As "MEMÓRIAS DO INSTITUTO BUTANTAN" têm por finalidade a apresenta¬

ção de trabalhos originais que contribuam para o progresso nos campos das Ciên¬

cias Biológicas, Médicas e Químicas, elaborados por especialistas nacionais e

estrangeiros.

São publicadas sob a orientação da Comissão Editorial, sendo que os concei¬

tos emitidos são de inteira responsabilidade dos autores.

The "MEMÓRIAS DO INSTITUTO BUTANTAN" are the vehicle of comunica-

tion for original papers written by national and foreign specialists who contribute

to the progress of Biological, Medicai and Chemical Sciences.

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SciELO

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Coordenação dos Institutos de Pesquisa

Instituto Butantan — São Paulo — SP — Brasil

MEMÓRIAS

INSTITUTO BUTANTAN

Volume 54, número 1, 1992

2 3 4

0 11 12 13 14 15 16

São Paulo, SP

1992

Brasil

SciELCVo

Mem. Inst. Butantan

v.54, n. 1, 1992

SUMÁRIO/CONTENTS

A peptide isolated from bovine plasma which behaves like T-Kinin.

Um peptídio que se comporta como a T-Cinina, isolado de plasma bovino.

Luiza A.F. FERREIRA, L.J. GREENE, Olga B. HENRIQUES . 5

Observações sobre ciclo evolutivo de Triatoma vitticeps (Stal, 1859) alimen¬

tados a intervalos controlados em pombos ou coelhos. (Hemiptera, Redu-

viidae, Triatominae)

Evolutive cycle observations of Triatoma vitticeps (Stal, 1859) fed on pi-

geons or rabbits in controlled intervals. (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae).

Ana Maria MARASSÁ. 11

Dosagem biológica do antiveneno botrópico.

Biological evaluation of the bothropic antevenin.

Sérgio Luiz DALMORA, Silvana F. VACCARI, Alexandre M. SAMPEDRO

João Eduardo da S. PEREIRA . 21

BOLETIM DE BIOTECNOLOGIA . 1

Caracterização de venenos de serpentes por eletroforese em poliacrilamida.

Characterization of snake venoms using polyacrylamide gel electrophoresis.

Ana Maria MOURA DA SILVA . 3

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Mem. Inst. Butantan

v. 54, n. 1, p.5-10, 1992

A PEPTIDE ISOLATED FROM BOVINE PLASMA,

WHICH BEHAVES LIKE T-KININ.

L.A.F. FERREIRA * *

L J. GREENE **

O. B. HENRIQUES *

ABSTRACT: T-kinin (Ile-Ser-bradykinin) the unique natural homolog of

bradykinin, was isolated from rat plasma and posesses pharmacologi-

cal properties similar to those of kinins. However this kinin showed a

greater depression of the rat blood pressure than that caused by bradyki¬

nin, Hiroshi and Greenbaum 5 . In this paper we describe the isolation

of a peptide from bovine plasma that contracts the isolated rat uterus

and decreases the blood arterial pressure of the rat and shows the same

retention time of T-kinin on HPLC.

KEYWORDS: T-Kinin, bradykinin, bovine plasma.

INTRODUCTION

Kinins are usually defined as hypotensive polypeptides which contract most

extravascular isolated smooth muscle preparations, but relax the rat duodenum.

Kinins also increase vascular permeability, produce pain and have been found in

mammals: bradykinin,lysyl-bradykinin(Kallidin), methionyl-lysyl-bradykinin(MLB)

and T-Kinin. In spite of fact that bradykinin is a typical plasma kinin, the kinins

mentioned above are generated from the following componente of blood: high

molecular weight kininogen, low molecular weight kininogen and T-kininogen

respectively, Pisano 8 and Okamoto and Greenbaum 7

Since Elliot and Lewis isolated methionyl-lysyl-bradykinin(MLB) from bovine se-

rum, concluding that the undecapeptide is formed as the result of activation of en-

* Serviço de Bioquímica — Laboratório Especial de Cininas Instituto Butantan, Av. Vital Brasil, 1.500. 05503-900,

SSo Paulo, SP, Brasil

• • Centro Interdepartamental de Química de Proteínas, Escola de Medicina da Universidade de São Paulo — Ribeirão

Preto, São Paulo, Brasil.

Supported by CNPq

Recebido para publicação em 13.5.91 e aceito em 31.3.92

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FERREIRA, L.A.F., GREENE, L.J., HENRIQUES, O.B. A peptite isolated from bovine plasma, which

behaves like T-Kinin. Mem. Inst. Butantan, v. 54, n. 1, p.5-10, 1992.

dogenous enzymes in the bovine serum it is possible that in spite of the dialysis,

a small amount of this peptide release at acid pH, remained adherent to the pro-

teins present.

Okamoto and Greenbaum 7 isolated T-kinin from rat plasma after the incuba-

tion at pH 2 on absence of enzyme followed by pH 8 in the presence of tripsin-TPCK.

We used bovine plasma under conditions similar to those described by the

authors mentioned above, and our experiments led us the separation of a peptide

that behaves like T-kinin on HPLC chromatography and on Silica gel thin-layer chro-

matography shows the same Rf as T-kinin.

MATERIALS

Bradykinin (BK), T-Kinin (Ile-Ser-BK), Methionyl-lysyl-Bradykinin(MLB), Kallidin,

(LBK) were purchased from the Sigma Chemicals, St. Louis, Mo. Sephadex resins

were Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala. Silica Gel G, type 60, was Merck

Darmstadt.

METHODS

Measurement of Kinin activity.

Kinin activity was measured on isolated uterus of female rats (in estrus), weigh-

ing 180-200 g. A 1-2 cm lenght of uterus was suspended in a 5 ml muscle cham-

ber with aerated Jalon Solution. To biological assay on isolated guinea-pig ileum

(female guinea-pigs 160-180 g), Tyrode solution containing atropine (1 ^g/ml) at

37°C was used, Dale 2 .

Separation of the peptide.

The bovine plasma (900 ml) proteins were precipitated beteween 33 and 70%

saturation with ammonium sulfate, separated by centrifugation and dissolved in

250 ml water. This solution was dialysed against 1 x 10' 2 M HCI during 36 hours

at pH 2.5 in the cold, and then lyophilized. The incubate (230 ml) then treated

with three equivalent volumes of boiling ethanol, centrifuged, concentrated by

evaporation on a Büchi Rotavaporand iVophilized (200 mg). The soluble material

was dissolved in 20 mM Tris-HCI buffer, pH 7 and submitted to chromatography

on a Sephadex G-75 column (2 x 100 cm), equilibrated with the same buffer (Fig.

1). The active fractions assayed on isolated guinea-pig ileum were mixed, lyophi¬

lized and (48 mg) were dissolved in 12 ml of 20 mM Tris-HCI buffer, pH 7 and

chromatographed on SP-Sephadex C-25 column (1 x 15cm) and the active frac¬

tions were eluted with the same buffer containing 0.12 M NaCI, (Fig. 2, according

to Hial 4 . The total kinin activity measured on the isolated guinea-pig ileum was

equivalent to 20 n g expressed as bradykinin.

HPLC separation of the active peak eluted of the SP-Sephadex C-25.

Separation of 15 ng of the active material eluted of the SP-Sephadex C-25 on

the reverse-phase HPLC column (/i-Bondapack C 18 , 300x 3.9 mm). Gradient Sys¬

tem was 20%, acetonitrile/80% and orthophosphoric acid 15%. Flow rate was

1 ml/min.

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FERREIRA, L.A.F., GREENE, L.J., HENRIQUES, O.B. A peptite isolated from bovine plasma, which

behaves like T-Kinin. Mem. Inst. Butantan, v. 54, n. 1, p.5-10, 1992.

Arterial Blood Pressure.

The carótide artery blood pressure of male rats (320 g), anesthetized with Nem-

butal (90 mg/kg), i.p., was recorded on a smoked drum, with the aid of a mercury

manometer. Administration of drugs was through a polyethylene catheter in-

troduced into the iliac vein.

Tbin-Layer Chromatography of Kinins.

The mobility of the isolated peptide (2 hq) was compared to that of standard

Kinins on Silica gel G plates by ascending chromatography. The method described

by Sampaio 9 was followed using Silica gel with a mixture of chloroform, methanol

and 17% ammonia (2:2:1) v/v, bradykinin (Bk), T-kinin, lysyl-bradykinin (LBK)

and methionyl-lysyl-bradykinin (MLB).

RESULTS AND DISCUSSION

After the precipitation of the bovine plasma proteins with ammonium sulfate,

incubation for 36 h at pH 2.5, ethanolic extraction, and two chromatographic steps,

filtration and ion exchange, followed by HPLC chromatography (Fig. 1,2 and 3A),

we found an active peptide that corresponds to the standard T-kinin peak on HPLC

(Fig. 3B). The isolated peptide from bovine plasma showed to be active on the

isolated rat uterus (Fig. 30, and on the isolated guinea-pig ileum.

When the isolated peptide (7 pcg/Kg) and T-kinin (1.8 and 3.7 ^ g) were paralelly

injected, intravenously into the rat, a decrease of the blood pressure was observed

(Fig. 4).

The isolated peptide showed a Rf value (6 cm) similar to that of T-kinin when

standard kinins were submitted to silica-gel thin-layer chromatography, (Fig. 5).

The present study demonstrates that a peptide with some kinin properties was

isolated from bovine plasma at pH 2,5 in absence of enzyme addition. The here

described peptide, might have been released by a plasma protease, which has

been activated during the incubation at pH 2.5, as it is known that the T-kinin

liberating enzymes are active in inflammatory processes during which the pH might

be alterated.

Apart of that, in this conditions the kinins substrates leveis are also increased,

Barlas 1 . According with the results above, there are evidences that this peptides

shows characteristics of the T-kinin in spite the fact that only two substrats that

generate the kinins are know in bovine plasma: low and hight molecular weight

kininogens, Kato 6 .

ACKNOWLEDGEMENTS

We are very grateful to Maria Amélia Gomes Ferreira for typing the manuscript.

RESUMO: Os autores descrevem o isolamento de um peptídio de plas¬

ma bovino, que possui propriedades farmacológicas das cininas;

Apresenta o mesmo valor de Rf da Tcinina em cromatografia em camada

delgada de silica gel e é eluído no mesmo tempo de retenção da Tcinina

em Hight Performance Liquid Chromatography (HPLC).

UNITERMOS: T-cinina, bradicinina, plasma bovino.

FERREIRA, L.A.F., GREENE, L.J., FIENRIQUES, O.B. A peptite isolated from bovine plasma, which

behaves like T-Kinin. Mem. Inst. Butantan, v. 54, n. 1, p.5-10, 1992.

FRACTIONS

Fig. 1. Chromatography on Sephadex G-75 column (2 x 100 cm) of 200 mg dry ethanolic

extract equilibrated with 20 mM Tris-HCI buffer, pH 7. Fraction volume 3 ml. (_)

Absorbance 280 nm; (•-•) Bradykinin equivalent activity.

Fig. 2. Chromatography on SP-Sephadex C-25 column (1 x 15 cm) of 48 mg active fractions

obtained from Sephadex C-75 column. Buffer: Tris-HCI 20 mM, pH 7. Arrow:

stepwise elution with 0.12 M NaCI in same buffer. Fraction volume 2 ml. ( _ )

Absorbance 280 nm; (•-•) Bradykinin equivalent activity.

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FERREIRA, L.A.F., GREENE, L.J., HENRIQUES, O.B. A peptite isolated from bovine plasma, which

behaves like T-Kinin. Mem. Inst. Butantan, v. 54, n. 1, p.5-10, 1992.

-I-1-F-

IS 20

MINUTES

TN TN TN P

• « 5 10 20 IS

MIN SS TO TS SO

Fig. 3. A-B Isolation of the active peptide (10 /xg) on a reverse-phase HPLC column (^Bon-

dapack C 18 , 300 x 3.9 mm). Gradient system: 20%, Acetonitrile/80% and or-

thophosphoric acid 15%. Flow rate was 1 ml/min. C Activity of the isolated peptide

(P) on the isolated rat uterus; n = 4.

ORUGS TK

íyUoIXo) '-8

Sol TK

100 pL\ 3.7

Fig. 4. Action of the peptide (P) and Bradykinin (BK) upon rat arterial blood pressure; n = 3.

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FERREIRA, L.A.F., GREENE, L.J., HENRIQUES, O.B. A peptite isolated from bovine plasma, which

behaves like J-Kinin. Mem. Inst. Butantan, v. 54, n. 1, p.5-10, 1992.

Fig. 5.Thin-Layer sílica gel plate of 2 pg of the isolated peptide and 2 pg of standard ki-

nins: Bradykinin (BK), methionyl — lysyl-bradykinin (MLB), lysyl-bradykinin (LBK) and

T-kínin (TK). Solvent system: chloroform-methanol-17% ammonia v/v: (2 : 2: 1).

REFERENCES

1. BARLAS, A., OKAMOTO, H., GREENBAUM, L.M. T-Kinin: The major plasma kininogen

in rat adjuvant arthritis. Biochem. Biophys. Res. Comm., v. 7 29, p. 280-286, 1985.

2. DALE, H.H. The anaphylactic reaction of plain muscle in the guinea-pig. J. Pharmacol.

Exptl. Therap., v. 4, p. 167, 1912/13.

3. ELLIOT, D.F. & LEWIS, G.R Methionyl-lysyl-bradykinin, a new kinin from ox blood. Bi¬

ochem. J., v. 95, p. 437-447, 1965.

4. HIAL, V., KEISER, H.R., PISANO, J.J. Origin and content of methionyl-lysyl-bradykinin,

lysyl-bradykinin and bradykinin in human urine. Biochem. Pharm., v. 25, p. 2499

- 2503, 1976.

5. HIROSFII, O. & GREENBAUM, L.M. Pharmacological properties of T-kinin from rat plas¬

ma. Biochem. Pharm., v. 77, p. 2637-2638, 1983.

6. KATO, H„ NAGASAWA, S„ IWANAGA, S. HMW and LMW kininogens. In: LORAND,

L, ed. Methods in Enzymology. New York: Academic Press, 1981. v. 80, part C, p.

172-98.

7. OKAMOTO, Fl. & GREENBAUM,, L.M. Isolation and structure of T-kinin. Biochem. Bi¬

ophys. Res. Comm., v. 7 22, p. 701-708, 1983.

8. PISANO, J.J. Kinins in nature. In: ERDOS, E.G., ed. Bradykinin, kallidin and Kallikrein.

Berlin: Springer-Verlag, 1979. p. 273-85 (Flandbook of experimental pharmacology,

25, supplement)

9. SAMPAIO, C.A.M., NUNES, S.T., MAZZACORATTI, M.G.N., PRADO, J.L. Inactivation of

kinins by chymotrypsin. Biochem. Pharm., v. 25, p. 2391 — 2394, 1976.

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Mem. Inst. Butantan

v. 54, n. 1, p.11-19, 1992

OBSERVAÇÕES SOBRE CICLO EVOLUTIVO DE TRIATOMA

VITTICEPS (STAL/1859) ALIMENTADOS A INTERVALOS

CONTROLADOS EM POMBOS OU COELHOS.

(HEMIPTERA-REDUVIIDAE-TRIATOMINAE).

Ana Maria MARASSÁ*

RESUMO: Foram feitas observações comparativas quanto ao desenvol¬

vimento de Triatoma vitticeps. Os exemplares foram criados em labora¬

tório em condições ambientais de temperatura e umidade. Foram

separados 160 exemplares, ninfas recém-eclodidas, formando-se 8 gru¬

pos alimentados respectivamente em coelhos ou pombos, obedecendo-

-se a intervalos de 7,14,21 e 28 dias entre os repastos. Os exemplares

foram observados durante o período de novembro de 87 a julho de 1990.

Pode-se constatar um período de vida ninfal mais curto no lote alimen¬

tado em coelhos com intervalo de 7 dias, e mais longo em exemplares

alimentados em pombos a cada 28 dias; entretanto não se observaram

diferenças entre exemplares alimentados a intervalos de 14 e 21 dias.

UNITERMOS: Triatoma vitticeps, alimentação.

INTRODUÇÃO

Dando prosseguimento à série de trabalhos bionômicos sobre triatomíneos ve¬

tores da Doença de Chagas, observações foram realizadas quanto ao comporta¬

mento de Triatoma vitticeps face a um regime com intervalos controlados de

alimentação efetuada respectivamente em coelhos ou pombos.

T.vitticeps, além de ser vetor da Doença de Chagas, encontra-se em fase ini¬

cial de transição de ambiente silvestre para domiciliar em determinadas regioês

do país, como citado por Barreto 1 e Silveira et al 10 , daí o interesse em aprofun¬

dar os conhecimentos sobre a espécie.

* Seção de Parasitologia

Instituto Butantan C.P. 65 — 05503-900 — São Paulo — SP

Recebido para publicação em 06.12.90 e aceito em 06.12.91.

í, | SciELO

MARASSÁ, A.M. Observações sobre ciclo evolutivo de Triatoma vitticeps (Stal, 1859) alimentados

a intervalos controlados em pombos ou coelhos. (Hemiptera-Reduviidae-Triatominae). Mem. Inst.

Butantan, v.54, n.1, p.11-19, 1992.

Estudos publicados por Corrêa 2 , Juarez 7 , Costa et al 3 , Diotaiuti et al 4 e Jur-

berg & Rangel 8 com exemplares de T. infestans, D. maximus, R. neglectus e /?.

pallescens contribuem com informações quanto ao conhecimento dessas espé¬

cies em relação à influência da alimentação em diferentes animais em laboratório.

Dado o encontro de T.vitticeps na natureza, quer seja coabitando com diferen¬

tes animais, roedores ou marsupiais ou mesmo nas proximidades de domicílios,

procurou-se nesta observação associar diferentes fontes alimentares a intervalos

de tempo, com objetivo de adequar um melhor intervalo entre os repastos, facili¬

tando o manuseio e consequentemente com resultados referentes ao desenvol¬

vimento da espécie.

MATERIAL E MÉTODOS

Dada a adaptação de T. vitticeps às condições ambientais do Laboratório da

Seção de Parasitoiogia do Instituto Butantan, exemplares desta espécie, descen¬

dentes de uma fêmea recebida de Vila Velha, ES vêm sendo criados desde 1974.

Em novembro de 1987 foram separados 160 exemplares, ninfas recém-

-eclodidas, divididas em 8 grupos de 20 exemplares cada. Para comparação 4

grupos foram alimentados em coelhos e 4 em pombos.

Os grupos tiveram alimentação controlada, obedecendo-se intervalos de fre¬

quência de 7,14,21 e 28 dias em cada uma das fontes alimentares.

A alimentação dos grupos de mesmo intervalo de freqüência foi simultânea,

tendo os repastos, tanto em pombos quanto em coelhos, duração de 20 minutos.

Os insetos foram criados individualmente em frascos de Borrei, em condições

ambientais de temperatura e umidade. As temperaturas mínima/máxima, bem co¬

mo a umidade relativa foram observadas diariamente entre 9:00 e 10:00 h. A va¬

riação de temperatura mínima no período de Novembro 87 — Julho 90 foi de

8,5°C — 25°C; a variação de temperatura máxima no mesmo período foi de 11 °C

— 29°C e a Umidade Relativa de 41 — 99%.

Neste experimento a Análise Estatística Inferencial foi realizada através das téc¬

nicas de Análise de Variância, Regressão Linear Múltipla e Teste de Tukey. Para

cada um dos estádios evolutivos foi feita Análise de Variância de dois fatores: 1)

Grupo:Coelho/Pombo e 2) Dias: 7/14/ 21/28.

Para homogeneizar as variâncias das combinações de tratamentos para cada

estádio, a análise foi realizada com o logaritmo natural dos dados originais. Em

casos onde se observou diferente número de respostas para cada combinação

de tratamento, foi utilizada a técnica de Regressão Linear Múltipla. Para realizar

as comparações múltiplas foi utilizado o teste de Tukey (alfa = 5%) dentro de

cada grupo, sendo apresentada também a significância descritiva (p)em cada teste.

RESULTADOS

Das 160 ninfas observadas, foram consideradas para análise geral apenas as

que participaram no experimento desde o primeiro estádio até adulto. Os exem¬

plares foram observados no período de novembro de 1987 a julho de 1990, data

da última ecdise realizada.

A menor duração do período ninfal foi de 368 dias com ninfa alimentada em

coelhos a intervalos de 7 dias e a maior foi de 962 dias com exemplar alimentado

em pombos a intervalos de 21 dias.

As durações mínimas, máximas e médias (em dias), em cada estádio evoluti¬

vo, referentes a cada grupo alimentado em coelhos ou pombos nos intervalos de

7, 14, 21 e 28 dias são apresentadas nas Tabelas 1 a 4.

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MARASSÁ, A.M. Observações sobre ciclo evolutivo de Triatoma vilticeps IStal, 1859) alimentados

a intervalos controlados em pombos ou coelhos. (Hemiptera-Reduviidae-Triatominae). Mem. Inst.

Butantan, v.54, n.1, p.11-19, 1992.

Considerando-se as médias, observou-se que exemplares alimentados em coe¬

lhos a intervalos de 7,14,21 e 28 dias apresentaram duração do ciclo evolutivo

de 395, 5; 458, 8; 514,3; 572,1 dias enquanto que os alimentados em pombos,

os períodos corresponderam respectivamente a 503, 1; 621, 5; 593, 4 e 679,

7 dias (Vide Tabelas)

Com as médias e desvios padrões das Tabelas 1 a 4 foram construídos os Grá¬

ficos 1 a 4.

Nos Gráficos 1 a 4 estão representados os perfis médios das 8 combinações

de tratamento: alimentação/intervalo de alimentação; ou seja alimentação em coe¬

lhos ou pombos a intervalos de 7,14,21 e 28 dias respectiva mente.

Observou-se que a duração em dias aumentou gradativamente a medida que

os estádios foram sucedendo, mas o Estádio IV em geral apresentou duração se¬

melhante ao Estádio V.

À medida que os estádios evolutivos avançaram houve aumento da variabili¬

dade (representada por barras verticais nos gráficos), nos grupos alimentados em

coelhos e pombos, sendo maior nestes últimos.

Com exceção do Estádio II, observou-se que as médias de duração em dias

foram maiores para os exemplares alimentados em pombos (linhas tracejadas).

Para cada estádio evolutivo foi feita Análise de Variância de dois fatores: 1) Gru¬

po: Coelho/Pombo 2) Dias: 7/14/21/28 e para realizar as comparações múltiplas

foi utilizado o teste de Tukey, sendo os resultados a seguir apresentados:

Para o Estádio I observou-se:

1 — Existe diferença significativa entre as médias do grupo alimentado em coe¬

lho e em pombo, (p < 5%) para todos os intervalos de alimentação (p = 0,0196).

2 — Existem diferenças significantes (p < 1%) entre os intervalos de alimen¬

tação (dias) (p = 0,0000). Ao aplicar-se o teste de Tukey constatou-se diferença

significante entre a média dos exemplares alimentados a cada 7 dias e outros

dias e entre os alimentados a cada 14 e 28 dias.

3 — Ao comparar-se os dois grupos verificou-se que apresentaram comporta¬

mento semelhante em relação aos intervalos de alimentação (p = 0,8523).

Para o Estádio II verificou-se:

1 — Não existe diferença significativa entre as médias globais do grupo ali¬

mentado em coelho e em pombo (p = 0,6834).

2 — Existem diferenças significantes entre as médias globais nos diferentes

dias (p=0,0000). Para explorar um pouco mais a diferença entre as médias foi

aplicado o teste de Tukey em cada grupo e observou-se diferença significativa

entre a média dos exemplares alimentados em coelho a cada 7 dias e aqueles

alimentados a cada 14 e 21 dias e entre a média dos alimentados em coelho a

cada 21 e 28 dias.

Nos exemplares alimentados em pombos observou-se diferença significativa en¬

tre a média dos alimentados a cada 7 dias e aqueles alimentados a cada 21 dias

assim como entre a média dos alimentados respectivamente a cada 14 e 21 dias.

3 — Ao comparar-se os dois grupos observou-se indícios de comportamento

diferente em relação aos intervalos de alimentação (p=0,0684).

Para o Estádio III verificou-se:

1 — Existe diferença significativa entre as médias do grupo alimentado em coe¬

lho e em pombo (p < 1%) (p=0,0080), para todos os intervalos de alimentação.

2 — Existem diferenças significantes (p < 1%) (p=0,0000) entre as médias

nos diferentes dias. Ao aplicar o teste de Tukey observou-se diferença entre a mé¬

dia dos exemplares alimentados a cada 7 dias e aqueles alimentados a cada 21

e 28 dias.

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MARASSÁ, A.M. Observações sobre ciclo evolutivo de Triatoma vitticeps (Stal, 1859) alimentados

a intervalos controlados em pombos ou coelhos. (Hemiptera-Reduviidae-Triatominae). Mem. Inst.

Butantan, v.54, n.1, p.11-19, 1992.

3 — Ao comparar-se os dois grupos verificou-se que apresentaram comporta¬

mento semelhante em relação aos intervalos de alimentação (p = 0,2499).

Para o Estádio IV observou-se:

1 — Existe diferença significativa entre as médias do grupo alimentado em coe¬

lho e em pombo (p < 1%) (p=0,0000).

2 — Existem diferenças significantes (p < 1%) (p=0,0000) entre as médias

nos diferentes dias. Para verificar a diferença entre as médias foi utilizado o teste

de Tukey em cada grupo e observou-se diferença entre a média dos exemplares

alimentados em coelho a cada 7 dias em relação aos demais dias.

Houve diferença entre a média dos exemplares alimentados em pombos ape¬

nas entre 14 e 28 dias.

3 — Os dois grupos apresentaram comportamento diferente em relação aos

intervalos de alimentação (p=0,0000).

Para o Estádio V os cálculos foram feitos através do enfoque de Regressão Linear

Múltipla dada a observação do diferente número de respostas para cada combi¬

nação de tratamento e constatou-se:

1 — Existe diferença significativa entre (p < 1%) (p=0,0035) entre as mé¬

dias do grupo alimentado em coelho e em pombo.

2 — Existem diferenças significantes (p < 1%) (p = 0,0000) entre as médias

nos diferentes dias. Para testar a diferença entre as médias foi utilizado o teste

de Tukey. Verificou-se que não existe diferença significativa entre as médias nos

diferentes intervalos nos exemplares alimentados em coelho.

Nos exemplares alimentados em pombo observou-se diferença significativa entre

a média dos exemplares alimentados a cada 7 dias e aqueles alimentados a cada

28 dias.

3 — Os dois grupos apresentaram comportamento diferente em relação aos

intervalos de alimentação (p < 1%) (p = 0,0008).

Ao considera-se a duração do período ninfal, os cálculos foram obtidos através

do enfoque de Regressão Linear Múltipla pelos mesmos motivos citados no Está¬

dio V e verificou-se:

1 — Existe diferença significativa entre as médias dos grupos alimentados em

coelho e em pombo (p < 1%) (p=0,0000).

2 — Existem diferenças significantes entre as médias nos diferentes dias

(p < 1%) (p=0,0000). Foi utilizado o teste de Tukey e verificou-se diferença en¬

tre a média dos exemplares alimentados a cada 7 dias em relação aos demais

e entre a média dos alimentados a cada 28 dias em relação aos demais. Não

houve diferença significativa entre as médias dos exemplares alimentados a cada

14 dias em relação àqueles alimentados a cada 21 dias.

3 — Os dois grupos apresentaram comportamento semelhante em relação aos

intervalos de alimentação (p=0,2552).

DISCUSSÃO

Corrêa 2 ao alimentar T. infestans em galinha, gambá ou cão, obteve uma du¬

ração total do ciclo evolutivo maior em cão, mas ao comparar exemplares alimen¬

tados em galinha ou em gambá não encontrou diferença.

Juarez 7 avaliou o comportamento de T. infestans Submetido a ação de três

variáveis; temperatura, fonte sanguínea e infecção pelo T. cruzi. Ao comparar as

fontes de sangue, galinha e camundongo, obteve um encurtamento do ciclo evo¬

lutivo em exemplares alimentados em camundongos, o mesmo ocorreu com au¬

mento da temperatura.

MARASSÁ, A.M. Observações sobre ciclo evolutivo de Triatoma vitticeps (Stal, 1859) alimentados

a intervalos controlados em pombos ou coelhos. (Hemiptera-Reduviidae-Triatominae). Mem. Inst.

Butantan, v.54, n.1, p.11-19, 1992.

Juberg & Rangel 8 estudando o ciclo biológico de R.pallescens em diversas

condições de temperatura, umidade, e luminosidade, alimentados em pombos

ou camundongos, constataram uma preferência alimentar por camundongo.

Diotaiuti et al 4 observou que à 27 ± 2°C e 70% de UR, exemplares de R.

neglectus alimentados em pombos ou camundongos apresentaram desenvolvi¬

mento mais rápido quando alimentados nestes últimos.

Costa et al 3 obteve resultados semelhantes com D.maximus, mantidos em es¬

tufa a 28°C e 65% UR.

Gonçalves et al 5 obteve adultos T. vitticeps num intervalo de 180 a 372 dias

a temperaturas de 25 ± 2°C a 28 ± 2°C e UR de 80 ± 2% com alimentação

semanal em camundongos.

Silva 9 observou um período de desenvolvimento menor em condições de tem¬

peratura que variaram de 25 ± 0,5°C e 30 ± 1°C. alimentando em galinhas.

Heitzmann-Fontenelle 6 observou vida ninfal de 379 a 781 dias oferecendo ali¬

mentação em coelhos, a intervalos que variaram de 7 a 10 dias.

Nesta observação, com exemplares mantidos em temperatura ambiente, fo¬

ram obtidos adultos cujo ciclo evolutivo foi acentuadamente maior do que os ve¬

rificados por Silva 9 e Gonçalves et al 5 . Os resultados encontrados para

exemplares alimentados em coelhos ou pombos a cada 7 dias ou 14 dias, foram

semelhantes aos obtidos por Heitzmann-Fontenelle.

0 prolongamento do período ninfal deve ser relacionado à variação individual

e a fatores extrínsecos, temperatura e umidade, que tiveram variação durante to¬

do o período de observação. A estes fatores deve-se acrescentar o estabeleci¬

mento de longo tempo de criação da colônia em laboratório. Deve-se destacar

porém o desenvolvimento mais rápido em exemplares alimentados em coelhos,

resultados estes compatíveis com os obtidos por Diotaiuti et al 4 , Costa et al 3 e

demais autores. No entanto não se pode afirmar uma maior adaptação dos exem¬

plares alimentados em coelhos.

CONCLUSÃO

Ao comparar os dois grupos em observação constatou-se:

1 - Um desenvolvimento mais rápido nos grupos alimentados em coelho em

todos os intervalos de freqüência em todo ciclo evolutivo com exceção ao Está¬

dio II.

2 - Não haver diferença significativa na duração do ciclo evolutivo dos exem¬

plares alimentados em coelhos ou pombos a intervalos de 14 e 21 dias.

3- Menor variabilidade de intermuda nos grupos alimentados em coelho. De

modo geral ao comparar-se as médias dos períodos de desenvolvimento observou-

-se que a alimentação em coelho favoreceu o desenvolvimento de Tvitticeps.

AGRADECIMENTOS

À Dra. Therezinha H.Fontenelle pela orientação e ao Prof. Dr. Fernando M.A.Cor-

rêa pela leitura crítica do texto e sugestões.

ABSTRACT: Comparative observations were made on the development

of Triatoma vitticeps. Specimens were maintained under variable labora-

tory conditions (temperature and humidity). Eight groups from 160

hatched nimphs were formed. They were fed respectively on rabbits or

pigeons. Feeding intervals of 7, 14,21 and 28 days were established.

Observations were made from November 1987 to July 1990. Insects

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

MARASSÁ, A.M. Observações sobre ciclo evolutivo de Triatoma vitticeps (Stal, 1859) alimentados

a intervalos controlados em pombos ou coelhos. (Hemiptera-Reduviidae-Triatominae). Mem. Inst.

Butantan, v.54, n.1, p.11-19, 1992.

fed on rabbits in intervals of 7 days showed the shortest growing period

meanwhile those fed on pigeons in intervals of 28 days took longer to

develop. There was no difference between those fed in intervals of respec-

tively 14 and 21 days.

KEYWORDS: Triatoma vitticeps, feeding

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. BARRETO, M.P. Ecologia de triatomíneos e transmissão do Trypanosoma cruzi, com

especial referência ao Brasil. Hev. Soc. bras. Med. trop., v. 10, p.339-353, 1976.

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3. COSTA, J.M., JURBERG, J., ALMEIDA, J.R. Estudos bionômicos de Dipetaiogaster ma-

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DE CHAGAS, 10, Caxambu, 1983 Resumos... v. 16.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

MARASSÁ, A.M. Observações sobre ciclo evolutivo de Thatoma vitticeps (Stal, 1859) alimentados

a intervalos controlados em pombos ou coelhos. (Hemiptera-Reduviidae-Triatominae). Mem. Inst.

Butantan, v.54, n.1, p.11-19, 1992.

TABELA 3

Duração do ciclo evolutivo em triatomíneos alimentados

em coelhos ou pombos a cada 21 dias.

Coelhos

Pombos

Estádio

D.P.

Min

Max

X D.P.

Min

Max

38,8

42,5 12,1

53,2

11,8

49,2 8,6

III

65,8

19,4

118

68,7 17,4

118

169,2

23,8

125

223

197,2 37,5

134

286

187,3

129

415

235,1 123,5

121

531

Total

514,3

85,4

444

751

593,4 138,8

474

962

N =

X =

D.P. =

número de exemplares

média

desvio padrão

TABELA 4

Duração do ciclo evolutivo em triatomíneos alimentados

em coelhos ou pombos a cada 28 dias.

Coelhos

Pombos

Estádio

D.P.

Min

Max

X D.P.

Min

Max

44,2

12,5

50,5 19,7

42,0

10,6

46,8 11,9

III

76,6

45,4

194

97,5 45,2

194

178,4

37,8

288

186,7 50,2

288

229,2

71,7

108

523

298,2 104

108

523

Total

572,1

120,7

474

832

679,7 96,8

474

832

N =

X =

D.P. =

número de exemplares

média

desvio padrão

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

MARASSÁ, A.M. Observações sobre ciclo evolutivo de Triatoma vitticeps IStal, 1859) alimentados

a intervalos controlados em pombos ou coelhos. (Hemiptera-Reduviidae-Triatominae). Mem. Inst.

Butantan, v.54, n.1, p.11-19, 1992.

X II TIT IV V Total

ESTÁDIOS EVOLUTIVOS

Graf. 1 Duração do ciclo evolutivo de T. vit- Graf. 2 Duração do ciclo evolutivo de T. vit¬

ticeps alimentados em coelhos ou

pombos a cada 7 dias.

ticeps alimentados em coelhos ou

pombos a cada 14 dias.

I II III IV V Total

ESTÁDIOS EVOLUTIVOS

Graf. 3 Duração do ciclo evolutivo de T. vit- Graf. 4 Duração do ciclo evolutivo de T. vit¬

ticeps alimentados em coelhos ou

pombos a cada 21 dias.

ticeps alimentados em coelhos ou

pombos a cada 28 dias.

Coelhos .

Pombos .

SciELO

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Mem. Inst. Butantan

v. 54, n. 1, p.21-30, 1992

DOSAGEM BIOLÓGICA DO ANTIVENENO BOTROPICO

Sérgio Luiz DALMORA* *

Silvana F. VACCARI**

Alexandre M. SAMPEDRO* * *

João Eduardo da S. PEREIRA****

ABSTRACT: The determination of the LD50 of bothropic reference ven-

om and the evaluation of the respective antivenin potency were stan-

dardized by intraperitoneal inoculation in mice. The Computer program

was developed for the calculations of the LD50 and the potency (ED50)

by probit analysis. The final results were consistent and reproducibles.

The weight obtained in independent assays was between 374 and 1762.

The precision index was X < 0,10.

KEYWORDS: Bothropic antivenins and venom, evaluation of bothropic

antivenin potency, LD50 of bothropic venom.

INTRODUÇÃO

O método de Vital Brazil 2 foi empregado durante muitos anos para a titula¬

ção da atividade tóxica de venenos de serpentes do gênero Bothrops, e para a

determinação da potência dos antivenenos botrópicos. Para a avaliação da po¬

tência o procedimento fundamenta-se na incubação da mistura veneno-antiveneno

a 37°C, durante 30 minutos e inoculação por via endovenosa em pombos. O pe¬

ríodo de observação, de 20 a 30 minutos, não possibilita quantificar os anticor¬

pos antitóxicos, mas aqueles específicos à atividade coagulante. 14 ' 16 . O número

(J> Financiado pela SCT/MS.

* Prof. Tit. Dept° de Farmácia Industrial — CCS — UFSM

* • Méd. Vet. do Dept 0 de Farmácia Industrial — CCS — UFSM

* * * Eng° do Núcleo de Processamento de Dados — UFSM

•••• Auxiliar-de-Ensino do Dept 0 de Estatística — CCNE — UFSM

" Departamento de Farmácia Industrial

Centro de Ciências da Saúde

Universidade Federal de Santa Maria

Campus Universitário — 97119 - Santa Maria — RS

Recebido para publicação em 30.07.1991 e aceito em 29.10.91.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

DALMORA, S.L., VACCARI, S.F., SAMPEDRO, A.M., PEREIRA, J.E. da S. Dosagem biológica do

antiveneno botrópico. Mem. Inst. Butantan, v. 54, n.1, p.21-30, 1992.

de respostas para cada nível de diluição é pequeno e a análise estatística dos

dados é restrita, influenciando assim a precisão das estimativas de potência. A

Farmacopéia Brasileira 7 preconiza esta metodologia.

Em 1937, Slotta e Syszka 18 realizaram ensaios com a finalidade de padroni¬

zar a utilização de camundongos para o estudo da atividade tóxica de venenos

ofídios. Kocholaty e cols. 13 testaram diferentes vias de administração demons¬

trando que as vias intravenosa e intraperitoneal propiciavam procedimentos ade¬

quados e reprodutíveis para o doseamento de antivenenos. Observaram, inclusive,

que a via de inoculação teria importância decisiva na demonstração do efeito pro¬

tetor na interação veneno-antiveneno, que por sua vez variaria de acordo com

o tipo de veneno. Furlaneto e cols. 10 ' 11 destacaram as vantagens deste animal

e realizaram experimentos empregando a via endovenosa e doses preparatórias

de veneno para a determinação da DL50 de venenos botrópicos. Siles Vilarroel

e cols. 16 obtiveram bons resultados efetuando a titulação da atividade tóxica de

venenos botrópicos pela via intraperitoneal em camundongos. Concluiram tam¬

bém que o método preenchia os requisitos necessários à quantificação, em ter¬

mos de DL50, dos fatores responsáveis pela toxicidade com alto grau de

sensibilidade e de reprodutividade, isento dos inconvenientes devidos ao fator coa-

gulante. Os mesmos autores 14 ' 15 numa etapa seguinte, padronizaram a metodo¬

logia para a avaliação da potência de antivenenos botrópicos, comprovando a

eficiência do modelo experimental e demonstrando que a inoculação intraperito¬

neal era um processo plenamente satisfatório, e perfeitamente reprodutível.

Ao verificar as metodologias preconizadas pelos autores 12 ' 17 ' 19 ' 20 para a de¬

terminação da capacidade neutralizante dos soros anti-ofídicos, encontra-se en¬

saios biológicos fundamentados nas atividades: letal, hemorrágica, edemaciante,

coagulante, miotóxica, necrosante, desfibrinante e enzimáticas. Por sua vez, as

Farmacopéias Européia 6 e Britânica 3 recomendam a utilização do camundongo

como animal de prova para a determinação da Dose Letal 50 do veneno e, a se¬

guir, a avaliação da potência do antiveneno respectivo em relação à toxicidade

encontrada.

Para o ensaio biológico que se fundamenta na determinação da atividade letal

há dois procedimentos: 1 °) mistura de quantidades fixas de veneno com dilui¬

ções variáveis do antiveneno 3 ' 4i 6 e 2°) mistura de doses diferentes de veneno

e quantidades constantes de soro 4 ' 13 ' 14 . Em ambos os casos realiza-se incuba¬

ção prévia a 37°C durante 30 minutos, antes da inoculação.

Este trabalho tem por finalidade padronizar a metodologia para a avaliação da

potência do antiveneno botrópico pela via intraperitoneal em camundongos. Efe¬

tuar a análise estatística dos dados pelos métodos de probitos demonstrando a

validade, a exatidão e a reprodutibilidade dos ensaios.

MATERIAL E MÉTODOS

1. Veneno de Referência

Foi utilizado o veneno de Bothrops jararaca como veneno de referência, lote

BRA/Bot/OOT, cedido pelo Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saú¬

de — INCQS. Cada frasco contém 30mg de veneno — 900 DL50 — e foi conser¬

vado a -20°C. Foram preparadas soluções de veneno na concentração de 10mg/ml

em solução fisiológica estéril.

DALMORA, S.L., VACCARI, S.F., SAMPEDRO, A.M., PEREIRA, J.E. da S. Dosagem biológica do

antiveneno botrópico. Mem. Inst. Butantan, v. 54, n.1, p.21-30, 1992.

2. Antivenenos Botrópicos

Foram utilizados três lotes de antivenenos botrópicos fornecidos pelo Instituto

Butantan de São Paulo e Instituto Vital Brazil do Rio de Janeiro e identificados

como antiveneno A,B,C.

3. Animais

Foram utilizados camundongos da linhagem BALB/c, de ambos os sexos, com

peso entre 18 e 20g. Os animais foram mantidos em jejum de 10 a 15 horas com

acesso à glicose a 10%. Para o ensaio, foram distribuídos aleatoriamente em gru¬

pos de 6 a 10 animais cada um, e identificados segundo a dose a ser injetada.

4. Determinação da Dose Letal 50 (DL50)

Foram preparadas 4 doses de veneno de B. jararaca diluído em solução fisioló¬

gica estéril segundo uma progressão geométrica com espaçamento logarítmico

constante igual a 0,1.

Injetou-se 0,5ml por camundongo pela via intraperitoneal. Os animais foram

observados durante 48 horas, registrando-se número de mortes para cada dose.

5. Avaliação da potência do antiveneno botrópico.

Preparou-se a solução do veneno de referência de B. jararaca em solução fi¬

siológica estéril, de modo a conter 20 DL50 de veneno por ml.

Segundo a potência suposta de cada soro antibotrópico foram preparadas qua¬

tro diluições em solução fisiológica estéril formando uma progressão geométrica

com espaçamento logarítimo igual a 0,097.

Transferiu-se 3ml de cada uma das diluições do antiveneno para tubos de en¬

saio com tampa, aos iguais adicionou-se 3ml da solução do veneno. Plomoge-

neizou-se. Os tubos foram incubados a 37°C, em banho-maria, durante 30

minutos.

Administrou-se 0,5ml da respectiva dose, pela via intraperitoneal, em camun¬

dongos. Os animais foram observados durante 48 horas, registrando-se o núme¬

ro de mortes para cada dose.

6. Análise estatística

Os resultados experimentais foram submetidos à análise estatística por probi-

tos segundo Finney 9 . A combinação de estimativas de potência, a ponderação

para cada ensaio e o índice de precisão foram calculados conforme a litera¬

tura 3 - 8 - 9 .

RESULTADOS

Para cada ensaio foi registrado o número de animais mortos para a respectiva

dose. Estes dados submetidos à análise estatística forneceram os valores de DL50

apresentados nas tabelas 1 e 5 e de potência nas tabelas 2 a 4 e 6 a 8, incluindo

as combinações de estimativas dos ensaios independentes.

O primeiro grupo de resultados corresponde às tabelas 1 a 4, onde os valores

experimentais de DL50 serviram de base para o planejamento dos ensaios de po¬

tência.

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DALMORA, S.L., VACCARI, S.F., SAMPEDRO, A.M., PEREIRA, J.E. da S. Dosagem biológica do

antiveneno botrópico. Mem. Inst. Butantan, v. 54, n.1, p.21-30, 1992.

TABELA 1

Estimativas de DL50 e limites de confiança (P=0,95) em microgramas de veneno

de Bothrops jararaca por camundongo. Ponderação de cada ensaio independente.

Combinação das estimativas e respectivo índice de precisão (X).

Ensaio n°

DL50

Limites de confiança (P = 0,95)

Ponderação

34,72

30,71 - 39,37

1317

35,77

31,31 - 41,41

1039

33,95

29,32 - 39,95

851

Potência

média

34,84

31,18 - 37,74

X = 0,07

Homogeneidade X 2 = 0,23 p > 0,05

TABELA 2

ANTIVENENO A. Estimativas de potência (DE50) e limites de confiança (P = 0,95),

em mg de veneno de B. jararaca neutralizados por ml de antiveneno.

Ponderação de cada ensaio independente. Combinação das estimativas

e respectivo índice de precisão (X).

Ensaio n?

DE50

Limites de confiança (P = 0,95)

Ponderação

(mg/ml)

% da potência

7,42

6,54 - 8,38

88,14 - 112,94

1320

7,32

5,61 — 8,95

76,64 - 122,27

374

7,20

6,31 - 8,25

87,64 - 114,58

1136

Potência

Média

7,32

6,72 - 7,97

91,80 - 108,88

X = 0,07

Homogeneidade X 2 = 0,10 p > 0,05

SciELO

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DALMORA, S.L., VACCARI, S.F., SAMPEDRO, A.M., PEREIRA, J.E. da S. Dosagem biológica

do antiveneno botrópico. Mem. Inst. Butantan, v. 54, n.1, p.21-30, 1992.

TABELA 3

ANTIVENENO B. Estimativas de potência (DE50) e limites de confiança (P = 0,95),

em mg de veneno de B.jararaca neutralizados por ml de antiveneno.

Ponderação de cada ensaio independente. Combinação das estimativas e

respectivo índice de precisão (X).

Ensaio n?

DE50

Limites de confiança (P = 0,95)

Ponderação

(mg/ml)

% da potência

5,88

5,25 - 6,65

89,28 - 113,09

1443

6,08

5,31 - 6,97

87,33 - 114,64

1101

5,55

4,88 - 6,33

87,93 - 114,05

1201

Potência

Média

5,83

5,41 - 6,27

92,79 - 107,55

X = 0,06

Homogeneidade X 2 = 0,9'\ p > 0,05

TABELA 4

ANTIVENENO C. Estimativa de potência (DE50) e limites de confiança (P = 0,95),

em mg de veneno de B. jararaca neutralizados por ml de antiveneno.

Ponderação do ensaio.

Ensaio n?

DE50

Limites de confiança (P = 0,95)

Ponderação

(mg/ml)

% da potência

5,89

5,21 - 6,69

88,45-113,58

1299

Para as avaliações de potência dos antivenenos botrópicos apresentadas nas

tabelas 6, 7 e 8, foram empregados os valores de DL50 determinados experi¬

mentalmente conforme a Tabela 5.

SciELO

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DALMORA, S.L., VACCARI, S.F., SAMPEDRO, A.M., PEREIRA, J.E. da S. Dosagem biológica

do antiveneno botrópico. Mem. Inst. Butantar/, v. 54, n.1, p.21-30, 1992.

TABELA 5

Estimativas de DL50 e limites de confiança (P = 0,95) em microgramas de

veneno de Bothrops jararaca por camundongo.

Ponderação de cada ensaio independente.

Combinação das estimativas e respectivo índice de precisão (X).

Ensaio n?

DL50

Limites de confiança (P = 0,95)

Ponderação

44,51

35,63 - 55,04

431

43,30

37,55 - 50,01

993

Potência

média

43,65

38,74 - 49,21

X = 0,10

Homogeneidade )fi = 0,04 p > 0,05

TABELA 6

ANTIVENENO A. Estimativas de potência (DE50) e limites de confiança (P = 0,95),

em mg de veneno de B. jararaca neutralizados por ml de antiveneno.

Ponderação de cada ensaio independente.

Combinação das estimativas e respectivo índice de precisão (X).

Ensaio n?

DE50

Limites de confiança (P = 0,95)

Ponderação

(mg/ml)

% da potência

7,76

5,59 - 8,72

72,03 - 112,37

414

7,38

6,48 - 8,28

87,80 - 112,19

1367

6,73

5,38 - 7,71

79,94 - 114,56

633

Potência

média

7,27

6,63 - 7,97

91,20 - 109,63

X=0,08 Homogeneidade X 2 =1,10 p > 0,05

I, | SciELO

DALMORA, S.L., VACCARI, S.F., SAMPEDRO, A.M., PEREIRA, J.E. da S. Dosagem biológica

do antiveneno botrópico. Mem. Inst. Butantan, v. 54, n.1, p.21-30, 1992.

TABELA 7

ANTIVENENO B. Estimativas de potência (DE50) e limites de confiança (P = 0,95),

em mg de veneno de B. jararaca neutralizados por ml de antiveneno.

Ponderação de cada ensaio independente.

Combinação das estimativas e respectivo índice de precisão (X).

Ensaio n?

DE50

Limites de confiança (P = 0,95)

Ponderação

(mg/ml)

% da potência

5,88

4,53 - 6,46

77,04 - 109,86

651

5,96

5,30 - 6,57

88,92 - 110,23

1762

Potência

média

5,94

5,42 - 6,51

91,24 - 109,60

X = 0,08

Homogeneidade 2^ = 0,02 p > 0,05

TABELA 8

ANTIVENENO C. Estimativa de potência (DE50) e limites de confiança (P = 0,95),

em mg de veneno de B. jararaca neutralizados por ml do antiveneno.

Ponderação do ensaio.

Ensaio n?

DE50

Limites de confiança (P = 0,95)

Ponderação

(mg/ml)

% da potência

5,34

4,69 - 5,98

87,83 - 111,98

1386

DISCUSSÃO

Os resultados experimentais encontrados são classificados em dois grupos cor¬

respondentes às tabelas 1 a 4 e 5 a 8, respectivamente. Estes valores foram ob¬

tidos com intervalos de tempo, aproximado de 15 meses entre as análises.

Para o primeiro grupo de dados composto pelas tabelas 1 a 4, foi inicialmente

determinada a Dose Letal 50 (DL50) do Veneno de Referência de Bothrops jarara¬

ca que, pela combinação de três ensaios independentes, forneceu um valor médio

de 34,84 microgramas por camundongo, tabela 1 (X = 0,07). Este valor foi utiliza¬

do para o planejamento dos ensaios de avaliação de potência dos antivenenos.

SciELO

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DALMORA, S.L., VACCARI, S.F., SAMPEDRO, A.M., PEREIRA, J.E. da S. Dosagem biológica

do antiveneno botrópico. Mem. Inst. Butantan, v. 54, n.1, p.21-30, 1992.

Para a realização das análises cujos resultados se encontram nas tabelas 5

a 8 foi procedido de modo similar. O mesmo lote de veneno de referência apre¬

sentou uma DL50 igual a 43,65 microgramas por camundongo conforme a ta¬

bela 5 (X = 0,10). Este valor serviu de base para o planejamento das reavaliações

de potência dos mesmos antivenenos.

Detectou-se uma variação na toxicidade do veneno de B. jararaca que poderia

invalidar o ensaio biológico 1 > 20 . Então, procedeu-se a repetição dos ensaios de

DL50 a fim de utilizar sempre o verdadeiro valor de letalidade no planejamento

dos experimentos e no cálculo da potência. Conforme se pode observar nas ta¬

belas 2a4e6a8,a metodologia proporcionou avaliações de potência precisas

com estreitos intervalos de confiança e uma variação de, no máximo, 8% em

torno da média para um nível de significância a =0,05. A reprodutibilidade e

a confiabilidade podem ser notadas nos ensaios completamente independentes,

mas principalmente na combinação destas estimativas. O índice de precisão foi

calculado pelo lambda de Gaddum obtendo-se valores X < 0,10. A ponderação

calculada para cada ensaio como a recíproca da variância do log da potência 8

variou entre 374 e 1762. A homogeneidade das estimativas independentes de

potência foi calculada pelo teste do x 2 .

Optou-se pela padronização da presente metodologia de acordo com literatu¬

ra 3 - 6 ' 12 - 13 - 20 , determinando-se inicialmente a DL50 do veneno de B. jararaca

e então, com base neste resultado, foi avaliada a potência do antiveneno. Adotou-

-se a mistura de quantidades fixas de veneno na proporção de 5 DL50 e diferen¬

tes diluições do antiveneno. De acordo com a curva dose-resposta foram

selecionadas 4 a 5 doses em progressão geométrica de modo que um grupo pro¬

piciasse 10 — 20% de mortalidade, outro 80 — 90% e, pelo menos um outro,

respostas intermediárias. O espaçamento logarítmico foi de 0,097. Embora a pré-

-incubação da mistura veneno-antiveneno não reproduza as características do

envenenamento ofídico, este procedimento é adequado para estudar a presença

e a potência de anticorpos neutralizantes nos antivenenos.

A utilização do camundongo como animal de prova em substituição ao pom¬

bo, possibilitou a realização de ensaios biológicos reprodutíveis, com maior nú¬

mero de respostas para cada nível de dosagem. Os animais foram deixados em

jejum com acesso a glicose a 10% pelo período de 10 a 15 horas, encontrando-

-se assim maior exatidão nas respostas. Escolheu-se a via intraperitoneal pela

sua conveniência e reprodutibilidade, mesmo contrastando com as vias intrave¬

nosas e intradérmica que mais de assemelhariam ao processo de acidente ofídi¬

co. Os animais foram observados durante 48 horas pois somente neste período

os efeitos biológicos são integrais, concordando com as observações de outros

autores 6 - 14 .

Os resultados foram submetidos à análise estatística por probitos segundo Fin-

ney 8 - 9 . Este procedimento possibilita uma análise mais completa, maiores in¬

formações a partir dos dados experimentais, apresentando assim vantagens sobre

os métodos simplificados de Spearman-Kárber, Reed-Müench, médias móveis 8 -

20 e outros. O desenvolvimento de programas de computação contribui para eco¬

nomia e simplicidade dos trabalhos.

A potência das amostras analisadas segundo esta metodologia é representa¬

da pela Dose Efetiva 50 (DE50) e foi expressa em miligramas de veneno neutrali¬

zados por mililitro de soro antibotrópico. Este também é o procedimento adotado

pelos laboratórios produtores e preconizado pela literatura 12 - 14 - 20 .

Recentemente, o Programa Nacional de Ofidismo da Secretaria Nacional de

Ações Básicas de Saúde, do Ministério da Saúde, contribuiu diretamente para

aprimorar e aumentar a produção de soros antiofídicos no Brasil, bem como pa-

SciELO

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DALMORA, S.L., VACCARI, S.F., SAMPEDRO, A.M., PEREIRA, J.E. da S. Dosagem biológica

do antiveneno botrópico. Mem. Inst. Butantan, v. 54, n.1, p.21-30, 1992.

ra uma revisão dos bioensaios empregados para estimar sua potência, buscando

adaptar esses métodos às recomendações da Organização Mundial da Saúde 5 -

20 . Deste modo, foi estabelecido o Veneno de Referência empregado neste es¬

tudo, e os laboratórios produtores nacionais passaram a avaliar a potência dos

soros antiofídicos em função de sua capacidade neutralizante em camundongos.

É importante que se continue a desenvolver procedimentos que contribuam

para ampliar os conhecimentos dos fenômenos que caracterizam o complexo qua¬

dro fisiopatológico do envenenamento ofídico e, ao mesmo tempo acrescentem

informações sobre a neutralização de outros efeitos farmacológicos, não só a le-

talidade. Neste sentido, seria recomendável o estabelecimento do antiveneno pa¬

drão e a padronização do ensaio de retas paralelas. Enquanto isto, metodologias

como a presente, se destacam pela sua importância e validade na dosagem de

potência dos antivenenos botrópicos.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Dr. Ciro C. de Resende, Coordenador do Programa

Nacional de Ofidismo do Ministério da Saúde pelo apoio que viabilizou o presen¬

te trabalho. Aos Institutos Butantan, Vital Brazil e INCQS pela doação dos antive¬

nenos e veneno de referência. Ao Téc. de Lab. João L. Rizzi pelo auxílio na parte

experimental e à Dra. Yoko Murata pela revisão crítica.

RESUMO: As metodologias para a determinação da Dose Letal 50 (DL

50) do veneno de Referência de Bothrops jararaca e para a avaliação

de potência do antiveneno botrópico, foram padronizados pela inocu¬

lação intraperitoneal em camundongos. Elaborou-se programa de com¬

putação que foi utilizado para a análise estatística dos dados pelo método

de probitos, encontrando-se uma reprodutibilidade significativa para a

= 0,05. A ponderação calculada para cada ensaio variou entre 374

e 1762. O índice de precisão foi X < 0,10.

UNITERMOS: Antiveneno botrópico, avaliação de potência de antive¬

neno botrópico, DL50 de veneno botrópico.

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I, | SciELO

BOLETIM DE

BIOTECNOLOGIA

VOLUME 3 - 1992 _ ISSN 0103-6548

Secretaria de Estado da Saúde

Coordenação dos Institutos de Pesquisa

Instituto Butantan

COMISSÃO EDITORIAL

Rosalvo Guidolin

Wilmar Dias da Silva

Isaias Raw

Henrique Moisés Canter

Luiz Sebastião Prigenzi

Renata Lara Paes de Barros

SUMÁRIO

Caracterização de venenos de serpentes por eletroforese em poliacrilamida Cha-

racterization of snake venoms using polyacrylamide gel electrophoresis

A.M. Moura da Silva . 3

Boi. Biotecnol., v. 3, p. 1-7 — 1992

I, | SciELO

Boi. Biotecnol.

v. 3, p. 3-7, 1992.

CARACTERIZAÇÃO DE VENENOS DE SERPENTES

POR ELETROFORESE EM POLI ACRILAMIDA

Ana Maria MOURA DA SILVA

RESUMO: Os venenos de Bothrops alternatus, Bothrops atrox, Both-

rops cotiara, Bothrops erythromelas, Bothrops jararaca, Bothrops jara-

racussu, Bothrops moojeni, Bothrops neuwiedi, Bothrops pradoi,

Crotalus durissus terrificus, Crotalus durissus collineatus, Lachesis mo¬

ta muta, Micrurus frontalis e Micrurus corallinus, foram fracionados por

eletroforese em gel de gradiente de poliacrilamida, em presença de SDS

e os componentes corados com azul de Coomassie. A comparação do

perfil eletroforético desses venenos mostrou que os venenos de B. al¬

ternatus, B. atrox, B. cotiara, B. erythromelas e B. jararaca apresenta¬

ram um perfil eletroforefico semelhante, com as bandas majoritárias

localizadas entre 20 — 30 kDa e 45 — 60 kDa, enquanto os venenos

de B. jararacussu, B. moojeni, B. neuwiedi e B. pradoi apresentaram

as bandas majoritárias localizadas entre 10 e 40 kDa. 0 veneno de L.

m. muta apresenta um perfil eletroforético bastante complexo, com ban¬

das predominantemente na região de 30 kDa. Os venenos de C. d. ter¬

rificus e de C. d. collineatus apresentaram padrões muito semelhantes.

0 veneno de M. frontalis apresentou um padrão mais complexo que

o de M. corallinus possuindo um grupo de bandas na região de 20 a

30 kDa. Através desse método, foi possível estabelecer diferenças no

perfil eletroforético dos venenos, o que pode auxiliar a classificação sis¬

temática das serpentes.

UNITERMOS: Venenos, serpentes, eletroforese.

Laboratório de Imunopatologia Instituto Butantan — São Paulo — Av. Vital Brasil, 1.500 — 05503-900 — São

Paulo, SP — Brasil

Recebido para publicação em 17.10.91 e aceito em 30.3.92.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

MOURA DA SILVA, A.M. Caracterização de venenos de serpentes por eletroforese em poliacrilami-

da. Boi. Biotecnol., v. 3, p. 3-7, 1992.

INTRODUÇÃO

Venenos de serpentes constituem-se em um conjunto complexo de proteínas

com diferentes atividades farmacológicas. A análise de proteínas por eletrofore¬

se em gel de gradiente de poliacrilamida permite a separação dos componentes

revelando um perfil eletroforético com bandas de coloração e migração relativa

altamente reprodutíveis. Dessa forma, passamos a investigar a possibilidade da

utilização da eletroforese em gel de gradiente de poliacrilamida, na presença de

SDS (SDS-PAGE), para a análise de amostras de veneno de serpentes de dife¬

rentes espécies. Esta análise dos venenos poderia auxiliar a classificação siste¬

mática das serpentes venenosas, assim como auxiliar na identificação de venenos

ofídicos.

Foram utilizados os venenos dessecados de B alternatus, B. atrox, B. cotiara,

B. erythromelas, B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni, B. neuwiedi, B. pradoi,

C. d. terrificus, C. d. collineatus, L. m. muta, M. frontalis e M. corallinus, prove¬

nientes da extração de vários exemplares de cada espécie. Soluções-estoque dos

venenos foram preparadas em salina, na concentração de 10 mg/ml. Após cen¬

trifugação por 5 minutos a 10.000 g, os sobrenadantes foram aliquotados e es¬

tocados à temperatura de -70°-C. No momento da utilização, as soluções foram

diluídas para a concentração de 1 mg/ml e a concentração protéica aferida por

leitura da absorbância a 280 nm. As soluções de venenos foram submetidas a

eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de SDS 3 , em condições não

redutoras. Para este fim, os venenos foram diluídos em um mesmo volume de

tampão de amostra (Tris/HCI 125 mM, pH 6,8, contendo 2,5% de SDS (dodecil

sulfato de sódio), 10% de glicerol, 0,05% de azul de bromofenol, 1 mM de PMSF

(fluoreto de fenilmetilsulfonila), 1 mM de TLCK (N-alfa-p-tosil-L-lisil-clorometil-

cetona) e 10 mM de EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético) e mantidas em

banho-maria fervente por 3 minutos. Amostras de cada veneno contendo 50ug

de proteína foram então aplicadas em um gel de empacotamento de 3 cm na

concentração de 4% de poliacrilamida e gel de resolução de 9 cm na concentra¬

ção de 8 a 18% de poliacrilamida e submetidas a eletroforese com corrente cons¬

tante de 25 mA, em tampão Tris/glicina pH 8,3 contendo 1% de SDS. Os géis

foram corados com negro de amido 0,1 % em 40% de metanol e 10% de ácido

acético e o excesso do corante removido com uma solução de etanol 40% e

ácido acético 7%. O peso molecular aparente das bandas foi calculado com ba¬

se na migração dos seguintes padrões de peso molecular: IgG de camundongo

(150 kDa), albumina sérica bovina (68 kDa), ovalbumina (43 kDa), tripsinogênio

(24 kDa) e lisozima (14 kDa), também em condições não redutoras.

Os perfis eletroforéticos obtidos após o fracionamento dos venenos de Both-

rops encontram-se na Figura 1. Os venenos de B. alternatus, B. atrox, B. cotiara,

B. erythromelas e B. jararaca apresentaram um perfil eletroforético semelhante,

com as bandas majoritárias localizadas nas faixas de peso molecular entre’20

— 30 kDa e 45 — 60 kDa. Por outro lado, os venenos de B. jararacussu, B. moo¬

jeni, B. neuwiedi e B. pradoi apresentaram também um perfil eletroforético se¬

melhante, porém mais complexo, com as bandas majoritárias localizadas entre

10 e 40 kDa, paralelamente a outras bandas distribuídas por todo o gel. Como

características particulares desses venenos, podemos acresentar: B. alternatus .

— uma banda forte de 35 kDa; B. atrox — duas bandas fracas de 31 e 38 kDa;

B. cotiara — uma banda forte de.34 kDa, outra de 65 kDa e a ausência de ban¬

das de peso molecular próximo a 15 kDa; B. erythromelas — uma banda forte

e isolada na região de 15 kDa e duas bandas fortes na região de 60 kDa; B. jara¬

raca — uma banda forte de 20 kDa; B. moojeni — pequena quantidade de ban-

MOURA DA SILVA, A.M. Caracterização de venenos de serpentes por eletroforese em poliacrilami-

da. Boi. Biotecnol., v. 3, p. 3—7, 1992.

das acima de 40 kDa e 4 bandas na região de 15 kDa; B. neuwiedi — apenas

uma banda na região de 15 k Da; os venenos de B. jararacussu e B. pradoi apre¬

sentaram perfis muito semelhantes podendo ser distintos apenas pela intensida¬

de relativa da coloração das bandas.

Na Figura 2 temos os perfis eletroforéticos dos venenos de L. m. muta, C.

d. terrificus, C. d. collineatus, M. frontalis e M. corallinus. O veneno de L. m.

muta apresenta um perfil eletroforético bastante complexo, com bandas predo¬

minantemente na região de 30 kDa. Uma característica peculiar desse veneno

é a presença de uma banda difusa de baixo peso molecular (8 kDa). Os venenos

de C.d. terrificus e de C. d. collineatus apresentaram padrões muito semelhan¬

tes, com variações apenas quanto a intensidade de coloração de algumas ban¬

das minoritárias, não sendo possível a distinção dos mesmos por este método.

A banda principal desses venenos apresenta um peso molecular aparente de

16kDa. Os venenos de Micrurus possuem um perfil eletroforético mais simples,

com poucas bandas distribuídas por todo o gel e uma banda majoritária de 48

kDa. O veneno de M. frontalis apresentou um padrão mais complexo que o de

M. corallinus possuindo um grupo de bandas na região de 20 a 30 kDa. Alguns

venenos de Bothrops, Crotalus e Lachesis, provenientes de extrações mais anti¬

gas, foram testados por esse método, reproduzindo perfis eletroforéticos muito

semelhantes aos aqui apresentados, com variação apenas na intensidade da co¬

loração de algumas bandas (não mostrado).

Através desse método, foi possível estabelecer diferenças no perfil eletroforé¬

tico dos venenos. Entretanto, é importante a utilização de gel de gradiente de

poliacrilamida. Em gel de concentração fixa, as bandas de peso molecular próxi¬

mo a 15 kDa. apresentam-se como um bloco, e é esta a localização onde ocorre

o maior número de diferenças nas bandas.

Por outro lado, já foi demonstrada a variação quantitativa de componentes de

venenos de uma mesma espécie segundo a localização geográfica 2 - 4 ou a idade 1

dos animais. Estas variações podem refletir em alterações do perfil eletroforéti¬

co, as quais não foram analisadas neste trabalho. Entretanto, a utilização do mé¬

todo para a análise de venenos provenientes da extração de vários exemplares

de uma mesma espécie nos parece válida, uma vez que essas variações quanti¬

tativas seriam compensadas, resultando em perfis eletroforéticos com diferen¬

ças apenas na intensidade de coloração de algumas bandas.

ABSTRACT : Venoms of Bothrops alternatus, Bothrops atrox, Bothrops

cotiara, Bothrops erythromelas, Bothrops jararaca, Bothrops jararacus¬

su, Bothrops moojeni, Bothrops neuwiedi, Bothrops pradoi, Crotalus

durissus terrificus, Crotalus durissus collineatus, Lachesis muta muta,

Micrurus frontalis and Micrurus corallinus, were fraccionated by gra-

dient polyacrylamide gel electrophoresis with SDS and stained by

Coomassie blue. Electrophoresis of these venoms showed that B. al¬

ternatus, B. atrox, B. cotiara, B. erythromelas and B. jararaca venoms

have a similar pattern, with the major bands located between 20 — 30

kDa and 45 — 60 kDa. Venoms of B. jararacussu, B. moojeni, B. neu¬

wiedi and B. pradoi showed the major bands between 10 and 40 kDa.

L. m. muta venom showed a complex electrophoretic pattern, with the

major bands close to 30 kDa. Venoms of C. d. terrificus and C. d. col¬

lineatus possessed very similar pattems while M. frontalis venom showed

a more complex pattern than M. corallinus venom, with many bands

between 20 and 30 kDa. Using this approach, it is possible to detect

differences in the electrophoretic pattern of venoms from different spe-

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MOURA DA SILVA, A.M. Caracterização de venenos de serpentes por eleroforese em poliacrilamida.

Boi. Biotecnol., v. 3, p. 3—7, 1992.

cies of snakes. This observations may help in the current methods used

for snake classification.

KEYWORDS: Venoms, snakes, electrophoresis.

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da. Boi. Biotecnol., v. 3, p. 3—7, 1992.

150-

2345 6789

Fig. 1: PERFIL ELETROFORÉTICO DOS VENENOS.

Os venenos de B. altematus (1), B. atrox (2), B. cotiara (3), B. erythromelas (4),

B. jararaca (5), B. jararacussu (6), B. moojeni (7), B. neuwiedi (8) e B. pradoi 19)

foram fracionados por SDS-PAGE e as proteínas coradas com negro de amido.

Os números à esquerda indicam a posição da migração dos marcadores de peso

molecular.

150 -

Fig. 2: PERFIL ELETROFORÉTICO DOS VENENOS.

Os venenos de L. m. muta (1), C. d. terrificus (2), C. d collineatus (3), M. frontalis

(4) e M. corallinus (5) foram fracionados por SDS-PAGE e as proteínas coradas

com negro de amido. Os números à esquerda indicam a posição da migração dos

marcadores de peso molecular.

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CONSTRUINDO UM fUTURO MELHOR

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INSTRUÇÕES AOS AUTORES

Somente serão aceitos trabalhos inéditos e que se destinem exclusívamente à revista. É proibida

a reprodução com fins lucrativos. Os artigos de revisão serão publicados a convite da Comissão

Editorial.

Os trabalhos deverão ser redigidos em português, inglês ou francês, datilografados preferencial-

mente em máquina elétrica, em espaço duplo em 3 (três) vias, em papel formato ofício e numera¬

dos no ângulo superior direito.

No preparo do original será observada, sempre que possível, a seguinte estrutura: Página de ros¬

to: titulo do artigo, nome(s) do(s) autor(es) e filiação científica. Texto: introdução, material e mé¬

todos, resultados, discussão, conclusões, agradecimentos e referência bibliográfica. Material de

referência: resumos (em português e inglês); unitermos (palavras ou expressões que identificam

o conteúdo do artigo; devem ser incluídas até um limite máximo de três, em português e inglês).

As referências bibliográficas deverão ser ordenadas alfabeticamente e numeradas.

Exemplos:

Para livros: autor, título, edição, local de publicação, editor, ano, páginas.

7. BIER, 0. Microbiologia e imunologia. 24ed. São Paulo: Melhoramentos, 1985. 1234p.

Para artigos: autor, título do artigo, título do periódico, volume, página inicial e final, ano.

8 MACHADO, J.C., SILVEIRA F?, J.F. Obtenção experimental da pancreatite hemorrágica aguda

no cão por veneno escorpiõnico. Mem. Inst. Butantan, v.40/41, p. 1-9, 1976/77.

As citações no texto devem ser por números-índices correspondentes às respectivas referências

bibliográficas.

Exemplos:

...método derivado de simplificação de armadilha de Disney 1

...segundo vários autores 2 ' 3 ' 4

As ilustrações (fotos, tabelas, gráficos etc.) deverão ser originais e acompanhadas de legendas

explicativas. As legendas serão numeradas e reunidas em folha à parte. Os desenhos deverão ser

a nanquim e as fotografias bem nítidas, trazendo no verso o nome do autor e a indicação numéri¬

ca da ordem a ser obedecida no texto. As ilustrações deverão ser organizadas de modo a permitir

sua reprodução dentro da mancha da revista (22 x 12,5cm).

Os artigos deverão conter no máximo 6 (seis) ilustrações (branco e preto). De cada trabalho serão

impressas 30 (trinta) separatas, sendo 10 para a Biblioteca do Instituto e 20 para os autores.

Os textos originais não serão devolvidos e os originais das ilustrações estarão à disposição dos

autores.

INSTRUCTIONS TO AUTHORS

1. Manuscripts submitted to the Editorial Board should be unpublished texts and should not be un-

der consideration for publication elsewhere. Reproduction for commercial purposes is not allo-

wed. The Editorial Board will plan lhe publication of revision articles,

2. The original and two copies of papers should be typewritten in Portuguese, English or French, double

spaced, on typing paper (31 x 21cm). Pages should be numbered consecutively at the upper right

corner.

3. The following structure should be considered in the preparation of the manuscript: Title page:

with article title, name of author(s), professional address. Text: with introduction, material and me-

thods, results, discussion, conclusions, acknowledgments, references, abstracts (in Portuguese

and English), and keywords. A maximal number of 03 keywords should be included in Portuguese

and English.

4. References in alphabetical order should be numbered consecutively.

Examples:

Books

7. BIER, 0. Microbiologia e imunologia. 24.ed. São Paulo: Melhoramentos, 1985. 1234p.

Articles

8. MACHADO,J.C., SILVEIRA F°, J.F. Obtenção experimental da pancreatite hemorrágica aguda

no cão por veneno escorpiõnico. Mem. Inst. Butantan, v.40/41, p. 1-9, 1976/77.

Citations in the text should be ídentified by the reference number.

Examples:

...método derivado de simplificação de armadilha de Disney 1

...segundo vários autores 2 ' 3 ' 4

5. Illustrations (photographs, tables, figures etc.) should be the originais and legends should be sub¬

mitted typewritten on a separate sheet. Line-drawings should be with China ink and photographs

rnust be of top quality. On the back of each figure of photograph the name of the author(s) should

be líghtly written and the number indicating the sequence in the text. Illustrations should fit in

a page measuring 22 x 12,5crn.

6. No rnore than 6 illustrations will be accepted and photographs should be black and white. Thirty

reprints of each article are provided without charge, and 10 will be kept at the iibrary.

7. Submitted manuscripts will not be returned to the author(s) but the original illustrations are availa-

ble to author(s) by request.

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