acide allantoïque préexistant dans le végétal étudié. Les résultats

sont consignés dans le tableau suivant et sur les graphiques de la figure 8.

DATE

de la récolte.

VALEUR DE A

Champignon

non sporulé.

Champignon sporulé.

Chapeau 1.

Stipe 1’.

Chapeau 2.

Stipe 2’.

10 mai 1934 ....

30,6

22,8

18,8

14,3

15 mai 1934 ....

31,6

21,5

17,5

13,3

30 mai 1934 ....

30,0

19,2

17,2

13,9

4 juin 1934 ....

36,7

22,2

19,4

15,5

21 juin 1934 ....

35,1

20,6

17,2

13,2

30 juin 1934 . . . .

33,7

20,4

18,7

12,7

20 juillet 1934 . . .

34,3

23,0

19,8

13,9

10 septembre 1934 .

32,0

20,1

19,6

13,2

27 septembre 1934 .

34,6

21,3

20,0

14,4

5 octobre 1934. . .

32,0

20,1

19,6

13,2

12 octobre 1934. . .

31,0

21,0

20,1

13,7

10 novembre 1934 . .

30,0

19,0

20,2

12,4

Les variations que présente l’activité allantoïnolytique (ou encore la

10 ■[ C. rrucccfui sp Stipe

Sia, Ju,n Juillet Jour Septembre Octobre

Fig. 8.

richesse en allantoïnase) de Coprinus micaceus, au cours de récoltes faites du

printemps à l’automne 1934 *, peuvent être considérées comme négligeables

comme le montre bien le graphique précédent.

i. lin été on constate une poussée rapide de Coprinus micaceus', le cycle complet cham¬

pignon jeune non sporulé. à champignon âgé sporulé, est atteint en trois jours, tandis

qu'en automne la fructification est lente, elle demande quelquefois huit jours (novembre).

60 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PCRIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

D. — Localisation de l’allantoïnase.

La mesure de l’activité de l’allantoïnase nous a permis d’étudier la locali¬

sation de cet enzyme chez quelques espèces.

Les différentes parties du carpophore, hyménium, chapeau total (chapeau

-j- hyménium), stipe, et dans certains cas le mycélium, ont été successive¬

ment examinées. La méthode suivie est celle de la détermination de A.

Les principaux résultats sont résumés dans le tableau suivant :

CHAMPIGNONS ÉTUDIÉS

VALEUR DE

A

Mycélium,

Chapeau

total.

Chapeau.

Hyménium.

Stipe.

Boletus scaber .

»

7,6

36,7

7,8

— luridus .

»

))

0

14,3

0

— calopus .

»

))

0

23,0

0

— aurantiacus .

»

))

10,4

28,6

8,0

Xerocomus subtomentosus . . .

»

18,8

26,5

16,5

Tylopilus felleus .

»

3,6

13,3

3,0

Paxillus atrotomenlosus ....

»

0

4,7

0

Russula vesca ..

»

9,0

))

0

Rhodophyllus lividus .

»

5,0

»

6,4

0

Collybia platyphylla .

0

5,8

»

7,0

0

— dryophila .

))

30,6

))

»

5,4

Clitocybe infundibuliformis . .

»

52,7

»

39,3

— viridis .

))

14,8

))

»

6,3

Armillariella mellea .

0

12,0

»

)»

3.8

Tricholoma aggregatum ....

»

6,0

3,0

9,5

0

Amanita verna .

»

10,5

»

)>

0

— rubescens .

»

4,5

1)

)>

0

Pholiota mutabilis .

))

5,7

»

))

2,5

Volvaria speciosa .

))

38,4

»

26,0

H iatula caepestipes .

0

40,0

»

)»

27,0

Agaricus campester .

0

4,5

))

»

0

— exquisitus .

»

5,8

»

)'

0

Coprinus micaceus .

»

34,9

))

M

25,0

— stercorarius ....

0

52,0

»

33,9

Mycélium. — Le mycélium d ’Agaricus campester, de Collybia platyphylla ,

d 'Hiatula caepestipes, de Coprinus stercorarius et les rhizomorphes d 'Armilla-

riella mellea ne possèdent aucune activité allantoïnolytique.

L’allantoïnase ne commence à apparaître que dans le primordium, lors de

l’ébauche du jeune carpophore, comme nous avons pu le constater sur de

nombreuses récoltes de Coprinus stercorarius.

Hyménium. — Chez le champignon évolué, l’allantoïnase se localise plus

particulièrement dans la partie reproductrice du carpophore, l’hyménium, où

elle manifeste une grande activité.

Chapeau et stipe. — Le chapeau et le stipe des champignons (Clitocybe

RECHERCHES SUR l’aCTIVITÉ DE L’ALLANTOÏNASE DES CHAMPIGNONS

61

infundibuliformis, Coprinus stercorarius...) possédant une grande activité

allantoïnolytique sont aussi riches en allantoïnase ; mais l’activité de l’enzyme

du chapeau et du stipe est toujours moins élevée que celle de l’hyménium

correspondant.

Enfin, dans de nombreux cas, le stipe a une activité enzymatique très faible

et même souvent nulle.

E. — Transformation totale de l’allantoïne en acide allantoïque

sous l’action de P allantoïnase des Champignons.

L’allantoïnase de Soja hispida, en présence de sesqui-carbonate d’ammo¬

nium ou d’urée, hydrolyse quantitativement l’allantoïne (27) ; cette nouvelle

réaction biochimique permet de doser cet uréide avec précision dans les

divers milieux biologiques.

Cette transformation est-elle réalisable avec l’enzyme des Champignons ?

L’allantoïnase de ces Thallophytes est très fragile ; nous avons vu en effet

qu’en milieu aqueux sa destruction est rapide. A priori , il faudra donc s’adres¬

ser à une poudre fermentaire d’activité A élevée.

1° Action , sur V allantoïne, d'une poudre fermentaire dont l'activité est com¬

prise entre 50 et 60. — Deux champignons furent étudiés :

Pseudocoprinus disseminatus (végétal jeune, non sporulé), A = 50,9.

Coprinus plicatilis (végétal jeune, non sporulé), A = 57,7.

Conditions expérimentales :

Solution d’allantoïne à 0,1 gr. + 2 gr. de sesqui-carbo¬

nate d’ammonium par litre.5 cc.

Poudre fermentaire de champignon.. . 0,05 gr.

Durée de fermentation.Variable.

Température.39°

Chloroforme.V gouttes.

L’acide allantoïque de fermentation est dosé par spectrophotométrie. On

tient compte de la présence de cet uréide dans la poudre fermentaire dans le

calcul de l’allantoïne transformée.

Résultats. — Expériences sur Pseudocoprinus disseminatus.

DURÉE

do fermentation.

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

ALLANTOÏNE

transformée.

Total.

préexistant.

de fermentation.

1 h.

59,5 mgr.

2,6 mgr.

56,9 mgr.

50,9 %

2

84,8 —-

—

82,2 —

73,6 —

3

93,1 —

—

90,5 —

81,0 —

4

94,8 —

—

92,2 —

82,5 —

5

93,7 —

91,1 —

81,7 —

62 A. BRUNEL. - MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQÜE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Expériences sur Coprinus plicatilis.

DURÉE

de fermentation.

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

ALLANTOÏNE

transformée.

Total.

préexistant.

de fermentation.

1 h.

75,0 mgr.

11,5 mgr.

63,5 mgr.

57,0 %

2

103,5 —

—

92,0 —

82,5 —

3

112,8 —

—

101.3 —

90,8 —

4

112,8 —

—

101,3 —

90,8 —

5

112,5 —

101,0 —

90,5 —

Après cinq heures de fermentation à 39°, le pourcentage d’allantoïne trans¬

formée en acide allantoïque atteint

82 % pour l’enzyme de Pseudocoprinus disseminatus

90 % pour celui de Coprinus plicatilis.

mais l’allantoïnase est pratiquement inactivée. On ne peut espérer avec de

telles poudres fermentaires hydrolyser quantitativement Fallantoïne en acide

allantoïque.

Action , sur Vallantoïne d'une poudre jermentaire dont l'activité A est supé¬

rieure à 60. — Deux essais furent effectués avec :

Coprinus stercorarius (végétal jeune, carpophore à stipe non différencié),

Clitocybe infundibuliformis (poudre fermentaire obtenue à partir de l’hymé-

nium).

Les conditions expérimentales sont identiques à celles décrites pour

Pseudocoprinus disseminatus.

Expériences sur Coprinus stercorarius.

DURÉE

de fermentation.

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

ALLANTOÏNE

transformée.

Total.

préexistant.

de fermentation.

1 h.

73,6 mgr.

0 mgr.

73,6 mgr.

65,8 %

2

90,1 —

—

90,1 —

80,8 —

3

102,3 —

—

102,3 —

91,5 —

4

10 J, 6 —

—

107,6 —

96,5 —

5

108,0 —

—

108,0 —

96,8 —

RECHERCHES SUR L’ACTIVITÉ DE L’ALLANTOÏNASE DES CHAMPIGNONS

63

Expériences sur Clitocybe infundibuliformis.

DURÉE

de fermentation.

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

ALLANTOÏNE

transformée.

Total.

préexistant.

de fermentation.

1 h.

98,2 mgr.

17,7 mgr.

80,5 mgr.

72,3 %

2

120,9 —

—

103,1 —

92,5 —

3

127,0 —

—

109,3 —

98,0 —

4

129,0 —

—

111,3 —

99,9 —

5

129,4 —

111,7 —

100,0 —

La transformation totale de l’allantoïne en acide allantoïque par l’allan-

toi'nase des Champignons peut être obtenue en s’adressant à des poudres fer-

mentaires dont A est au moins ^ 70.

La nécessité d’utiliser une poudre de champignon d’activité allantoïno-

lytique élevée, pour obtenir la transformation totale de l’allantoïne, accuse

nettement la différence de comportement entre l’enzyme des Champignons et

celui des graines de Légumineuses.

Nous avons déterminé A sur différentes récoltes de Soja hispida et nous

avons obtenu les valeurs moyennes suivantes :

PROVENANCE VALEUR DE A

Graines de Soja hispida (Mandchourie) 1931 . 25,7

(Vilmorin) 1932 . 21,8

— — (Vilmorin) 1933 . 22,4

— — (Ukraine) 1933 n° 1.27,6

— n° 2.29,4

— — n°3.28,9

Si l’on compare maintenant les courbes d’action en fonction du temps de

l’allantoïnase des graines de Soja hispida (Mandchourie) Courbe I

et des graines de Soja hispida (Ukraine n° 2) Courbe II

avec celle obtenue à partir de la poudre de Pluteus patricius Courbe 111

(fig. 9, p. 64) on constate que

1° Après cinq heures de fermentation l’allantoïnase de Pluteus patricius

est pratiquement inactivée ; la transformation n’atteint que 44,6 % de l’al¬

lantoïne mise en expérience, alors qu’en une heure elle était déjà de 34,4 %.

2° Dans les mêmes conditions, avec l’enzyme de Soja hispida , l’allantoïno-

lyse se poursuit normalement et atteint respectivement 64,3 et 75,1 % de

l’allantoïne, alors qu’en une heure elle n’était que de 25,7 et 29,4 %.

Cette différence dans la marche de l’hydrolyse enzymatique de l’allantoïne

est due à la rapide inactivation de l’allantoïnase des Champignons en milieu

aqueux, comme le montre l’expérience suivante :

6-4 A. BBITHEL. - MÉTABOLISME DE L’AZOTE l'ÜRIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

On prépare deux macérations aqueuses, l’une de Soja hispicla (farine de

Soja 5 gr., eau 50 cc.), l’autre de poudre de Pluteus Patricius (poudre de

P. patricius 5 gr., eau 50 cc.). Après une heure de contact, on centrifuge et

on porte les liqueurs surnageantes à 80° pendant 30 minutes.

On constate après ce temps, que l’allantoïnase est totalement détruite dans

la macération de Pluteus patricius , tandis

que celle de Soja hispida hydrolyse encore

normalement l’allantoïne en acide allan-

toïque.

C’est un fait d’ailleurs bien connu que les

enzymes des Champignons sont en général

beaucoup plus fragiles que ceux des Végé¬

taux supérieurs.

F. — Sur la conservation de l’allantoïnase

des Champignons Affaiblissement

de son activité avec le temps.

En général, l’activité des enzymes se

conserve avec le temps; cependant le vieillis¬

sement conduit à des transformations du cata¬

lyseur biochimique qui influent sur ses pro¬

priétés. G. Bertrand et A. Compton (7)

ont observé qu’avec une émulsine préparée

depuis plusieurs années le pH optimum était

nettement déplacé vers la zone acide et que

son activité avait diminué vis-à-vis de

Temps en heures l’amygdaloside. Des constatations analogues

2 3 4 s 6 7 à ont été faites par M. Bridel et M lle Des-

9 marest (10) pour la glucosidase (3 et la lac-

tase.

Différents facteurs influent sur cette destruction, notamment la chaleur

et la lumière. Remarquons que dans les deux cas il s’y ajoute toujours, dans

une certaine mesure, l’effet de l’oxygène de l’air. Cette destruction est plus

ou moins marquée suivant les enzymes et leur état. Ils résistent mieux à

l’état sec qu’en présence d’eau ; c’est qu’ils sont d’ailleurs oxydables, et

l’oxydation se manifeste plus rapidement en milieu aqueux qu’à l’état solide.

Le support aussi est un facteur non négligeable ; les enzymes précipités

ou adsorbés sur certains corps résistent mieux à l’oxydation.

Nous avons vu que la destruction de l’allantoïnase en milieu aqueux était

rapide ; cette sensibilité que l’on retrouve chez beaucoup d’enzymes des

Champignons explique la diminution notable de l’activité de l’allantoïnase

avec le temps.

RECHERCHES SUR [/ACTIVITÉ DE l’aLLANTUÏNASE DES CHAMPIGNONS 65

Dès leur arrivée au laboratoire, les champignons ont été séchés dans le vide

sur chlorure de calcium et broyés ; on a déterminé immédiatement l’activité

A (voir p. 50), puis les poudres fermentaires furent conservées en flacons

bouchés. De nouvelles déterminations de A ont été effectuées ensuite après des

temps variant de soixante à quatre-vingt-dix jours. Les résultats sont résumés

dans le tableau suivant :

PROVENANCE

des poudres fermentaires.

DURÉE

de conservation

VALEUR

primitive de A.

NOUVELLE

valeur do A.

PERTE

d'activité.

Pluteus patricius .

60 jours

34,4

19,5

43,3 %

Clitocybe cyathiformis .

80 —

48,2

30,2

37,2 —

Collybia maculata .

87 —

16,7

9,0

46,1 —

Collybia distorta .

64 —

20,2

9,8

51,4 —

Pleurotus eryngii .

85 —

8,7

3,1

64,3 —

Pleurotus ostreatus .

70 —

6,5

3,1

53,8 —

Après soixante jours, l’activité allantoïnolytique de Pluteiis patricius a

baissé de 43,3 % ; il en est de même pour les autres poudres fermentaires où

l’on constate des pertes notables d’activité.

Conclusion. — L’alJantoïnase des Champignons ne se conserve pas en pré¬

sence de l’air et de la lumière. Cette destruction peut être attribuée à une

oxydation du catalyseur.

La recherche de cet enzyme devra donc être effectuée avec des poudres

fermentaires fraîchement préparées et non avec des végétaux séchés ou

conservés en herbier.

Ici encore on constate une différence très nette entre l’enzyme des Champi¬

gnons et celui des graines de Légumineuses. En particulier, l’allantoïnase des

graines de Canavalia ensiformis âgées de trente-huit ans produit encore rapi¬

dement de l’acide allantoïque aux dépens de l’allantoïne (23).

s.

M émoi rk s du muséum, nouvello série, Lomé VI.

DEUXIÈME PARTIE

REIHERCSES SŒft L URIC ASE DES CHAMPIGNONS

CHAPITRE PREMIER

PRÉSENCE DE L'URICASE CHEZ LES CHAMPIGNONS

A. — La dégradation de l’acide urique par les enzymes

des Champignons se fait par la voie de l’allantoïne.

Dans une suite de remarquables travaux Wiechowski (69) a établi que

l’enzyme uricase du foie et du rein de nombreux Mammifères (sauf l’homme)

dégrade l’acide urique par la voie de l’allantoïne.

NH — CO

I I

CO C — NH

I II

NH — C — NH'

NH 2 CO —NH

Uricase

\ co + O + H-0 - CO 1

CO

NH — CH

CO

NH

L’allantoïne injectée aux animaux est totalement excrétée, sans être aucu¬

nement attaquée. Elle serait d’après Wiechowski, Jones (47), Sciiittenhelm

et Seisser (62) le produit ultime de la dégradation in vivo de l’acide urique

et par conséquent des purines.

Cependant l’allantoïne n’est pas toujours le produit final de la dégrada¬

tion de l’acide urique par les enzymes des tissus animaux. L’acide allantoïque

se forme par fermentation de l’acide urique en présence du foie des Batraciens

(Rana viridis) et des Poissons (Raja clavata, Clupea harengus, etc...) (28).

D’après A. Nemec (58) les enzymes végétaux conduiraient la dégradation

de l’acide urique jusqu’à l’ammoniac, la participation de plusieurs enzymes

étant d’ailleurs nécessaire. L’uricase signalée par cet auteur dans quelques

plantes produirait l’allantoïne, qu’un enzyme hypothétique scinderait en

acide oxalique et urée, l’urée étant ensuite transformée en carbonate d’am¬

monium par l’uréase.

R. Fosse, A. Brunel et P. De Graeve (25) ont démontré que chez les Végé-

68 A. BRtJNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PUBIQÜE CHEZ LES CHAMPIGNONS

taux supérieurs l’acide allantoïque prend naissance par fermentation de l’acide

urique sous la double action de l’uricase et de l’allantoïnase. Cette nouvelle

fermentation, particulièrement facile à mettre en évidence avec les graines de

Légumineuses, se produit aussi par l’action des enzymes des tissus de cham¬

pignon sur l’acide urique.

On sait que la dégradation de l’acide urique peut se faire par deux voies :

NH — CO

I I

CO C — NH

\

1 /

CO

O + H-0

NH — C — NH'

Acide urique.

COOH

I

NH —C—NH

I I

CO CO

I I

NH — C — NH

OH

Oxyacétylène-diuréine

carbonique.

ILN-CO-NH. .COOH

X/

H' 2 N • CO ■ NH 7 X COOH

Acide uroxanique.

1 H-N • CO • NH — CH — NH

I

CO — NH

Allantoïne.

CO

La fermentation de l’acide urique conduit-elle à l’acide uroxanique ou à

l’acide allantoïque par la voie de l’allantoïne ?

Comme l’acide allantoïque, l’acide uroxanique en effet donne, à 100° en

milieu chlorhydrique, de l’acide glyoxylique et de l’urée. Il se combine au

xanthydrol en milieu acétique ; l’acide dixanthyluroxanique qui a pris nais¬

sance (20) se transforme par simple dissolution à chaud dans la pyridine en

acide dixanthyllantoïque :

C«H l

0<f \CH — NH • CO ■ NH COOH

X C 6 H 4/ \ r /

C 6 !! 1 // \

0<f VlH —NHCO-NH "COOH

X C , H' /

-CO-

0

CHL

C 6 H'

^CH—NH-CO-NH

C 6 H V

NcH — NH • CO • NH

x C fi H l/

>CH COOH.

Ces réactions communes aux deux acides ne permettraient pas de les dis¬

tinguer ; nous avons pu y réussir toutefois en nous basant sur l’action diffé¬

rentielle de l’acétate basique de plomb sur ces deux acides.

PRÉSENCE DE l’üRICASE CHEZ LES CHAMPIGNONS

69

Action de l’acétate de plomb sur les acides uroxanique et allan-

toïque. -— L’acétate basique de plomb donne avec l’acide uroxanique, même

à la dilution de 1 /50.000, des cristaux brillants argentés d’uroxanate de plomb.

La solution allantoïque dans ces conditions demeure absolument limpide.

Expérience. — On place au bain d’eau à 39°, dans des tubes à centrifuger

des milieux de composition :

Solution d’urate de K à 1 gr. d’acide urique + 2 gr. de

sesqui-carbonate d’ammonium par litre.20 cc.

Poudre de Coprinus stercorarius (champignon très jeune). 0,2 gr.

Chloroforme.V gouttes.

Après huit heures de fermentation la liqueur est refroidie vers 0°, déféquée

par la quantité calculée de nitrate de plomb en solution saturée, filtrée et neu¬

tralisée. On ajoute alors à 2 cc. du filtrat une goutte de sous-acétate de plomb

et une goutte d’acide acétique cristallisable. Après douze heures d’abandon

à la glacière on ne constate pas la formation de cristaux caractéristiques,

brillants, d’uroxanate de plomb.

La dégradation de l’acide urique par les enzymes des Champignons se fait

par la voie de l’allantoïne. Elle est l’œuvre d’au moins deux enzymes : Yuri-

case (sans préjuger du terme intermédiaire que donne l’acide urique) qui

conduit à l’allantoïne, que Vallantoïnase hydrolyse en acide allantoïque.

NH — CO

I I

CO c-

NH

NH — C — NH'

Uricase

H- O + H -’O — CO 2 ”

NH-

I

CO

N H

CO

— NH

NH 2

N H 2

1

Allantoïnase

1

CO

COOH

CO

I

+ H 2 0

1

|

CH

— NH

NH —

CH-

- NH.

La dégradation fermentaire de l’acide urique conduit comme pour l’allan¬

toïne à l’acide allantoïque. L’uricolyse pourra être caractérisée par toutes les

réactions que possède cet acide :

Précipitation à l’état de sel d’argent ou de dérivé dixanthylé et réaction

de ses produits d’hydrolyse acide : urée et acide glyoxylique.

L’action de l’uricase pourra être mesurée quantitativement en dosant l’urée

pondéralement ou l’acide glyoxylique par spectrophotométrie.

B . — Présence de l'uricase dans Coprinus stercorai-ius. Fr. ex Bull.

Ce champignon a été récolté très jeune (carpophore à stipe non différencié)

puis séché dans le vide sur chlorure de calcium et réduit en poudre fine. La

70 A. BBUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

poudre fermentaire ne renferme pas, comme le montre le dosage, d’acide allan¬

toïque préformé.

Isolement, a l’état de dérivé dixanthylé, de l’acide allantoïque

engendré par fermentation de l’acide urique. — On place au bain d’eau

à 39°, des milieux de composition :

E T

Solution d’urate de K à 1 gr. d’acide urique

par litre. 500 cc. 500 cc.

Poudre fermentaire de Coprinus slercorarius . . 5 gr. —

Même poudre traitée par C1H pour détruire les

enzymes.— 5 gr.

Sesqui-carbonate d’ammonium.1 gr. 1 gr.

Chloroforme.0.2 cc. 0,2 cc.

Après huit heures de fermentation, E donne la réaction colorée glyoxylique

de l’acide allantoïque, T ne donne pas cette réaction.

Isolement de Vacide allantoïque de E. — Le milieu fermentaire refroidi vers 0°

est déféqué par le nitrate d’argent en solution normale (30 cc.), centrifugé et

filtré ; le filtrat précipité par l’acétate mercurique solide est abandonné

douze heures à la glacière, puis le précipité mercurique, recueilli par centri¬

fugation, lavé à l’eau deux fois, mis en suspension dans l’eau glacée (35 cc.),

est décomposé par l’hydrogène sulfuré; la liqueur (30 cc.), privée du sulfure

par filtration, de l’excès d’hydrogène sulfuré par un courant d’air et alcali-

nisée par la potasse concentrée, est pourvue d’acide acétique cristallisable

(30 cc.) et de xanthydrol en solution au 1 /10 dans le méthanol (1 /40 du volume

total). Après douze heures de séjour à la glacière, on recueille l’acide dix-

anthyllantoïque par centrifugation et on le purifie par cristallisation dans la

pyridine.

Analyse du corps séché à 100°.

Matière = 9,320 mgr., Azote = 0,828 cc., H = 765 mm., t = 19°.

Pour :

( C 6 H* \2

0<f /CH — NH • CO • NH ) Cil ■ COOH Calculé N % = 10,44

x C 6 H i/ / Trouvé N % = 10,23

L’action successive des enzymes uricase et allantoïnase de Coprinus ster-

corarius conduit la dégradation de l’acide urique jusqu’à l’acide allan¬

toïque.

PRÉSENCE DE L’URICASE CHEZ LES CHAMPIGNONS

71

C. — Méthode de recherche de l’uricase chez les Champignons.

La recherche de l’uricase chez les Champignons est délicate; il faut tenir

compte de la présence fréquente dans le végétal étudié de l’acide allantoïque

et de l’allantoïne qui peuvent causer des erreurs.

D’autre part, il ne faut pas s’attendre à obtenir un pourcentage de transfor¬

mation élevé, car l’uricase des Champignons est peu active ; aussi, seule une

méthode quantitative de recherche très sensible, appliquée d’une façon inva¬

riable aux différents types étudiés, permettra de conclure à la présence de

l’uricase.

Conditions expérimentales de la recherche de l’uricase *.

E T

Solution d’urate de K à 0,1 gr. d’acide

urique par litre.10 cc. —

Eau. — 10 cc.

Poudre fermentaire de champignon. . . 0,1 gr. 0,1 gr.

Sesqui-carbonate d’ammonium.0,02 gr. 0,02 gr.

Chloroforme.V gouttes Y gouttes.

Préparation de la solution d’urate monopotassique. — Dans une fiole jaugée

de un litre, on introduit 0,1 gr. d’acide urique très finement pulvérisé et

500 cc. d’eau ; on laisse en contact dix minutes, puis on ajoute de la potasse

normale (0,6 cc.) pour obtenir le sel monopotassique. Après un long contact

et de fréquentes agitations la dissolution est totale ; on complète alors à

1000 cc. Il est très important que l’acide urique soit réduit en poudre très

fine, sinon la dissolution ne se fait pas totalement. Un excès de potasse

conduit à une inhibition complète de l’uricase. Enfin, la solution d'urate

doit toujours être fraîchement préparée.

Dosage de l’acide allantoïque dans les milieux fermenlaires. — L’acide allan-

toïque est dosé dans E et T après une heure de fermentation par la méthode

spectrophotométrique. Le témoin T permet de tenir compte de l’acide allan¬

toïque et de l’allantoïne préexistant dans le champignon étudié.

Si A e est la teneur en acide allantoïque de E,

Si A t est la teneur en acide allantoïque de T,

la présence de l’uricase dans le végétal étudié pourra être affirmée si

A E > At.

1. Cette méthode de recherche de l’uricase n’est pas applicable dans le cas où le cham¬

pignon étudié ne renferme pas d’allantoïnase. Pour déceler l’uricolyse en l'absence de

l’allantoïnase on aura recours à la technique que nous décrirons lors de la recherche de

l’uricase dans le mycélium de Sterigmatocystis nigra (voir p. 135). Signalons que tous les

champignons que nous avons examinés au point do vue de leurs propriétés uricolytiques

renfermaient de l'allantoïnase.

72 A. BRÜNEL. — MÉTABOLISME DE l’aZOTE TORIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Nous avons pu en appliquant cette technique constater l’existence del’uri-

case dans les champignons suivants :

BASIDIOMYCÈTES HOMOBASIDIÉS

Boletales.

Boletaceae, Boleteae

Gen. Boletus Fr. ex Dill.

Boletus edulis Fr. ex Bull., var. reticulatus (Boud. ex Schaefï.) Bat., var.

pinicola Sacc., ssp. aereus Fr. ex Bull., Boletus scaber Fr. ex Bull., ssp. aurait-

tiacus Roq. ex Bull.

Gen. Xerocomus Quél.

Xerocomus subtomentosus (Fr. ex Lin.) Quél.

Gen. Ixocomus Quél.

Ixocomus granulatus (Fr. ex Lin.) Quél.

Agaricales.

Rhodogoniosporaceae, Riiodogoniosporeae

Gen. Rhodophyllus Quél.

Rhodophyllus (Leptonia) solstitialis Fr.

Tricholomaceae, Marasmieae

Gen. Androsaceus Pat.

Androsaceus vulgaris Pat.

CoLLYBIEAE

Gen. Collybia Quél.

Collybia distorta Fr., dryophila Fr. ex Bull., butyracea Fr. ex Bull., maculata

(Fr. ex Al b. et Schw.) Quél.

Omphalieae

Gen. Clitocybe Quél.

Clitocybe infundibuliformis Fr. ex Schaeff.

Amanitaceae, Lepioteae

Gen. Lepiota Fr. incl. Cystoderma Fayod (= Lepiota emend. Heim).

Lepiota acutesquamosa (Weinm.) Gill., cristata Fr. ex Alb. et Schw.

PRÉSENCE DE L’URICASE CHEZ LES CHAMPIGNONS

73

Pluteae

Gen. Volvaria Fr.

Volvaria speciosa Fr. ex Krombh.

Gen. Pluteus Fr.

Pluteus cervinus Fr. ex Lasch., var. patricius (Schulz.) Fr.

CORTINARIACEAE, CoRTINARIEAE

Gen. Inocybe Fr.

Inocybe Bresadolae Massee = grammata Quél. var. rubescens Heim, eulheies

Quél. var. Quéleti (Maire et Konrad) Heim, lacera Fr.

Phoi.ioteae

Gen. Pholiota Fr.

Pholiota praecox Fr. ex Pers., cylindracea Fr., dura (Fr. ex Boit.) Quél.

Coprinaceae, Pratelleae

Gen. Leucocoprinus Pat.

Leucocoprinus excoriatus (Fr. ex Schaefï.) Pat., var. mastoideus (Fr.) Quél.,

procerus (Fr. ex Scop.) Pat., naucinus (Fr.) Quél.

Coprineae

Gen. Panaeolus Fr.

Panaeolus campanulatus Fr. ex Lin., relirugis Fr. ex Batsch., papiliona-

ceus Fr.

Gen. Psalhyrelia Fr.

Psathyrella gracilis Fr. ex Pers., subalrata Fr. ex Batsch.

Gen. Pseudocoprinus Kühner

Pseudocoprinus disseminatus (Fr.) Kühner.

Gen. Coprinus Fr.

Coprinus atramentarius Fr. ex Bull., lagopus Fr., micaceus Fr. ex Bul!.,

plicatilis Fr. ex Curt., stercorarius Fr. ex Bull., comatus Fr. ex Müller.

Conclusion. — L’uricase, enzyme qui dégrade l’acide urique en allantoïne,

est très répandue chez les Champignons Basidiomycètes.

CHAPITRE II

SUR QUELQUES PROPRIÉTÉS DE L’URICASE DES CHAMPIGNONS

A . — Influence de la température sur la dégradation enzymatique

de l’acide urique.

Conditions expérimentales :

Solution d’urate de K à 0,1 gr. d’acide

urique + 2 gr. de sesqui-carbonate

E

T

d’ammonium par litre.

Solution de sesqui-carbonate d’ammo-

5 cc.

nium à 2 °/ 0 o.'.

Poudre fermentaire de Coprinus sterco-

—

5 cc.

rarius .

0,05 gr.

0,05 gr..

Durée de fermentation.

1-5 heures

1-5 heures.

Température.

Variable.

Chloroforme.

V gouttes

V gouttes.

L’acide allantoïque est dosé par spectrophotométrie dans E et T. Le té¬

moin T permet de tenir compte de l’allantoïne préexistant dans la poudre de

Coprinus stercorarius et qui, lors de la fermentation, est hydrolysée en acide

allantoïque.

La différence

Ac. allantoïque de E. -— Acide allantoïque de T

donnera l’acide allantoïque provenant de la dégradation enzymatique du

l’acide urique.

Le tableau I traduit les résultats obtenus.

SDH QUELQUES PROPRIÉTÉS DE l’üRICASE DES CHAMPIGNONS

75

Tableau I

TEMPÉ¬

RATURE

DURÉE

de fermentation.

ACIDE AL

Total.

LANTOÏQUE P

préexistant.

AR LI'IRE

do fermentation.

ACIDE

urique détruit.

35°

1 h.

25,0

mgr.

5,0

mgr.

20,0

mgr.

19,0 %

37°

—

28,7

—

6,6

- -

22,1

—

20,9 —

39°

—

31,7

—

7,5

—

24,2

—

22,0 —

40°

—

34,4

—

9,2

—

25,2

—

23.9 -

43°

—

33,1

—

9,4

—

23,7

—

22.5 —

45°

—

30,5

—

9.6

—

20,9

—

19,6 —

35°

5 h.

58,5

—

11,5

—

47,0

—

44,6 —

37°

—

61,5

—

12,5

—

49,0

—

46,5 —

39°

—

66,2

—

14,4

—

51,8

—

49,2 —

40°

—

65,4

—

14,7

—

51,7

—

49,1 —

43°

—

65,0

—

15,0

—

50,0

—

47.5 —

45»

—

64,2

—

15.6

48,6

46,1 —

La température optimum pour la dégradation enzymatique de l’acide

urique est située vers 39°-40°.

B. — Marche de la dégradation enzymatique de l’acide urique

en fonction du temps.

Conditions expérimentales :

On place au bain d’eau à 39°, dans des tubes à centrifuger, des milieux :

Solution d’urate de K à 0,1 gr. d’acide

Ei

urique par litre.

Même solution d’urate +2%o de sesqui-

5 cc.

—

carbonate d’ammonium.

Poudre fermentaire de Coprinus sterco-

—

5 cc.

rarius .

0,05 gr.

Chloroforme.

V gouttes

Y gouttes.

Des expériences témoins T, et T 2 correspondant à E, et IL sont instituées en

remplaçant la solution d’urate par de l’eau ; elles permettent de doser l’acide

allantoïque qui a pris naissance par fermentation de l’allantoïne préexistant

dans le champignon et d’en tenir compte pour Ex et E>. L’acide allantoïque

a été dosé par spectrophotométrie. Les résultats sont consignés dans le ta¬

bleau I et mis en évidence par les courbes I et II (fig. 10, p. 76).

76 A. UUU.NEL. - MÉTABOLISME DE l’aZOTE PÜBIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Tableau I

EXPÉRIENCE

DURÉE

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

ACIDE

de fermentation.

Total.

préexistant.

de fermentation.

urique détruit.

E x

1 h.

2 —

17,2 mgr.

27,9 —

4,2 mgr.

6,4 —

13,8 mgr.

21,5 —

12.3 %

20.4 —

—

3 —

34,9 —

6,5 —

28,4 —

27,0 —

—

4 —

36,5 —

6,5 —

30,0 —

28,5 —

—

5 —

39,1 —

6,7 -

32,4 —

30,7 —

—

7 -

39,5 —

6,8 —

32,7 -

31,0 —

E,

1 —

33,2 —

8,8 —

24,4 —

23,2 —

—

2 —

52.4 —

13,3 —

39,1 —

37,1 —

—

3 —

58,5 —

13,3 —

45,2 —

42,9 —

—

4 —

61,5 —

13,7 —

47,8 —

45,4 —

—

5 —

61,9 -

13,9 —

48,2 —

45,8 —

7 —

61.9 —

13,9 —

48,0 —

45,6 —

Nous constatons que le système uricase-allantoïnase agit énergiquement

réaction se poursuit, l’activité enzymatique diminue, finit par s’annuler et la

courbe représentative devient parallèle à l’axe des x. La transformation

atteint alors respectivement 31 % (E,) et 45 % (E») de l’acide urique mis en

SUR QUELQUES PROPRIÉTÉS DE l’üRICASE DES CHAMPIGNONS

77

expérience. Après cinq heures de fermentation, le système enzymatique est

pratiquement inactivé.

Le sesqui-carbonate d’ammonium favorise la marche de l’uricolyse et permet

d’obtenir un pourcentage de transformation plus élevé.

C. — Influence de l’oxygène sur la marche de la dégradation enzymatique

de l'acide urique.

Cette étude a été faite avec un nouvel échantillon de Coprinus stercorarius

(champignon jeune, non sporulé). La recherche de l’acide allantoïque dans la

poudre fermentaire s’est montrée négative. Les conditions expérimentales

étaient les suivantes :

Solution d’urate de Iv à 0,1 gr. d’acide urique

-|- 2gr. de sesqui-carbonate d’ammonium

’ Ei

Ej

par litre.

5 cc.

Poudre fermentaire de Coprinus stercorarius.

0,05 gr.

Durée de fermentation.

Variable

Variable.

Température.

39°

Fluorure de sodium.

1 /2000

On fait passer un courant d’oxygène dans les expériences

Ej, à raison d’une

bulle toutes les deux secondes. Un témoin où la solution d’urate est remplacée

par de l’eau donne la correction due à la fermentation de l’allantoïne préexis¬

tant dans la poudre fermentaire. L’acide allantoïque a été dosé par spectro-

photométrie. Les résultats sont consignés dans le tableau I et mis en évi¬

dence sur les courbes I et II (fig. 11).

Tableau I

EXPÉRIENCE

DURÉE

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

ACIDE

de fermentation.

Total.

préexistant.

de fermentation.

urique détruit.

E,

1 h.

2 —

20,7 mgr.

29,4 —

3,6 mgr.

4,5 —

17,1

24,9

mgr.

16,1 %

23,6 —

—

3 —

36,5 —

5,0 —

31,5

—

29,9 —

—

4 —

40,0 —

5,8 —

34,2

—

32,5 —

—

5 —

42,5 -

6,0 —

36,5

—

34,6 —

—

7 —

43,4 —

6,2 —

37,2

—

35,3 —

E,

1 —

37,4 —

3,6 —

33,8

—

32.1 —

—

2 -

55,6 —

4,5 —

51,1

—

48,5 —

—

3 —

64,0 —

5,0 —

59,0

—

56.0 —

—

4 —

67,9 —

5,8 —

62,1

—

59,0 —

—

5 —

69,6 —

6,0 —

63,6

—

60.4 —

7 —

70,4 —

6,2 —

64,2

61,0 —

78 A. BRUXEL. - MÉTABOLISME DE l’aZUTE PURIQÜE CHEZ LES CH \MPIGNONS

Tandis qu’en l’absence d’oxygène, la transformation de l’acide urique après

sept heures de fermentation n’atteint que 35 %, en présence de ce gaz 61 %

de l’acide urique sont détruits. Mais dans les deux cas, déjà après deux

heures de fermentation, il y a un freinage très net de la réaction, dû à l’auto-

destruction du système enzymatique uricase-allantoïnase en milieu aqueux.

D. — Influence de la cencentration en acide urique sur la marche

de la dégradation enzymatique.

Conditions expérimentales.

Solution d’urate de Kde concentration variable -f- 2 °/ 0 o

de sesqui-carbonate d’ammonium.5 cc.

Poudre fermentaire de Coprinus stercorarius .0,05 gr.

Durée de fermentation.7 heures.

Température ..39°

Chloroforme.V gouttes.

L’acide urique a été dissous à l’état d’urate monopotassique par la quantité

théorique de potasse normale ; les solutions avaient des concentrations com¬

prises entre 0,05-1 gramme par litre. Un témoin, où la solution d’urate est

remplacée par une solution de sesqui-carbonate d’ammonium, est institué

pour tenir compte de l’acide allantoïque engendré par fermentation de l’allan-

toïne préexistant dans la poudre fermentaire. L’acide allantoïque est dosé

par spectrophotométrie.

Le tableau I et la courbe de la figure 12 résument les résultats obtenus :

Tableau I

TITRE

a:.ide allantoïque par litre

A' IDE

URIQUE

on acide urique.

transformé.

Total.

préexistât) t.

de fermentation.

0,05 gr.

41,8 mgr.

6,2 mgr.

35,6 mgr.

33,7 mgr.

67,4 %

0,075 —

50,9 —

—

44,7 —

42,5 —

56,6 —

0,100 —

60,3 —

—

54,1 —

51,4 —

0,200 —

70,9 —

—

64,7 —

61,4 —

30,7 —

0,300 —

84,1 —

—

77,9 —

73,8 —

24,6 —

0,400 —

86,7 —

—

80,5 —

76,5 —

19,1 —

0,500 —

86,7 —

—

80,5 —

76,5 —

15,3 —

0,600 —

87,1 —

—

80,9 —

76,8 —

12,8 —

0,700 —

86,5 —

—

80,3 —

76,3 —

10,9 —

0,800 —

86,7 —

—

80,5 —

76,5 —

9,5 —

0,900 —

87,5 —

—

81,3 —

77,2 —

8,5 —

1,000 —

89,3 —

—

83,1 —

78,9 —

7,8 —

SDR QUELQUES PROPRIÉTÉS DE l'üRICASE DES CHAMPIGNONS

79

La courbe montre que la quantité d’acide allantoïque formé ne croît

pas porportionnellement à la concentration en acide urique. Cette propor¬

tionnalité existe cependant pour des teneurs en acide urique inférieures à 0,1 gr.

par litre ; au delà, la courbe représentative s’infléchit, puis devient parallèle

à l’axe des x.

A partir d’une concentration en acide urique de 0,4 gr. par litre, la quantité

Fig. 12.

d’acide allantoïque formé est indépendante de la concentration du substrat.

Tout se passe comme si une quantité limitée d’uricase ne pouvait agir sur une

quantité illimitée d’acide urique. Ce fait peut être expliqué par la formation

d’une combinaison entre l’enzyme et le substrat, représentant dans ce cas, la

première phase de l’uricolyse. Si U représente l’uricase, S le substrat, c’est-à-

dire l’acide urique, on a :

(1) (S) + u = U(S)

(2) U(S) + HO + O = (S ■ H O • O) + U(CO-).

La réaction est limitée, l’enzyme ne se recombine plus à une nouvelle quan¬

tité d’acide urique.

CHÀPITUE III

RECHERCHES SUR L ACTIVITÉ DE L URICASE

A. — Activité de l’uricase.

L’uricase possède la propriété de transformer l’acide urique en allantoïne;

toutefois le pouvoir uricolytique des poudres fermentaires provenant de divers

champignons présente des variations qu’il est intéressant de déterminer. Dans

ce but nous avons employé la méthode suivante :

On place au bain d’eau à 39°, dans des tubes à centrifuger, des milieux de

composition :

E

T

Solution d’urate de K à 0,1 gr. d’acide

urique 2 gr. de sesqui-carbonate

d’ammonium par litre.

5 cc.

Solution de sesqui-carbonate d’ammo-

nium à 2 % 0 .

—

5 cc.

Poudre fermentaire de champignon. . ,

0,05 gr.

Durée de fermentation.

1 heure

1 heure.

Température.

39°

Chloroforme.

V gouttes

V gouttes.

La solution d’urate est toujours préparée au moment de l’emploi. L’expé¬

rience T permet de connaître la teneur en acide allantoïque apporté par la

poudre fermentaire.

Après une heure de fermentation, l’acide allantoïque est dosé parla méthode

spectrophotométrique.

Si Ae représente l’acide allantoïque de E (en mgr. par litre),

Si At représente l’acide allantoïque de T (en mgr. par litre),

L’acide allantoïque provenant de la dégradation fermentaire de l’acide

urique sera donné par la relation

A f — Ae — At

RECHERCHES SUR L’ACTIVITÉ DE l’üRICASE

81

et le pourcentage d’acide urique détruit par

A f X

Acide urique

Acide allantoïque

= A r X

168

176

= Af X 0,95.

Ce pourcentage représentera l 'activité, uricolytique (U) de la poudre fermen-

taire.

Remarquons que les chiffres obtenus ne sont pas absolus, mais la mesure

de l’activité permet de se rendre compte de la plus ou moins grande vitesse de

destruction de l’acide urique par l’uricase des champignons et d’en faire une

étude comparative.

Le tableau suivant résume les résultats obtenus et donne l’ordre de grandeur

de l’activité uricolytique de quelques champignons.

Champignons étudiés valeur de U

Boleteae.

Boletus scaber (tubes hyméniaux). 7,8

Agaricales. Riiodogoniosporeae.

Rhodopkyllus solstitialis . 20,9

Tricholomaceae. Marasmieae.

Androsaceus vulgaris . 8,7

Collybieae.

Collybia distorta . 12,3

Collybia dryophila . 9,9

Collybia maculata . 8,7

Omphalieae.

Clitocybe infundibuliformis . 6,2

Amanitaceae. Pluteae.

Pluteus cervinus . 4,1

Pluteus cervinus var. patricius . .... 7,8

Cortinariaceae. Cortinarieae.

Inocybe euthel.es . 9,9

Jnocybe lacera . 7,8

Pholioteae.

Pholiota praecox . 2,4

Pholiota cylindracea . 3,5

CoPRINACEAE. PrATELLEAE.

Leucocoprinus naucinus . 12,4

Leucocoprinus rhacodes . 19,3

Leucocoprinus mastoideus . 13,3

Mémoires du muséum, nouvelle série, Ionie VI 6

82 A. URUNEL. - MÉTABOLISME DE l’aZOTE PÜRIQÜE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Champignons étudiés Valeur de U.

Hiatula caepestipes 1. ..15,3

— 2.13,7

Coprineae.

Panaeolus campanulatus. . . 8,2

Psathyrella gracilis . . . . 5,7

Pseudocoprinus disseminatas . 9,9

Coprinus micaceus. non sporulé.7,7

Coprinus stercorarius , non sporulé.17,6-23,2

L’étude comparative de l’uricase chez de nombreux champignons nous

montre, qu’en opposition avec l’allantoïnase, cet enzyme est en général peu

actif.

Lors de la recherche de l’uricase, avant de conclure à un résultat positif

ou négatif, il est donc très important d’examiner plusieurs récoltes du même

champignon pris à des stades de développement différents.

B. — Variations de l’activité de l'uricase avec le stade

de développement du carpophore.

Nous nous proposons de démontrer que l’activité uricolytique des poudres

fermentaires de champignon est fonction de l’état de développement du car¬

pophore.

Nous avons étudié à ce point de vue sept échantillons moyens de Coprinus

stercorarius préalablement séchés dans le vide sur chlorure de calcium. Ils

répondaient aux caractéristiques suivantes :

1. Champignon très jeune, carpophore à stipe non diffé¬

rencié.

2. Champignon jeune, non sporulé, lamelles blanches. . Chapeau.

2'. — — — . . Stipe.

3i Champignon sporulé, lamelles brunes.Chapeau.

3'. — — .Stipe.

4. Champignon âgé, lamelles déliquescentes.Chapeau.

4'. — — .Stipe.

Mesure de U. La mesure de U a été effectuée en suivant la technique pré¬

cédemment décrite. Résultats :

RECHERCHES SUR ^ACTIVITÉ DE l’DBICASE

83

ÉCHANTILLON

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

VALEUR

de U.

Total.

préexistant.

do fermentation.

1 . Total .

22,9 mgr.

4,3 mgr.

18,6 mgr.

17,6

2 . Chapeau .

27,2 -

7,5 —

19,7 —

18,7

3 . — ....

50,5 —

35,5 —

15,0 —

14,2

4 . — ....

56,4 —

43,9 —

12,5 —

11,8

1!'. Stipe .

17,8 —

5,3 —

12,5 —

11,8

3'. — .

19,2 —

8,2 —

11,0 —

10,4

4'. — .

12,9 —

7,6 —

5,3 —

5,0

Nous constatons chez Coprinus stercorarius que

1° L’enzyme uricase existe dans le carpophore aux différents stades du déve¬

loppement.

2° L’activité uricolytique du chapeau ou encore la richesse en uricase est

maximum chez le champignon jeune, non sporulé, puis elle diminue régulière¬

ment en corrélation avec l’évolution du carpophore.

3° L’activité uricolytique du stipe suit la même évolution que celle dupéridium.

C. — Répartition de l’uricase dans les différentes parties du carpophore.

Les recherches concernant la répartition de F uricase ont été faites sur un cer¬

tain nombre d’espèces appartenant aux genres Boletas, Androsaceus, Collybia ,

Pluteus, Pholiota, Psathyrella et Coprinus. La méthode adoptée est celle de

la détermination de U, les résultats sont résumés dans le tableau suivant :

CHAMPIGNONS ÉTUDIÉS

VALEUR

DE U

Chapeau

total.

Hyménium.

Chapeau.

Stipe.

Boletus scaber .

6,3

7,8

2,2

1,5

Boletus aurantiacus .

7,2

9,0

2,3

1,5

Androsaceus vulgaris .

10,0

)>

»

1,0

Collybia distorta .

13,2

«)

))

0

Collybia dryophila .

11,4

»

0

Pluteus cervinus .

5,3

))

»

0

Pluteus cervinus var. patricius . . .

9,0

»

0

Pholiota praecox .

3,5

»

))

0

Pholiota cylindracea .

4,0

))

»

0

Psathyrella gracilis .

7,0

»

)>

0

Coprinus stercorarius, non sp. . . .

18,7

»

11,8

— — sp.Lam. brunes.

14,2

»

10,4

— — sp. Lam. deliqu.

11,8

»

5,0

Coprinus micaceus 1.

10,0

»

))

6,7

— — 2.

11,3

»

8,6

Coprinus atramentarius .

11,7

»

6,2

84 A. BRDNEL. - MÉTABOLISME DE l’aZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Hyménium. — Comme pour l’allantoïnase, l’uricase se localise plus particu¬

lièrement dans la partie reproductrice du carpophore, l’hyménium, où son

activité est maximum.

Chapeau. — Chez certains champignons du genre Boletus , où il est facile

de séparer le chapeau de l’hyménium, nous avons pu constater la présence de

Furicase dont l’activité est toutefois nettement plus faible que celle de

l’enzyme de l’hyménium correspondant.

Stipe. — La richesse en uricase du stipe est très variable ; dans de nom¬

breux cas l’activité uricolytique n’est pas décelable. Cependant, chez les cham¬

pignons où la valeur de U est élevée, on constate dans le stipe un pouvoir très

net de dégradation de l’acide urique.

D. — Sur la conservation des propriétés de l’uricase des Champignons.

Affaiblissement de son activité avec le temps.

Dans la première partie de ce Travail nous avons vu que l’activité de l’al¬

lantoïnase diminuait avec le temps.

Cette destruction du catalyseur biochimique est encore nettement plus

marquée pour Furicase, comme le montrent les nouvelles mesures de l’activité

uricolytique de poudres de champignon, conservées 90 jours au laboratoire.

Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau suivant :

CHAMPIGNONS ÉTUDIÉS

VALEUR

primitive de U.

NOUVELLE

valeur de U.

PERTE

d'activité.

Androsaceus vulgaris .

8,7

1,0

88,5 %

Collybia distorta .

12,3

3,2

73,9 —

Collybia dryophila .

9,9

2,4

75,7 —

Clitocybe infundibuliformis .

6,2

1,2

80,6 -

Pluteus patricius .

7,8

2,0

74,3 —

Hiatula caepestipes .

13,7

5,0

63,5 —

Panaeolus campanulatus .

8,2

3,0

63,4 —

Pseudocoprinus disseminatus ....

9,0

1,7

82,8 —

Coprinus micaceus .

7,6

1,4

81,6 —

Coprinus stercorarius, total ....

17,6

3,8

78,4 —

— — Chapeau ....

18,7

4,3

77,0 —

— — Stipe .

11,8

2,4

79,7 —

L’activité de Furicase ne se conserve pas avec le temps. Après trois mois

on constate une inactivation presque totale de l’enzyme. Les nouvelles mesures

de U montrent une perte de 70 à 90 % sur l’activité initiale, tandis que pour

l’allantoïnase, dans le même temps, la perte d’activité est de l’ordre de 40 à

50 %.

RECHERCHES SUR L'ACTIVITÉ DE l’uRICASE

83

Chez les Champignons Basidiomycètes la dégradation de l’acide urique se

fait par la voie de l’allantoïne et conduit à l’acide allantoïque.

La dégradation de l’acide urique est une réaction très complexe car, ainsi

qu’ont pu le démontrer K. Félix, F. Scheel et W. Schuler (18) avec une

uricase d’origine animale (beaucoup plus maniable et plus active que l’enzyme

des Champignons), l’uricolyse se fait au moins en deux temps.

1° Oxydation et hydratation,

2° Décarboxylation.

Sous le nom d’uricase on désigne deux enzymes distincts :

1° L ’uricoxydase (pH optimum 8,9) qui conduirait au terme intermédiaire

de Behrend et Biltz : l’oxyacétylènediuréinecarbonique.

NH

CO

I

C —NH

CO

I il /

NH — C — NH

Uricoxydase

^CO + Ô + H-0

NH

CO

COOH

I

C —NH

I

CO

NH—C —NH

I

OH

2° La décarboxylase (pH optimum 9,9) qui conduit à l’allantoïne.

COOH

-NH

NH —C

I

CO

I

NH —C —NH

I

OH

^ Décarboxylase ^

— OU

NH —CH—NH

1 I 1

CO

I I

NH — C-

N1I

NH —CH — NH

I

CO I CO

NH* CO —NH

OH

Et enfin chez les Champignons vient s’ajouter l’action de Vallantoïnase

(pH optimum 7,6) qui conduit à l’acide allantoïque.

CO —NH

NH !

I

CO

I

NH — CH — NH

NH-

CO A1Iant - ° T ïn ‘ ase > A o

H-'O

N H

NH 2

I

COOH CO

I I

CH-NH

Ces considérations d’ordre chimique, auxquelles il faut ajouter la fragilité

connue des enzymes des Champignons, expliquent les difficultés que l’on

rencontre dans l’étude de l’uricase des Champignons ainsi que les faibles

transformations que nous avons généralement observées.

TROISIÈME PARTIE

LES URÉIDES GLYOXYLIQUES

(ACIDE ALLANTOÎQUE ET ALLANTOÏNE)

CHEZ LES CHAMPIGNONS

CHAPITRE PREMIER

L’ACIDE ALLANTOIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS BASIDIOMYCÈTES

A. — Caractérisation et détermination quantitative de l’acide allantoïque.

Sa répartition chez les Champignons.

L’acide allantoïque a été isolé par R. Fosse et A. Brtenel chez les cham¬

pignons (24), où cet uréide peut être facilement caractérisé par ses produits

d’hydrolyse chlorhydrique à 100° : l’urée que l’on précipite par le xanthydrol

à l’état de dixanthylurée, l’acide glyoxylique qui donne la réaction colorée

très sensible de Fosse et Hieulle avec le réactif chlorhydrate de phényl-

hydrazine, acide chlorhydrique concentré, ferricyanure de potassium.

La détermination quantitative de l’acide allantoïque se ramène, soit au

dosage de l’urée (22) pour des teneurs supérieures à 0,15 °/ 00 , soit au dosage

spectrophotométrique de l’acide glyoxylique pour des teneurs inférieures à

0,1 0 /oo- Cette dernière méthode convient particulièrement dans le cas des

champignons;; nous ne reviendrons pas sur sa .technique déjà décrite dans la

première partie de ce Travail (voir p. 16).

Avant de procéder à la détermination de l’acide allantoïque, les .champi¬

gnons sont séchés dans le vide sur chlorure de calcium, puis réduits en poudre

fine par broyage au moulin et au mortier. On tiendra oompte de l’humidité

restante (en général ,de l’ordre de 5-8 %), que l’on déterminera par dessic¬

cation à 100° jusqu’à poids constant.

La teneur en acide allantoïque sera exprimée par rapport à 1000 grammes

de plante sèche ou par rapport à l’azote total.

Nous avons consigné dans la liste suivante la teneur en acide allantoïque

de quelques champignons.

88

A. BRUNEL. - MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

ACIDE ALLANTOÏQUE

pour 1000 gr. de plante

CHAMPIGNONS ÉTUDIÉS séchée a 100».

Polyporus intybaceus. ..0,14 gr-

Xerocomus subtomentosus .0,66 —

— chrysenteron .0,95 —

Paxillus involutus .0,96 —

Lactarius trivialis .0,50 —-

Russula adusta .0,29 —

— vesca .0,32 —

— foetens .0,30 —

— emetica .0,37 —

— fragilis .0,48 —

— xerampelina .0,47 —

— fellea .0,41 —

Rhodophyllus icterinus .0,41 —

— solstitialis .6,72 —

Lentinus cochleatus .0,32 —

Androsaceus vulgaris .2,11 —

Marasmius rotula .2,93 —

erythropus .0,75 —

Mycena pura 1.2,98 —

— 2.3,62 -

— pelianthina .4,93 —

— alcalina .3,67 —

Collybia butyracea .3,50 -

— ambusta .2,36

— velutipes .0,38 —

— fusipes .0,34 —-

Pleurotus geogenius .1)00 —

— eringii .0,24 —

Clitocybe dealbata .0,29 —

— inversa .0,95 —

Armillariellamellea, jeune.0,25 —

— — sporulé, âgé.. 1,30 —

Amanita vaginata var. fulva .0,36 —

— phalloïdes .0,70

Lepiota acutesquamosa .1)59 —

— cristata .4,47 —

Pluteus cervinus var. eximius .0,43

Volvariaspeciosa .2,37

Inocybe hiulca .1)67

— eutheles .2,45

— Bresadolae .1)02

l’acide ALLANTOÏQUE chez les champignons basidiomycètes

ACIDE ALLANTOÏQUE

, pour 1000 gr. de piaule

CHAMPIGNONS ETUDIES séchée à 100°.

Hebelomaradicosum .0,70 gr.

Flammula sapinea .0,39 —

—• spectabilis .0,14 —

Pholiota praecox .1,01 —

— mutabilis .0,50 —

— spectabilis .0,14 —

Leucocoprinus excoriatus .2,88 —

Hiatulalicmophora .5,70 —

Agaricus arvensis .0,40 —

—• xanthodermus , non sporulé.0,53 —

— silvicola .0,72 —

Hypholoma hydrophilum .0,26 —

— Candolleanum .1,30 —

Lacrymaria velutina .0,93 —

Panaeolus campanulatus .1,22 —

Psathyrella gracilis .1,14 —

Psathyrella subatrata, jeune.0,99 —

— — âgé.1,75 —

Pseudocoprinus disseminatus , non sporulé.0,26 —

— — sporulé.1,72 —

Psilocybefoenisecii .1,79 —

Coprinus lagopus, sporulé. 4,79 —

L’acide allantoïque est très répandu chez les Champignons, où il coexiste

fréquemment dans le même carpophore avec l’enzyme qui lui donne naissance

aux dépens de l’allantoïne : l’allantoïnase.

B. — Répartition de l’acide allantoïque dans les différentes parties

du carpophore.

Les différentes parties du carpophore et aussi le mycélium ont été examinés

chez un certain nombre d’espèces.

L’acide allantoïque a été dosé par spectrophotométrie et les résultats de ces

dosages sont mentionnés dans le tableau suivant :

90 A. 1ÎRUNEL. — MÉTABOLISME DE I,’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

CHAMPIGNONS ÉTUDIÉS

ACIDE ALLANTOÏQUE

pour 1000 grammes de plante.

Mycélium.

Hyménium.

Clmpeau

total.

Chapeau.

Stipe.

Boletus calopus .

»

0,36 gr.

»

0

Xerocomus subtomentosus . . .

»

0,92

»

0

Russula vesca .

»

))

0,32 gr.

0

Collybia dryophila .

»

))

4,06

»

0,82 gr.

Clitocybe infundibuliformis . .

»

))

2,12

»

1,37

Amanita rubescens .

»

0,42

»

0

Volvaria speciosa .

»

))

2,70

»

1,70

Pholiola mutabilis .

»

))

0,83

»

0,49

Hiatula caepestipes, âgé . . .

0

»

7,55

»

2,60

Agaricus campester .

0

»

0,24

»

0,14

Coprinus stercorarius sp. . . .

0

))

3,45

))

0,67

— micaceus .

»

5,52

»

1,55

Mycélium. — Nous n’avons pu mettre en évidence l’acide alla ni oïque dans

les mycéliums d 'Hiatula caepestipes, de Coprinus stercorarius et d 'Agaricus

campester ; ces faits sont en accord avec l’absence de l’allantoïnase dans ces

mêmes mycéliums.

Chapeau total. — C’est la partie du carpophore la plus riche en acide allan-

toïque; c’est aussi dans cette partie du carpophore que l’allantoïnase est la

plus active.

Stipe. — En général, le stipe renferme de l’acide allantoïque, mais la teneur

en cet uréide est toujours nettement plus faible que pour l’hyménium et le

chapeau correspondants.

C. — Influence de l’état de développement du carpophore

sur la teneur en acide allantoïque chez Coprinus micaceus

et Hiatula caepestipes.

Nous avons étudié à ce point de vue trois échantillons moyens de Coprinus

micaceus préalablement séchés dans le vide sur chlorure de calcium et répon¬

dant aux caractéristiques :

1. Champignon jeune, non sporulé, lamelles blanches.

2. Champignon sporulé, lamelles brunes.

3. Champignon sporulé, lamelles déliquescentes.

L’acide allantoïque a été dosé par spectrophotométrie. Résultats :

l’acide allantoïque chez les champignons basidiomycètes

91

POUR 1000 GRAMMES DE PLANTE SÉCHÉE

COPRINUS MICACEUS

dans le vide

à 100°.

Humidité restaute.

Acide allantoïque.

Acido allantoïque.

1. Champignon jeune, non sporulé .

5,4 %

0,71 gr.

0,75 gr.

2. Champignon sporulé, lamelles

brunes.

5,3 —

2,81

2,96

3. Champignon sporulé, lamelles

déliquescentes.

5,5 —

4,44

4,69

La teneur en acide allantoïque va donc en augmentant, à mesure que le

stade végétatif est plus avancé. Une récolte plus abondante de Coprinus mica¬

ceus nous a permis de confirmer ces résultats et d’étudier séparément le péri-

dium total et le stipe. Les échantillons avaient les caractéristiques suivantes:

1. Champignon jeune, non sporulé, lamelles blanches. . Chapeau.

1'. — — — . . Stipe.

2. Champignon à spores naissantes, lamelles grises . . Chapeau.

2’. — — — . . Stipe.

3. Champignon sporulé, lamelles brunes.Chapeau

3. — — .Stipe.

4. Champignon sporulé, lamelles déliquescentes.... Chapeau.

4'. — — ... Stipe.

Après séparation du chapeau et du stipe, on procède à la dessiccation dans

le vide sur chlorure de calcium. On opérera rapidement le broyage des échan¬

tillons 3,3' et 4,4', car ils sont hygroscopiques.

Dosage de l’acide allantoïque. Résultats :

ÉCHANTILLON

POUR 1000 GRAMMES DE PLANTE SÉCHÉE

dans le vide.

à 100°.

Humidité restante.

Acide allantoïque

Ac de allantoïque.

1 . Chapeau.

6,3 %

0,92 gr.

0,98 gr.

2 . — .

6,5 —

1,69 —

1,80 —

3. — .

7,3 —

2,70 —

2,91 —

4 . — .

7,0 —

3,32 —

3,57 —

1’. Stipe.

»

Traces

2’. — .

6,0 —

0,25 —

0,26 —

3’. — .

6,0 —

0,39 —

0,41 —

4’. — .

6,2 —

1,58 —

1,68 —

L’examen des différentes parties de Coprinus micaceus permet de constater

l’apparition d’importantes quantités d’acide allantoïque avec le mûrissement

92

A. BRtJNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

du carpophore. Ces faits ne sont pas particuliers à Coprinus micaceus, nous

avons pu les retrouver pour Hiatula caepestipes.

Accumulation de l’acide allantoïque dans HIATULA CAEPES¬

TIPES. — D’importantes récoltes de Hiatula caepestipes, faites dans la serre

chaude du Muséum, nous ont permis d’étudier ce champignon au point de vue

des variations que présente la teneur en acide allantoïque avec le mûrisse¬

ment du carpophore. Les échantillons avaient les caractéristiques suivantes

1. 1. 1". Champignon très jeune, non sporulé, non épanoui.

2. 2'. Champignon sporulé, épanoui.

3. 3'. 3 . Champignon sporulé, nettement flétri.

L’acide allantoïque est dosé par spectrophotométrie. Résultats :

ÉCHANTILLON

POUR 1000 GRAMMES DE PLANTE SÉCHÉE

daus le vide.

à 100°.

Humidité restante.

Acide allantoïque

Acide allantoïque.

t.

7,8 %

1,66 gr.

1,80 gr.

i'.

11,8 —

1,03 —

1,16 —

i".

9,3 —

0,88 —

0,97 —

2.

9,5 —

2,50 —

2,76 —

2'.

9,1 —

2,63 —

2,90 —

3.

9,0 —

5,03 —

5,52 —

3'.

9,2 —

6,00 —

6,60 —

3”.

9,2 —

7,08 —

7,79 —

Chez Coprinus micaceus et chez Hiatula caepestipes on constate que la teneur

en acide allantoïque croît régulièrement jusqu’à la décrépitude du carpophore.

Cette accumulation de l’acide allantoïque est comparable dans une certaine

mesure à celle que l’on observe lors de la germination des graines de Légumi¬

neuses (34) à l’obscurité.

Dans les champignons ci-dessus mentionnés nous avons pu en outre mettre

en évidence l’allantoïne et les enzymes allantoïnase et uricase. Cet ensemble

de faits laisse entrevoir l’origine purique possible de l’acide allantoïque chez

les Champignons.

D. — Relation entre la sporulation et l’augmentation

de la teneur en acide allantoïque chez Coprinus stercorarius.

La teneur en acide allantoïque augmente subitement quand on passe d’un

champignon non sporulé à un végétal dont les spores sont en voie de formation

ou formées ( Coprinus micaceus). Y a-t-il une relation entre la sporulation et

l’augmentation de la teneur en acide allantoïque ?

l'amok ALLANTOÏQUE CHEZ 1RS CHAMPIGNONS HAUDIOMYCÊTES

93

Nous avons étudié à ce point de vue l’apparition et l’évolution de l’acide

allantoïque dans différents échantillons de Coprinus stercorarius répondant

aux caractéristiques suivantes

1. Champignon très jeune, carpophore à stipe non différencié.

2. Champignon jeune, non sporulé, lamelles blanches. . Chapeau.

2'. — — — . Stipe.

3. Champignon sporulé, lamelles brunes.Chapeau.

3 — — .Stipe.

4. Champignon sporulé, lamelles déliquescentes .... Chapeau.

4. -— — . . Stipe.

L’acide allantoïque est dosé par spectrophotométrie. Résultats :

ÉCHANTILLON

POl'R 1000 GRAMMES DE PLANTE SÉCHÉE

dans le vide.

à 100°.

Humidité restante

Acide allantoïque.

1. Total.

))

Traces

2. Chapeau.

5,2 %

3. — .

5,0 —

3,19 —

3,35 —

4. — .

5,0 —

3,58 —

3,76 —

2'. Stipe.

))

0

3'. — .

5,3 —

0,57 —

0,60 —

4’. — .

5,1 —

0,63 —

0,66 —

D’autres échantillons recueillis quelques jours plus tard et répondant aux

mêmes caractéristiques nous ont donné les résultats suivants :

ÉCHANTILLON

POUR 1000 GRAMMES DE PLANTE SÉCHÉE

dans le vido.

à 100°.

Humidité restante.

Acide allautoïque.

Acide allantoïque.

1. Total.

))

Traces

2. Chapeau.

4,5 %

0,53 gr.

0,55 gr.

3. — .

5,0 —

2,99 —

3,14 —

4. — .

4,8 —

3,29 —

3,45 —

2’. Stipe.

»

Traces

3'. — .

5,0 —

0,47 —

0,49 —

4'. — .

4,9 —

0,65 —

0,69 —

On constate que

1° Dans la phase 1-2 du développement du carpophore (différenciation du

stipe) l’acide allantoïque apparaît.

2° Dans la phase 2-3 (sporulation), la teneur en acide allantoïque croît

94 A. URUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQÜE CHEZ LES CHAMPIGNONS

subitement ; elle passe de 0,44 gr. à 3,35 gr. et de 0,55 gr. à 3,14 gr. pour

1000 gr. de champignon.

3° Dans la phase 3-4 (décrépitude du carpophore) l’acide allantoïque

continue à croître mais plus lentement ; sa teneur passe de 3,35 gr. à 3,76 gr. et

de 3,14 à 3,45 gr. pour 1000 gr. de champignon.

On assiste donc, lors de la sporulation chez Coprinas stercorarius, à une activité

très grande de l’allantoïnase : une allantoïnolyse intense coïncide avec la sporu¬

lation. Il se produit un remaniement profond dans le contingent des uréides

glyoxyliques, l’allantoïne disparaît pour faire place à l’acide allantoïque dont la

teneur continue àcroître, mais lentement, jusqu’à la décrépitude du carpophore.

E. — Acide allantoïque en fonction de l'azote total chez les Champignons.

Si l’on traduit les résultats relatifs aux variations de la teneur en acide

allantoïque par rapport à 1000 gr. de substance sèche, on constate que cette

teneur varie

1° Avec le champignon étudié.

2° Avec l’état de développement du carpophore (les champignons sporulés

sont plus riches en acide allantoïque que les champignons jeunes non sporulés).

Ce mode d’expression des résultats ne donne pas de renseignements sur

l’importance relative de l’acide allantoïque dans le métabolisme azoté du

végétal. Dans ce but, il est préférable d’exprimer les résultats par rapport à

l’azote total.

Nous avons déterminé les teneurs en acide allantoïque et en azote total et

nous avons calculé la valeur du rapport

„ Azote de l’acide allantoïque

R ■ -à— t t t i --— X 100

Azote total

pour de nombreux champignons appartenant à la famille des Agaricacées;

la teneur en azote total a été obtenue par la méthode du micro-Kjeldahl

modifiée par Parnas et Wagner (60).

Mode opératoire. — Les échantillons moyens, obtenus par dessiccation dans

le vide sur chlorure de calcium et broyage en poudre fine, sont séchés à 100°

jusqu’à poids constant. On prélève 0,1-0,2 gr. du végétal sec que l’on attaque

par l’acide sulfurique concentré pur (5 cc.)en présence de sulfate de cuivre et

de sulfate neutre de potassium comme catalyseur. La destruction sulfurique

est menée lentement ; après décoloration totale, ce qui demande en général

vingt-quatre heures, on continue le chauffage pendant quatre heures. On

amène alors le volume à 100 cc.et l’on dose l’ammoniac sur une partie aliquote

(5-10 cc.) par le procédé iodométrique.

Les chiffres consignés dans ce tableau représentent la moyenne de trois

déterminations.

Abréviations utilisées : sp. = sporulé, im. — non sporulé, lam. = lamelles,

Ch. = chapeau, St. = Stipe.

l’acide allantuïque chez les ciiampignuns ba-idiomycètes

95

CHAMPIGNONS ÉTUDIÉS

A DE

allau toupie

pour 100 gr.

de piaule.

AZO i E

de l’acide

allautoïque.

AZOTE

total

°/o

VALEUR

de R.

Rhodophyllus lividus sp.

0,138 gr.

0,0439 gr.

5,0

0,88

— icterinus sp.

0,041 —

0,013 —

4,7

0,27

— solstitialis sp.

0,672 —

0,2138 —

10,8

1,98

Mycena pura sp. 1.

0,298 —

0,0948 —

6,3

1,56

— — 2 .

0,362 —

0,115 —

6,4

1,80

— pelianthina sp.

0,493 —

0,157 —

6,4

2,45

— alcalina sp.

0,367 —

0,119 —

6,3

1,85

Collybia butyracea sp.

0,350 —

0,111 —

7,3

1,52

—• velutipes sp.

0,038 —

0,012 —

5,6

0,21

— ambusta sp.

0,236 —

0,075 —

5,7

1,31

— fusipes sp.

0,034 —

0,010 —

5,8

0,18

— maculata sp. 1.

0,075 —

0,0238 —

6,5

0,37

— maculata sp. 2.

0,125 —

0,0397 —

6,6

0,60

— distorta sp.

0,094 —

0,0299 —

6,5

0,46

— dryophila sp. Ch.

0,406 —

0,129 —

7,0

1,84

— dryophila sp. St.

0,082 —

0,0261 —

4,4

0,59

— dryophila sp.

0,266 —

0.084 —

6,1

1,30

Clitocybe infundibuliformis sp. 1. .

0,133 —

0,0422 —

7,5

0,56

_ _ 2

0,196 —

0,0623 —

7,9

0,79

— — 3. .

0,260 —

0,0827 —

7,7

1,07

cyathiformis sp.

0,230 —

0,073 —

6,6

1,10

Amanita phalloïdes sp.

0,07 —

0,022 —

6,6

0,33

Amanita rubescens sp.

0,04 —

0,012 —

6,8

0,18

julva sp.

0,036 —

0,011 —

5,9

0,19

Lepiota acutesquamosa sp.

0,159 —

0,050 —

6,6

0,76

— cristata sp.

0,447 —

0,142 —

8,3

1,71

Pholiota cylindracea sp .

0,280 —

0,089 —

7,8

1,14

— praecox sp .

0,261 —

0,083 —

6,6

1,25

— mutabilis sp. 1 .

0,05 —

0,015 —

3,2

0,49

_ _ 2

0,06 —

0,019 —

3,6

0,53

— spectabilis sp .

0,014 —

0,004 —

3,9

0,10

Leucocoprinus mastoideus sp. . . .

0,196 —

0,062 —

7,4

0,84

— procerus sp .

0,365 —

0,116 —

7,4

1,56

rhacodes sp .

0,380 —

0,121 —

11,9

1,01

— excoriatus sp .

0,288 —

0,091 —

7,7

1,19

— naucinus sp .

0,218 —

0,069 —

8,5

0,81

Agaricus campester sp .

0,070 —

0,022 —

7,7

0,29

— —• sp.St .

0,024 —

0,007 —

8,4

0,09

— • — sp. St .

0,014 —

0,004 —

7,0

0,06

Agaricus exquisitus im. Ch .

0,013 —

0,004 —

7,9

0,05

— —• im.St.

0,015 —

0,004 —

6,8

0,07

Agaricus arvensis sp.

0,04 —

0,012 —

6,6

0,19

—■ silvicola sp.

0,08 —

0,025 —

8,4

0,30

— xanthodermus sp .

0,06 —

0,019 —

9,4

0,20

Coprinus micaceus im. Ch .

0,098 —

0,031 —

6,0

0,52

— — im. St .

Traces

))

»

))

Coprinus micaceus sp. Ch.

0,357 —

0,113 —

5,3

2,14

— — sp. St .

0,168 —

0,053 —

3,7

1,44

Coprinus lagopus sp. lam. gr. Ch.. .

0,204 —

0,065 —

6,4

1,0

— sp. lam. gr. St . . .

0,053 —

0,016 —

5,9

0,28

Coprinus lagopus sp. lam. dél. Ch. .

0,271 —

0,086 —

5,5

1,56

Coprinus lagopus sp. lam. dél. St. .

0,093 —

0,029 —

4,9

0,06

—- comatus sp.

0,300 —

0,095 —

5,7

1,67

— atramentarius sp.

0,240 —

0,076 —

4,9

1,55

9(5 A. IIUUNEL. — MÉTABOLISME DE LAZOTE PUBIQDE CHEZ LES CHAMPIGNONS

La valeur du rapport

R =

Azote de l’acide allantoïque

Azote total

X 100

montre que la teneur en azote allantoïque par rapport à l’azote total, varie

1° Entre les espèces d’un même genre,

2° Pour la même espèce, avec l’état de développement du carpophore.

1° Entre les espèces d’un même genre.

Genre Rhodophyllus Quél.

Alors que R a une valeur de 0,88 pour Rhodophyllus lividus et de 0,27 pour

Rhodophyllus icterinus, il est de 1,98 pour Rhodophyllus solstitialis. Nous

n’avons pu signaler l’acide allantoïque dans Rhodophyllus rhodopolius.

Genre Mycena Fr.

La valeur de R est très variable, elle est voisine de 1,5 pour Mycena pura ,

pelianthina, alcalina. Par contre, nous n’avons pu signaler l’acide allantoïque

dans Mycena calopoda et inclinata, fait en accord avec la présence dans ces

champignons, d’une allantoïnase peu active.

Genre Collybia Quél.

R est supérieur à 1 pour Collybia ambusta, dryophila, butyracea\ R est voi¬

sin de 0,5 pour Collybia mandata et Collybia distorta , de 0,2 pour Collybia

fusipes et Collybia velutipes. Nous n’avons pu signaler l’acide allantoïque dans

Collybia platyphylla.

Genre Clitocybe Quél.

Alors que R est 1 pour Clitocybe infundibuliformis et Clitocybe cyathi-

formis , nous n’avons pu mettre en évidence l’acide allantoïque dans Clito¬

cybe viriclis , flaccida , aurantiaca, nebularis , brumalis et tabescens.

Genre Amanita Secr. ex Pers.

Voisine de 0,2-0,3, la valeur de R est toujours peu élevée pour les espèces

du genre Amanita ; ces faits sont en accord avec la faible activité de l’allan-

toïnase de ces champignons.

Genre Pholiota Fr.

R est supérieur à 1 pour les Pholiotes du groupe praecox (Pholiota praecox,

dura) et Pholiota cyliridracea ; il est peu élevé et compris entre 0,1-0,5 pour les

Pholiotes du groupe squarrosa (Pholiota squarrosa, mutabilis, adiposa...).

Ces faits sont en accord avec la présence d’une allantoïnase active dans les

espèces du groupe praecox et, au contraire, peu active pour les Pholiotes du

groupe squarrosa.

Genre Leucocoprinus Pat.

Pour le champignon sporulé, la valeur de R est touj ours élevée et supérieure à 1.

Genre Agaricus Fr. ex Lin. emend. Sacc.

En général valeur peu élevée de R, ce qui correspond à la faible activité de

l’allantoïnase chez ces champignons.

Genre Coprinus Fr.

l’acide allantoïque chez les champignons basidiomycètes

97

R est peu élevé pour le champignon jeune non sporulé ; au contraire, il est

supérieur à 1 pour le végétal âgé sporulé.

2° R EST FONCTION DE L’ÉTAT DE DÉVELOPPEMENT DU CARPOPHORE.

C’est ce qu’indiquent déjà les valeurs de R obtenues pour les espèces du

genre Coprinus. Nous allons maintenant étudier plus particulièrement l’in¬

fluence de l’état de développement du carpophore sur la valeur de R chez

Coprinus micaceus et chez Hiatula caepestipes.

F. — Influence de l’état de développement du carpophore

sur la valeur du rapport

R =

Azote de l’acide allantoïque

Azote total

X 100.

L’influence de l’état de développement du carpophore sur la teneur en azote

allantoïque par rapport à l’azote total est mise en évidence par la présence

ou l’absence de l’acide allantoïque et les variations de sa teneur chez un même

champignon.

Nous nous sommes proposé d’étudier à ce point de vue différents stades

évolutifs chez Coprinus micaceus et Hiatula caepestipes. Les récoltes de Co¬

prinus micaceus ont été faites au voisinage de Robinia pseudoacacia\ celles

de Hiatula caepestipes dans la serre chaude du Muséum d’Histoire Naturelle.

Les champignons furent séchés rapidement dans le vide sur chlorure de cal¬

cium. Les résultats des dosages de l’acide allantoïque sont mentionnés dans

le tableau suivant :

CHAMPIGNONS ÉTUDIÉS

ACIDE

allantoïque

pour 10Q gr.

de plante.

AZOTE

de l’acide

allantoïque.

AZOTE

total.

VALEUR

de R.

C. micaceus, im., Lam. bl., Ch.. . .

0,098 gr.

0,031

g' 1 -

6,0 %

0,51

— sp., Lam. gr., Ch. . . .

0,180 —

0,057

5,3 —

1,08

sp., lam. br., Ch. . . .

0,291 —

0,092

—

5,2 —

1,77

— sp., lam. del., Ch. . . .

0,357 —

0,113

—

5,3 —

2,14

C. micaceus, im., lam. bl., St. . . .

Traces

))

— sp., lam. gr., St. . . .

0,026 —

0,008

—

3,8 —

0,21

— sp., lam. br., St. . . .

0,041 —

0,013

—

3,9 —

0,33

— sp., lam. dél., St. . . .

0,168 —

0,053

—

3,7 —

1,44

H. caepestipes, non épanoui 1 . . .

0,180 —

0,057

—

7,8 —

0,70

— — 1' . . .

0,116 —

0,037

—

7,6 —

0,48

— — 1". . .

0,097 —

0,030

—

7,0 —

0,44

H. caepestipes, épanoui, sp. 2 . . .

0,276 —

0,087

—

8,1 —

1,08

— — 2' . . .

0,290 —

0,092

—

7,7 —

1,19

H. caepestipes, flétri, sp. 3.

0,552 —

0,175

—

7,1 —

2,47

— — 3' . . . .

0,660 —

0,209

—

7,5 —

2,79

— — 3" . . . .

0,779 —

0,242

—

8,0 —

3,09

Mémoires du muséum, uouvelle série, Lomé VI.

98 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PUDIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Les résultats concernant Coprinus micaceus et Hiatula caepestipes montrent

que la valeur du rapport R augmente avec l’évolution du carpophore.

Chez Coprinus micaceus , pour le péridium, la valeur de R passe de 0,51

(champignonnon sporulé)à 2,14(champignonsporulé, lamelles déliquescentes).

Chez Hiatula caepestipes, pour le champignon total, la valeur de R passe

de 0,70 (végétal non sporulé) à 3,09 (champignon flétri).

L’acide allantoïque des Champignons, qui s’accumule jusqu’à la décrépi¬

tude du carpophore, peut être considéré comme le terme ultime de l’allan-

toïnolyse intense qui coïncide chez Coprinus micaceus et Coprinus stercora-

rius avec la sporulation.

Chez les Légumineuses au contraire, l’acide allantoïque est une forme d’ac¬

cumulation d’azote capable de rentrer dans le cycle de nouvelles synthèses

après avoir peut être été désintégré jusqu’au stade ammoniac.

G. — Variation de la teneur en azote allantoïque de Coprinus micaceus

par rapport à l’azote total, au cours des récoltes faites

sur la végétation d’une année.

De nombreuses récoltes de ce champignon faites au voisinage de Robinia

pseudoacacia , s’échelonnant du printemps à l’automne, ont été analysées

tant au point de vue de l’acide allantoïque qu’à celui de l’azote total.

Le champignon a été récolté à deux stades de développement : sporulé et

non sporulé ; les stipes furent séparés des chapeaux. Les échantillons répon¬

daient aux caractéristiques suivantes :

1. Champignon jeune, non sporulé, lamelles blanches . Chapeau.

1'. — — — . Stipe.

2. Champignon âgé, sporulé, lamelles déliquescentes. . Chapeau.

2'. — — — . . Stipe.

Nous avons résumé dans le tableau suivant les valeurs du rapport R

obtenues sur les différents échantillons, 1, 1' et 2, 2 .

date de la récolte

VALEUR DE R

Champignon non sporulé.

Champignon sporulé.

Echantillon i.

Échantillon 1'.

Échantillon 2 .

Échantillon 2 '.

10 mai 1934 .

0,37

»

2,7

0,73

15 mai 1934 .

0,47

»

2,6

0,38

30 mai 1934 .

0,46

»

2,4

0,94

4 juin 1934 .

0,36

0,24

2,8

1,10

21 juin 1934 .

0,46

0,34

2,7

0,56

30 juin 1934 .

0,46

0,36

2,9

1,00

20 juillet 1934 .

0,39

0,28

2,6

0,85

10 septembre 1934. . . .

0,37

0,34

2,7

1,00

27 septembre 1934 ....

0,38

0,36

2,7

1,10

12 octobre 1934 ...

0,25

))

2,0

0,44

10 novembre 1934 . . .

0,11

))

1,9

0,32

l’acide allantoïque chez les champignons basidiomycètes

99

Ces résultats sont traduits par les graphiques ci-dessous (fig. 13).

1° Acide allantoïque du péridium total. — Chez le champignon non sporulé,

la valeur de R reste voisine de 0,4 pour les récoltes faites de mai à septembre ;

puis, pour les échantillons recueillis en octobre-novembre, la teneur en azote

allantoïque diminue nettement par rapport à l’azote total, la valeur de R

s’abaisse alors à 0,1.

Pour le champignon sporulé les mêmes remarques sont applicables ; R

3 -r

pendant la période de mai-septembre reste voisin de 2,7, puis, pour la période

octobre-novembre il diminue et passe à la valeur de 1,9.

2° Acide allantoïque du stipe. — On constate pour le stipe des variations de

même sens que pour le péridium.

En résumé, tandis que la richesse en allantoïnase de différentes récoltes de

Coprinus micaceus , faites du printemps à l’automne 1934, A r arie peu (nous

avons pu démontrer en effet, qu’m vitro , son activité allantoïnolytique pré¬

sente une grande fixité), on constate au contraire une importante diminution

de la teneur en azote allantoïque par rapport à l’azote total pour les récoltes

d’octobre-novembre.

Il semble que pendant cette dernière période, il y ait, avec l’abaissement de

la température, un net ralentissement du catabolisme purique. Cette consta¬

tation est en rapport avec la durée de l’évolution du champignon de l’état

non sporulé à l’état sporulé ; cette durée est en général de trois jours en été et

de huit jours en novembre.

CHAPITRE II

L’ALLANTOÏNE CHEZ LES CHAMPIGNONS BASIDIOMYCÈTES

A. — Recherche qualitative et détermination quantitative de l’allantoïne.

1° Recherche qualitative de l’allantoïne.

La caractérisation de l’allantoïne dans les milieux biologiques était une

opération fort délicate, car si cet uréide possède de nombreuses réactions

qualitatives', celles-ci manquent de spécificité. La seule méthode rigou¬

reuse, celle de Wiechowski (70), basée sur l’isolement de l’allantoïne à l’état

pur et le dosage de l’azote, ne nécessitait pas moins de vingt manipulations

longues et difficiles.

R. Fosse et A. Hieulle (36) démontrent que l’allantoïne se combine au

xanthydrol pour donner la xanthylallantoïne.

C 6 H l

0^ \CH — NH ■ CO • NH — CH — NH

x C 6 H l/ ! \C0

CO — NH X

Quelques milligrammes d’allantoïne peuvent être transformés en ce nouveau

composé fondant à 214-215°. La xanthylallantoïne se dissout dans les bases

diluées (HOK nj 20), et se transforme lentement en xanthylallantoate de

potassium qui précipite à l’état cristallisé. Sur cette propriété repose une

nouvelle méthode de recherche de l’allantoïne ; elle a été appliquée au contenu

cellulaire de PhaseoluS vulgaris et aux feuilles d 'Acer pseudoplatanus (Fosse),

aux feuilles de Platanus orientalis et à l’urine des Animaux (Hieulle).

Enfin l’allantoïnase, enzyme spécifique de l’allantoïne, permet à R. Fosse

et à ses collaborateurs d’établir un procédé très rapide de recherche de cet

uréide et d’étudier sa répartition chez les Animaux et les Végétaux (29,32).

2° Détermination quantitative de l’allantoïne.

Au point de vue quantitatif, le procédé de dosage de Wiechowski (70) a

permis d’accumuler d’importants résultats sur le métabolisme de l’azote

I. On trouvera dans un travail de J. More intitulé « Sur une réaction de l'allantoïne

applicable à son dosage ». ( Journ. Pharm. et Chim. 7, p. 209, 1927), tous les renseigne¬

ments bibliographiques concernant cette question.

i.’allantoïne chez les champignons basidiomycètes

101

purique chez les Mammifères ; mais cette méthode n’est plus applicable quand

il s’agit de doser de petites quantités d’allantoïne, en particulier chez les

Champignons où la teneur en cet uréide est toujours peu élevée.

En 1929, R. Fosse et V. Bossuyt (22) démontrent que le dosage se ramène

à celui de l’urée produite par l’action successive des bases et des acides sur

l’allantoïne. L’allantoate de potassium formé d’abord

H-NCONH— CH — NH

I

CO — NH

^>CO

HOK

H 2 N • CO • NH

/CH ■ COOK

H*N • CO • NH /

se scinde ensuite en urée et acide glyoxylique

HN-CO-M1.

>CH COOK

H N CO ■ Mr

+ C1H + HO

NH 2 CHO

20C( + | + Cl K.

X NH 2 COOH

Mais cette méthode 1 applicable à des solutions pures d’allantoïne ne l’est

plus aux milieux biologiques contenant guanéides, uréides, protides ; car il

faut alors tenir compte de l’urée préformée, engendrée ou détruite, par l’action

des bases sur ces substances.

R. Fosse, A. Brunel et P. De Graeve (27) établissent que le processus

,„ Allantoïnase ,

Allantoïne->■ Acide allantoïque

est total en présence de sesqui-carbonate d’ammonium ou d’urée ; cette

réaction leur permet d’établir un procédé de dosage de l’allantoïne, applicable

aux milieux biologiques même en présence de l’urée, la teneur en allantoïne

devant être supérieure à 0,15 gr. par litre.

Description de la méthode de dosage pondéral de l’allantoïne. —

Préparation d'une allantoïnase active. — On prépare une macération aqueuse

à 1 /10 de farine de Soja hispida (25 gr.) dans l’eau glacée (250 cc.) ; après deux

heures on centrifuge, on filtre et on précipite le filtrat par l’éthanol à 96°

glacé (5 volumes).Le précipité est centrifugé très rapidement à fond,lavé deux

fois à l’éther anhydre par centrifugation et séché dans le vide sur chlorure de

calcium. La poudre obtenue par broyage est alors reprise par l’eau glacée

(macération à 1 /20) ; après deux heures, on filtre sur coton ou sur amiante,

on précipite par cinq volumes d’éthanol à 96°, on lave deux fois à l’éther

anhydre par centrifugation et on sèche dans le vide sur chlorure de calcium.

Il convient de vérifier que la poudre fermentaire ainsi obtenue, soluble

dans l’eau, transforme quantitativement en acide allantoïque une solution

d’allantoïne à 1 gr. par litre.

1. Les procédés de dosage de Kishijn Ro (49) et de Frank W. Allen et R. Cefiecedo (40)

étant des modilications de cette méthode, nous ne les décrirons pas.

102 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PÜRIQDE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Technique du dosage pondéral de Vallantoïne. — La liqueur à analyser

(5-10 ce.), contenant 1 % de poudre fermentaire de Soja et 2 % 0 de sesqui-car-

bonate d’ammonium est placée dix heures au bain d’eau à 39° (après ce temps

l’allantoïne est totalement hydrolysée en acide allantoïque par l’allantoïnase).

Puis les milieux à doser, neutralisés par ClHn en présence d’hélianthine, amenés

à un titre acide environ n /20 par C1H n (0,25-0,5 cc.), sont portés pendant

trente minutes au bain d’eau à 60° pour hydrolyser l’acide allantoïque en urée

et acide glyoxylique ; ils sont ensuite refroidis par l’eau, alcalinisés par HONa

concentrée et déféqués par le réactif de Tanret-Fosse (0,5-1,5 cc.) de formule :

Chlorure mercurique. 2,7 gr.

Iodure de potassium. 7,2 gr.

Acide acétique cristallisable. 66,6 cc.

Eau pour amener le volume à.100,0 cc.

On filtre sur entonnoir de Joulie dans une éprouvette graduée de manière à

obtenir après trois lavages un volume final de 12 à 17 cc. Le filtrat est trans¬

vasé dans une fiole conique à bec ; l’éprouvette est rincée trois fois avec de

l’acide acétique cristallisable (en employer un volume double du filtrat soit

24-34 cc.). On ajoute alors à la liqueur une solution de xanthydrol au 1 /10

dans le métbanol (1 /20 du volume total soit 1,8-2,5 ce.). Après trois à quatre

heures de condensation, la xantbylurée (UX 2 ) est recueillie sur un entonnoir

concave, lavée trois fois à l’alcool à 50° et séchée à l’étuve à 100°. La pastille

de dixanthylurée détachée du papier filtre est pesée directement à la balance

de précision.

Allantoïne en fonction de UX a =

UX 2

7

X

Allantoïne

2 Urée

UX J 158

7 X 120 —

= UX 2 X 0,18 8

Nota. — Dans le cas où le milieu à doser renfermerait de l’acide urique, on

ajoute 1 /10.000 de cyanure de potassium qui inhibe l’uricase et élimine la

cause d’erreur due à la transformation enzymatique de cet acide en allantoïne.

La méthode pondérale très précise donne d’excellents résultats pour des

teneurs en allantoïne supérieures à 0,15 gr. par litre ; au-dessous de cette

teneur, il faut concentrer pour ramener le dosage dans les limites indiquées-

Pour cette raison l’application aux champignons en est délicate ; il est alors

préférable d’utiliser la méthode de dosage spectrophotométrique de l’allan-

toïne que nous allons décrire.

Dosage spectrophotométrique de l’allantoïne.

R. Fosse, A. Brunel et P.-E. Thomas (31) dosent l’allantoïne par spec-

trophotométrie. Dans ce but ils utilisent

1° La propriété que possède l’acide allantoïque de se scinder quantitative¬

ment en acide glyoxylique et urée.

l’allantoïnk chez les champignons basidiomycètes 103

2° La coloration rouge que donne cet acide-aldéhyde avec le réactif

phénylhydrazinique de Schryver-Fosse l .

La mesure au spectrophotomètre de la densité d’absorption de la solution

colorée produite par l’acide glyoxylique avec ce réactif permet, dans des

conditions déterminées, le dosage de l’acide allantoïque et par suite de l’allan-

toïne. Ce procédé très sensible est applicable à des teneurs en allantoïne infé¬

rieures à 0,1 gr. par litre. En opérant en présence de cyanure de potassium qui

inhibe l’uricase, on évite l’erreur due à la présence possible de l’acide urique

dans le champignon étudié.

Technique du dosage spectrophotométrique de Vallantoïne. — Dans un tube

à centrifuger contenant un poids p de champignon on ajoute 5 à 10 cc. d’une

solution aqueuse à 2 % 0 de sesqui-carbonate d’ammonium et à 1 /10.000 de

cyanure de potassium, puis 1 % de poudre fermentaire de Soja et du chloro¬

forme (V gouttes). On porte les milieux à doser pendant douze heures au bain

d’eau à 39° ; l’allantoïne est transformée intégralement en acide allantoïque.

Le milieu fermentaire est alors déféqué par le tungstate de sodium à 10 %

et l’acide sulfurique 2/3 n, centrifugé, filtré sur entonnoir de Joulie dans une

fiole jaugée ; le précipité est lavé trois fois avec Cl H n/100 en ayant soin

d’ajouter à chaque lavage, avant centrifugation, une goutte de tungstate et

une goutte d’acide et on amène finalement à un volume connu V avec C1H

n/100.

Réaction colorée. — On place deux minutes au bain d’eau bouillante dans

un tube à essai

Liqueur déféquée.2 cc.

Solution de chlorhydrate de phénylhydrazine

à 1 p. 100.0,1 cc. (II gouttes).

puis après refroidissement rapide, on ajoute

Acide chlorhydrique concentré pur.1,2 cc.

Solution de ferricyanure de potassium à 5 %. 0,1 cc. (II gouttes).

On mesure au spectrophotomètre dans une cuvette de 1 cm. d’épaisseur

pour 1 = 5.200 A la densité d’absorption totale 8=2 colog. sin 9 (9 = angle

lu à l’appareil). La même mesure 3 0 = 2 colog. sin 6 0 est effectuée sur un

mélange n’ayant pas subi l’action de la chaleur.

La différence 8 — o 0 = A est la densité d’absorption de la solution colorée

produite par l’acide glyoxylique provenant de l’acide allantoïque. De A on

déduit la teneur en acide allantoïque (mgr. par litre) de la solution, en se

1. D’après E. Stransky (67) la réaction glyoxylique de Fosse n’est pas caractéristique de

l'acide allantoïque, elle serait donnée aussi par l'allantoïne à chaud, surtout en présence

d’acide acétique fort. Nous tenons à faire remarquer :

1° Que l’allantoïne pure ne donne pas la réaction glyoxylique.

2° Que la coloration observée par cet auteur est due à l’acide acétique seul.

104 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE l’AZOTE PÜRIQÜE CHEZ LES CHAMPIGNONS

reportant à la courbe des concentrations en acide allantoïque en fonction des

densités d’absorption.

Si p est le poids de champignon servant au dosage, V le volume de la liqueur

avant la mesure au spectrophotomètre, A la teneur en acide allantoïque en

grammes par litre, la quantité d’acide allantoïque contenu dans p de cham¬

pignon sera donnée par

A X Vcc.

1.000

A x V

et pour 1000 gr. de champignon - .

P

La quantité d’allantoïne dans 1000 gr. de champignon sera de :

A X V Allantoïne _ A X V 158 A X V

p ^ Acide allantoïque p ^ 176 p X , 1 •

Nota. — Dans le cas où le champignon étudié renfermerait de l’acide allan¬

toïque, un dosage préalable permettra d’en tenir compte.

Si A,, est la teneur en acide allantoïque préexistant,

A, la somme : A p -j- acide allantoïque de l’allantoïne, la différence

Ai — A f

représentera la teneur en acide allantoïque provenant do l’allantoïne. La

teneur en allantoïne sera donnée par

158

(Ai — A„) X -ÿjQ = (Ai - A,,) X 0,897.

Application. — Dosage de Vallantoïne dans Collybia butyracea. — Le cham¬

pignon total est séché dans le vide sur chlorure de calcium puis réduit en poudre

fme. La recherche de l’acide allantoïque dans cette poudre étant positive, on

procède au dosage de cet uréide par spectrophotométrie.

Dosage de Vacide allantoïque. — On pèse 0,1 gr. de poudre de Collybia

butyracea que l’on introduit dans un tube à centrifuger avec 5 cc. d’acide

chlorhydrique n/ 20 glacé qui détruit les enzymes. Après trente minutes de

contact on neutralise par le carbonate d’ammonium, on défèque par le tungs-

tate de sodium à 10 % et l’acide sulfurique 2 /3 n, on centrifuge, on filtre, on

lave trois fois avec C1H n/100 par centrifugation, en ayant soin d’ajouter à

chaque lavage une goutte de tunsgtate et une goutte d’acide et on amène

au volume de 50 cc.

On place deux minutes au bain d’eau à 100° dans un tube à essai

Liqueur déféquée.2 cc.

Solution de chlorhydrate de phénylhydrazine

àl%

0,1 cc. (II gouttes).

l’allantoïne chez les champignons BASIDIOMTCÈTES

105

puis après refroidissement on ajoute

Acide chlorhydrique concentré pur.1,2 cc.

Solution de ferricyanure de potassium à 5 %. 0,1 cc. (II gouttes).

On mesure au spectrophotomètre la densité d’absorption totale 3 =

2 colog. sin 9 (0 = 16°30), on effectue la même mesure sur un mélange n’ayant

pas subi Faction de la chaleur 3 0 = 2 (colog. sin. 9 0 (9 0 = 55°). D’où 3„ =

173 et 3 = 1093 et 8 — 3 0 = A = 920. En se reportant à la courbe des den¬

sités d’absorption en fonction de la concentration en acide allantoïque on

trouve

A = 920 soit 6,4 mgr. d’acide allantoïque par litre.

D’où acide allantoïque pour 1000 gr. de poudre de Collybia butyracea

0,0064 X 1.000

2

= 3,20 gr.

et en tenant compte de l’humidité restante qui est égale à 6 % on a

Acide allantoïque pour 1000 gr. de poudre de Collybia butyracea séchée à 100°

3,20 X 100

94

3,4 gr.

Dosage de Vallantoine. -—On pèse 0,05 gr. de poudre de Collybia butyracea ,

on ajoute de l’eau (5 cc.) contenant 2 % 0 de sesqui-carbonate d’ammonium.

1 /10.000 de cyanure de potassium et du chloroforme (V gttes). On aban¬

donne le milieu à doser au bain d’eau à 39 3 pendant une nuit, l’allantoïne

est totalement hydrolyséeen acide allantoïque que l’on dose par spectropho-

tométrie. Volume avant dosage = 50 cc.

Résultats : 9 0 = 59°, fl = 18°, S 0 = 133, 8 = 1020, A = 3 — 8„ = 887 soit

6,17 mgr. d’acide allantoïque pour 1000 cc. de la solution.

D’où

Acide allantoïque total pour 1000 gr. de champignon séché dans le vide

0,00617x 1.000

- -, -— = 6,17 gr.

Acide allantoïque de l’allantoïne : 6,17 — 3,20 = 2,97 gr.

Allantoine pour 1000 gr. de champignon séché dans le vide :

2,97 X 0,897 == 2,66 gr.

Allantoine pour 1000 gr. de champignon séché à 100°.

2,66 X 100

94

= 2,8 gr.

106 A. BRONEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PUKIQÜE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Nota .—Nous avons insisté particulièrement sur le dosage de l’allantoïne,

car il demande beaucoup de soins et le mode opératoire doit toujours être

strictement suivi ; dans ces conditions seulement on obtiendra des chiffres

corrects.

Nous avons résumé, dans le tableau suivant, les résultats du dosage de l’al-

lantoïne dans quelques champignons :

CHAMPIGNONS ÉTUDIÉS

ALLANTOÏNE

pour 1000 gr.

de plaute séchée à 100°.

Rhodophyllus solstitialis sp. ..0,72 gr.

— icterinus sp.0,50

Androsaceus vulgaris sp. 0,90

Mycena alcalina sp.1)27

— pelianthina sp.1,10

Collybia dryophila sp. 0,25

— — sp. Chapeau.0,46

— sp. Stipe.0,10

Collybia maculata non sp.1,96

— — sp.' . . . 1,25

Collybia distorta sp.1,44

— ambusta sp.1,45

Pleurotus eryngii sp.0,24

Clitocybe infundibuliformis sp. 1.0,53

— — 2.0,31

— — 3.0,70

Clitocybe cyathijormis sp.0,88

Amanita phalloides sp.0,10

Amanita spissa sp.0,20

Lepiota cristata sp.0,74

— acutesquamosa sp. ..0,65

Pluteus cervinus sp.0,10

— — var. eximius sp.0,09

Inocybe Bresadolae sp.0,35

— eutheles sp.0,48

Hebeloma radicosum sp.1,13

Naucoria melinoïdes sp. 1,07

Pholiota cylindracea sp.0,36

•— praecox sp.0,10

Leucocoprinus excorialus sp. 1,09

— mastoïdeus sp.0,57

— — non sp.1,38

Leucocoprinus procerus sp.1,30

— rhacodes sp. âgé.4,69

naucinus sp.1,10

l’allantoïne chez les champignons basidiomïcètes

107

ALLANTOÏNE

CHAMPIGNONS ÉTUDIÉS , pour 1000 gr

de plante séchée a 1Q(K

Hiatula caepestipes nonsp.1,06 gr.

— — sp.1,00

Panaeolus papilionaceiis sp.0,41

— campanulatus sp. 1,21

Psathyrella gracilis sp.0,48

Psilocybe foenisecii sp.0,95

Coprinus comatus sp.0,90

— atramentarius sp.1,00

— lagopus sp.0,30

— plicatilis sp.0,25

Comme l’acide al]antoïque,l’allantoïneestlargement répandue cliezlesCham¬

pignons où elle coexiste fréquemment dans le même carpophore, comme nous

nous proposons de le démontrer, avec les enzymes uricase et allantoïnase.

B . — Coexistence fréquente de l’allantoïne, de l’acide allantoïque

et des enzymes uricase et allantoïnase dans le même carpophore.

Nous avons étudié au point de vue des uréides glyoxyliques et des enzymes

uricase et allantoïnase trois échantillons moyens de Coprinus micaceus pris à des

stades de développement différents répondant aux caractéristiques suivantes :

1. Champignon jeune, non sporulé, lamelles blanches,

2. Champignon sporulé, lamelles brunes,

3. Champignon âgé, lamelles déliquescentes.

Après dessiccation dans le vide sur chlorure de calcium les champignons

sont réduits en poudre fine. On procède alors au dosage des uréides glyoxy¬

liques et à la recherche des enzymes.

1° Dosage de l’acide allantoïque. — Il a été effectué par spectrophoto-

métrie. Résultats :

ÉCHANTILLON

POUR 1000 GR. DE PLANTE

SÉCHÉE

dans le vide

à 100°.

Humidité restante.

Acide allantoïque.

î

5,4 %

0,71 gr.

0,75 gr.

2

5,3

2,81 —

2,96 —

3

5,5 —

4,44 —

4,69 —

108 A. BRUXEL. —• MÉTABOLISME DE l’aZOTE PORIQÜE CHEZ LES CHAMPIGNONS

2° Dosage de l’allantoïne. — - L’allantoïne a été dosée par spectro-

photométrie, après transformation en acide allantoïque par l’action de Fallan-

toïnase de Soja. Résultats :

ÉCHANTILLON

ACIDE ALLANTOÏQUE

pour 1000 grammes de plante séchée dans le vide

ALLAN TOÏNE

pour 1000 gr. de plante séchée

total.

préexistant.

de l’allantoïne.

dans le vide.

à 100°.

a

1,81 gr.

0,71 gr.

1,10 gr.

0,98 gr.

1,04 gr.

2

4,47 —

2,81 —

1,66 —

1,48 —

1,56 —

3

5,89 —

4,44 —

1,45 —

1,29 —

1,37 —

3° Recherche de l’allantoïnase et de l’uricase. — La recherche de

l’allantoïnase et de Furieuse est positive pour les trois échantillons de Coprinus

micaceus étudiés.

Il est donc possible de mettre en évidence simultanément chez Coprinus

micaceus les uréides glyoxyliques et les enzymes uricase et allantoïnase.

L’étude de nombreux champignons conduit à des résultats identiques que nous

avons réunis dans le tableau suivant :

CHAMPIGNONS ÉTUDIÉS

RECHERCHE DE

POUR

lüûû grammes de plante

Uricase.

Allantoïnase.

Allantoïne.

Acide

allantoïque.

Rhodophyllus solstitialis .

+

4-

0,72 gr.

6,68 gr.

Androsaceus vulgaris .

+

0,90 —

2,11 —

Collybia dryophila total.

+

4-

0,25 —

1,73 —

— — chapeau. . . .

+

0,46 —

4,06 —

— — stipe.

+

0,10 —

0,82 —

Collybia maculata 1.

4-

+

1,96 —

1,74 —

— — 2 .

+

1,25 —

1,73 —

Collybia distorta .

+

4-

1,44 —

0,94 —

ambusta .

+

1,45 —

2,36 —

Clitocybe infundibuliformis 1 . . .

+

0,53 —

1,96 —

— — 2 . . .

+

0,31 —

2,60 —

— — 3 . . .

+

-F

0,70 —

1,33 —

Lepiota acutesquamosa .

+

0,65 —

1,59 —

— cristata .

+

4-

0,74 —

4,47 —

Pluteus cervinus .

+

0,10 —

1,22 —

Inocybe Bresadolae .

+

4-

0,35 —

1,02 —

—• eutheles .

+

4-

0,48 —

2,45 —

Naucoria melinoides .

+

4-

1,07 —

0,10 —

Pholiota praecox .

+

0,10 —

1,01 —

l’allantoïne chez les champignons basidiomycètes

109

CHAMPIGNONS ÉTUDIÉS

RECHERCHE DE

POUR

1000 grammes de plante.

[Jricase.

Allantoïnase.

Allantoïne.

Acide

allantoïque.

Pholiota cylindracea .

+

0,36 gr.

2,80 gr.

Leucocoprinus excoriatus .

+

1,09 —

2,88 —

procerus .

+

1,30 —

3,65 —

— rhacodes .

+

4,69 -

3,80 —

— naucinus .

+

0,10 —

2,18 —

Hiatulacaepestipes jeune .

+

1,06 —

1,80 —

— — âgé .

+

0,24 —

6,74 —

Panaeolus papilionaceus .

+

0,41 —

1,09 —

— campanulatus .

+

1,21 —

1,22 —

Pseudocoprinus dissem.inatus. . . .

+

1,00 —

1,72 —

Psathyrella gracilis .

+

0,48 —

1,14 —

Psilocybe foenisecii .

+

0,95 —

1,79 —

Copnnus comatus sp .

+

0,90 —

3,00 —

— atramentarius sp .

+

1,00 —

2,40 —

— lagopus sp.

+

0,30 —

4,80 —

— plicatilis sp.

_L

+

0,25 —

0,70 —

Les deux uréides glyoxyliques, allantoïne et acide allantoïque, se ren¬

contrent souvent simultanément dans le même champignon accompagnés

des enzymes uricase et allantoïnase. Cette coexistence fréquente pose le pro¬

blème de l’origine de l’acide allantoïque chez les Champignons : cet acide

dérive-t-il de l’allantoïne comme chez les Végétaux supérieurs ? (26).

Avant de répondre à cette question nous examinerons tout d’abord les

rapports :

1° Entre l’azote de l’allantoïne,

2° Entre l’azote contenu dans F allantoïne et l’acide allantoïque,

3° Entre l’azote de l’ensemble (allantoïne, acide allantoïque et urée)

d‘une part, et l’azote total d’autre part.

C. — Allantoïne en fonction de l'azote total chez les Champignons.

Connaissant la teneur en allantoïne de quelques champignons, il nous est

possible de calculer le rapport

R,

Azote de l’allantoïne

Azote total

X 100.

et de juger de l’importance relative de cet uréide par rapport à l’azote

total.

l'IO A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQDE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Résultats :

CHAMPIGNONS ÉTUDIÉS

ÀLLÀN-

TOÏNE

pour 100 gr,

de plante.

AZOTE

de

l'allautoïne.

AZOTE

total

%

VALEUR

do R.

Rhodophyllus solstitialis sp.

0,110 gr.

0,039 gr.

10,8

0,35

— icterinus sp.

0,05 —

0,0177 —

4,7

0,37

Mycena alcalina sp.

0,127 —

0,045 —

6,3

0,71

— pelianthina sp.

0,110 —

0,039 —

6,4

0,60

Collybia dryophila sp.

0,025 —

0,0088 —

6,1

0,14

— — sp. Ch.

0,046 —

0,0163 —

7,0

0,23

— — sp. St.

0,010 —

0,0035 —

4,4

0,08

Collybia mandata sp. 1 .

0,196 —

0,0694 —

6,5

1,06

— — 2.

0,125 —

0,0443 —

6,6

0,67

Collybia distorta sp. .

0,144 —

0,051 —

6,5

0,78

— ambusta .

0,145 —

0,0514 —

5,7

0,90

Clitoeybe injundibulijormis sp. J . .

0,053 —

0,0187 —

7,5

0,25

— — 2. .

0,031 —

0,0109 —

7,9

0,14

- - ' . .

0,070 —

0,0248 —

7,7

0,32

Clitoeybe cyathiformis sp. ....

0,088 —

0,0311 —

6,6

0,47

Amanita phalloides sp . . .

0,010 —

0,0035 —

6,6

0,05

Lepiota acutesquamosa sp.

0,065 —

0,023 —

6,6

0,35

Lepiota cristata sp..

0,074 —

0,0262 —

8,3

0,31

Pholiota cylindraeea sp. . . . . .

0,036 —

0,0127 —

7,8

0,16

— praecox sp .

0,010 —

0,0035 —

6,6

0,05

Leucocoprinus excoriatus sp .

0,109 —

0,0386 —

7,7

0,50

— mastoideus sp. . . .

0,057 —

0,0202 —

7,4

0,27

— procerus sp .

0,130 —

0,046 —

7,4

0,62

— rhacodes sp. âgé. . .

0,469 —

0,166 —

11,9

1,39

— naucinus sp .

0,100 —

0,0354 —

8,5

0,41

Iliatulacaepestipes im.

0,106 —

0,0481 —

7,8

0,48

— — sp .

0,100 —

0,0354 —

8,0

0,44

Coprinus comatus sp .

0,094 —

0,032 —

5,7

0,56

— atramentarius sp .

0,100 —

0,0354 —

4,9

0,72

— micaceus im, . ♦ . . . .

0,104 —

0,0368 —

5,7

0,64

— — sp., Lam.br.. .

0,156 —

0,0553 —

5,5

1,05

— — sp., lam. del.. .

0,137 —

0,0485 —

5,3

0,91

Contrairement à ce que nous avons vu pour l’acide allantoïque, la valeur du

rapport

Ri

Azote de l’allantoïne

Azote total

X 100

est toujours peu élevée, l’allantoïne, terme intermédiaire, étant en majeure

partie hvdrolysée en acide allantoïque par l’allantoïnase.

l'allantoïne chez les champignons basidiomycètes

111

D. — Acide allantoïque et allantoïne

en fonction de l’azote total chez les Champignons.

Nous avons indiqué dans ce tableau les valeurs du rapport

R,

N acide allantoïque -f- N allantoïne

Azote total

X 100

montrant l’importance de l’azote des uréides glyoxyliques par rapport à

l’azote total chez quelques champignons.

CHAMPIGNONS ÉTUDIÉS

POUR

100 grammes de plante.

N.ALLAN¬

TOÏNE

+

N. Acide

allantoïque.

AZOTE

VALEUR

Allantoïne.

Acide

allantoïque.

total.

de R*.

Rhodophyllus solstitialis sp. .

0,110 gr.

0,672 gr.

0,2528 gr.

10,8 %

— icterinus sp. . .

0,05 —

0,041 —

0,0307 —

4,7 —

Mycena alcalina sp.

0,127 —

0,367 —

0,164 —

6,3 —

LwV'lWs

— pelianthina sp. . . .

0,110 —

0,493 —

0,196 —

6,4 —

3,06

Collybia dryophila sp. . . .

0,025 —

0,266 —

0,0928 —

6,1 -

1,52

— — sp. Ch. . .

0,046 —

0,406 —

0,1453 —

7,0 -

2,07

— -— sp. St. . .

0,010 —

0,082 —

0,0296 —

4,4 —

0,67

Collybia maculata sp. 1 . . .

0,196 —

0,075 —

0,0932 —

6,5 —

1,43

— — 2 . . .

0,125 —

0,084 —

6,6 —

1,27

Collybia distorta sp.

0,144 —

0,094 —

0,0813 —

6,5 —

1,25

— ambusta sp.

0,145 —

0,236 —

0,1264 —

5,7 —

2,21

Clitocybe infundibuliformis

sp. 1.

0,053 —

0,133 —

0,0609 —

7,5 -

0,81

Clitocybe infundibuliformis

sp. 2.

0,031 —

0,196 —

0,0732 —

7,9 —

0,92

Clitocybe infundibuliformis

sp. 3.

0,070 —

0,260 —

0,1075 —

7,7 —

1,39

Clitocybe cyathiforrnis sp.. . .

0,088 —

0,230 —

0,1041 —

6,6 —

1,57

Amanita phalloides sp.

0,010 —

0,070 —

0,0255 —

6,6 —

0,38

Lepiota acutesquamosasp. . .

0,065 —

0,159 —

0,073 —

6,6 —

1,10

— cristata sp.

0,074 —

0,447 —

0,1682 —

8,3 —

2,02

Pholiota praecox sp.

0,010 —

0,261 —

0,0865 —

6,6 —

1,31

cylindracea sp. . . .

0,036 —

0,280 —

0,1017 —

7,8 —

1,30

Leucocoprinus excoriatus sp. .

0,109 —

0,288 —

0,1296 —

7,7 —

1,68

— rnastoideus sp..

0,057 —

0,196 —

0,0822 —

7,4 —

1,11

— procerus sp. . .

0,130 —

0,365 —

0,162 —

7,4 —

2,18

— rhaeodes sp.âgé.

0,469 —

0,380 —

0,287 —

11,9 —

2,41

— naucinus sp. .

0,100 —

0,218 —

0,104 —

8,5 —

1,23

Hiatulacaepestipes im. . . .

0,106 —

0,186 —

0,1073 —

7,8 —

1,37

— — sp.

0,100 —

0,770 —

0,2832 —

8,0 —

3,54

Coprinus comatus sp.

0,090 —

0,300 —

0,127 —

5,7 -

2,22

— atramentarius sp. . .

0,100 —

0,240 —

0,114 —

4,9 —

2,27

— micaceus sp., lam. br.

0,156 —

0,296 —

0,1495 —

5,5 —

2,71

— — sp.,lam.dél.

0,137 —

0,469 —

0,1977 —

5,3 —

3,73

— — im.,lam. bl.

0,104 —

0,075 —

0,0606 —

5,7 —

1,06

112 A. BRUNEL. - MÉTABOLISME DE L’AZOTE PÜRIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

„ N allantoïne + N acide allantoïque ,

Le rapport R; =- Aa.te total -~ X 100

qui mesure l’importance de l’azote des uréides glyoxyliques par rapport à

l’azote total est en général supérieur à 1.

D’autre part ce tableau permet de constater que :

1° Ro varie d’une espèce à l’autre,

2° IL, pour une même espèce, augmente régulièrement avec la maturation

du carpophore,

3° L’azote de l’acide allantoïque entre pour une large part dans la valeur

de R;. En effet, la plus grande partie de l’azote de l’allantoïne est passée à

l’état d’azote allantoïque, sous l’influence de l’allantoïnase que nous avons

pu mettre en évidence dans tous les champignons étudiés.

E. — Acide allantoïque, allantoïne et urée

en fonction de l'azote total chez quelques champignons.

Chez de nombreux champignons appartenant aux genres Lepiota, Leuco-

coprinus , Hiatula et Agaricus, l’acide allantoïque est accompagné de notables

quantités d’urée.

Chez ces espèces le métabolisme des substances azotées emprunte au moins

deux voies principales ; une partie importante de l’azote passe à l’état d’urée,

une autre partie passe à l’état d’acide allantoïque et d’allantoïne.

Pour déterminer l’importance relative de ces deux processus, nous avons

dosé, chez ces champignons, les deux uréides glyoxyliques par spectro-

photométrie, l’urée à l’état de dixanthylurée et l’azote total par micro-

Kjeldahl ; puis nous avons calculé le rapport

N acide allantoïque + N allantoïne + N urée

3 Azote total

Les résultats sont consignés dans le tableau delà page 113; mais, avant

de les discuter, nous allons décrire rapidement la méthode de dosage de l’urée.

Dosage de l’urée chez les champignons.

Pour éviter des erreurs en excès sur la teneur en urée libre, dues à la préci¬

pitation possible d’acide dixanthylallantoïque lors du dosage de la carbamide

par le xanthydrol, nous profitons de la propriété que possède l’acide allantoïque

de se scinder quantitativement en urée par hydrolyse chlorhydrique et nous

déterminons directement la somme

Urée totale = Urée libre -f- Urée de l’acide allantoïque.

De plus, on connaît la teneur T en acide allantoïque par spectrophoto-

métrie d’où il est facile de calculer l’urée correspondante U ; on a en effet

2 Urée _ 120

U = TX

- = T

Acide allantoïque " 176

l’ALLANTOÏNE CHEZ LES CHAMPIGNONS BAsIDIOMYCÈTES

D’où l’on a : Urée libre = Urée totale — U.

113

Mode opératoire. — Dans un tube à centrifuger on pèse de 0,1-0,25 gr. de

champignon préalablement séché dans le vide et réduit en poudre fine, on

ajoute de l’eau (5-10 cc.) et on amène à un titre acide de ’n /20 environ avec

l’acide chlorhydrique normal (0,25-0,5 cc. de CUI ri) en présence d’hélian¬

thine. Le milieu servant au dosage est porté au bain d’eau à 60° pendant

trente minutes, refroidi, alcalinisé par HONa concentrée, déféqué par le

Tanret-Fosse (1-1,5 cc.), centrifugé, filtré sur filtre sans pli et sur entonnoir

de Joulie dans une éprouvette graduée. Le précipité est lavé à l’eau (3 fois)

chargée de Tanret-Fosse, de manière à avoir un volume de 12 à 17 cc. On

transvase alors le filtrat dans une fiole conique, on ajoute un volume double

d’acide acétique cristallisable (24-34 cc.) et du xanthydrol en solution dans le

méthanol au 1 /10 (1 /20 du volume total soit 1,8-2,5 cc.). Après trois heures

de condensation la xanthylurée est reçue sur un entonnoir concave, la pastille

est lavée trois fois avec l’éthanol à 50°, puis séchée à l’étuve à 100° et pesée.

D'où l’urée en fonction de la xanthylurée (UX -) de la prise d’essai

Urée = UX- X Xan , t , h?lu '' ée = -ÏÏL.

Uree 7

On rapportera les résultats à 100 gr. de champignon sec et on tiendra

compte de l’humidité restante que l’on déterminera par dessiccation à l’étuve

à 100° jusqu’à poids constant.

ESPÈCES ÉTUDIÉES

100 GRAMMES DE

contiennent

PLANTE

N. URÉE

-f- acide

allantoïque

~h

nllantoïne.

AZOTE

total

ta

P M

w ça

j ©

< -o

>

Urée.

Acide

allantoïque.

Allantoïuc.

Lepiota cristata .

3,17 gr.

0,447 gr.

0,074 gr.

1,647 gr.

8,3 %

19,8

— acutesquamosa . .

0,498 —

0,159 —

0,065 —

0,315 —

6,6 —

4,7

Leucocoprinus mastoideus .

1,21 —

0,196 —

0,057 —

0,647 —

7,4 —

8,7

— excoriatus .

1,54 —

0,288 —

0,109 —

0,848 —

7,7 —

11,0

— rhacodes âgé.

6,90 —

0,380 —

0,469 —

3,507 —

11,9 —

29,4

— procerus . .

2,14 —

0,365 —

0,130 —

1,161 —

7,4 —

15,6

— naucinus . .

2,12 —

0,218 —

0,100 —

1,094 —

8,5 —

12,8

Hiatula caepestipes im. . .

0

0,186 —

0,106 —

0,107 —

7,8 —

1,3

— im. . .

0

0,116 —

0,085 —

0,067 —

7,6 —

0,88

— — im. . .

0

0,097 —

0,077 —

0,058 —

7,0 —

0,83

— — sp. . .

2,52 —

0,276 —

0,127 —

1,309 —

8,1 —

16,1

— — sp. . .

2,17 —

0,290 —

0,140 —

1,154 —

7,7 —

14,9

— — sp. âgé.

5,52 —

0,552 —

0,180 —

2,825 —

7,1 —

39,7

— sp. âgé.

3,18 —

0,660 —

0,155 —

1,749 —

7,5 —

23,3

— — sp. âgé.

4,00 —

0,779 —

0,100 —

2,150 —

8,0 —

26,8

Agaricus campes ter sp. . .

3,52 —

0,070 —

0,05 —

1,683 —

7,7 —

21,8

— arvensis sp . . .

1,41 —

0,040 —

0,03 —

0,681 —

6,6 —

10,3

— xanthodermus sp..

3,08 —

0,060 —

0,01 —

1,492 —

9,4 —

15,8

— silvicola sp.. . .

1,52 -

0,080 —

0,08 —

0,763 —

8,4 —

9,0

Mémoires du muséum, nouvelle série, Lomé VI.

8

114 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

L’importance de l’azote uréique et de l’azote des uréides glyoxyliques par

rapport à l’azote total est très grande chez les espèces appartenant aux genres

Lepiota , Leucocoprinus , Hiatula et Agaricus.

Chez Hiatula caepestipes où nous avons étudié des échantillons répondant

à des stades de développement différents, on constate que l’urée et l’acide

allantoïque augmentent parallèlement : la valeur de R ; , passe en moyenne de

1 pour le végétal non sporulé à 15 pour le champignon sporulé, puis R :i devient

supérieur à 25 pour le champignon sporulé âgé.

Au contraire, chez les espèces du genre Agaricus , seul le métabolisme uréique

est très marqué ; la valeur de R 3 qui est voisine de 15 ne représente pratiquement

que l’importance du métabolisme uréique. Nous avons d’ailleurs vu que chez

les Agarics l’allantoïnase était peu active et la teneur en acide allantoïque et en

allantoïne toujours peu élevée.

CHAPITRE III

ORIGINE DES URÉIDES GLYOXYLIQUES

CHEZ LES CHAMPIGNONS BASIDIOMYCÈTES

MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE ET URÉIQUE

CHEZ LES AMANITACEAE, CORTINARIACEAE, COPRINACEAE.

APPLICATION A LA SYSTÉMATIQUE DES NOTIONS CONCERNANT

L’ALLANTOÏNASE ET LE MÉTABOLISME DE L AZOTE

A. — Origine de l’acide allantoïque chez les Champignons Basidiomycètes.

Les deux uréides glyoxyliques allantoïne et acide allantoïque coexistent

fréquemment dans le même carpophore ; l’un des deux uréides se forme-t-il,

in vivo, aux dépens de l’autre ?

NH-

CO —

NH

NH 2

1

1 + HT)

1

CO

CO -i

CO

COOH

CO

|

| — H ; 0

|

1

NH —

(

1H —

NH

NH —

CH-

- NH

Nous nous proposons de démontrer qu’iw vitro l’acide allantoïque apparaît

par fermentation, à 39°, en présence ou non de sesqui-carbonate d’ammo¬

nium, de l’allantoïne contenue dans la poudre de Collybia maculata ou de

Hiatula caepestipes, mise en suspension dans l’eau.

1° Expériences sur COLLYBIA MACULATA. — On place au bain

d’eau à 39° dans des tubes à centrifuger, des milieux de composition :

E, Ti E, T,

Eau.10,2 cc. 10,2 cc. 10 cc. 10 cc.

Poudre fermentaire de

C. maculata .... 0,1 gr. — 0,1 gr. —

Même poudre traitée

parClH pourdétruire

les enzymes. ... — 0,1 gr. — 0,1 gr.

Solution de sesqui-car¬

bonate d’ammonium

à 10 % et de CNK

à 0,5% . — — 0,2 cc. 0,2 cc.

Chloroforme.V gouttes V gouttes V gouttes V gouttes.

116 A. BRUNEL. - MÉTABOLISME DE l’aZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Expériences témoins T 1; 'L. — Elles sont obtenues en détruisant les enzymes

par C1H re/20 (5 cc.) ; après quinze minutes de contact, on neutralise par le

sesqui-carbonate d’ammonium et on complète à 10 cc. L’acide allantoïque

est dosé par spectrophotométrie dans E,, Tj, E 2 , T 2 , au temps zéro et après des

durées variables de fermentation. Les résultats sont consignés dans le tableau

DURÉE

de

fermentation.

ACIDE ALLANTOÏQUE

pour 10ÛQ grammes.

ALLANTOÏNE

transformée

en acide

allantoïque

Total.

Préformé.

De fermentation.

E, E.

0 h.

1,74 gr.

0, gr.

E x .

5

2,02 —

—

0,28 —

0,24 —

7

2,02 —

—

0,28 —

0,24 —

E.

5

2,66 —

—

0,92 —

0,81 —

- .

7

2,79 —

—

1,02 —

0,97 —

Tjl.

7

1,72 —

—

0 ,

T,.

7

1,78 —

0,04 —

0,03 —

2° Expériences sur HIATULA CAEPESTIPES. — Elles sont con¬

duites comme pour Collybia maculata.

Résultats :

EXPÉRIENCE

DURÉE

de

fermentation.

ACIDE ALLANTOÏQUE

pour 1000 grammes.

ALLANTOÏNE

transformée

en acide

allantoïque

°, 00

Total.

Pré formé.

De fermentation.

5,03 gr.

0, gr.

—

0,27 —

^ 52 „Of

—

0,49 —

—

1,22 —

— .

5

6,60 —

—

1,57 -

1,40 —

T,.

5

5,02 —

—

0, —

o, —

To.

5

5,04 —

0,01 —

0,008 —

L’acide allantoïque prend naissance par fermentation aux dépens de l’al-

lantoïne contenue dans les poudres de Collybia maculata et de Hiatula caepes-

tipes mises en suspension dans l’eau.

En présence de sesqui-carbonate d’ammonium, il s’en forme des quantités

appréciables :

1,05 gr., après sept heures de fermentation (Collybia maculata ),

1,57 gr., après cinq heures de fermentation (Hiatula caepestipes). En l’ab¬

sence de ce sel la transformation est nette mais plus faible.

Ces résultats obtenus in vitro ainsi que l’augmentation de la teneur en acide

ORIGINE DES ÜRÉIDES GLYOXYLIQUES CHEZ LES CHAMPIGNONS BASIDIOMYCÈTES 117

allantoïque que nous avons observée, in vivo , chez Coprinus micaceus et

Hiatula caepestipes au cours du développement du carpophore, montrent

que l’allantoïne doit engendrer, par fermentation sous l’action de l’allan-

toïnase, l’acide allantoïque des Champignons.

Nous considérons que chez les Champignons Basidiomycètes l’acide allan¬

toïque est le terme ultime de l’hydrolyse enzymatique de l’allantoïne.

Malgré l’extrême facilité avec laquelle l’acide allantoïque se scinde en ses

constituants dès que le pH est inférieur à 7, nous n’avons jamais pu constater

la présence chez ces Champignons d’un enzyme capable de fixer une molécule

d’eau sur l’acide allantoïque pour donner l’urée et l’acide glyoxylique, ou

encore l’existence de tout autre processus permettant d’effectuer cette hydro¬

lyse.

B. — Origine purique de l’acide allantoïque et de l’allantoïne

chez les Champignons Basidiomycètes.

In vitro , l’acide allantoïque prend naissance par fermentation de l’allan-

toïne contenue dans les poudres de Collybia maculata et de Hiatula caepestipes

mises en suspension dans l’eau ; nous nous proposons de confirmer ces résultats

et de démontrer que les deux uréides glyoxyliques se forment aux dépens de

l’acide urique quand on provoque l’absorption de cet acide par les tissus de

Coprinus micaceus.

Absorption de l’allantoïne par HYPHOLOMA HYDROPHILUM. —

Ce champignon qui croît en touffes serrées se prête admirablement à ce genre

d’expériences. On élimine avec soin les exemplaires non intacts et la terre

qui tient aux stipes, qu’on enlève soigneusement au pinceau, puis on prélève :

1° Trois échantillons T (10 champignons) que l’on sèche rapidement dans

le vide sur chlorure de calcium et qui serviront aux dosages de l’acide allan¬

toïque et de l’allantoïne préexistants.

2° Trois échantillons E (10 champignons) que l’on place dans trois cristal-

lisoirs, le stipe plongeant de 1 centimètre environ dans de l’eau distillée con¬

tenant 1 /5.000 de FNa,

3° Trois échantillons A (10 champignons) que l’on place dans trois cristal-

lisoirs, le stipe plongeant de 1 centimètre environ dans une solution d’allan-

toïne à 1 °/oo et à 1 /5.000 de FNa.

Après trente six heures, les expériences sont arrêtées ; on essuie soigneuse¬

ment l’extrémité des stipes, on sèche rapidement les échantillons E et A dans

le vide sur chlorure de calcium et on procède aux dosages de l’allantoïne et de

l’acide allantoïque dans E, T et A.

118 A. BRÜNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Résultats :

EXPÉRIENCE

ACIDE ALLANTOÏQUE

pour 1000 grammes de plante séchée à 100°.

ALLANTOÏNE

pour 1000 grammes de plante séchée à 100°.

T.

0,26 gr.

0,50 gr.

Traces

E.

0,86 —

1,10 —

0,94 -

1,08 gr.

1,14 gr.

1,20 gr.

A.

6,91 —

7,38 —

4,44 —

14,0 —

12,9 —

13,3 —

Acide allantoïque.

Expériences E. — L’acide allantoïque prend naissance quand on laisse se

développer sur l’eau Hypholoma hydrophilum ; sa teneur passe de 0,26 gr.

à 0,86 gr., de 0,50 gr. à 1,10 gr. et de 0,50 gr. à 0,94 gr. pour 1000 gr. de cham¬

pignon.

Expériences A. — Si l’on remplace l’eau par une solution d’allantoïne on

constate que cet uréide est absorbé ; la formation d’acide allantoïque devient

alors considérable, sa teneur passe de 0,86 gr. à 6,91 gr., de 1,10 gr. à 7,38 gr.

et de 0,94 gr. à 4,44 gr. pour 1000 gr. de champignon.

Allantoïne.

Expériences E. — L’allantoïne apparaît quand on laisse se développer sur

l’eau Hypholoma hydrophilum ; sa teneur passe de 0 gr. à 1,08 gr., à 1,14 gr.

et 1,20 gr. pour 1000 gr. de champignon.

Expériences A. — Elles démontrent nettement l’absorption de l’allantoïne

par les tissus A'Hypholoma hydrophilum.

Des résultats de même ordre ont été obtenus avec Psathyrella subatrata ;

ils sont consignés dans le tableau suivant :

EXPÉRIENCE

ACIDE ALLANTOÏQUE

pour 1000 grammes de plante séchée à 100°.

ALLANTOÏNE

pour 1000 grammes de plante séchée à 100°.

T.

0,99 gr.

0,92 gr.

1,02 gr.

0,20 gr.

0,50 gr.

0,45 gr.

E.

2,40 —

2,22 —

2,20 —

0,94 —

1,10 —

1,20 —

A.

3,11 —

3,88 —

3,64 —

3,00 —

2,40 —

2,80 —

Conclusion. — Ces expériences démontrent que

ORIGINE DES URÉIDE3 GLYOXYLIQUES CHEZ LES CHAMPIGNONS BASIDIOMYCÈTES 119

1° L’acide allantoïque et l’allantoïne apparaissent quand on laisse se déve¬

lopper sur l’eau Hypholoma liydrophilum et Psathyrella subatrata,

2°. L’allantoïne est facilement absorbée par les tissus des champignons.

Absorption de l’allantoïne et de l’acide urique par COPRINUS

MICACEUS. — Ce champignon a été récolté jeune, non sporulé. Les expé¬

riences ont été conduites comme pour Hypholoma hydrophilum , mais une

quatrième série d’expériences U a été instituée en remplaçant l’eau par une

solution d’urate de potassium correspondant à 1 gr. d’acide urique par litre.

Résultats :

EXPÉRIENCE

ACIDE ALLANTOÏQUE

pour 1000 grammes de piaule séchée à 100°.

ALLANTOÏNE

pour 1000 grammes de plante séchée à 100°.

T.

1,00 gr.

0,82 gr.

1,02 gr.

0,95 gr.

0,70 gr.

0,73 gr.

E.

4,14 —

5,75 —

5,11 —

1,86 —

1,58 —

1,11 —

A.

7,23 —

13,80 —

7,60 —

4,80 —

8,90 —

3,56 —

U.

6,01 —

8,89 —

6,67 —

3,35 —

2,60 —

2,85 —

Acide allantoïque.

Expériences E et A. —■ Ces expériences confirment les résultats déjà obtenus

pour Hypholoma hydrophilum et Psathyrella subatrata.

Allantoïne.

Expériences E ef A. — Comme pour Hypholoma hydrophilum l’allantoïne

se forme quand on laisse se développer sur l’eau Coprinus micaceus. Cet uréide

est en outre facilement absorbé par les tissus de celui-ci.

Acide urique.

Expériences U. — Lors de l’absorption de l’acide urique par les tissus de

Coprinus micaceus on constate qu’il apparaît aux dépens de cet acide :

1° d’importantes quantités d’acide allantoïque dont la teneur passe de

4,14 gr. à6,01 gr., de 5,75 gr.à 8,89 gr. et de 5,11 gr. à 6,67 gr. pour 1000 grammes

de champignon,

2° d’importantes quantités d’allantoïne dont la teneur passe de 1,86 gr.

à 3,35 gr., de 1,58 gr. à 2,60 gr. et de 1,11 gr. à 2,85 gr. pour 1000 grammes

de champignon.

Conclusion. — La formation de l’allantoïne et de l’acide allantoïque, lors

de l’absorption de l’acide urique par les tissus de Coprinus micaceus , démontre

120 A. BRUNRL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQÜE CHEZ LES CHAMPIGNONS

que, comme chez les Végétaux supérieurs, les deux uréides glyoxyliques ont

une origine purique chez les Champignons.

NH — CO

I

CO

C — NI1

Uricase

NH — C — NH

\co + O + H 2 0 — CO ;

/

NH 2

I

CO

I

NH — CH

CO — NII

CO

I

NH

Allantoïnase

+ H^Ô *

NH 2

I

CO

I

N H -

NII 2

I

COOH CO

I I

Cil-NH

L’acide urique, terme intermédiaire, provient de la dégradation enzyma¬

tique des nucléines :

_, Nucléases _ . Purinoxydases .

Nucleines-<• Purmes--—> Acide urique.

C. — Métabolisme comparé de l'azote purique et uréique

chez les Amanitaceae, Cortinariaceae et Coprinaceae-

Le groupement des résultats concernant la répartition des enzymes allan¬

toïnase et uricase, des uréides allantoïne et acide allantoïque, termes ultimes

de la dégradation des nucléines chez les Champignons Basidiomycètes, va nous

permettre de dégager l’importance du métabolisme de l’azote purique, en

particulier du catabolisme purique chez les Amanitaceae, les Cortinariaceae

et les Coprinaceae.

Nous y joindrons certaines considérations sur le métabolisme de l’azote

uréique basées :

1° Sur nos recherches personnelles concernant la présence ou l’absence de

l’urée et de l’uréase chez les Champignons,

2° Sur les documents empruntés à la thèse de P. Costy (14)’« Uréase et urée

chez les Champignons supérieurs »,

3° Sur les résultats de N. N. Iavanoff (45) concernant la genèse de la car-

bamide chez les Champignons supérieurs.

Nous considérerons séparément les Amanitaceae, les Cortinariaceae et les

Coprinaceae, puis nous mettrons en évidence les identités ou les divergences

dans le métabolisme purique et uréique d’un certain nombre d’espèces appar¬

tenant aux familles de ces trois importantes séries.

ORIGINE DES ÜRÉIDES GLYOXYLIQUES CHEZ LES CHAMPIGNONS BASIDIOMYCÈTES 121

Amanitaceae.

Amaniteae. Genre Amanita Secr. ex Pers.

Métabolisme purique. — Toutes les espèces étudiées : Amanita aspera,

caesarea, citrina, muscaria , pantherina, phalloides, verna , rubescens, vaginata ,

vaginata var. julva , mappa , spissa, solitaria et strobiliformis, présentent une

remarquable unité dans leurs propriétés. L’allantoïnase y est peu active

bien qu’elle existe en général, l’uricase est difficile à mettre en évidence, la

teneur en acide allantoïque et en allantoïne est peu élevée, le catabolisme

purique peu marqué.

Métabolisme aréique. — L’absence de l’uréase est la règle, sauf chez Amanita

spissa (P. Costy) où cet enzyme a d’ailleurs une faible activité ; au contraire

la présence de l’urée est très fréquente. Ces espèces possèdent la propriété de

synthétiser l’urée.

Conclusion. — Les espèces du genre Amanita , qui se distinguent par la volve

persistante séparable du revêtement du chapeau, les lamelles à trames bila¬

térales, les grandes spores globuleuses, ovoïdes ou elliptiques sans pore ger¬

minatif, sont en outre caractérisées au point de vue physiologique par un cata¬

bolisme purique peu marqué et par la propriété de synthétiser l’urée.

Genre Lepiota Fr. incl. Cystoderma Fayod ( = Lepiota em. Heim).

Les résultats concernant les espèces étudiées de ce genre sont consignés

dans le tableau suivant :

ESPÈCES ÉTUDIÉE 3

RECHERCHE DES ENZYMES

1000 grammes

de plante contiennent

Uricase.

Allantoï-

naso (A).

Uréaso.

Allantoïne.

Acide

allautonjue.

Urée.

Lepiota cristata .

+

35,0

_

0,74 gr.

4,47 gr.

31,7 gr.

— acutesquamosa . .

+

39,3

—

0,65 —

1,59 —

4,98 —

— cinnabarina . . .

n. r

15,5

—

n. r

traces

6,30 —

— helveola .

_L

20,1

—

n. r

traces

n. r

— clypeolaria. . . .

--

7,8

+

n. r

0

n. r = non recherché.

Métabolisme purique. — Alors que pour Lepiota cristata , acutesquamosa,

cinnabarina et helveola , le catabolisme purique est très net (présence de l’uri-

case, de l’allantoïnase, de l’allantoïne et de l’acide allantoïque), on constate

une remarquable exception pour Lepiota clypeolaria. Ce champignon, où nous

n’avons pu mettre en évidence ni l’uricase ni l’acide allantoïque sur les nom¬

breux échantillons récoltés pendant trois ans dans les forêts de Presles et de

Coye-Orry la ville, a aussi des propriétés allantoïnolytiques peu marquées.

Métabolisme uréique. —- Comme les Amanites les Lépiotes possèdent la

122 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

propriété de synthétiser l’urée. Ici encore Lepiota clypeolaria se sépare nette¬

ment des autres espèces par la présence d’une uréase active et l’absence de

l’urée.

Conclusion. — Les espèces de ce genre, caractérisées par l’absence de volve,

par le voile partiel souvent développé, par les lamelles à trame régulière, par

les spores blanches sans pore germinatif, présentent un catabolisme purique

intense et un pouvoir très net de synthétiser l’urée. Une exception est offerte

par Lepiota clypeolaria qui, malgré ses affinités, en particulier avec Lepiota

cristata, a un catabolisme purique peu marqué et dégrade l’urée en carbonate

d’ammonium.

Pluteae. Genres Vol varia Fr. et Pluteus Fr.

Nous n’avons pu examiner beaucoup d’espèces appartenant à ces deux

genres. Il résulte cependant, de l’étude de Volvaria speciosa, de Pluteus cer-

vinus, de Pluteus cervinus var. eximius et var. patricius, que ces espèces pré¬

sentent un catabolisme purique très marqué et le pouvoir de synthétiser l’urée.

Le tableau suivant résume les principaux résultats obtenus sur les Amani-

taceae.

AMAN ITACEAE

CATABOLISME

purique.

POUVOIR

de synthèse

de l’urée.

POUVOIR

de destruction

de l'urée.

Amaniteae. Genre Amanita . . .

faible

intense

nul

Genre Lepiota. . . .

intense

nul

(Lepiota clypeolaria) .

faible

nul

intense

Pluteae. Genre Volvaria. . . .

intense

nul

Genre Pluteus. . . .

intense

nul

Cortinariaceae.

Cortinarieae. Genre Cortinarius Fr.

Métabolisme purique. — Les espèces de ce genre très homogène ont en géné¬

ral un catabolisme purique peu marqué ; l’uricase et l’allantoïnase sont peu

actives, la teneur en acide allantoïque est peu élevée.

Métabolisme aréique. — En général, les Cortinaires possèdent la propriété

d’hydrolyser l’urée en carbonate d’ammonium (P. Costy).

Genres Inocybe Fr. et Hebeloma Fr.

Les espèces appartenant à ces deux genres se comportent comme les Cor¬

tinaires.

Conclusion. — La tribu des Cortinarieae comprend des champignons ter¬

restres à péridium et stipe confluents, à voile général formant une cortine

nettement visible ou soudée au revêtement du chapeau et du stipe, à spores

ocracées lisses ou verruqueuses, sans pore germinatif, à cystides nulles sauf

ORIGINE DES URÉIDES GLYOXYLIQUES CHEZ LES CHAMPIGNONS B ASIDIOMYCÈTES 123

chez les Inocybes ; les espèces de cette tribu sont caractérisées en général

par un catabolisme purique peu marqué et la propriété d’hydrolyser l’urée en

earbonate d’ammonium.

Pholioteae. Genres Flammula Fr., Pholiota Fr., Rozites Karst.

Les résultats concernant les espèces appartenant aux différents genres de

cette tribu sont consignés dans le tableau suivant :

ESPÈCES ÉTUDIÉES

RECHERCHE DES ENZYMES

Uricase.

Allanloïnase

(A).

IJréase.

Allantoïne.

Acide

allantoïque.

Urée.

F. conissans ....

5,0

n. r

traces

0

F. capnoides. . . .

—

4,0

—

n. r

traces

n. r

F. sapinea .

—

4,7

—

n. r

0,39 gr.

n. r

F. alnicola .

n. r

6,4

—

n. r

traces

n. r

F. spectabilis. . . .

—

2,9

—

traces

0,14 —

n. r

Ph. squarrosa. . . .

n. r

5,3

—

0,10 gr.

0,20 —

n. r

Ph. mutabilis. . . .

—

6,0

—

0,50 —

0,70 —

0

Ph. adiposa .

n. r

6,9

—

0,50 —

0

n. r

Ph. destruens. . . .

n. r

7,1

—

n. r

traces

n. r

Ph. praecox .

+

34,0

0,10 —

2,61 —

0

Ph. cylindracea.

-F

28,0

+

0,36 —

2,81 —

0

Ph. dura .

+

28,9

+

0,50 —

1,50 —

0

R. cape rata ....

+

12,4

—

traces

n. r

Abréviations utilisées : n. r = non recherché, F. = Flammula, Ph. =

Pholiota , R. = Rozites.

Genre Flammula Fr.

Métabolisme purique. — Le catabolisme purique chez les espèces apparte¬

nant à ce genre est en général peu marqué. L’uricase est difficile à mettre en

évidence, l’allantoïnase est peu active, la teneur en acide allantoïque est tou¬

jours peu élevée.

Métabolisme uréique. — Nous n’avons pu mettre en évidence, ni l’uréase

chez les Flammules, ni l’urée chez Flammula conissans et spectabilis.

Genre Pholiota Fr.

Métabolisme purique. — Au point de vue du métabolisme purique les espèces

de ce genre se divisent en deux groupes :

1° Espèces du groupe squarrosa (Pholiota squarrosa, mutabilis, adiposa et

destruens),

2° Espèces du groupe praecox (Pholiota praecox, dura) et Pholiota cylindracea.

Les espèces du groupe squarrosa se distinguent par un catabolisme purique

peu marqué et la faible activité de l’allantoïnase.

Les espèces du groupe praecox, au contraire, possèdent un catabolisme

purique très marqué, une allantoïnase active et une forte teneur en acide

allantoïque.

124 A. BRUNEt,. - MÉTABOLISME DE L'AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Métabolisme uréique. — L’antagonisme du groupe praecox et du groupe

squarrosa se retrouve dans le métabolisme uréique ; alors que les espèces du

premier groupe dégradent l’urée en carbonate d’ammonium, les espèces du

groupe squarrosa ne possèdent pas cette propriété.

Conclusion. — Les Flammules, auxquelles il faut joindre les Pholiotes du

groupe squarrosa , possèdent des propriétés communes : catabolisme purique

peu intense, métabolisme uréique caractérisé par l’absence de l’uréase.

Au contraire, les Pholiotes du groupe praecox et Pholiota cylindracea s’en

éloignent nettement par leurs propriétés physiologiques : catabolisme purique

très marqué, métabolisme uréique caractérisé par la présence de l’uréase.

Ces différences dans le comportement physiologique complètent les diffé¬

rences anatomiques déjà signalées par Fayod.

Nematolomeae. Genre Nematoloma Karst.

Métabolisme purique. — Les espèces de ce genre, Nematoloma fasciculare,

capnoides et sublateritium, présentent une remarquable unité dans leurs pro¬

priétés ; Fallantoïnase y est peu active, l’uricase est difficile à mettre en évi¬

dence, et la teneur en acide allantoïque y est toujours peu élevée.

Métabolisme uréique. — Les Nematolomes ne possèdent pas la propriété

d’hydrolyser l’urée en carbonate d’ammonium.

Les résultats généraux concernant les Cortinariaceae peuvent être résumés

comme suit :

CORTINARIACEAE

CATABOLISME

purique.

POUVOIR

do destruction

de l’urée.

Cortin’Arieae. Genre Corlinarius ....

faible

positif

— Genre Inocybe .

faible

positif

Pholioteae. Genre Flammula .

faible

nul

— Genre Phol iota( groupe squar-

rosa) .

faible

nul

Pholioteae. Genre Pholiota (groupe prae-

cox) .

intense

Pholioteae. Genre Rozites .

faible

nul

Nematolomeae. Genre Nematoloma . . .

faible

nul

Coprinaceae.

Pratelleae. Genres Leucocoprinus Pat., Hiatula (P. Henn.) Heim et

Romagnesi, Agaricus Fr. ex Lin. em. Sacc.

Les résultats concernant les espèces appartenant aux différents genres de

cette tribu sont consignés dans le tableau suivant :

ORIGINE DES URÉIDES GLYOXYLIQUES CHEZ LES CHAMPIGNONS BASIDIOMÏCÈTES 125

PRATELLEAE

RECHERCHE DES ENZYMES

1000 grammes

de plante renferment

Uricase.

Allan-

toïnasc (A'.

Uréase.

Allautoïne.

Acide

allan toupie.

Urée.

L. excoriatus ....

+

41,0

1,09 gr.

2,88 gr.

15,4 gr.

L. mastoideus. . . .

4-

45,0

—

0,57 —

1,96 —

12,1 —

L. procerus .

-L

40,0

—

1,30 —

3,65 —

21,4 —

L. rhacodes .

4 -

3S,0

—

4,69 —

3,80 —

69,0 —

L. naucinus ....

-f-

47,0

—

0,10 —

2,18 —

21,2 —

H. caepestipes ....

+

40,0

—

0,24 —

6,74 —

55,2 —

H. licmophora. . . .

+

15,0

—

n. r

5,70 —

n. r

A . campester ....

—

4,0

—

0,10 —

0,30 —

35,2 —

A. silvaticus . . . .

n. r

13,2

—

n. r

1,20 —

n. r

A. exquisitus. . . .

—

5,0

—

0,10 —

n. r

A. silvicola .

n. r

10,2

—

0,72 —

15,2 —

A. arvensis .

n. r

10,2

—

0,40 —

14,1 —

A. xanthodermus . .

n. r

14,2

—

n.r

1,20 —

30,8 —

Genre Leucocoprinus Pat. et Genre Hiatula (P. Henn.) Heim et Roma-

gnesi.

Métabolisme purique. — Les espèces appartenant à ces deux genres ont un

catabolisme purique très marqué : présence de l’uricase, d’une allantoïnase

très active et haute teneur en acide allantoïque.

Métabolisme aréique. — Chez les Leucocoprinus et les Hiatula l’absence

de l’uréase est la règle; au contraire, ils possèdent la propriété de synthétiser

l'urée.

Genre Agaricus Fr. ex Lin. em. Sacc.

Métabolisme purique. — A l’inverse des Leucocoprinus et des Hiatula , les

espèces du genre Agaricus ont un catabolisme purique peu marqué ; l’uricase

y est difficile à mettre en évidence, l’allantoïnase est peu active et la teneur en

acide allantoïque y est toujours faible.

Métabolisme uréique. — Comme les Leucocoprinus et les Hiatula , les espèces

du genre Agaricus possèdent la propriété de synthétiser l’urée.

Stropharieae. Genre Stropharia Fr.

Métabolisme purique et uréique. — Nousjn’avons étudié que Stropharia aeru-

ginosa , champignon caractérisé par un catabolisme purique très peu marqué

et par la présence de l’uréase (P. Costy).

Genre Hypholoma Fr.

Métabolisme purique. — Toutes les espèces étudiées : Hypholoma appendicu-

latum , appendiculatum var. Candolleanum, hydrophilum et lacrymabundum,

possèdent un catabolisme purique très net (présence de l’uricase et d’une

allantoïnase active).

Métabolisme uréique. — Les Hypholomes ont la propriété d’hydrolyser

l’urée en carbonate d’ammonium.

126 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PORIQDE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Coprineae. Genre Panaeolus Fr.

Métabolisme purique. — Catabolisme purique très marqué chez Panaeolus

campanulatus, retirugis et papilionaceus.

Métabolisme uréique. — Nous n’avons pas recherché Puréase chez ces

espèces.

Genres Psathyrélla Fr., Pseudocoprinus Kühner, Coprinus Fr.

Métabolisme purique. — Les espèces étudiées appartenant aux genres

Psathyrélla (Psathyrélla gracilis et subatrata ), Pseudocoprinus (Pseudocopri¬

nus disseminalus) et Coprinus (Coprinus atramentarius, fimetarius , lagopus,

p ica ce us. micaceus, plicatilis , stercorarius et comatus) sont caractérisées par

un catabolisme purique intense ; Puricase et l’allantoïnase sont actives et la

teneur en acide allantoïque est élevée.

Métabolisme uréique. — Les espèces étudiées de ces trois genres possèdent

la propriété d’hydrolyser Purée.

Les résultats obtenus concernant les Coprinaceae sont consignés dans le

tableau suivant. :

COPRINACEAE

CATA¬

BOLISME

purique.

POUVOIR

<le synthèse

de l'urée.

POUVOIR

de

destruction

de l’urée.

Pratelleae. Genre Leucocoprinus .

intense

nul

— Genre Hiatula ..

intense

nul

— Genre Agaricus .

faible

intense

nul

Stropharieae. St. aeruginosa .

faible

nul

net

— Genre Hypholoma .

intense

nul

net

Coprineae. Genre Panaeolus .

intense

n. r

— Genre Psathyrélla .

intense

nul

net

— Genre Pseudocoprinus .

intense

nul

net

— Genre Coprinus .

intense

nul

intense

Résumons dans un tableau général les principaux résultats obtenus

concernant les :

Amanitaceae, Cortinariaceae et les Coprinaceae.

AMANITACEAE, CORTINARIACEAE, COPRINACEAE

CATA¬

BOLISME

purique.

POUVOIR

do synthèse

do l'uréo.

POUVOIR

de

dostruction

de l'uréo.

Amanitaceae. Amaniteae. G. Amanita .

faible

intense

nul

— — G. Lepiota .

intense

nul

— Pluteae. G. Volvaria .

intense

nul

— — G. Pluteus .

intense

nul

Cortinariaceae. Cortinarieae. G. Cortinarius. .

faible

n. r

net

— — G. Inocybe. . . .

faible

n. r

net

1

ÛUIGINE DES URÉIDES GLY0XTL1QDES CHEZ LES CHAMPIGXOXS BASIDIOMYCÈTES 127

AMANITACEAE, CORTINARIACEAË, COPRINACÉAE

CATA¬

BOLISME

purique.

POUVOIR

de synthèse

de l’urée.

POUVOIR

de

destruction

de l’urée.

Cortin ARïACEAE. Pholioteae. G. Flammula. . . .

faible

n. r

nul

— — G. Pholiota ....

—- — gr. squarrosa ....

faible

n. r

nul

— — gr. praecox .

intense

nul

intense

— — G. Hozites .

faible

n. r

nul

—- Nematolomeae. G. Nematoloma. .

faible

n. r

nul

Coprinaceae. Pratelleae. G. Leucocoprinus . . . .

intense

nul

' — — G. Hiatula .

intense

nul

—• — G. Agaricus .

faible

intense

nul

—- Stropharieae. St. aeruginosa. . . .

faible

nul

net

— — G. Hypholoma . . .

intense

nul

net

— Coprineae. G. Panaeolus .

intense

n. r

-— — G. Psathyrella .

intense

nul

net

— — G. Pseudocoprinus. . .

intense

nul

net

— — G. Coprinus .

intense

nul

intense

Conclusion. — Les résultats ci-dessus ont été obtenus à partir d’un certain

nombre d’espèces appartenant à 'divers genres. L’examen de ce tableau

permet de constater que pour les espèces examinées d’un même genre le méta¬

bolisme de l’azote présente un certain caractère de fixité.

D’autre part, le métabolisme de l’azote purique et uréique suggère les

considérations suivantes sur l’origine de l’acide allantoïque et de l’urée chez

les Champignons :

L’acide allantoïque des Champignons Basidiomycètes a une origine purique ;

cet uréide apparaît en effet par fermentation de l’allantoïne contenue dans les

poudres de Collybia maculata et de Hiatula caepestipes ou encore au cours de

l’absorption, soit de l’allantoïne, soit de l’acide urique par les tissus de

Coprinus micaceus.

L’acide allantoïque serait-il le précurseur de l’urée chez les Basidiomycètes

et la carbamide aurait-elle une origine purique ?

A priori , la coexistence fréquente de l’acide allantoïque et de l’urée dans le

même carpophore, l’identité dans le sens de la variation de leur teneur qui

augmente avec la maturation, la facilité avec laquelle l’acide allantoïque se

scinde en urée et acide glyoxylique sans intervention enzymatique dès que le

pH est inférieur à 7 ne permettent pas d’écarter cette hypothèse.

Sans nier qu’une partie de l’urée des Champignons puisse provenir de

j’acide allantoïque, la disproportion entre la teneur maximum en acide allan¬

toïque et en carbamide, chez Hiatula caepestipes (catabolisme purique intense)

et chez Agaricus campester (catabolisme purique faible), jette un doute sur

l’origine purique exclusive de l’urée chez les Champignons.

Nous admettrons avec N.-N. Iwanoff (45) que l’urée des Champignons a

pour principale origine l’ammoniac et le gaz carbonique.

128 A. BRUNEL. - MÉTABOLISME DE L’AZOTE PUR1QUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

En effet, cet auteur a pu démontrer que la carbamide prend naissance chez

ces Thallophytes par un processus d’ordre protoplasmique aux dépens, soit

de l’ammoniac, soit des sels ammoniacaux (carbonate).

I). — Essai d’application à la systématique des notions

concernant l allantoïnase et le métabolisme de l'azote chez les Champignons.

Dans ces dernières années les notions d’ordres biochimique et physiologique

ont pris une certaine importance en systématique.

Chez les Végétaux chlorophylliens, A. de Cugnac (15) a montré que les

Graminées formaient deux groupes physiologiques bien définis :

a) les Saccharifères, qui ne forment jamais de lévulosides dans leurs tissus,

b) les Lévulifères,caractériséesparla présencede lévulosides dans leurs tissus.

11 a établi que la présence ou l’absence des fructoholosidespeut, dans certains

cas, servir à juger de la légitimité de genres ou d’espèces affines. Il a pu ainsi

confirmer et préciser l’autonomie du genre Brachypodium par ses caractères sac¬

charifères, alors que les genres voisins Bromus et Agropyrum sont fructosifères.

Chez les Champignons Macromycètes, R. IIeim (41) a insisté sur l’impor¬

tance des caractères physiologiques en systématique. De plus en plus, dit-il,

on tendra vers la reconnaissance de plusieurs notions d’espèces : espèce mor¬

phologique, espèce chimique, espèce physiologique. La notion de Slirpe qu’il

a introduite chez les Hyménomycètestire justement sa valeur de la coexistence

de critères à la fois physionomiques et biochimiques. Cet auteur a en

outre utilisé chez les Agarics (42) le caractère de l’odeur et montré qu’il est

lié à des particularités non seulement d’ordre biochimique mais encore d’ordre

anatomique. De même, chez les Champignons filamenteux, notamment les

Actinomyces , le caractère de l’odeur présente une valeur d’ordre assez

général (les Actinomyces ont fréquemment l’odeur de moisi, alors que les

levures ne possèdent jamais cette odeur) (J. Duché) (17).

En général, l’étude d’un groupe étendu de substances, du métabolisme des

glucides ou de l’azote, de certaines propriétés enzymatiques... pourra apporter

des données utiles au Systématicien.

Nous nous sommes demandé si les résultats acquis, concernant l’allan-

toïnase et le métabolisme de l’azote purique et uréique, présentaient un intérêt

au point de vue de la systématique des Champignons dits supérieurs ?

Pour l’allantoïnase, la notion d’activité, exposée dans la première partie de

ce Travail, suggère les considérations suivantes :

L’intensité des propriétés allantoïnolytiques des champignons varie d’une

espèce à l’autre et, pour une même espèce, avec l’état de développement du

carpophore ; les chiffres obtenus dans la mesure de A ne peuvent donc avoir

qu’une valeur indicative.

Cependant, l’examen des valeurs moyennes de A obtenues sur divers échan¬

tillons de la même espèce appartenant à des genres homogènes (Bussula,

ORIGINE DES URÉIDES GLYOXYLIQUES CHEZ LES CHAMPIGNONS BASIDIOMYCÈTES 129

Lactarius, Amanita , Cortinarius ) conduit à des chiffres d’un même ordre de

grandeur pour chaque genre déterminé. Pour les espèces de ces genres, il y a

donc similitude des propriétés allantoïnolytiques et la valeur de A est carac¬

téristique du végétal étudié.

Il est de toute évidence que seule doit être retenue une série de valeurs

moyennes de A, obtenue sur différents échantillons du même champignon pris

à des états de développement voisins.

Cette notion d’activité allantoïnolytique, à laquelle il faut joindre des consi¬

dérations sur la présence ou l’absence de l’uréase, sur l’intensité du méta¬

bolisme de l’azote purique et uréique, permettra, dans certains cas, de préciser

ja position systématique d’espèces manifestant des affinités aux points de vue

morphologique et anatomique et de juger de la valeur de certaines coupures

taxonomiques.

Les données que nous avons réunies sur l’ensemble des Basidiomycètes

sont encore beaucoup trop incomplètes pour en tirer des conclusions générales

concernant la systématique; ce n’était pas d’ailleurs le but de notre Travail,

aussi nous ne considérerons que quelques cas typiques où ces données physio¬

logiques sont particulièrement nettes.

Pholioteae.

Genres Flammula, Pholiota, Rozites. Nous y joindrons les espèces du genre

Nematoloma qui ont des affinités certaines avec les Flammules.

Le tableau suivant indique les propriétés des espèces étudiées.

w

ALLANTOINASE

a ©

Valeur de A).

a g

A

CATA-

CHAMPIGNONS ÉTUDIÉS

w 3

BOLISME

Récolte

Kécolte

U ©

purique.

1932.

1933.

1934.

A

Flammula sapinea sp.

5,2

3,1-4,7

5,8-4,9

_

Faible

— conissans sp.

5,3

5,0

—

»

— alnicola sp.

6,4

4,0

—

»

— spectabilis sp.

1,2-5,0

2,3-4,0

4,9-2,9

—

»

Pholiota squarrosa sp.

6,0-6,4

5,3-6,2

6,5

—

))

— mutabilis sp.

5,0-6,0

4,7-2,7

4,8-3,7

—

»

— — sp. Ch . . . .

—

5,7

—

»

— sp. St . . . .

—

2,5

—

))

— adiposa sp.

6,9

5,5

—

))

— destruens sp. ... .

—

7,1

5,2

—

»

— praecox sp.

33,6-30,8

34,0-30,5

32,0

+

Intense

— dura sp.

28,9

—

_L

))

— cylindracea sp . . .

28,1

27,2-25,0

30,7

+

)>

Rozites caperata sp.

11,1

12,4

10,2

—

Faible

Nematoloma fasciculare sp. . . .

7,1

5,0-6,0

4,7

—

))

— sublateritium sp. . .

6,1

4,2

3,0

—

»

— capnoides sp.

5,0

3,0

»

Mémoires du muséum, nouvelle série, tome VI.

9

430 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME UE l’aZOTE PÜRIQDE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Les espèces des genres Nematoloma , Flammula, et les Pholiotes du groupe

squarrosa , possèdent des propriétés communes : allantoïnase peu active

(A < 10), absence de l’uréase, métabolisme purique peu intense. A leurs affi¬

nités morphologiques et anatomiques vient s’ajouter l’identité de ces pro¬

priétés physiologiques.

Au contraire, les Pholiotes du groupe praecox (Pholiota praecox , dura) et,

Pholiota cylindracea , s’en éloignent nettement par une allantoïnase active,

par la présence de l’uréase et par le catabolisme purique intense.

Ces différences dans le comportement physiologique complètent les distinc¬

tions anatomiques signalées pour la première fois par Fayod.

Agarics Ianthinosporés et Mélanosporés.

Nous admettrons ici les trois séries par lesquelles H. Romagnesi (61) a

proposé de diviser les Agarics Ianthinosporés et Mélanosporés, exclusion faite

des espèces du genre Agaricus :

1° Série des Coprins, caractérisée par la déliquescence des lames et par

l’hyménium à maturation progressive, comprenant le genre Coprinus.

2° Série des Scotospores, caractérisée par la cuticule celluleuse, par la fré¬

quence des cystides lagéniformes et comprenant les Psathyra, Psathyrella, Hy-

pholoma , Psilocybe p. p., Pseudocoprinus , Panaeolus, Panaeolina et Copelandia.

_ 3° Série des Strophaires, caractérisée par la cuticule filamenteuse peu

différenciée, par la fréquence des cystides immerses plus ou moins clavi-

formes ou fusiformes et comprenant pour l’instant les genres Nematoloma ,

Stropharia et Deconica.

Nous avons étudié quelques genres appartenant aux deux premières séries

et obtenu les résultats suivants :

Série des Coprins. — Au point de vue des propriétés uricolytique et allan-

toïnolytique, cette série est très homogène. Toutes les espèces que nous avons

examinées, Coprinus micaceus , picaceus , plicatilis , stercorarius , lagopus , atrci¬

me ntar lus, fimetarius possèdent des propriétés communes : présence d’une

uricase et d’une allantoïnase actives, pouvoir de destruction de l’urée (pré¬

sence de l’uréase), catabolisme purique très intense (haute teneur en acide

allantoïque).

R. Heim et H. Romagnesi (43) rapprochent les Leucocoprinus du groupe

caepestipes des Coprinus , et les rattachent au genre Hiatula , conservant le

genre Leucocoprinus pour les espèces charnues non putrescentes, à anneau

membraneux double et mobile, à spores blanches munies d’un pore germinati

large (Lépiotes du groupe procera).

Nous avons étudié tout particulièrement Hiatula caepestipes. Ce champi¬

gnon possède des propriétés communes avec les Coprins (présence d’une uricase

et d’une allantoïnase actives et un catabolisme purique intense) ; il s’en écarte

cependant par la propriété de synthétiser l’urée, propriété que possèdent aussi

ORIGINE DES ÜRÉIDES GLYOXYLIQDES CHEZ LES CHAMPIGNONS BASIDIOMYCÈTES 131

les Leucocoprinus. Il est intéressant de remarquer qu’en général le métabolisme

de l’azote purique et uréique est plus marqué chez les Hiatula que chez les

Leucocoprinus ; la valeur du rapport R 3 (voir page 113) est de l’ordre de 25-30

en moyenne pour Hiatula caepestipes , alors que pour les Leucocoprinus il est

de 10-15.

Le genre Hiatula (P. Henn.) Heim et Romagnesi pourrait donc être

considéré à ce point de vue biochimique comme intermédiaire entre les

Leucocoprinus et les Coprinus. De toute façon, nos résultats confirment le

rapprochement ci-dessus, appuyé déjà sur des arguments d’ordres macro- et

microscopique.

Série des Scotospores. — Nous ne considérerons que les genres Psathyrella

et Panaeolus.

Genre Psathyrella Fr.

Trois espèces du genre Psathyrella ont été étudiées : Psathyrella disseminala,

subatrata et gracilis. Psathyrella disseminata se sépare nettement des autres

espèces par son allantoïnase très active (A = 45) et aussi par son métabolisme

purique très marqué (haute teneur en acide allantoïque).

Ces différences dans le comportement physiologique viennent s’ajouter

aux différences anatomiques signalées par R. Kühner (52) et confirment la

valeur du nouveau genre Pseudocoprinus Kühn., créé par cet auteur pour

recevoir cette espèce.

Genre Panaeolus Fr.

Jusqu’ici les Panaeolus étaient rattachés, soit à la tribu des Stropharieae

(genres Stropharia, Panaeolus et Deconicd) soit à celle des Coprineae (R. Maire,

H. Romagnesi). Les propriétés physiologiques des Panaeolus confirment et

précisent cette seconde manière de voir. La présence de l’uricase et d’une

allantoïnase active (A = 30), ainsi que le catabolisme purique intense, rap¬

proche plus les Panaeolus des Coprins que des Strophaires de la section des

Viscipelles ( Stropharia aeruginosa, coronilla ), où nous avons constaté l’absence

de l’uricase, la présence d’une allantoïnase peu active et un catabolisme

purique peu marqué.

Bien que fragmentaires, ces recherches, que nous nous proposons de

reprendre plus tard, mettent en évidence l’intérêt que peuvent présenter les

critères d’ordres biochimique et physiologique en systématique.

QUATRIÈME PARTIE

RECHERCHES SUR LES ENZYMES

DE STERIGMATOCYST1S N1GRA

CHAPITRE PREMIER

L’ALLANTOÏNASE ET L’URICASE DE STERIGMATOCYSTIS NIGRA

L’enzyme allantoïnase est peu répandu chez les Champignons Ascomycètes.

Nous n’avons pu le mettre en évidence chez les Discales operculés ( Helvelleae ,

Pezizeae), inoperculés ( Leotieae) et chez les Ascomycètes hypogés ( Tubereae ).

En 1930, R. Fosse, A. Brunel et P. de Graeve (26) ont signalé la présence

de cet enzyme dans le mycélium d’une Mucédinacée, le Sterigmatocystis nigra

cultivé sur milieu de Raulin acide. Nous nous sommes proposé de reprendre

l’étude du Sterigmatocystis nigra. Les recherches concernant ce champignon

feront l’objet de la quatrième partie de notre Travail.

Le Sterigmatocystis nigra , organisme hétérotrophe, utilise surtout l’ammo¬

niac comme source d’azote ; mais, comme l’a démontré M. Molliard (54), il

est capable de se développer en empruntant l’azote à de nombreuses sub¬

stances organiques (amides, acides aminés, guanidine, allantoïne, acide urique,

caféine, nicotine, méthylhydrazine...). L’utilisation de l’azote organique pose

un problème très intéressant de physiologie végétale. Sous quelle forme

l’azote est-il utilisé pour l’édification du mycélium ? Y a-t-il assimilation

directe de l’azote organique ou retour préalable à l’azote minéral c’est-à-dire

à l’ammoniac ?

En 1903, Shibata (65) signale la présence de l’uréase dans le mycélium de

Sterigmatocystis nigra. Il émet l’hypothèse que cet enzyme existe chaque fois

qu’il est nécessaire de décomposer l’urée ou un « dérivé azoté » pour former

l’ammoniac, élément de la synthèse des protides. Puis, il étudie l’action enzy¬

matique de ce mycélium sur différentes substances et constate son activité

hydrolysante sur l’acétamide, l’oxamide, i’acide hippurique, le biuret, l’uré-

thane et l’asparagine. Au contraire, le mycélium est sans action sur la guani¬

dine, l’allantoïne et l’acide urique.

134 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE l’aZOTE PtJRIQDE CHEZ LES CHAMPIGNONS

En 1912, Kossowicz (51) étudie la culture de certaines moisissures ( Botrytis

Bassiana, Pénicillium crustaceum , Mucor Boidin, Aspergillus glaucus, Asper-

gillus niger...) sur milieu synthétique avec, comme sources d’azote, l’urée?

l’acide urique ou le glycocolle. Il démontre, à l’aide du réactif de Nessler ou du

chlorure de platine, que l’ammoniac prend naissance aux dépens de ces trois

substances.

L’utilisation de l’azote organique par les moisissures est donc conditionnée

par la dégradation préalable des molécules azotées : l’azote organique est

transformé en azote minéral, en ammoniac, avant d’entrer dans le cycle des

synthèses. D. Bach (3) se range aussi à cette manière de voir dans son étude

sur « L’évolution de l’uréase dans les cultures de Sterigmatocystis nigra ».

L’uréase intervient, dit-il, pendant les phénomènes de synthèse qui se passent

dans la première partie de la culture ; elle transforme l’urée en ammoniac

assimilable.

Si, comme l’indique Shibata, le Sterigmatocystis nigra n’a aucune action

enzymatique sur l’allantoïne et l’acide urique, par quel mécanisme et sous

quelle forme ce champignon utilise-t-il l’azote de ces deux substances pour

édifier son mycélium ?

Nous nous proposons de démontrer que l’utilisation de ces corps se fait en

deux temps :

1° Dislocation totale de la molécule urique ou allantoïnique par voie enzy¬

matique avec formation d’ammoniac.

2° Édification du mycélium à partir de l’azote ammoniacal.

A. — Culture du Sterigmatocystis nigra sur le milieu de Czapek

avec le sulfate d’ammonium comme source d’azote.

Absence de l’allantoïnase et de l’uricase dans le mycélium

Les cultures pures de ce champignon provenaient de la Mycothèque du

Laboratoire de Cryptogamie du Muséum; nous tenons à remercier MM. R.

Heim et J. Duché qui ont bien voulu mettre à notre entière disposition leur

précieuse collection de Champignons inférieurs.

On ensemence largement, avec une souche de Sterigmatocystis nigra pro¬

venant d’une culture sur Sabouraud, 400 cc. de milieu de Czapek liquide de

composition

SO'Mg.0,5 gr. SO l Fe. . . . 0,01 gr.

PO’H 2 K .... 1,0 — SO l (NH‘)*. . 6,6 —

Cl K.1,0 — Saccharose . 100,0 —

SO'Zn.0,01 — Eau .... 1000 cc.

préalablement stérilisé à l’autoclave à 120° et placé dans une cuvette photo¬

graphique à l’étuve humide à 36°. Après soixante heures on recueille le mycé-

l’allantoïnase et l’uricase de sterigmatocystis nigra

135

liurn blanc, gaufré ; on le lave six fois à l’eau distillée, on l’essore entre des

doubles de papier Joseph après chaque lavage et on procède à la dessiccation

dans le vide sur chlorure de calcium, suivie d’un broyage au moulin et au mor¬

tier.

Recherche de l’allantoïnase dans le mycélium. — On place au bain

d’eau à 35°, dans des tubes à centrifuger, des milieux de composition :

Solution fraîche d’allantoïne à 2,25 gr. par

E

T

litre.

15 cc.

Poudre de Sterigmatocystis nigra .

Même poudre portée à 100° pendant 30' pour

0,2 gr.

—

détruire les enzymes.

—

0,2 gr.

Eau.

5 cc.

Chloroforme.

V gouttes

La solution d’allantoïne est obtenue par dissolution à froid de cet uréide

très finement pulvérisé.

Préparation du milieu T. — On pèse 0,2 gr. de mycélium dans un tube à

centrifuger, on ajoute 5 cc. d’eau et on porte le mélange pendant trente mi¬

nutes au bain d’eau bouillante, au reflux, afin d’éviter la concentration du

milieu ; après refroidissement, on ajoute l’allantoïne, puis le chloroforme

et on porte le tout au bain d’eau à 35° en même temps que le milieu E.

Résultats. — Après une, deux, trois, quatre heures de fermentation on ne

constate pas dans le milieu E la formation d’acide allantoïque, qu’on ne peut

caractériser par sa réaction colorée glyoxylique après hydrolyse chlorhydrique

à 100° et, à fortiori, dans le témoin T où les enzymes ont été détruits. L’allan¬

toïnase n’existe pas dans le mycélium de Sterigmatocystis nigra cultivé sur le

milieu de Czapek liquide, avec le sulfate d’ammonium comme source d’azote.

Recherche de l’uricase dans le mycélium. — Jusqu’ici nous avons

caractérisé l’uricolyse par la formation de l’acide allantoïque aux dépens de

l’acide urique, sous l’action successive des enzymes uricase et allantoïnase.

Dans le cas du Sterigmatocystis nigra l’absence de l’allantoïnase complique

Ja recherche de l’uricase, car la dégradation de l’acide urique, si elle existe,

s’arrête à l’allantoïne. Nous avons institué une méthode qui tient compte de

Ja formation possible de l’allantoïne comme terme ultime de la fermentation.

Elle est basée sur l’action des enzymes du mycélium sur l’acide urique et de

l’allantoïnase de Soja hispida sur l’allantoïne de fermentation, en présence de

cyanure de potassium qui inhibe l’uricase de Soja.

1° Action des enzymes du mycélium sur l'acide urique. — On place au bain

136 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQDE CHEZ LES CHAMPIGNONS

d’eau à 35° pendant deux heures, dans des tubes à centrifuger, des milieux

de composition :

Solution fraîche d’urate de K à 1 0 / 0 o d’acide

E

T

urique.

15 cc.

Poudre de Sterigmatocystis nigra .

Même poudre portée à 100° pendant 30' avec

0,2 gr.

—

l’eau pour détruire les enzymes.

—

0,2 gr.

5 cc.

Toluène.

V gouttes

2° Action de Vallantoïnase de Soja. — Après deux heures de fermentation

les milieux E et T sont pourvus de 1 /5.000 de cyanure de potassium et de 1 %

de poudre fermentaire de Soja (voir page 101). Les milieux sont encore main¬

tenus pendant trois heures au bain d’eau à 35°, pour permettre l’hydrolyse

de l’allantoïne par l’allantoïnase ; puis, l’acide allantoïque de fermentation

est recherché dans E et T par sa réaction glyoxylique après hydrolyse chlor¬

hydrique. On ne constate pas, dans le milieu E et à fortiori dans le témoin T,

la formation d’acide allantoïque. Le mycélium ne possède donc aucune action

uricolytique.

Conclusion. — Dans les conditions de culture où nous nous sommes placé,

le mycélium de Sterigmatocystis nigra ne renferme ni allantoïnase ni uricase.

B. — Culture du Sterigmatocystis nigra sur milieu de Czapek

avec l’allantoïne comme source d’azote. Synthèse de l'allantoïnase

par ce champignon; absence de l'uricase dans le mycélium.

M. Molliard a démontré que l’allantoïne, au même titre que l’acide urique,

est un excellent aliment azoté pour les Végétaux chlorophylliens (56) comme

pour les Champignons. En particulier, le Sterigmatocystis nigra se développe

parfaitement bien quand la source d’azote est constituée par cet uréide et le

rendement en substance sèche est élevé.

Nous avons cultivé ce champignon sur milieu de Czapek, avec l'allantoïne

comme source d’azote. Le milieu de culture (400 cc.), sans allantoïne, est sté¬

rilisé à l’autoclave à 120° pendant trente minutes. L’allantoïne est dissoute

dans le minimum d’eau bouillante puis ajoutée directement avant ensemence¬

ment, à raison de 4 gr. par litre (1,4 gr. d’azote). On procède de cette manière

pour éviter une hydrolyse partielle de l’uréide, lors de la stérilisation en

autoclave.

Après quarante-huit heures de culture à l’étuve humide à 36°, le mycélium

est récolté, lavé soigneusement six fois à l’eau, essoré, puis séché dans le vide

sur chlorure de calcium et finalement réduit en poudre fine.

L’ALLANTOÏNASE ET l’üRICASE DE STERIGMATOCrSTIS NIGUA

137

Recherche de l’allantoïnase dans le mycélium. — On place au bain

d’eau à 35°, dans des tubes à centrifuger, des milieux :

Solution fraîche d’al¬

lantoïne à 2,25 gr.

Ex

T,

E.

T,

par litre.

Poudre de Sterigma-

15 cc.

—

tocystis nigra. . .

Même poudre portée

à 100° pendant 30'

pour détruire les

0,2 gr.

enzymes.

—

0,2 gr.

—

0,2 gr.

Eau.

5 cc.

20 cc.

Chloroforme....

V gouttes

Préparation des milieux T, T 2 . — On pèse 0,2 gr. de mycélium dans des

tubes à centrifuger, on ajoute 5 cc. d’eau et on porte le mélange au bain d’eau

bouillante pendant trente minutes, au reflux. Après refroidissement total on

ajoute à T, 15 cc. d’allantoïne et le chloroforme et à T» 15 cc. d’eau et le

chloroforme. Les milieux Ex T, E. T 2 sont alors placés au bain d’eau à 35°.

Recherche et dosage de Vacide allantoïque au temps 0 et après fermentation . —

Malgré des lavages répétés, le mycélium retient toujours une certaine pro¬

portion d’acide allantoïque qu’il est nécessaire de connaître, car la présence

de cet uréide apporte une cause d’erreur lors de la recherche de l’allantoïnase,

les témoins donnant la réaction de l’acide allantoïque comme les expériences.

Au temps 0 on dosera donc, dans E, T. E. T 2 , l’acide allantoïque par spectro-

photométrie, puis on effectuera le même dosage après des durées de fermen¬

tation variables.

Les résultats sont consignés dans le tableau suivant :

D U RÉ E

de fermentation.

ACIDE ALLANTOÏQUE

pour 1QOO centimètres cubes de liquide fermen taire.

Expérience E,.

Expérience T,.

Expérience Eu.

Expérience T t .

0 h.

23,0 mgr.

18,0 mgr.

23,8 mgr.

17,0 mgr.

2

65,0 —

17,3 —

24,0 -

16,0 —

4

84,0 —

18,6 —

22,5 —

18,0 —

Dans l’expérience E, il se forme d’importantes quantités d’acide allantoïque

138 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURTQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

par fermentation aux dépens de l’allantoïne; dans les mêmes condition», les

témoins T, E 2 T 2 ne donnent rien. Le Sterigmatocystis nigra cultivé sur

Pallantoïne comme source d’azote renferme donc l’enzyme allantoïriase.

Recherche de l’uricase. — On place au bain d’eau à 35°, dans des tubes

à centrifuger, des milieux de composition :

E, E, T,

Solution fraîche

d’urate de K à

1 0 /oo d’ac. urique. 15 cc. 15 cc.

Poudre de Sterigma¬

tocystis nigra. . . 0,2 gr. — 0,2 gr. —

Même poudre portée

à 100° pendant 30'

pour détruire les

enzymes .... —• 0,2 gr. — 0,2 gr.

Eau. 5 cc. 5 cc. 20 cc. 20 cc.

Toluène.V gouttes V gouttes V gouttes V gouttes

Dosage de l'acide allantoïque au temps 0 et après fermentation. Résultats :

DURÉE

de fermentation.

ACIDE ALLANTOÏQUE

pour 1000 centimètres cubes de liquide fermentaire.

Expérience E t .

Expérience T,.

Expérience E â .

Expérience T*.

0 h.

24,0 mgr.

16,5 mgr.

23,5 mgr.

18,0 mgr.

2

25,5 —

-

24,5 —

—

4

24,8 —

17,5 —

23,0 —

17,2

L’uricolyse ne peut être mise en évidence par l’action sur l’acide urique

des enzymes du mycélium de Sterigmatocystis nigra cultivé sur milieu de

Czapek avec l’allantoîne comme source d’azote.

Conclusion. — Le mycélium de Sterigmatocystis nigra , cultivé sur allantoïne

comme source d’azote, effectue la synthèse de l’enzyme allantoïnase, mais

il est sans action sur l’acide urique (absence de l’uricase).

l’allantoT.nase et l’ubicase de sterigmatocystis NIGRA

139

C. — Culture du Sterigmatocystis nigra sur milieu de Czapek

avec l'acide urique comme source azotée.

Présence de l’allantoïnase et de l’uricase dans le mycélium.

Nous avons cultivé le Sterigmatocystis nigra sur le milieu de Czapek liquide

avec l’acide urique comme source d’azote. Le milieu de culture sans acide

urique est stérilisé à l’autoclave à 120° pendant trente minutes. L’acide

urique est ajouté au milieu de culture avant ensemencement, à l’état d’urate

de potassium, à raison de 4,2 gr. par litre (1,4 gr. d’azote). Après quarante-huit

heures de culture à l’étuve humide à 36°, le mycélium est récolté, lavé six fois

à l’eau distillée pour éliminer le milieu quil’imprègne, puis séché dans le vide

sur chlorure de calcium et réduit en poudre fine.

Recherche de l’allantoïnase dans le mycélium. — La méthode de

recherche de cet enzyme est celle indiquée pour le mycélium cultivé sur

allantoïne. Elle permet de constater la présence de l’allantoïnase dans ce mycé¬

lium.

Recherche de l’uricase dans ce mycélium. — La recherche, effectuée

comme pour le mycélium obtenu sur milieu de Czapek avec l’allantoïne comme

source d’azote, est positive.

Conclusion. — Le mycélium de Sterigmatocystis nigra, cultivé sur l’acide

urique comme source d’azote, renferme les deux enzymes allantoïnase et

uricase. Dans ces conditions de culture, le mycélium effectue la synthèse de

l’uricase.

D. — Cultures du Sterigmatocystis nigra sur différents milieux

et différentes sources d’azote.

Pour compléter les recherches précédentes nous avons cultivé ce champi¬

gnon sur différents milieux contenant divers composés azotés. Le tableau sui¬

vant indique les résultats obtenus concernant la présence ou l’absence de

l’allantoïnase et de l’uricase dans les mycéliums provenant de ces cultures.

RECHERCHE

MILIEU DE CULTURE

source d’azote

des enzymes

Allauloïnase.

Uricase.

Czapek liquide. . . .

SO'(NH*) 2

_

- - ...

Urée

—

- - ....

Allantoate de potassium

+

—

- - ....

Uroxanate de potassium

+

—

- - ...

Allantoïne

-f

—

- - ....

Urate de potassium

+

140 A. BRÜNEL. — MÉTABOLISME DB l’AZOTE PDBIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

RECHERCHE

MILIEU DE CULTURE

SOURCE D’AZOTE

des enzymes

Allantoïnase.

Uricase.

Raulin acide ....

NO’NH 4 , S0 4 (NH 4 ) 2

+

- -

Allantoïne

+

—

- - ....

Urate de potassium

+

Raulin neutre ....

NO :, NH‘

+

—

- - ....

Allantoïne

+

—

- - ....

Urate de potassium

+

G. Bertrand.

S0 4 (NH 4 ) 2 ,N0 : ’NH\ P0 4 H(NH 4 ) 2

Allantoïne

+

—

. .

+

—

.....

Urate de potassium

+

H"

Conclusions. — Le Sterigmatocystis nigra est capable d’utiliser, comme

l’avait déjà démontré M. Molliard, non seulement l’azote des sels ammonia¬

caux, mais aussi l’azote des substances organiques, en particulier l’azote de

l’urée, de l’allantoate de potassium, de l’uroxanate de potassium, de l’allan-

toïne, de l’acide urique...

La culture de ce champignon sur le milieu de Czapek, avec le sulfate d’am¬

monium comme source d’azote, conduit à l’obtention d’un mycélium pauvre

en enzymes : absence de l’uricase et de l’allantoïnase. Au contraire, si l’on

remplace le sulfate d’ammonium par l’urée, l’allantoate de potassium, l’uroxa¬

nate de potassium, l’allantoïne ou l’acide urique, on voit apparaître dans le

mycélium l’enzyme capable de fixer une molécule d’eau sur l’allantolne :

Y allantoïnase.

Les cultures de Sterigmatocystis nigra sur les milieux de Raulin acide, de

Raulin neutre et de G. Rertrand, la source d’azote étant constituée par les sels

ammoniacaux, l’allantoïne ou l’acide urique, conduisent à des mycéliums

renfermant l’allantoïnase.

Les cultures de ce champignon sur les milieux de Czapek, de Raulin acide,

de Raulin neutre et de G. Rertrand, avec l’acide urique comme source azotée,

accusent une évolution très nette des propriétés enzymatiques des mycéliums.

On y constate non seulement la présence de l’allantoïnase, mais encore celle

de l’enzyme dégradant l’acide urique en allantoïne : Yuricase.

En première approximation, on peut donc admettre que, comme chez les

Champignons Rasidiomycètes, la dégradation de l’acide urique et de l’allan-

toïne conduit à l’acide allantoïque.

l’alLANTOÏNASE ET l’üRICASE DE STERIGMATOCYSTIS NIGRA

141

NH — CO

I I

GO C — NH

NH — C

N H

\co

Uricase

O + H 2 0 — CO 2

CO — NH

NH-

I

GO

I

NH — CH

CO

I

NH

Allantoïnase

+ H 2 0

NH 2

I

CO

I

NH -

NH-

I

COOH CO

I I

CH-NH

Pour confirmer ces résultats, il était nécessaire d’isoler l’acide allantoïque

provenant de la dégradation de ces substances ; mais, à notre surprise et

malgré l’extrême sensibilité de la méthode qui permet de précipiter cet uréide

à l’état de dérivé dixantbylé, nous n’avons pu mettre l’acide allantoïque en

évidence dans les milieux fermentaires. Nous nous sommes alors demandé

si la dégradation de cet acide s’arrêtait, comme chez les Basidiomycètes, au

stade acide allantoïque ou si elle se poursuivait plus loin ?

Expériences. — On place au bain d’eau à 35°, des milieux de composition

Solution fraîche d’allantoïne à 2,25 gr. par

E

T

litre.

15 cc.

Poudre de Sterigmatocystis nigra (provenant

d’une culture sur allantoïne).

0,2 gr.

Même poudre portée à 100° pendant 30' pour

détruire les enzymes.

_

0,2 gr.

Eau.

5 cc.

Chloroforme.

V gouttes

Après six heures de fermentation on constate que l’expérience E donne :

1° La réaction colorée glyoxylique de l’acide allantoïque après hydrolyse

chlorhydrique à 100°,

2° A froid, la même réaction colorée phénylhydrazinique de l’acide glyoxy-

Jique,

3° Une liqueur alcaline où l’ammoniac peut être mis en évidence par le

réactif de Nessler.

Dans ces mêmes conditions l’expérience témoin T ne donne pas ces réactions.

Cet ensemble de faits permet de supposer qu’il doit exister dans le mycé¬

lium de Sterigmatocystis nigra un enzyme capable de scinder l’acide allantoïque

en ses constituants : urée et acide glyoxylique,

H 2 N • CO • NH V

>CH•COOH

H 2 N • CO • NH /

Enzyme

+ ïucT

NH-

2 OC< +

V NH-

CHO

I

COOH

142 A. BRUNEL. - MÉTABOLISME DE L’AZOTE PÜRIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

puis l’urée formée est hydrolysée par l’uréase du mycélium en carbonate

d’ammonium,

Uréase

ÜL \ NH2 + 2 H-O

C0 3 (NH')-

ce qui explique la présence de l’ammoniac dans le liquide fermentaire.

CHAPITRE II

UN NOUVEL ENZYME VALLANTOÏCASE

A. — Démonstration de la présence d’une nouvelle hydrolase

dans le mycélium de Sterigmatocystis nigra

Les expériences qui vont suivre ont été faites avec le sel de potassium de

l’acide allantoïque dont nous allons décrire la préparation.

Préparation de l'allantoate de potassium pur. — On abandonne trente-six

heures à la température du laboratoire :

Allantoïne pure 5 gr., Eau 5 cc., HOK pure 5 gr.

La liqueur, qui s’est prise en masse, est additionnée du minimum d’eau pour

dissoudre le précipité. On acidifie par l’acide acétique cristallisable en présence

de phtaléine, on revient en arrière avec une goutte de HOK pour avoir une

solution à peine alcaline, on ajoute de l’alcool à 96° qui diminue la solubilité

de l’allantoate et on laisse cristalliser. Après une recristallisation dans l’eau

avec addition d’alcool, on essore l’allantoate de potassium, on le lave à l’alcool

à 96° puis à l’éther et on le sèche à l’étuve à 70°. Dans ces conditions, l’allan-

toate de potassium obtenu est généralement pur à l’analyse.

Recherche d’un enzyme hydrolysant l’acide allantoïque dans le

mycélium de STERIGMATOCYSTIS NIGRA ortenu sur milieu de

Czapek avec l’allantoïne comme souncE d’azote. — On cultive le Sterig¬

matocystis nigra sur le milieu de Czapek avec l’allantoïne comme source d’azote.

Le mycélium est récolté après cinquante heures à l’étuve humide à 36°, lavé

six fois à l’eau distillée avec essorage intermédiaire au papier Joseph, séché

dans le vide sur chlorure de calcium et réduit en poudre fine.

Étude du mycélium. — Recherche de l’acide glyoxylique par sa réaction

colorée phénylhydrazinique à froid : négative.

Recherche de l’acide allantoïque par sa réaction phénylhydrazinique après

hydrolyse chlorhydrique à 100° : positive faible.

Recherche de l’allantoïnase : positive.

Recherche de l’uricase : négative.

Recherche de l'enzyme hydrolysant l'acide allantoïque. — Toutes les expé¬

riences sont faites à pH 7 avec le mélange tampon de Clark et Lues :

Dans une fiole de 200 cc. mélanger : HONa M/5 29,63 cc., PO' 1 H-’K M/5

50 cc., puis compléter à 200 cc. avec l’eau distillée.

144 A. BRDNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Expériences. — On place au bain d’eau à 30-31°, dans des tubes à centri-

fuger, des milieux de composition :

E,

Mélange tampon à

Ti

E,

T 2

pH 7.

AUantoate de potas-

20 cc.

sium pur ....

Poudre de Sterigma-

0,02 gr.

tocystis nigra. . .

Même poudre portée

à 100° pendant 30'

pour détruire les

0,2 gr.

enzymes.

—

0,2 gr.

—

0,2 gr.

i Toluène.

V gouttes

Y gouttes

V gouttes

Prèparation du milieu T,. — On pèse 0,2 gr. de mycélium dans un tube à

centrifuger, on ajoute 10 cc. du mélange tampon et on porte le tout au bain

d’eau à 100° pendant trente minutes. Après refroidissement complet on ajoute

encore 10 cc. du mélange tampon, puis l’allantoate de potassium et le toluène.

Expériences ^, T,. — Elles sont destinées à la recherche de l’acide glyoxylique

provenant de l’hydrolyse enzymatique de l’acide allantoïque. L’acide glyoxy¬

lique est caractérisé par la très sensible réaction phénylhydrazinique de

Fosse et Hieulle.

Après une, deux, trois, quatre heures de fermentation, on introduit dans

des tubes à essais, 2 cc. de Ex et de T,, on refroidit extérieurement par l’eau,

puis on ajoute dans chaque tube :

Solution aqueuse de chlorhydrate de phényl-

hydrazine à 1 %.2 gouttes (0,1 cc.).

et, après deux minutes de condensation

Solution aqueuse de ferricyanure de potassium

à 5 %.2 gouttes (0,1 cc.).

Acide chlorhydrique concentré pur.1,2 cc.

Le tableau suivant indique les résultats obtenus :

DURÉE

de fermentation

RECHERCHE DE l’ACIDE GLYOXYLIQUE

Expérience E ( .

Expérience Ti

1 h.

positive

négative

2

—

3

—

4

UN NOUVEL ENZYME l’aLLANTOÏC ASE

145

Dans l’expérience E,, où les enzymes n’ont pas été détruits, on constate

la formation d’importantes quantités d’acide glyoxylique aux dépens de l’acide

allantoïque.

Dans l’expérience Ti, où les enzymes ont été détruits par la chaleur, il n’y

a pas formation d’acide glyoxylique aux dépens de l’acide allantoïque.

Conclusion. — L’acide glyoxylique apparaît par voie enzymatique quand

on fait agir le mycélium de Sterigmatocystis nigra sur l’allantoate de potassium.

Expérience E 2 . — L’expérience E 2 , identique à Ei, a pour but de rechercher

l’urée provenant de l’hydrolyse de l’acide allantoïque.

Après deux, trois, quatre heures de fermentation, on mesure 5 cc. de E*, on

refroidit extérieurement par l’eau, on défèque par le réactif de Tanret-Fosse,

on lave trois fois et on ajoute au fdtrat (environ 10 cc.) un volume double

d’acide acétique cristallisable (20 cc.), puis du xanthydrol en solution dans

l’acide acétique au 1 /10 (1 /20 du volume total) et on laisse condenser trois

heures.

Résultats :

DURÉE

<le fermentât ion.

RECHERCHE

de l'urée.

2 heures.négative

3 — —

4 — —

L’urée ne peut être mise en évidence dans le milieu E>. Ce fait s’explique

par la présence de l’uréase dans le mycélium qui hydrolyse la carbamide en

carbonate d’ammonium à mesure de sa formation. Au contraire, l’ammoniac

est facilement caractérisé dans E 2 par le réactif de Nessler.

Expérience T,. — Elle permet de contrôler les résultats de T t . Elle a pour

but de rechercher si, avec le temps et à pH 7, l’allantoate de potassium ne

subit pas un commencement d’hydrolyse. Dans les conditions de température

et de temps où nous nous sommes placé, on ne constate pas dans T 2 après deux,

trois, quatre heures de séjour à 30-31°, la formation d’acide glyoxylique aux

dépens de l’allantoate de potassium.

Conclusions. — Le mycélium de Sterigmatocystis nigra renferme une hydro-

lase capable de scinder l’acide allantoïque en ses constituants, urée et acide

glyoxylique :

H 2 N • CO • NH V

>CH•COOH

H ! N'CO • NH /

Hydrolase

+ HAP

20C

\

/ NH 2

NH-

CHO

I

CO 2 H

L’acide glyoxylique peut être aisément caractérisé par la réaction phényl-

hydrazinique de Fosse et Hieulle. La présence de l’urée ne peut être mise

en évidence par précipitation à l’état de dixanthylurée, carie mycélium ren¬

ferme une uréase active qui transforme l’urée en carbonate d’ammonium.

10

Mémoires du muséum, nouvelle série, tome VI.

146 A. BRÜNEL. — MÉTABOLISME DE L'AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

oc/

NH 2

Uréase

+ 2H 2 0

C0 3 (NH‘) 2 .

Conformément à fa nomenclature des enzymes, nous appellerons Allan¬

toïcase la nouvelle hydrolase qui scinde l’acide allantoïque en urée et acide

glyoxylique.

La recherche de l’allantoïcase dans de nombreux mycéliums de Sterigmato-

cystis ni.gr a, obtenus sur différents milieux contenant divers composés azotés,

nous a donné les résultats consignés dans le tableau suivant :

MILIEU DE CULTURE

SOURCE D’AZOTE

RECHERCHE

de l’allantoïcase.

Czapek liquide.

SO l (NH 4 ) 2

+

. . .

Urée

+

- - ‘.

Allantoate de potassium

. . .

Uroxanate de potassium

+

. . .

Allantoïne

+

. . .

Urate de potassium

+

Raulin acide.

NO‘NH\ SO’(NH 4 ) 2

+

- - ...

Allantoïne

+

. ..

Urate de potassium

+

Raulin neutre.

NO’NH*

4-

. . .

Allantoïne

+

. . .

Urate de potassium

+

G. Bertrand.

SO‘(NH') 2 , NO’NH 1 , PO'HfNH'’) 2

+

. .

Allantoïne

+

. .

Urate de potassium

+

Le Sterigmalocystis phoenicis voisin du Sterigmatocystis nigra renferme aussi

l’enzyme Allantoïcase.

La culture de YAspergillus orizeae sur le milieu de Czapek avec l’allantoïne

comme source d’azote conduit à un mycélium renfermant F allantoïcase.

B. — Sur quelques propriétés de l’allantoïcase.

Influence de la température sur la réaction.

H 2 N CO -NIL

)CH • COOH

H 2 N ■ CO • NH /

Allantoïcase

+ ILO” '

2 OC

NH 2

"NH-

CHO

I

COOH

Les expériences qui vont suivre ont été effectuées avec un mycélium de

Sterigmatocystis nigra obtenu sur milieu de Czapek liquide avec l’allantoïne

comme source d’azote après une durée de culture de quarante-huit heures.

UN NOUVEL ENZYME — l’aLLANTOÏCASE

147

Étude du mycélium. — Recherche de l’acide glyoxylique : négative.

Dosage de l’acide allantoïque : 0,23 P- % O-

Recherche de l’allantoïnase : positive.

Recherche de l’allantoïcase : positive.

Recherche de l’uricase : négative.

Recherche de la température optimum d’action.

Conditions expérimentales. — On place au bain d’eau à des températures

variables des milieux de composition :

Solution d’allantoate de K à

1,216 % 0 soit 1 % 0 d’acide al-

Jantoïque.

Poudre de Sterigmatocystis nigra

Durée de fermentation.

Toluène.

E,

T,

10 cc.

0,1 gr.

—

1-3 h.

V gouttes

Expériences Ej. — On dose à l’état de dixanthylurée (voir page 15) l’acide

allantoïque non détruit par l’allantoïcase : 1° après une heure ; 2° après trois

heures de fermentation.

Expérience Ti. — Elles sont destinées à la recherche de l’urée provenant de

l’hydrolyse de l’acide allantoïque par l’allantoïcase. Après une et trois heures

de fermentation, les milieux T, refroidis sont déféqués par le réactif de Tanret-

Fosse et filtrés; les précipités sont lavés trois fois et les filtrats additionnés

d’un volume double d’acide acétique cristallisable et de xanthydrol en solu¬

tion au 1 /10 dans l’acide acétique (1 /20 du volume total).

Résultats : après trois heures de condensation on n’obtient pas de précipité

de dixanthylurée. Ce fait s’explique par la présence dans le mycélium d’une

uréase active qui hydrolyse l’urée à mesure de sa formation. Dans les expé¬

riences Ei, c’est donc bien l’acide allantoïque non détruit que l’on dose à l’état

de dixanthylurée.

Expériences T 2 . — Elles ont pour but de rechercher si, avec le temps et à des

températures différentes, l’acide allantoïque ne subit pas un commencement

d’hydrolyse. L’acide glyoxylique a été recherché par sa réaction colorée

phénylhydrazinique. Résultats :

TEMPÉRATURE

25°-27°-30°

32°5-35°5

38°

TEMPS

1-3 heures

»

3 heures

RECHERCHE

(le l’acide glyoxylique,

négative

positive faible

Conclusion. — Il résulte des expériences T, et 'L, que l’acide allantoïque

non détruit par l’allantoïcase peut être dosé pondéralement à l’état de dixan¬

thylurée et que dans les conditions de nos expériences on ne doit pas dépasser

148 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

la température de 38° car, au-dessus, sans intervention fermentaire, il y a début

d’hydrolyse de l’allantoate de potassium.

Nous avons consigné dans le tableau suivant les résultats des expériences Ej.

TEMPÉ-

RATU RE

TEMPS

en heures.

ux*

p. 10 cc.

en

milligrammes.

ACIDE ALI

Introduit.

ANTOÏQUE

Trouvé.

PAR LITRE

Détruit.

ACIDE

allantoïque

détruit p. IÛ0.

25°

i

40,4

1 gr.

0,846 gr.

0,154 gr.

15,4

27°

—

38,0

0,796 —

0,204 —

30°

—

35,0

—

0,733 —

0,267 —

26,7

32 °5

—

39,2

—

0,811 —

0,189 —

18,9

35°5

—

44,0

—

0,921 —

0,079 —

7,9

38»

—

45,6

—

0,955 —

0,045 —

4,5

25»

3

32,8

—

0,687 —

0,313 —

31,3

27°

—

28,2

—

0,590 —

0,410 —

—

22,8

—

0,477 —

0,523 —

52,3

32 °5

—

26,4

—

0,553 —

0,447 —

44,7

35°5

—

31,2

—

0,653 —

0,347 —

34,7

38°

—

34,0

—

0,712 —

0,288 —

28,8

Les courbes correspondantes I et II (fig. 14) permettent de constater que

rS ?T

l’optimum de température se trouve placé vers 30° quand la fermentation

s’effectue en l’absence de mélange tampon.

TJN NOUVEL ENZYME — l’alLANTOÏCASE

149

C. — pH optimum de Pallantoïcase de Sterigmatocystis nigra.

Nous avons utilisé les solutions tampons de Clark et Lubs à base de

HONa M/5 et de P0 4 H 2 K M/5. L’allantoate de potassium est ajouté direc¬

tement à ces solutions, à raison de 1,216 gr. par litre, soit une teneur en acide

allantoïque de 1 gr. par litre.

Conditions expérimentales :

Solution d’allantoate de potassium à 1 °/ 00 d’acide allan¬

toïque...10 cc.

Poudre de Sterigmatocystis nigra .0,10 gr.

pH.... variable.

Durée de fermentation.. 3 heures,

T emp ér ature.30°

Toluène.. Y gouttes.

L’acide allantoïque non détruit est dosé à l’état de dixanthylurée.

Les résultats sont consignés dansle tableau suivant ; ils ont servi à construire

la courbe de la figure 15.

VALEUR

du pli.

ux*

p. 10

ceulimètres cubes

en

milligrammes.

ACIDE AL

Introduit.

LANTOÏQUE P

Trouvé.

4R LITRE

Détruit.

ACIDE

allantoïque

détruit p. 100 .

6,4

34,40

1,00 gr.

0,720 gr.

0,180 gr.

18,0

6,6

30,08

—

0,630 —

0,370 —

37,0

6,8

25,8

—

0,540 —

0,460 —

46,0

6,9

24,90

—

0,521 —

0,479 —

47,9

7,0

24,44

—

0,510 —

0,490 —

49,0

7,1

23,28

—

0,487 —

0,513 —

51,3

7,2

22,4

—

0,469 —

0,531 —

53,1

7,3

21,9

—

0,458 —

0,542 —

54,2

7,4

23,28

—

0,487 —

0,513 —

51,3

7,5

26,0

—

0,544 —

0,456 —

45,6

7,6

27,4

—

0,564 —

0,436 —

43,6

7,8

29,2

—

0,611 —

0,389 —

38,9

8,0

30,7

—

0,643 —

0,357 —

35,7

Pour une température de 30° le p H optimum est situé à p H 7,3.

Nous avons repris l’étude de l’influence de la température en se plaçant

au pH optimum 7,3, les conditions expérimentales étant les suivantes :

Solution d’allantoate de K à 1 % 0 d’acide allantoïque à

pH 7,3.10 cc.

Poudre de Sterigmatocystis nigra .0,1 gr.

Durée de fermentation.. . 2-3 heures.

Température.. variable

Toluène.. V gouttes.

'ISO A. BR0NEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE P0RIQ0E CHEZ LES CHAMPIGNONS

L’acide allantoïque non détruit est dosé à l’état de dixanthylurée. Résultats :

TEMPÉ¬

RATURE

TEMPS

en heures.

üp

pour

10 cent, cubes

en

milligrammes.

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

ACIDE

allantoïque

détruit p. 100.

Introduit.

Trouvé.

Détruit.

27°

2

33,20

KHI

0,695 gr.

0,305 gr.

30,5

30°

—

31,90

—

0,668 —

0,332 —

33,2

32°

—

31,00

—

0,649 —

0,351 —

35,1

35°

—

27,40

—

0,574 —

0.426 —

42,6

36°

—

26,0

—

0,544 —

0,456 —

45,6

37°

—

24,0

—

0,502 —

0,498 —

49,8

38°

—

22,02

—

0,460 —

0,540 —

54,0

39°5

—

25,84

—

0,460 —

46,0

40°5

—

29,0

—

0,607 —

0,393 —

39,3

27°

3

27,0

—

0,565 —

0,435 —

43,5

30°

—

24,0

—

0,502 —

0,498 —

49,8

32°

—■

22,0

—

0,460 —

0,540 —

54,0

35°

—

19,28

—

0,596 —

59,6

37°

—

18,30

—

0,383 —

0,617 —

61,7

38°

—

17,28

—

0,362 —

0,638 —

63,8

39°

—

20,02

—

0,419 —

0,581 —

58,1

40°5

24,60

0,515 —

0,485 —

48,5

A pH 7,3, on constate un très net déplacement de la température optimum

d’action qui se trouve alors être de 38°.

Fig. lu.

ÜN NOUVEL ENZYME — L’ALLANTOÏCASE

151

Connaissant le pH optimum et la température optimum d’action nous

allons étudier la marche de l’hydrolyse enzymatique de l’acide allantoïque en

fonction du temps.

J). — Courbe d’action de l’allantoïcase en fonction du temps.

Conditions expérimentales :

Solution d’allantoate de K à 1 °/ 0 o d’acide allantoïque

àpH.7,3.10 cc.

Poudre de Sterigmatocystis nigra .0,1 gr.

Durée de fermentation.variable.

Température.38°

Toluène.V gouttes.

L’acide allantoïque non détruit est dosé à l’état de dixanthylurée :

Résultats :

DURÉE

de

fermentation.

UX 2

pour 10

centimètres cubes

en

milligrammes.

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

ACIDE

allantoïque

détruit p. 100.

Introduit.

Trouvé.

Détruit.

1 h.

33,00

1,00 gr.

0,691 gr.

0,309 gr.

30,9

2

23,30

—

0,488 —

0,512 —

51,2

3

19,34

—

0,405 —

0,595 —

59,5

4

17,4

—

0,364 —

0,636 —

63,6

5

15,6

—

0,326 —

0,674 —

67,4

6

13,8

—

0,289 —

0,711 —

71,1

7

13,0

0,272 —

0,728 —

72,8

8

12,7

0,266 —

0,734 —

73,4

9

12,4

—

0,260 —

0,740 —

74,0

10

12,2

—

0,255 —

0,745 —

74,5

La courbe de la figure 16 (p. 152) traduit ces résultats.

Très rapide au début, l’action enzymatique se ralentit et la courbe repré¬

sentative devient parallèle à l’axe des x. Nous retrouvons ici l’allure habituelle

des courbes d’action des enzymes des Champignons.

Le freinage de la réaction ne doit pas être attribué à une variation impor¬

tante de la réaction de milieu, mais plutôt à la destruction de l’allantoïcase

en milieu aqueux, comme nous l’avons déjà vu pour l’allantoïnase et l’uri-

case et que D. Bach (2) a signalée pour l’asparaginase de Sterigmatocystis

nigra.

152 A. BRDNEL. — MÉTABOLISME DE l’aZOTE PURIQÜE CHEZ LES CHAMPIGNONS

B. — Recherches comparatives sur les propriétés enzymatiques de mycéliums

de Sterigmatocystis nigra cultivés sur Gzapek avec différents corps

azotés. Mécanisme de l’utilisation de 1 azote de ces substances dans l'édifica¬

tion du mycélium.

Des cultures de Sterigmatocystis nigra ont été effectuées sur le milieu de

Czapek liquide avec comme sources d’azote :

1. Sulfate d’ammonium .... 6 gr. 6 soit 1 gr. 40 d’N par litre

2. Urée.3 gr. — 1 gr. 39 —

3. Allantoate de potassium ... 5 gr. 4 — 1 gr. 40 —-

4. Allantoïne.4 gr. — 1 gr. 41 —

5. Acide urique.4 gr. 2 — 1 gr. 39 —

Le saccharose a été utilisé comme source de carbone à raison de 100 gr. par

Fig. 16.

litre. La substance azotée (l’acide urique à l’état d’urate de potassium) est

ajoutée directement au milieu de culture préalablement stérilisé à l’autoclave

à 120° pendant 30'. Tous les milieux 'sont ensemencés largement avec une

ÜN NOUVEL ENZYME — l’aLLANTOÏCASE

153

souche de Sterigrnatocystis nigra provenant d’une culture sur Sabouraud. Les

mycéliums sont récoltés uniformément après quarante-huit heures de culture

à l’étuve humide à 36° ; on les lave soigneusement six fois sur entonnoir à

l’eau distillée avec essorage intermédiaire au papier Joseph ; on procède alors

à la dessiccation dans le vide sur chlorure de calcium puis au broyage au

moulin et au mortier pour obtenir une poudre fine.

Recherches qualitatives effectuées sur ces mycéliums. — Nous avons

étudié ces mycéliums au point de vue :

1° des acides glyoxylique et allantoïque,

2° des enzymes uricase, allantoïnase, allantoïcase et uréase.

Les méthodes de recherche des enzymes ont été décrites au cours de ce

Travail, nous n’y reviendrons pas. Le tableau suivant indique les résultats

obtenus :

MYCÉLIU M

récolté sur

RECHERCHE

des acides

RECHERCHE DES ENZYMES

Glyoxylique.

Allantoïque.

Uricase.

Allantoïnase.

Allantoïcase.

Uréase.

1. SOhNH 1 )- . . .

+

2. Urée.

—

+

3. Allantoate de K .

—

traces

—

+

4. Allantoïne. . . .

—

traces

—

+

5. Acide urique. . .

—

traces

+

“T

+

Conclusions.

Acides glyoxylique et allantoïque. — Nous n’avons pu mettre en

évidence l’acide glyoxylique dans les différents mycéliums étudiés ; quant à

l’acide allantoïque, il existe à l’état de traces dans les mycéliums où la sub¬

stance azotée du milieu nutritif était constituée :

1° par l’allantoate de potassium,

2° par l’allantoïne ou l’acide urique, substances dont la dégradation conduit

à l’acide allantoïque.

Uricase. — La présence de l’uricase n’a pu être constatée que dans le mycé¬

lium 5. Quand la source azotée est constituée par l’acide urique, le mycélium

de Sterigrnatocystis nigra effectue la synthèse de l’uricase.

Allantoïnase. — Présence générale de cet enzyme dans les mycéliums

étudiés sauf quand la source d’azote est constituée par le sulfate d’ammonium.

Allantoïcase et Uréase. — Tous les mycéliums étudiés renferment ces

deux enzymes.

154 A. BRÜNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Recherches comparatives sur les propriétés allantoïcolytiques de

ces mycéliums. — L’expérience a montré que l’allantoïcase contenue dans les

divers mycéliums de Sterigmatocystis nigra ne présente pas les mêmes degrés

d’activité. Dans un but de comparaison nous exprimerons ces variations,

ainsi que nous l’avons exposé pour l’allantoïnase (voir page 50), par le pour¬

centage d'acide allantoïque détruit dans un milieu de composition déterminée.

Les conditions expérimentales de la mesure de l’activité allantoïcolytique

que nous désignerons par A c ont été fixées comme suit :

Solution fraîche d’allantoate de K à 1 °/ 00 d’acide allan¬

toïque, à pH 7,3.10 cc.

Mycélium très finement pulvérisé. 0,1 gr.

Température.38°

Durée de fermentation.2 heures.

Toluène. V gouttes.

L’acide allantoïque non détruit est dosé par la méthode pondérale à l’état

de dixanthylurée. Le tableau suivant donne la valeur de Ac pour les mycé¬

liums 1, 2, 3, 4, 5, obtenus sur le milieu de Czapek liquide avec diverses

sources d’azote.

MYCÉLIUM

UX 2

pour 10

centimètres cubes

en

milligrammos.

ACIDE AI

Introduit.

LANTOÏQUE P

Trouvé.

AR LITRE

Détruit.

VALEUR

de A c .

i

44,82

1,00 gr.

0,939 gr.

0,061 gr.

6,1

2

39,42

—

0,825 —

0,175 —

17,5

3

37,70

—

0,789 —

0,211 —

21,1

4

26,0

—

0,544 —

0,456 —

45,6

5

25,0

0,502 —

0,498 —

49,8

Conclusions. —- La présence de l’allantoïcase dans le mycélium de Sterig¬

matocystis nigra est indépendante de la source azotée. Elle n’est pas liée à la

présence, dans le milieu de culture, de l’allantoate de potassium.

L’activité allantoïcolytique ou encore la richesse en allantoïcase des diffé¬

rents mycéliums est très variable ; elle dépend de la source azotée. L’activité

est maximum quand la source d’azote est constituée par l’allantoïne ou l’acide

urique.

a) Culture sur milieu de Czapek avec le sulfate d’ammonium comme

source d’azote. — Quand la source azotée est constituée par le sulfate d’am¬

monium directement assimilable, le mycélium possède une allantoïcase peu

active (A c = 6,1). La présence de cet enzyme démontre que le Sterigmatocystis

nigra est capable de le synthétiser même en l’absence de la substance qu’il

dégrade.

UN NOUVEL ENZYME — l’alLANTOÏCASE

loo

h ) Culture sur milieu de Czapek avec l’urée. Mécanisme de l’utili¬

sation DE LA CARBAMIDE DANS L’ÉDIFICATION DU MYCÉLIUM. — Quand la

source d’azote est constituée par l’urée, la teneur en allantoïcase du mycélium

augmente ; l’activité de cet enzyme prend une valeur moyenne, égale ici à 17,1.

La teneur en uréase du mycélium suit une évolution parallèle; elle est aussi

beaucoup plus élevée (D. Bach) (3). Il semble donc exister une relation entre

ces deux enzymes, mais dans l’état actuel de nos connaissances il est impos¬

sible d’en préciser la nature.

Conformément aux recherches de Shibata, Kossowicz, Bach... le Sterig-

matocystis nigra utilise l’urée pour l’édification de son mycélium, après sa

transformation préalable en carbonate d’ammonium par l’uréase.

NH 2

N H 2

Uréase

+ 1 ! 0

C0 3 (NH') 2 .

c) Culture sur le milieu de Czapek avec l’allantoate de potassium.

Utilisation de cet uréide dans l’édification du mycélium. — Quand

la source azotée est constituée par l’allantoate de potassium, la teneur en

allantoïcase n’augmente que faiblement par rapport à celle du mycélium

obtenu sur l’urée ; son activité est ici de 21,1. Les propriétés allantoïcoly-

tiques de ces deux mycéliums sont en tous points comparables. Cette simili¬

tude s’explique par la facilité avec laquelle l’allantoate de potassium est hydro-

lysé en milieu acide. En effet, sans intervention enzymatique, dans le milieu

de Czapek à l’étuve à 36°, une partie de l’allantoate de potassium est scindée

en urée et acide glyoxylique. L’allantoate de potassium se comporte donc

comme l’urée vis-à-vis du Sterigmatocystis nigra.

L’utilisation de l’allantoate de potassium dans l’édification du mycélium

se fait en deux temps :

1° par voie chimique et enzymatique cet uréide est scindé en ses consti¬

tuants,

H 2 N • CO • NH V

>CH•COOH

H-N • CO • NH'

p H < 7 et allantoïcase

+TÜÔ

,NH 2

2 OC\ +

J \

NH J

CHO

I

COOH.

2° l’uréase hydrolyse l’urée formée en carbonate d’ammonium.

/'NH" Uréase

N\H 2 + 2H 2 0

C0 3 (NH‘)-.

Comme la carbamide, l’allantoate de potassium est dégradé préalablement

jusqu’à l’ammoniac.

d) Culture sur milieu de Czapek avec l’allantoïne. Mécanisme de

l’utilisation de cet uréide dans l’édification du mycélium. — Avec

156 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

l’allantoïne comme source d’azote, on constate une importante augmentation

de la teneur en allantoïcase du mycélium. L’activité de cet enzyme passe à

45,6. Le mycélium renferme en outre une allantoïnase et une uréase actives.

Le Sterigmatocystis nigra est donc capable de modifier les propriétés enzyma¬

tiques de son mycélium en fonction de la nature de la substance azotée.

L’utilisation de l’allantoïne par le Sterigmatocystis nigra se fait par toute

une série d’étapes enzymatiques qui conduisent l’azote de cet uréide à l’état

d’azote ammoniacal et dont le schéma suivant rend bien compte.

NH 2

I

CO

I

NH —

CO — NH

I

CO

I

CH — NH

Allantoïnase

4- H’O "

NH 2

1

NH 2

i

1

CO

COOH

i

1

CO

j

N H —

1

CH-

|

- NH

/NH- Uréase

^NH 2 + 2H-0

Allantoïcase

L 11-0 '

C0 3 (NH’) 2

NH 2

I

2CO +

!

NH 2

CHO

COOH

t) Culture sur milieu de Czapek avec l’acide urique. Mécanisme de

l’utilisation de cet acide dans l’édification du mycélium. — La

culture du Sterigmatocystis nigra sur l’acide urique comme source d’azote accuse

une transformation très importante des propriétés enzymatiques du mycé¬

lium ; l’allantoïcase y est aussi très active (A c = 49,8), mais il apparaît dans le

mÿcéliüm un nouvel enzyme : l’uricase.

L’utilisation de l’acide urique comme source d’azote demande une étape

enzymatique supplémentaire : la dégradation de cet acide en allantoïrie.

NH

I

CO

I

NH

CO

I

C — NH

II

C—NH

Uricase

\qq + O H O — CO J

N H 2 CO

I

CO

I

NH — CH

N H

I

CO

I

NH

Comme pour l’allantoïne, l’azote de l’acide urique est finalement conduit

à l’état d’azote ammoniacal.

Le Sterigmatocystis nigra est donc capable d’édifier son mycélium avec

l’urée, l’allantoate de potassium, l’allantoïne ou l’acide urique comme sources

d’azote. L’utilisation de ces substances ne se fait qu’après dégradation com¬

plète de la molécule, retour de l’azote organique à l’azote minéral, c’est-à-dire

à l’ammoniac.

Pour cette dégradation, le Sterigmatocystis nigra emprunte la voie enzyma-

UN NOUVEL ENZVME — LALLANTOÏCASE 157

tique ; le mycélium effectue la synthèse des enzymes qui lui sont néces¬

saires.

A la liste des enzymes, connus dans ce champignon, viennent s’ajouter

l’uricase, l’allantoïnase et l'allantoïcase.

)

[

t

F. — Culture du Sterigmatocystis nigra sur les milieux de Raulin j

et de G. Bertrand avec différentes sources d'azote.

Propriétés enzymatiques des mycéliums obtenus.

i

Les cultures du Sterigmatocystis nigra sur le milieu de Czapek avec des

sources d’azote variées conduisent à l’obtention de mycéliums dont le»

propriétés enzymatiques sont en rapport avec la nature de la substance

azotée. Nous nous sommes proposé d’étudier, à ce même point de vue, les

cultures obtenues sur les milieux de Raulin acide, de Raulin neutre et de

G. Bertrand.

i • ' *1

1°Culture du STERIGMATOCYSTIS NIGRA sur milieu de Ra.ulin

acide.

i

Le milieu de culture avait la composition : ;

Eau. 1.500 cc. CO :î Mg..... 0 gr. 4

Saccharose ... 70 gr. SO‘Zn. 0 gr. 07 I

Acidetartrique. . 4— SO‘Fe. Ogr. 07 , j

PO‘H 4 K .... 0 gr. 6 Si0 3 K 3 . 0 gr. 07 !

CO 3 K 2 . 0 gr. 6 . h j

La source d’azote était constituée par les sels ammoniacaux, l’allantoïaq

ou l’acide urique. Les teneurs étaient les suivantes :

N ra = Mycélium cultivé sur sels ammoniacaux : N O'N H 4 4 gr., SO(NH')-O,9gr.

A,,, = — — — allantoïne : allantoïne 4,50 gr.

U ra = — — — acide urique : acide urique 4,80gr. (urate de K).

La souche d’ensemencement provenait d’une culture de Sterigmatocystis

nigra sur Sabouraud ; les mycéliums furent récoltés uniformément après

quarante-huit heures, lavés six fois à l’eau distillée avec essorage intermédiaire

entre chaque lavage, séchés dans le vide sur chlorure de calcium et broyés au

moulin et au mortier.

Recherches qualitatives effectuées sur ces mycéliums. — Nous

avons recherché dans ces mycéliums :

1° les acides glyoxylique et allantoïque,

2° les enzymes uricase, allantoïnase, allantoïcase et uréase.

1.58 A. BRUNEL. - MÉTABOLISME DE l’aZOTE PURIQÜE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Les résultats sont consignés dans le tableau suivant :

MYCÉLIUM

RECHERCHE

des acides

RECHERCHE DES ENZYMES

Glyoxylique.

Allantoïque.

Uricasc.

Allantoïnase.

Allan toïcase.

Uréase.

N,,.

_

+

_L

4-

Ara .

—

traces

—

+

-

+

Ura .

—

traces

+

Mesure de l’activité allantoïcolytique de ces mycéliums. — Nous

avons mesuré l’activité de Pallantoïcase de ces mycéliums vis-à-vis de l’allan-

toate de potassium en suivant la technique décrite page 154. Résultats :

MYCÉL11J M

UX 2

pour

10 cent, cubes

en

milligrammes.

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

VALEUR

de A r.

Introduit.

Trouvé.

Détruit.

N,.

34,20

1,00 gr.

0,716 gr.

0,284 gr.

28,4

An.-.

29,00

—

0,607 —

0,393 —

39,3

U,.

28,25

—

0,592 —

0,408 —

40,8

Réunissons dans un tableau les caractéristiques de ces mycéliums et de ceux

obtenus sur Czapek dans des conditions de cultures identiques.

RECHERCHE DE

MYCÉLIUMS OBTENUS

sur Czapek.

MYCÉLIUMS OBTENUS

sur Rauliu acide.

S0 4 (NH*) s

Allantoïne.

Acide

urique.

Sels d’am¬

moniaque.

Allautoïne.

Acide

urique.

Ac. glyoxylique. . .

Ac. allantoïque. . .

-—

traces

—

traces

Uricase.

—

_

+

Allantoïnase ....

—

+

“f"

Allantoïcase (A,) . .

6,1

45,6

49,9

28,4

39,3

40,8

Uréase.

+

-f

+

UN NOUVEL ENZYME — l’ALLANTOÏCASE

159

Conclusions.

Acide glyoxylique. — L’acide glyoxylique n’est pas caractérisable dans

Jes différents mycéliums provenant des cultures sur Czapek et Raulin acide.

Au contraire il peut être facilement mis en évidence dans les milieux de culture

quand la source d’azote est constituée par l’allantoïne ou l’acide urique.

Acide allantoïque. — Quand la source d’azote est constituée par les sels

ammoniacaux, l’acide allantoïque n’est pas caractérisable dans les mycéliums

obtenus sur Czapek et Raulin acide.

La source d’azote étant l’allantoïne ou l’acide urique, l’acide allantoïque

existe à l’état de traces dans ces mêmes mycéliums. Il peut être aussi mis en

évidence dans les milieux de culture.

Uricase. — ■ Quel que soit le milieu de culture, le Sterigmatocystis nigra

n’effectue la synthèse de cet enzyme qu’avec l’acide urique comme source

azotée.

Allantoïnase. — 11 existe, quant à l’allantoïnase, une différence très

intéressante entre les mycéliums cultivés sur Czapek et sur Raulin acide avec

les sels d’ammonium. Le mycélium obtenu sur Czapek avec le sulfate d’am¬

monium comme source azotée ne renferme pas d’allantoïnase; au contraire

sur le milieu de Raulin acide, le mycélium effectue la synthèse de cet enzyme.

Allantoïcase. — L’allantoïcase est présente dans tous les mycéliums

étudiés. Mais, comme pour l’allantoïnase, la nature du milieu de culture a une

influence très nette sur la teneur en enzyme. Le mycélium obtenu sur le milieu

de Czapek avec le sulfate d’ammonium a une activité allantoïcolytique de 6,1,

alors que celui obtenu sur milieu de Raulin a une activité de 28,4. La richesse

en enzyme est donc nettement plus élevée pour le mycélium obtenu sur Raulin

acide ; ce fait se retrouve pour les cultures sur les milieux de Raulin neutre

et de G. Bertrand comme nous le verrons plus loin. D’autre part, l’activité de

l’allantoïcase est maximum quand la source d’azote est constituée par l’allan-

toïne ou par l’acide urique.

Uréase. — L’uréase existe dans tous les mycéliums étudiés.

2° Culture du STER1MATOCYSTIS NIGRA sur le milieu de raulin

neutre. — Cultures effectuées sur le milieu de Raulin neutre de composition :

Eau. 1,500 cc. CO Mg. 0,4 gr.

Saccharose ... 70 gr. SO'K-.0,25 gr.

Tartrate neutre de SO'Zn.0,07 gr.

potassium... 6,5 gr. SO’Fe.0,07 gr.

PO H K 2 . 0,6 gr. Si0 3 Na-.0,07 gr.

160 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQÜE CHEZ LES CHAMPIGNONS

La source azotée était constituée par les sels ammoniacaux, l’allantoïne

ou l’acide urique. Les teneurs étaient les suivantes :

N r „ - Mycélium cultivé sur sel ammoniacal : N0 :i N1 1 ' 6,50 gr.

A r „ = — — — allantoïne : allantoïne 6,40 gr.

U rn = — — — acide urique : acide urique 6,80gr. (urate de K).

La technique des cultures est identique à celle décrite pour le milieu de

Raulin acide.

Recherches qualitatives effectuées sur ces mycéliums. — Nous

avons recherché dans ces mycéliums :

1° les acides glyoxylique et allantoïque,

2° les enzymes uricase, allantoïnase, allantoïcase et uréase. Résultats :

MYCÉLIUM

RECHERCHE

des acides

RECHERCHE DES ENZYMES

Glyoxylique.

Allantoïque.

Uricase.

Allantoïnase.

Allantoïcase.

U réase.

Nrn.

_

+

A, n.

—

traces

—

+

Urn.

—

traces

+

Mesure de l’activité allantoïcolytique deces mycéliums. — Résultats :

MYCÉLIUM

UX 2

pour 10

cent, cubes

en

milligrammes.

ACIDE AL

Introduit.

.ANTOÏQUE T

Trouvé.

AR LITRE

Détruit.

VALEUR

de A c .

Nrn.

32,44

1,00 gr.

0,679 gr.

0,321 gr.

32,1

Arn • .

20,20

—

0,423 —

0,577 —

57,7

Urn.

22,00

—

0,461 —

0,539 —

53,9

Réunissons dans un tableau les caractéristiques de ces mycéliums et de ceux

obtenus sur milieu de Czapek.

ON NOUVEL ENZYME — l’ALLANTOÏCASE

161

RECHERCHE DE

MYCÉLIUMS

obtenus sur Czapek.

MYCÉLIUMS

obtenus sur Kaulin neutre.

SO'(NHV.

Allantoïne.

Acide

urique.

NO'NH*.

Allantoïne.

Acide

urique.

Ac. glyoxylique. . .

_

Ac. allantoïque. . .

—

traces

—

traces

Uricase.

—

+

—

+

Allantoïnase ....

—

+

-f

+

Allantoïcase (A,.) . .

6,1

45,6

49,8

32,1

57,7

53,9

Uréase.

+

“T

+

Les propriétés des mycéliums obtenus sur le milieu de Raulin neutre

sont identiques à celles des mycéliums provenant des cultures sur Raulin

acide.

3° Culture du STER1GMATOCYSTIS NIGRA sur milieu de

G. Bertrand.

Nous avons utilisé le milieu de culture type, indiqué par G. Bertrand (5),

de composition :

Eau. 400 cc. CO' ! K 2 . 0,160 gr.

SO'Mg.0,34 gr. Saccharose .... 18,0 —

Alun de fer. . . 0,034 — Acide tartrique . . 1,06 —

SO'Zn.0,0166 — PO'H-K. 0,20 —

SO'Mn. 0,008 —

La source d’azote était constituée par les sels ammoniacaux, l’allantoïne

ou l’acide urique. Les teneurs étaient les suivantes :

N g b = Mycélium cultivé sur sels ammoniacaux: NO'NH 4 1,2 gr., PO'H(NH')

0,16gr. (Dans ce milieu PO'H-K. est remplacé par P0 4 H(NH 4 ) 2 ). SO^NH 4 )-’

0,08 gr.

A gb = Mycélium cultivé sur allantoïne : allantoïne 1,35 gr.

U g b = —- — acide urique : acide urique 1,45 gr. (urate de K).

La technique des cultures est identique à celle utilisée pour le milieu

de Raulin acide.

Recherches qualitatives effectuées sur ces mycéliums. — Nous

avons recherché :

1° les acides glyoxylique et allantoïque,

2° les enzymes uricase, allantoïnase, allantoïcase et uréase. Résultats :

Mémoires du muséum, aouvolle série, tomo VI.

11

162 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

MYCÉLIUM

RECHERCHE

des acides

RECHERCHE DES ENZYMES

Glyoxylique.

Allantoïque.

Uricase.

Allaatoïuase.

Allautoïcase.

Uréase.

N„.i,.

_

.

_

+

4”

+

A p i.

—

traces

—

+

4~

U sb .

—

traces

4b

+

4-

Mesure de l’activité allantoïcolytique de ces mycéliums. —

Résultats :

MYCÉLIUM

UX 2

pour 1U

cent, cubes

eu

milligrammes.

ACIDE ALLANTOÏQUE PAR LITRE

VALEUR

de A t .

Introduit.

Trou ré.

Détruit.

Ngb.

32,08

1,00 gr.

0,672 gr.

0,328 gr.

32,8

A, b .

18,20

—

0,381 —

0,619 —

61,9

U g i- .

20,60

—

0,431 —

0,569 —

56,9

Réunissons dans un tableau les propriétés de ces mycéliums et de ceux

obtenus sur milieu de Czapek.

RECHERCHE DE

MYCÉLIUMS

obtenus sur Czapek.

MYCÉLIUMS

oblonus sur G. Bertrand.

SO‘(NH*)L

Allantoïue.

Acide

urique.

Sels d’am¬

monium.

Allantoïne.

Acide

urique.

Acide glyoxylique .

_

Acide allantoïque. .

—

traces

—

traces

Uricase.

—

+

—

4*

Allantoïnase ....

—

4“

4~

4"

4-

Allantoïcase (A,-) . .

6,1

45,6

49,8

32,8

61,9

56,9

Uréase.

+

4-

+

La culture du Sterigmatocystis nigra sur milieu de G. Bertrand conduit à

l’obtention de mycéliums ayant des propriétés identiques aux mycéliums

OS NOUVEL ENZYÜE — l’aLLANTOÏCASI

163

obtenus sur milieu de Raulin acide ou sur milieu de Raulin neutre. L’allan-

toïcase y est particulièrement active, aussi nous a-t-il paru intéressant de

tracer la courbe d’action de cet enzyme en fonction du temps.

Expérience. — On place au bain d’eau à 38°, des milieux de composition :

Solution d’allantoate de K à 1 °/ 00 d’acide allantoïque

à pH 7,3.. 10 cc.

Poudre de Sterigmatocystis nigra (A gb ).. , 0,1 gr.

Toluène . .V gouttes.

L’acide allantoïque non détruit est dosé par la méthode pondérale à l’état

de dixanthylurée. Pour des poids inférieurs à 10 mgr. la xanthylurée est

recueillie sur filtre Scbott. Au-dessous de 5 mgr. les ohiffres n’ont plus qu’une

valeur indicative, la méthode de dosage pour des teneurs aussi faibles en

carbamide ne présentant plus la rigueur nécessaire.

Le tableau suivant indique les résultats obtenus :

DURÉE

de

fermentation.

UX 2

pour 10

centimètres cubes

eu

milligrammes.

ACIDE AL

Introduit.

LANTOÏQUE P

Trouvé.

\.R LITRE

Détruit.

ACIDE

allantoïque

détruit

°/o

1 h.

29,20

1,00 gr.

0,611 gr.

0,389 gr.

38,9

2

18;00

—

0,377 —

0,623 —

62,3

3

9,06

—

0,190 —

0,810 —

81,0

4

4,64

—

0,097 —

0,903 —

90,3

5

2,48

—

0,052 —

0,948 —

94,8

6

traces

—

7

traces

—

--

—

Dans des conditions déterminées, l’allantoïcase de Sterigmatocystis nigra

est capable d’hydrolyser intégralement l’acide allantoïque en urée et acide

glyoxylique, l’urée étant finalement transformée en carbonate d’ammonium.

Conclusions.

Les cultures de Sterigmatocystis nigra sur les milieux de Raulin acide, de

Raulin neutre et de G. Bertrand, avec les sels ammoniacaux comme source

d’azote, conduisent à l’obtention de mycéliums où l’on peut caractériser les

enzymes allantoïnase, allantoïcase et uréase ; tandis que, dans les mêmes

conditions, le mycélium obtenu sur le milieu de Czapek ne renferme pas

l’enzyme hydrolysant l’allantoïne, l’allantoïnase.

Les cultures de ce champignon sur les mêmes milieux, mais avec l’allantoïne

comme source azotée, donnent qualitativement des résultats identiques :

présence de l’allantoïnase, de l’allantoïcase et de l’uréase. L’allantoïcase est

particulièrement active.

Avec l’acide urique comme source d’azote, apparaît un quatrième enzyme,

164 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PÜRIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

l’uricase, qui dégrade l’acide urique en allantoïne. C’est un fait que nous avons

aussi constaté dans les cultures de ce champignon sur le milieu de Czapek

avec l’acide urique. Dans tous les cas, l’uricase est d’aüleurs peu active.

Quel que soit le milieu, Czapek, Raulin acide, Raulin neutre, G. Bertrand,

l’utilisation de l’azote organique par le Sterigmatocystis nigra se fait par le

même processus. Par voie enzymatique, le mycélium dégrade les substances

azotées (urée, allantoate de potassium, allantoïne, acide urique) jusqu’à l’am¬

moniac qui sert à l’édification du mycélium.

En particulier, quand la source d’azote est l’acide urique, le Sterigmato¬

cystis nigra effectue la synthèse de l’uricase et procède à la désintégration

complète de la molécule urique dont la simplification est poussée au maximum ;

il y a retour de l’azote organique à l’ammoniac.

Qualitativement le Sterigmatocystis phoenicis se comporte comme le Sterig¬

matocystis nigra.

Tandis que chez les Champignons Basidiomycètes la dégradation du noyau

purique a pour terme ultime l’acide allantoïque,

NH — CO

NH- CO — NH NH 2 NH 2

CO CO Allant °'" a il CO COOH CO

I I + H '° I I I

NH—CH —NH NH—CH-NH

CO C —NH

Uricase

N H

C — NH

">00 + 0 + H 0 — CO 2

chez certains Champignons Ascomycètes ( Sterigmatocystis nigra , Sterigma¬

tocystis phoenicis), cette dégradation va jusqu’à l’ammoniac.

NH — CO

I I

CO C —NH.

I II >co

NH — C — NH /

Uricase

NH-

I

CO

I

NH — CH

NH-

0 4- H O — CO 2

CO — NH

CO

COOH CO

CO

I

NH — CH — NH

NH 2 CHO

i l

Allantoïcase

Allantoïnase

+ HT)

H O

N H

COOH

NH J

I

2 CO

NH J

NH 3

I

NH 3

CO

COOH

i

CO

NH —

1

CH-

-NH

Uréase

+ 2 HTf

CO (NH ) 3 .

Cette importante différence dans le métabolisme de l’azote est due à

la présence dans ces champignons d’un nouvel enzyme : 1’ Allantoïcase.

ÜN NOUVEL ENZYME — l’ALLANTOÏC ASE

16 o

G. — Influence de manganèse sur les propriétés enzymatiques

du Sterigmatocystis nigra cultivé sur le milieu de Gzapek

avec le sulfate d’ammonium comme source azotée.

Déjà Raulin dans sa thèse intitulée « Études chimiques sur la végétation »

avait vu l’importance de la présence de certains sels métalliques dans le milieu

de culture et il avait reconnu que le zinc était indispensable à la végétation

du Sterigmatocystis nigra.

Confirmant les recherches de Raulin, M. Javilliee démontra, qu’en pré¬

sence de zinc, on obtenait en un temps donné des récoltes bien plus considé¬

rables qu’en l’absence de cet élément et que le zinc était un véritable catalyseur

spécifique de croissance du Sterigmatocystis nigra.

L’influence de ce métal n’intéresse pas que la croissance du Sterigmato¬

cystis nigra ; la suppression de cet élément dans le milieu de culture entraîne

des perturbations importantes dans lessécrétions enzymatiques de cette Mucé-

dinée (M. Javilliee) (46). En particulier, l’étude par cet auteur, de la sécré¬

tion de la sucrase, de la tréhalase, de la gélatinase, de l’éreptase et de l’émul-

sine par le mycélium a conduit aux résultats généraux suivants :

En l’absence de zinc,

1° La sécrétion enzymatique est extrêmement précoce ; elle atteint son

maximum dès les premières heures de la vie de la plante, puis disparaît,

2° La teneur en enzyme est considérablement moins élevée, ce qui entraîne

une faible activité enzymatique.

D’autres sels minéraux jouent un rôle analogue, c’est le cas des sels de

manganèse : G. Beeteand avait déjà montré que l’action enzymatique de la

laccase était accrue par la présence de manganèse.

Je me suis proposé de déterminer l’influence du manganèse sur les propriétés

enzymatiques du Sterigmatocystis nigra cultivé sur le milieu de Czapek avec

le sulfate d’ammonium comme source d’azote.

On ensemence avec des spores de Sterigmatocystis nigra provenant d’une

culture sur Sabouraud deux milieux (400 cc.) ayant la composition indiquée

par Czapek (voir page 134) et dont l’un renferme 20 mgr. de sulfate de manga¬

nèse par litre. Après quarante-huit heures à l’étuve humide à 36°, on récolte

les deux mycéliums, on les lave six fois à l’eau distillée, on les essore entre des

doubles de papier Joseph, puis on procède à la dessiccation dans le Aude sur

chlorure de calcium suivie d’un broyage au moulin.

Recheeches effectuées sue ces mycéliums.

1° Allantoïnase. — Alors que cet enzyme n’existe pas dans le mycélium

obtenu sur le milieu de Czapek en l’absence de manganèse, nous avons pu le

mettre en évidence dans le mycélium récolté sur le même milieu, mais en pré-

166 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PUBIOLE CHEZ LES CHAMPIGNONS

sence de ce métal. L’allantoïnase est d’ailleurs peu active puisqu’en trois

heures la transformation de l’allantoïne en acide allantoïque n’atteint pas

5 % de l’allantoïne mise en expérience.

2° Allantoïcase. — L’allantoïcase existe dans les deux mycéliums mais,

alors que l’activité allantoïcolytique du mycélium obtenu en l’absence de

manganèse n’est que de 7, le mycélium provenant de la culture en présence

de manganèse a une activité de 27,1.

Conclusions. — La présence de manganèse dans le milieu de Czapek suffit

pour faire apparaître Fallantomase dans le mycélium dont l’activité allantoï-

colytique est par ailleurs considérablement augmentée.]

Il y a donc avantage, pour le développement du Sterigmatocystis nigra, à

n’utiliser que des milieux de cultures normalement équilibrés au point de vue

des sels minéraux.

CONCLUSIONS

Les recherches exposées dans ce Travail permettent d’affirmer

1° La présence des enzymes allantoïnase et uricase chez les Champignons

Basidiomycètes,

2° La répartition très large des deux uréides glyoxyliques, allantoïne et

acide allantoïque, chez ces mêmes Végétaux,

3° La présence, chez les Sterigmatocystis, d’une nouvelle hydrolase :

I’Allantoïcase.

Allantoïnase.

Comme les Végétaux chlorophylliens, les Champignons renferment fré¬

quemment l’enzyme allantoïnase. Nous avons pu le caractériser dans de nom¬

breuses familles du groupe des Autobasidiomycètes hoxnobasidiés :

Gymnocarpes Cantharellaceae , Polyporaceae.

Il é.m i axgiocarpes Boleloceoe, Paxillaceae, Hygrophoraceae,

Russulaceae , Agaricaceae.

L’étude des propriétés de cet enzyme nous a conduit aux résultats suivants :

la réaction

Allantoïnase ...

Allantoïne---► Acide allantoïque

est favorisée par la présence de sels à réaction alcaline, en particulier par celle

de sesqui-carbonate d’ammonium. Le pH optimum de l’enzyme est situé vers

7,6 pour la température optimum de 39° ; il présente des variations notables

(7,3 à 7,6) selon l’origine de l’enzyme.

La marche de l’hydrolyse enzymatique de l’allantoïne en fonction du temps

est rapide pendant les premiers moments de l’action, puis l’activité de l’allan-

toïnase diminue et finit par s’annuler. Ce fait s’explique aisément par une

inactivation rapide de l’enzyme qui se détruit, au cours de la macération, au

contact de l’eau. La présence de sesqui-carbonate d’ammonium dans le milieu

fermentaire exerce, dans une certaine mesure, une action protectrice contre-

cette autodestruction en milieu aqueux.

Pour l’allantoïnase, conformément à l’hypothèse de Michaelis et Mentes

on peut admettre l’existence d’une combinaison enzyme-substrat, premier

168 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PCHIQDE CHEZ LES CHAMPIGNONS

stade de l’hydrolyse enzymatique où l’allantoïnase serait inaltérable. Si nous

représentons par A l’allantoïnase, par (S) le substrat, on aurait :

(1) A +S =A(S)

(2) A(S) + H'O = (S. HO) + A

l’enzyme libéré d’après l’équation (2) rentre à nouveau en réaction. Mais la

rapide inactivation de l’enzyme au contact de l’eau finit par empêcher la

réaction (1) de se produire.

Les procédés de purification et de concentration des enzymes par adsorp-

tion et élution, que l’on doit à Willstaetter et à ses collaborateurs, ne sont

pas applicables à l’allantoïnase des Champignons ; au contraire, la précipi¬

tation par l’alcool de macérations aqueuses de champignon, conduit à l’ob¬

tention de poudres fermentaires plus actives.

L’allantoïnase des Champignons est spécifique de l’allantoïne, elle ne possède

aucune action sur la p-méthylallantoïne.

La notion d’activité d’allantoïnase nous a permis de constater les faits

suivants :

L’activité allantoïnolytique ou encore la richesse en allantoïnase des diffé¬

rents champignons est très variable.

En général, les espèces appartenant aux genres Clitocybe, Volvaria , Pholiota

(groupe praecox), Leucocoprinus, Panaeolus , Psilocybe , Pseudocoprinus et

Coprinus, possèdent un enzyme particulièrement actif sur l’allantoïne.

Par contre, les espèces appartenant aux genres Leucoporus , Melanopus,

Paxillus, Lactarius , Russula, Lentinus, Pleurotus, Tricholoma , Amanita , Corti-

narius , Flarnmula. Pholiota (group esquarrosa), Nematolorna , etc..., sont pauvres

en allantoïnase.

L’état de développement du carpophore a une influence très nette sur la

valeur de l’activité allantoïnolytique. Cette activité est maximum chez le

champignon jeune non sporulé, puis elle diminue régulièrement avec la matu¬

ration du carpophore ( Coprinus micaceus , stercorarius).

En général, l’allantoïnase n’existe pas dans le mycélium (Agaricus cam-

pester, Hiatula caepestipes, Coprinus stercorarius...) ; elle commence à appa¬

raître dans le primordium, lors de l’ébauche du jeune carpophore ( Coprinus

stercorarius).

Chez le végétal évolué, l’allantoïnase se localise plus particulièrement dans

l’hyménium, partie reproductrice du carpophore; elle existe aussi dans le péri-

dium et le stipe, mais son activité est alors nettement plus faible.

La richesse en allantoïnase des récoltes de Coprinus micaceus faites au cours

de la végétation d’une année varie peu, comme le montre la mesure de l’acti¬

vité allantoïnolytique.

En s’adressant à des poudres fermentaires de grande activité (A > 70), i]

est possible de transformer intégralement l’allantoïne en acide allantoïque,

L’allantoïnase des Champignons s’altère avec le temps en présence de l’air

CONCLUSIONS 169-

et de la lumière et par suite l’activité allantoïnolytique des poudres fermen-

taires diminue régulièrement.

Uricase des Champignons.

La dégradation de l’acide urique par les enzymes des Champignons se fait

par la voie de l’allantoïne. Elle est l’oeuvre d’au moins deux enzymes : Furi¬

euse qui conduit à l’allantoïne et l’allantoïnase qui hydrolyse celle-ci en acide

allantoïque.

NH

CO

r L i Uricase

I || ^CO +0 + H-0 — C0 ;

NH — C — NH""

NH ;

I

CO

CO —NH

I

CO

Allantoïnase

+ H 2 0 >

NH —CH —NH

NH-

NH J

|

CO

COOH

i

CO

NH —

1

CH-

|

- NH.

L’uricase est très répandue chez les Champignons Basidiomycètes ; nous

avons pu la mettre en évidence chez les Boletaceae, les Russulaceae et les Aga-

ricaceae.

L’étude des propriétés de cet enzyme nous a conduit aux résultats suivants :

la marche de la dégradation enzymatique de l’acide urique en fonction du

temps par le système uricase-allantoïnase est rapide pendant les premiers

moments de Faction, puis, avec le temps, l’activité enzymatique diminue et

finit par s’annuler. La présence de l’oxygène favorise Faction fermentaire et

permet d’accroître le pourcentage d’acide urique transformé.

Au cours de la dégradation enzymatique, la quantité d’acide allantoïque

formée est proportionnelle à la concentration en acide urique pour des teneurs

inférieures à 0,1 0 / 0 o ; au-delà, la courbe représentative s’infléchit puis devient

parallèle à l’axe des x. A partir d’une teneur en acide urique de 0,4 °/ 0 o la quan¬

tité d’acide allantoïque formé est indépendante de la concentration du subs~

trat; tout se passe comme si une quantité limitée d’uricase ne pouvait agir

sur une quantité illimitée d’acide urique. Ce fait peut être expliqué par la

formation d’une combinaison enzyme-substrat représentant le premier stade

de l’uricolyse. Si U représente Furicase, S le substrat, on aurait :

(1) (S) + U = (S) • U

(2) (S) • U + O + H-0 — (S ■ H-0 • O) + U ■ (CO ! ).

La réaction est limitée car l’enzyme mis en liberté (équation 2) ne se

recombine plus à une nouvelle quantité d’acide urique.

470 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PDRIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Les champignons ne possèdent en général qu’un faible pouvoir urico-

lytique.

La répartition de l’uricase dans les différentes parties du carpophore est

très inégale ; en général c’est l’hyménium qui est le plus riche en cet enzyme

qu’on retrouve aussi dans le stipe et dans le péridium. Au contraire chez

certains champignons appartenant au genre Boletus l’uricase est localisée

uniquement dans l’hyménium (Boletus luridus, Boletus calopus). Nous n’avons

pu mettre en évidence l’uricase dans les mycéliums de Coprinus stercorarius ,

Hiatula caepestipes, etc...

Chez Coprinus stercorarius Yuric&se existe dans le carpophore aux différents

stades de développement ; l’activité uricolytique est maximum dans le cham¬

pignon jeune non sporulé, puis elle diminue régulièrement, au cours de la ma¬

turation du carpophore.

L’uricase des Champignons s’altère rapidement avec le temps ; son activité

vis-à-vis de l’acide urique diminue et, après trois mois, cette perte d’activité

atteint généralement 70 à 80 % de l’activité initiale.

Les difficultés que l’on rencontre dans l’étude de l’uricase des Champignons

s’expliquent par la complexité du phénomène de l’uricolyse. Le passage de

l’acide urique à l’allantoïne se fait au moins en deux étapes :

1° oxydation et hydratation de l’acide urique par Yuricoxydase (pH

optimum 8,9) et formation de l’oxyacétylène-diuréinecarbonique,

NH — CO

I I

CO C — NH

I il

NH. — C — NH"

Uricoxydase ^

SCO + O + H O

COOH

I

NH — C — NH

I

CO

I

NH

C — NH

1

OH

2° décarboxylation de l’oxyacétylène-diuréinecarbonique par la décar-

boxylase (pH optimum 9,9), qui conduit à l’allantoïne,

COOH

I

NH — C —NH

NH — CH

CO

Décarhoxyla se ^

I

— CO a

NH — C — NH

I

OH

N H

C —

I

OH

NH NH —CH —NH

I I I

CO — CO CO

i I I

NH NH- CO —NH

et enfin hydrolyse par Yaïlantoïnase (pH optimum 7,6) de l’allantoïne

formée.

CONCLUSIONS

171

Acide allantoïque des Champignons.

L’acide allantoïque, nouveau principe naturel, découvert par R. Fosse

chez les Végétaux supérieurs, est aussi très répandu chez les Champignons ;

nous avons pu le caractériser et le doser dans de nombreuses espèces appar¬

tenant aux Polyporaceae, Boletaceae, Russulaceae et Agaricaceae.

L’étude de la répartition de cet uréide dans différentes parties du végétal

nous a révélé les faits suivants :

1° Mycélium.

L’acide allantoïque n’a pu être mis en évidence dans les mycéliums de

Hiatula caepestipes, de Coprinus stercorarius , etc... L’absence de cet uréide est

en corrélation avec celle de l’allantoïnase dans ces mêmes mycéliums,

2° Péridium et hyménium.

Ce sont les parties du carpophore les plus riches en acide allantoïque, elles

renferment également l’allantoïnase la plus active,

3° Stipe.

En général, le stipe renferme de l’acide allantoïque, mais la teneur en cet

uréide est toujours plus faible que pour l’hyménium correspondant.

L’influence de l’état de développement du carpophore sur la teneur en acide

allantoïque est des plus nettes ; cette teneur croît régulièrement jusqu’à la

décrépitude du carpophore. L’accumulation de l’acide allantoïque est compa¬

rable, dans une certaine mesure, à celle que l’on observe lors de la germination

des graines de Légumineuses à l’obscurité.

Lors de la sporulation, chez Coprinus stercorarius, on assiste à une formation

très importante d’acide allantoïque. Une allantoïnolyse intense coïncide avec

la sporulation ; il se produit un remaniement profond dans le contingent des

uréides glyoxyliques, l’allantoïne disparaît pour faire place à l’acide allan¬

toïque dont la teneur continue à augmenter, mais lentement, jusqu’à la décré¬

pitude du carpophore.

La mesure du rapport

Azote de l’acide allantoïque

Azote total

X 100

chez de nombreux champignons confirme et précise les résultats acquis

concernant l’augmentation de la teneur en acide allantoïque avec le mûrisse¬

ment du carpophore.

Pour des récoltes de Coprinus micaceus faites sur la végétation d’une année,

la valeur de R indique une importante diminution de la teneur en azote allan¬

toïque par rapport à l’azote total pour les échantillons recueillis en octobre-

novembre ; pendant cette dernière période, il y a un très net ralentissement du

172 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

catabolisme purique en rapport avec la durée de l’évolution du champignon

de l’état non sporulé à l’état sporulé, durée qui est en général de trois jours en

été et de huit jours en novembre.

Enfin, l’acide allantoïque des Champignons Basidiomycètes peut être consi¬

déré comme le terme ultime de l’allantoïnolyse qui coïncide chez Coprinus

stercorarius avec la sporulation.

Allantoïne des Champignons.

Avant ces recherches l’allantoïne n’avait pas été signalée chez les Champi¬

gnons ; nous avons pu démontrer que, comme l’acide allantoïque, cet uréide

est très répandu chez les Basidiomycètes, où il coexiste fréquemment avec les

enzymes allantoïnase et uricase.

Contrairement à ce que nous avons vu pour l’acide allantoïque, la valeur

du rapport

„ Azote de l’allantoïne ...

Rl =- Azoté total X 100

est toujours peu élevée, car l’allantoïne, terme intermédiaire, est pour la plus

grande partie hydrolysée en acide allantoïque par l’allantoïnase.

Chez de nombreux champignons nous avons déterminé le rapport

^ N de l’allantoïne -f- N de l’acide allantoïque

" Azote total

qui mesure l’importance de l’azote des uréides glyoxyliques par rapport à

l’azote total et nous avons constaté qu’il varie d’une espèce à l’autre et que,

pour une même espèce, sa valeur augmente régulièrement quand on passe

du végétal jeune non sporulé au champignon âgé, sporulé.

Chez quelques champignons, l’allantoïne et l’acide allantoïque sont ac¬

compagnés de notables quantités d’urée; la mesure du rapport

,N allantoïne -f- N acide allantoïque 4- N urée

Azote total

nous a permis de démontrer que l’importance de l’azote uréique et de l’azote

des uréides glyoxyliques par rapport à l’azote total est très grande chez les

espèces appartenant aux genres Lepiota (certaines espèces), Leucocoprinus et

Hiatula. En particulier chez Hiatula caepestipes la valeur de R 3 passe en

moyenne de 1 pour le champignon non sporulé à 15 pour le végétal sporulé,

puis à 25-30 pour le champignon sporulé, âgé.

Au contraire, chez les espèces du genre Agaricus, seul le métabolisme uréique

est très marqué et la valeur de R 3 , voisine de 15, ne représente pratiquement

que l’importance de l’azote uréique par rapport à l’azote total.

CONCLUSIONS

173

Origine des uréides glyoxyliques

Chez les Champignons l’allantoïne engendre l’acide allantoïque par fermen¬

tation sous l’action de l’allantoïnase.

D’autre part, les deux uréides glyoxyliques se forment'quand on provoque

l’absorption de l’acide urique par les tissus de Coprinus micaceus ; ces faits

permettent de conclure que, comme chez les Végétaux chlorophylliens, l’acide

allantoïque et l’allantoïne ont une origine purique. L’acide urique, terme inter¬

médiaire, provient de la dégradation des nucléines :

, . Nucléases _ . -, Purinoxydases . .,

Nucleines-» Purines_-—-► Acide urique.

Tandis que chez les Légumineuses l’acide allantoïque est une forme d’ac¬

cumulation de l’azote capable de rentrer dans le cycle de nouvelles synthèses,

chez les Champignons Basidiomycètes l’acide allantoïque s’accumule jusqu’à

la décrépitude du carpophore et peut-être considéré comme le terme ultime

de l’allantoïnolyse intense qui coïncide chez Coprinus stercorarius avec la spo¬

rulation.

Métabolisme de 1 azote purique et uréique.

L’étude du métabolisme comparé de l’azote purique et uréique chez les

Amanitaceae, les Cortinariaceae et les Coprinaceae nous a conduit aux résultats

suivants :

Métabolisme purique

Amanitaceae (Amaniteae, Pluteae).

Catabolisme purique intense chez les espèces des genres Lepiota, Volvaria

et Pluteus , faible pour les espèces du genre Amanita.

Cortinariaceae ( Cortinarieae , Pholioteae , Nematolomeae).

Catabolisme purique intense pour les Pholiotes du groupe praecox, faible

pour les espèces des genres Cortinarius, Inocybe, Pholiota (groupe squarrosa),

Flammula , Rozites et Nematoloma.

Coprinaceae ( Pratelleae , Stropharieae, Coprineae).

Catabolisme purique intense chez les espèces des genres Leucocoprinus,

Hiatula, Hypholoma , Panaeolus , Psathyrella , Pseudocoprinus et Coprinus.

faible pour les espèces des genres Agaric us et Stropharia.

174 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE l’aZOTE PURIQCE CHEZ LES CHAMPIGNONS

Métabolisme uréique

Amanitaceae ( Amaniteae , Pluteae).

Pouvoir de synthèse de l’urée chez les espèces appartenant aux genres

Amanita, Lepiota , Volvaria et Pluteus.

Cortinariaceae (Cortinarieae, Pholioteae , Nematolomeae).

Pouvoir de destruction de l’urée chez les espèoes des genres Cortinarius,

Inocybe et Pholiota (groupe praecox). Absence de l’uréase chez les espèces des

genres Pholiota (groupe squarrosa). Rozites et Nematoloma.

Coprinaceae ( Pratelleae , Stropharieae , Coprineae).

Pouvoir de synthèse de l’urée chez les espèces des genres Leucocoprinus,

Hiatula et Agaricus. Au contraire, pouvoir de destruction de l’urée (présence

de l’uréase) chez les espèces des genres Stropharia, Hypholoma , Psathyrella,

Pseudocoprinus et Coprinus.

Déductions concernant la systématique mycologique.

La notion d’activité allantoïnolytique, à laquelle il faut joindre différentes

considérations sur la présence ou l’absence de l’uréase et sur l’intensité du

métabolisme purique, permet dans certains cas d’apporter un nouvel argu¬

ment en faveur d’une position systématique discutée chez des espèces d’affi¬

nités douteuses et de juger de la légitimité de certaines coupures.

I£n particulier, nous avons pu démontrer :

1° Que les Pholiotes du groupe praecox et Pholiota cylindracea se séparent

nettement par leurs propriétés allantoïnolytiques des Pholiotes vraies du

groupe squarrosa , faits en accord avec les différences anatomiques déjà signa¬

lées par Fayod,

2° L’homogénéité de la série des Coprins et les affinités physiologiques des

espèces des genres Coprinus , Hiatula et Leucocoprinus, soutenues par

Patoulllard et Roger Heim,

3° La valeur de la coupure Pseudocoprinus créée par R. Küiiner pour

Psathyrella disseminata,

4° Les affinités des espèces du genre Panaeolus avec les Coprins et la légiti¬

mité de leur rapprochement, en faveur duquel H. Romagnesi a apporté

récemment de nouveaux arguments.

Recherches sur les enzymes du Sterigmatocystis nigra.

Allantoïnase.

Le mycélium de Sterigmatocystis nigra cultivé sur milieu de Czapek au sul¬

fate d’ammonium ne renferme pas l’enzyme allantoïnase. Si l’on remplace

CONCLUSIONS

175

le sulfate d'ammonium comme souTce d’azote par l’urée, l’allantoate de potas¬

sium, l’uroxanate de potassium, l’allantoïne ou l’acide urique, le Sterigmato¬

cystis nigra effectue la synthèse de l’allantoïnase.

L’allantoïnase existe aussi dans les mycéliums obtenus sur les milieux de

Raulin acide, de Raulin neutre et de G. Bertrand, avec les sels ammonia¬

caux, l’allantoïne ou l’acide urique comme sources d’azote.

L’allantoïnase apparaît dans le mycélium quand on cultive le Sterigmato¬

cystis nigra sur le milieu de Czapek au sulfate d’ammonium en présence de

sulfate de manganèse.

Uricase.

Le mycélium de Sterigmatocystis nigra effectue la synthèse de l’uricase,

uniquement quand la source azotée est constituée par l’acide urique.

L’uricase a pu être mise en évidence dans les mycéliums de ce champignon,

obtenus sur les milieux de Czapek, de Raulin acide, de Raulin neutre et de

G. Bertrand, avec l’acide urique comme source d’azote.

Un nouvel enzyme : l’allantoïcase.

Les mycéliums de Sterigmatocystis nigra et de Sterigmatocystis phoenicis

renferment une nouvelle hydrolase capable de scinder l’acide allantoïque en

urée et acide glyoxylique :

L’Allantoïcase.

H-N • CO • NH

>CH•COOH

H-N ■ CO • NH X

Allantoïcase

+ HO

,NH J CHO

20C( + I

X NH 2 COOH.

L’allantoïcase existe dans les mycéliums de Sterigmatocystis nigra obtenus

sur milieux de Czapek avec le sulfate d’ammonium, l’urée, l’allantoate de

potassium, l’uroxanate de potassium, l’allantoïne ou l’acide urique comme

sources d’azote. Ellepeutaussi être facilement caractérisée dans les mycéliums

de ce champignon, obtenus sur les milieux de Raulin acide, de Raulin neutre

et de G. Bertrand, avec les sels ammoniacaux, l’allantoïne et l’acide urique

comme sources d’azote.

L’allantoïcase possède les propriétés suivantes : son optimum de tempéra¬

ture varie avec la réaction du milieu fermentaire. En l’absence de tampon, il

est situé vers 30° ; pour une valeur du pH égale à 7,3 l’optimum de tempéra¬

ture s’élève et passe à 38°.

Le pH optimum déterminé pour la température de 30°, avec les solutions

tampons de Clark et Lubs est égal à 7,3.

La courbe d’action de l’allantoïcase en fonction du temps montre que cette _

176 A. BRUNEL. — MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS

action très rapide au début se ralentit avec le temps et que l’hydrolyse de

l’acide allantoïque n’est pas totale. Cependant, en nous adressant à une allan-

toïcase très active, nous avons pu obtenir la dégradation totale de l’acide

allantoïque en urée et acide glyoxylique, l’urée étant finalement hydrolysée

en carbonate d’ammonium par l’uréase.

La mesure de l’activité de l’allantoïcase nous a permis de constater l'in¬

fluence de la nature de la source azotée sur la teneur en enzyme des mycéliums ;

la teneur en allantoïcase est maximum quand l’azote est fourni au Sterig-

matocystis nigra sous forme d’allantoïne ou d’acide urique.

Utilisation de l'azote organique par le Sterigmatocystis nigra.

Conformément aux recherches de Shibata, Kossowicz, etc..., le Sterigma¬

tocystis nigra utilise l’azote organique pour l’édification de son mycélium,

après transformation préalable en azote minéral, c’est-à-dire en ammo¬

niac.

La présence des enzymes uricase, allantoïnase, allantoïcase et uréase dans

ce champignon, éclaire d’une façon très nette le mécanisme de cette utilisation.

Pour effectuer la dégradation de la molécule de certains corps azotés, le Sterig¬

matocystis nigra emprunte la voie enzymatique ; ce champignon synthétise

les enzymes qui lui sont nécessaires.

L’utilisation parle Sterigmatocystis nigra de l’azote de l’urée, de l’allantoate

de potassium, de l’allantoïne ou de l’acide urique se fait par les processus

enzymatiques suivants :

1° Utilisation de l’azote de l’urée.

L’uréase, découverte par Shibata dans le mycélium de Sterigmatocystis

nigra, transforme la carbamide en carbonate d’ammonium,

Uréase

W +^H ; 0

CO*(NH')*

l’ammoniac sert ensuite à l’édification des différents constituants du mycé¬

lium.

2° Utilisation de l’azote de l’acide allantoïque.

Par voie chimique et enzymatique cet uréide est scindé en ses constituants :

urée et acide glyoxylique,

H 2 N • CO ■ NH

)CH-CO H

pH < 7 et allantoïcase

+ H 2 0

NH’

2 OC(

x NH a

CHO

I

COOII

H-N • CO • NH

CONCLUSIONS

177

puis l’uréase hydrolyse l’urée en carbonate d’ammonium.

X NH 2

OC<

NH !

Uréase

+ 2 H -U

CO'(NH') ! .

Comme la carbamide, l’acide allantoïque est dégradé jusqu’à l’ammoniac.

3° Utilisation de l’azote de l’allantoïne.

L’utilisation de l’allantoïne par le Sterigmatocystis nigra se fait par une série

d’étapes enzymatiques qui conduisent l’azote de cet uréide à l’état d’azote

ammoniacal.

NH“ CO — NH

I I

CO CO

I I

NH — CH — NH

NH 2

Allantoïnase

+ H 2 0

1

CO

COOH

|

1

CO

|

Allantoïcase

|

+ H 2 0

NH —

CH —

-NH

CHO NH-

I

+ 2 CO

I

COOH NH 2

/^H- Uréase^

NyH 2 +2H j O

CO s (NH) 2 .

4° Utilisation de l’azote de l’acide urique.

Elle demande une étape enzymatique supplémentaire : la dégradation de

l’acide urique en allantoïne.

NH — CO

I I

CO C —NH

I II

NH — C — NH

^CO

Uricase

-j- O + H J 0 — CCT

NH 2 CO—NH

CO

NH — Ch — NH

Tandis que chez les Champignons Basidiomycètes la dégradation enzyma¬

tique de l’acide urique ou de l’allantoïne apour terme ultimel’acide allantoïque,

chez certaines Mucédinées ( Sterigmatocystis nigra , Sterigmatocystis phoenicis)

cette dégradation se continue jusqu’à l’ammoniac. Il y a retour de l’azote

organique à l’azote minéral.

Cette importante différence dans le métabolisme de l’azote est due à une

nouvelle hydrolase, I’Allantoïcase, qui scinde l’acide allantoïque formé en

urée et acide glyoxylique.

L’allantoïcase vient prendre place dans la série des enzymes de dégradation

du noyau purique :

Purinoxydases , Uricase, Allantoïnase, Allantoïcase, Uréase.

Mémoires du Muséum, nouvelle série, Lomé VI.

il

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180

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TABLE DES MATIÈRES

Introduction. 1

PREMIÈRE PARTIE

CHAPITRE PREMIER

PRÉSENCE DE L’ALLANTOÏNASE CHEZ LES CHAMPIGNONS

A. Récolte, choix et traitement du matériel d’étude. 9

B. Caractérisation de l'enzyme allantoïnase chez les Champignons. 10

C. Démonstration de la présence de l’allantoïnase dans Boletus scaber Fr. ex

Bull. 12

D. Déterminations quantitatives de l’acide allantoïque engendré par fermenta¬

tion de l’allantoïne . 15

E. Répartition de l’allantoïnase chez les Champignons. 18

CHAPITRE II

SUR QUELQUES PROPRIÉTÉS DE L’ALLANTOÏNASE DES CHAMPIGNONS

A. Influence de la température sur l’allantoïnolyse. 29

B. Action des sels sur l’allantoïne et sur son hydrolyse enzymatique. 31

C. Recherche du pH optimum de l’allantoïnase des Champignons. 33

D. Marche de l’hydrolyse de l’allantoïne par l’allantoïnase des Champignons. . 37

E. Allantoïnase de Collybia maculata; sa destruction en milieu aqueux .... 39

F. Influence de la concentration en allantoïne sur la marche de l’hydrolyse

enzymatique. 41

G. Influence de la concentration en poudre fermentaire sur la marche de

l’hydrolyse enzymatique. 44

H. Essais de purification et de concentration de l’allantoïnase des Champignons 45

I. Sur la spécificité de l’allantoïnase des Champignons. 47

CHAPITRE III

RECHERCHES SUR L’ACTIVITE DE L’ALLANTOÏNASE

A. Activité de l’allantoïnase. Sa mesure. Résultats.. 50

B. Variations de l’aetivité de l’allantoïnase avec l’état de développement dm

carpophore chez Coprinus micaceus et Coprinus stercorurius . 56

184 TABLE DES MATIÈRES

■C. Recherches sur les variations de l’activité de l’allantoïnase de Coprinus mi-

caceus, au cours de la végétation d’une année. 58

D. Localisation de l’allantoïnase. 60

E. Transformation totale de l’allantoïne en acide allantoïque sous l’action de

l’allantoïnase des Champignons. 61

F. Sur la conservation de l’allantoïnase des Champignons. Affaiblissement de

son activité avec le temps. 64

DEUXIÈME PARTIE

CHAPITRE PREMIER

PRÉSENCE DE L’URICASE CHEZ LES CHAMPIGNONS

A. La dégradation de l’acide urique par les enzymes des Champignons se fait

par la voie de l’allantoïne. 67

B. Présence de l’uricase dans Coprinus stercorarius . 69

C. Méthode de recherche de l’uricase chez les Champignons. Sa répartition chez

les Champignons Basidiomycètes. 71

CHAPITRE II

SDR QUELQUES PROPRIÉTÉS DE L’URICASE DES CHAMPIGNONS

A. Influence de la température sur la marche de l’uricolyse. 74

B. Marche de la dégradation enzymatique de l’acide urique en fonction du

temps. 75

C. Influence de l’oxygène sur la marche de l’uricolyse. 77

D. Influence de la concentration en acide urique sur la marche de l’uricolyse . . 78

CHAPITRE III

RECHERCHES SUR L ACTIVITÉ DE L’URICASE

A. Activité de l’uricase. Sa mesure. Résultats. 80

B. Variations de l’activité uricolytique avec le stade de développement du car-

pophore. 82

C. Répartition de l’uricase dans les différentes parties du carpophore. 83

D. Sur la conservation des propriétés de l’uricase des Champignons. Affaiblisse¬

ment de son activité avec le temps. 84

TROISIEME PARTIE

CHAPITRE PREMIER

L ACIDE ALLANTOÏQUE CHEZ LES CHAMPIGNONS BASIDIOMYCÈTES

A. Caractérisation et détermination quantitative de l’acide allantoïque. Sa

répartition chez les champignons. 87

B. Répartition de l’acide allantoïque dans les différentes parties du carpophore. 89

C. Influence de l’état de développement du carpophore sur la teneur en acide

allantoïque chez Coprinus micaceus et Hiatula caepestipes . 90

TABLE DES MATIÈRES

185 .

D. Relation entre la sporulation et l’augmentation de la teneur en acide allan¬

toïque chez Coprinus stercorarius . 92

E. Acide allantoïque en fonction de l’azote total chez les Champignons Basidio-

mycètes. 94

F. Influence de l’état de développement du carpophore sur la teneur en acide

allantoïque par rapport à l’azote total. 97

G. Variations delà teneur en acide allantoïque de Coprinus micaceus, en fonc¬

tion de l’azote total, sur des récoltes faites au cours de la végétation

d’une année. 98

CHAPITRE II

L’ALliANTOÏNE CHEZ LES CHAMPIGNONS BASIDIOMYCÈTES

A. Recherche qualitative et détermination quantitative de l’allantoïne chez les

Champignons. Résultats.100

B. Coexistence fréquente de T allantoïne, de l’acide allantoïque, de l’uricase et

de l’allantoïnase dans le même carpophore.107

C. Allantoïne en fonction de l’azote total chez les Champignons.103

D. Allantoïne et acide allantoïque en fonction de l’azote total chez les Champi¬

gnons.111

E. Allantoïne, acide allantoïque et urée en fonction de l’azote total chez les

Champignons.112

CHAPITRE III

ORIGINE DES URÊIDES GLYOXYLIQÜES

MÉTABOLISME DE L’AZOTE PURIQUE ET URÊIQUE

APPLICATION DES DONNÉES BIOCHIMIQUES A LA SYSTÉMATIQUE

A. Origine de l’acide allantoïque chez les Champignons Basidiomycètes. ... 115

B. Origine purique del’acide allantoïque et de l’allantoïne chez les Champignons

Basidiomycètes.117

C. Essai sur le métabolisme de l’azote purique et uréique chez les

Amanitaceae .121

Cortinariaceae . 122

Coprinaceae .124

D. Application à la systématique des notions concernant l’allantoïnase et le

métabolisme de l’azote.128

QUATRIÈME PARTIE

CHAPITRE PREMIER

RECHERCHES SUR L’ALLANTOÏNASE

ET L URICASE DE STERIGMATOCYSTIS NIGRA

A. Culture du Sterigmatocystis nigrasurlemüieu de Czapekavecle sulfate d’am¬

monium. Absence de l’allantoïnase et de l’uricase dans le mycélium. . 134

B. Culture du Sterigmatocystis nigra sur le milieu de Czapek avec l’allantoïne.

Absence de l’uricase ; synthèse de l’allantoïnase par le mycélium . . . 136

C. Culture du Sterigmatocystis nigra sur le milieu de Czapek avec l’acide urique.

Présence de l’allantoïnase et de l’uricase dans le mycélium.139

186 TABLE DES MATIÈRES

D. Culture du Sterigmatocystis nigra sur différents milieux et divers composés

azotés. Propriétés enzymatiques des mycéliums.139

CHAPITRE II

UN NOUVEL ENZYME. L’ALLANTOÏCASE

A. Présence d’une nouvelle hydrolase, l’allantoïcase, dans le mycélium de

Sterigmatocystis nigra .143

B. Sur quelques propriétés de l’allantoïcase. Influence de la température sur

l’allantoïcolyse.146

C. pH optimum de l’allantoïcase.149

D. Courbe d’action de l’allantoïcase en fonction du temps.151

E. Recherches comparatives sur les propriétés enzymatiques des mycéliums de

Sterigmatocystis nigra obtenus sur milieu de Czapek avec différentes

sources d’azote. Utilisation de l’azote organique par ce champignon. . 152

F. Propriétés enzymatiques des mycéliums de Sterigmatocystis nigra, obtenus

sur les milieux de Raulin et de G. Bertrand avec différentes sources

d’azote. 157

G. Influence du manganèse sur les propriétés enzymatiques du Sterigmatocystis

nigra cultivé sur le milieu de Czapek avec le sulfate d’ammonium

comme source d’azote.165

Conclusions générales .167

Index bibliographique. 179

ÉDITIONS DU MUSÉUM NATIONAL D’HISTOIRE NATURELLE

Archives du Muséum national d’Histoire naturelle (commen¬

cées en 1802 comme Annales du Muséum national a Histoire

naturelle). (Un vol. par an, 200 fr.).

Bulletin du Muséum national d’Histoire naturelle (com¬

mencé en 1895). (Un vol. par an, 5 o fr.).

Mémoires du Muséum national d'Histoire naturelle , nouvelle

série. (Sans périodicité fixe; abonnement pour un volume :

1 5 o fr.).

Index Seminum in Hortis Musaei parisiensis collectorum.

(Laboratoire de culture; paraît depuis 1822; échange.)

Notulae Systematicae. (Directeur M. H. Humbert, laboratoire

de Phanérogamie ; paraît depuis 1909 ; abonnement au volume,

4o fr.).

Revue française d Entomologie. (Directeur M. le D r R. Jeannel,

laboratoire d’Entomologie ; paraît depuis 1934 ; abonnement

annuel France, 5 o fr., Etranger, 60 fr.).

Revue de Botanique appliquée et d’Agriculture coloniale.

(Directeur : M. A. Chevalier, laboratoire d’Agronomie coloniale;

parait depuis 1921 ; abonnement pour la France, 100 fr.).

Revue Algologique. (Dii’ecteurs MM. P. Allorge et R. Lami,

laboratoire de Cryptogamie ; paraît depuis 1924; abonnement

France, 5 ofr., Etranger, 100 fr.).

Revue Bryologique et Lichénologique. (Directeur M. P. Allorge,

laboratoire de Cryptogamie; paraît depuis 1874; abonnement

France, 5 o fr., Étranger, 100 fr.).

Revue de Mycologie (anciennement Annales de Cryptogamie

exotique). (Directeurs MM. R. Heim, J. Duché et G. Malen-

çon, laboratoire de Cryptogamie; paraît depuis 1928 ; abonne¬

ment France, 80 fr., Etranger, 100 fr.).

Bulletin du Laboratoire maritime du Muséum national

d’Histoire naturelle à Dinar d. (Directeur M. A. Gruvel, labo¬

ratoire maritime de Dinard ; suite du même Bulletin à Saint-

Servan ; paraît depuis 1928 ; prix variable par fascicule).

Bulletin du Musée d’Ethnographie du Trocadéro. (Directeur

M. P. Rivet, Musée du Trocadéro ; paraît depuis 1931 ; prix

du numéro : 5 fr.).

Recueil des travaux du Laboratoire de Physique végétale.

(Laboratoire de Physique végétale ; paraît depuis 1927; échange).

Travaux du Laboratoire d’Entomologie. (Laboratoire d’Entomo¬

logie ; paraît depuis ig 34 ; échange).

La Terre et la Vie , publiée en collaboration par la Société des

Amis du Muséum et la Société nationale d’Acclimatation.

Rédacteur en chef : M. G. Petit, 57, rue Cuvier, Paris 5 °;

abonnement : 3 o fr.).

Prix : 50 francs.

IMPRESSIONS

: P. ANDRÉ :