As "MEMÓRIAS DO INSTITUTO BUTANTAN" têm por finalidade a apresentação

de trabalhos originais que contribuam para o progresso nos campos das Ciências Bio¬

lógicas, Médicas e Químicas, elaborados por especialistas nacionais e estrangeiros.

São publicadas sob a orientação da Comissão Editorial, sendo que os conceitos

emitidos são de inteira responsabilidade dos autores.

The "MEMÓRIAS DO INSTITUTO BUTANTAN" are the vehicle of comunication

for original papers written by national and foreign specialists who contribute to the

progress oF Biological, Medicai and Chemical Sciences.

They are published under lhe direction of the Editorial Board which assumes no

responsability for staternents and opinions advanced by contributors.

Diretor do Instituto Butantan

Dr. Isaias Raw

Comissão Editorial

Henrique Moisés Canter — Presidente

Ivan Mota — Membros

Tetsuo Yamani

Maria Nazareth Rabello-Gay

Luciana Cezar do C. Leite

Renata Lara Paes de Barros — Bibliotecária

Indexado/Indexed: Biosis Data Base, Current Contents, Index Medicus.

Periodicidade: iriegular

Permuta/Excfiange: são feitas entre entidades governamentais, com publicações con¬

gêneres, mediante consulta prévia. Exchanges with similar publications can bo set-

tled wilti acadernic and governrnental institutions thiough prior mutual arjreement.

Endufoço/Addross. Instituto Butantan Biblioteca. Av. Vital Brasil, 1.500

05503 -- 900 — São Paulo, Sf^ —■ Brasil

Telefone/Telephone: (01 1) 813-7222 - R. 2129 - Telex; (011) 83325 BUTA-BR

Telelax: (011) 815-1505

1 SciELO

Governo do Estado de São Paulo

Secretaria de Estado da Saúde

Coordenação dos Institutos de Pesquisa

Instituto Butantan — São Paulo — SP — Brasil

MEMÓRIAS

INSTITUTO BUTANTAN

Volume 55, número 1, 1993

São Paulo, SP — Brasil

1993

1 1 SciELO

MEMÓRIAS do INSTITUTO BUTANTAN.

(Secretaria de Estado da Saúde)

São Paulo, SP — Brasil, 1918 —

1990, 52 (1—3, supl.)

Em apenso, a partir de 1990, 52(3): BOLETIM DE BIOTECNOLOGIA

1991, 53(1, Supl. 1,2)

1992, 54 (1,2)

1993, 55(1,

ISSN 0073-9901

MIBUAH

CDD 614.07205

Solicita-se permuta/Exchange desired

Mem. Inst. Butantan

V. 55, n. 1, 1993

SUMÁRIO/CONTENTS

The envenomation by Tityus serrulatus scorpion venom in the rat: age and sex

influence.

Efeitos do veneno do escorpião Tityus serrulatus: influência do sexo e da idade.

Maria Regina L. SANDOVAL, Valquiria A.C. DORCE .

Influencia de la temperatura sobre la digestion en Crotalus durissus terrificus

(Serpentes: Viperidae; Crotalinae).

Influence of temperatura on digestion in Crotalus durissus terrificus (Serpen¬

tes: Viperidae: Crotalinae).

Flavio FRANCINI, Carlos S. GRISOLIA, Nestor O. STANCHI, Fabio O.

Epidemiologia do acidente por aranhas do gênero Loxoscetes (Fleinecken & Lo-

we) no estado do Paraná (Brasil).

Accidents by spiders of the genus Loxosceles (Fleinecken & Lowe) in the Para¬

ná State, Brazil: epidemologic data.

Lindioneza A. RIBEIRO, Vera Regina D. von EICKSTEDT, Gisélia B.G. RU-

BIO, José F. KNOLSAISEN, Zuhrer HANDAR, Marlene ENTRES, Vera A.

Fischer Pires de CAMPOS, Miguel Tanús JORGE.

Diagnosis and treatment of acariasis in mice.

Diagnóstico e tratamento de acaríase em camundongos.

Fernando SOGORB S., Sueli Blanes DAMY, Ana Paula ROCHA DA SIL¬

VA, Ubimara Pereira RODRIGUES, Luziani CHAGURI.

Ovarian cycle of the snake Bothrops jararaca

Ciclo ovariano de serpentes Bothrops Jararaca.

Thélia R.F JANEIRO-CINOUINI, Frederico F. LEINZ, Eduardo C. FARIAS

2 3

5 6

11 12 13 14 15

BOLETIM DE BIOTECNOLOGIA

Otimização do processo de purificação industrial de toxoide tetânico por gel

filtração.

Improvement in the industrial purification of tetanus toxoid by gel filtration.

Sally M.A. PRADO, Mary D.C. VANCETTO, José M, de OLIVEIRA, Fer¬

nando FRATELLI, Sandra de J.D. MATHIAS, Hisako G. HIGASHI ... 3

Esquema de hiperimunização eqüina mais conveniente à produção de plasma

antiveneno Botrópico-Crotálico.

A more suitable equine hyperimmunization schedule for antivenom Bothrops-

-Crotalus plasma production.

Celso R CARICATI, Rosalvo GUIDOLIN, Ivone K. YAMAGUSHI, Josefina

F. MORAIS, Wilmar DIAS DA SILVA, Hisako G. HIGASHI . 9

BHK cellgrowth on microcarriers in a bioreactor.

Crescimento de células BHK em microcarregadores utilizando bioreactores.

Ronaldo Z. MENDONÇA, Carlos A. PEREIRA . 13

1 SciELO

Mem. Inst. Butantan

V. 55, n. 1, p. 5-10, 1993.

THE ENVENOMATION BY TITYUS SERRULATUS SCORPION

VENOM IN THE RAT: AGE AND SEX INFLUENCE

Maria Regina L. SANDOVAL

Valquiria A.C. DORCE

ABSTRACT: This study was designed in order to investigate possible differ-

ences between the LD50 values obtained in adult and new-ablactate

male rats and the influence of sex on the development of the lung ede¬

ma induced by Tityus serrulatus scorpion whole venom. The scorpion

venom LD50 (by intravenous route) obtained in adult and new-ablactate

male rats were similar. Intravenous injection of scorpion whole venom,

in both male or female rats, aiso induced a similar lung edema whereas

rats ovariectomized and treated with estrogen developed a more severe

edema. It is suggested that estrogen treatment may facilitate the lung

edema development.

KEYWORDS: Scorpion venom, lung edema, LD50 in rats, ovariectomy.

INTRODUCTION

The scorpion Tityus serrulatus posses a powerfui venom which may cause, in

human aduits, a very painfui response with more or less noticeable systemic ef-

fects of transient character. Even in these cases there may not exist serious danger

of death, uniess the victim is a very tiny child®.

Intravenous injection of scorpion whole venom or of scorpion purified toxin

(tityustoxin) in rats causes lung edema This effect is due, at least in part, to

severe cardiovascular elterations and to the release of catecholamines and kinins,

that increase the pulmonary vascular permeability^-’'®. Irregular and deep respi-

Laboratório de Farmacologia, Instituto Butantan, Sâo Paulo, Brasil.

Research supported by CNPq

Correspondence: Dra. M.R.L Sandoval, Serviço de Farmacologia, Instituto Butantan. Av. Vital Brasil, 1.500 —

CEP 05503-900, São Paulo, SP-Brasil.

Recebido para publicação em 28.01.92 e aceito em 01.12.92.

2 3

5 6

11 12 13 14 15

SANDOVAL, M.R.L., DORCE, V.A.C. The evenomation by Tityus serrulatus scorpion venom in the rat:

age and sex influence. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.l, p. 5-10, 1993.

ration, increase of bronchial secretion and tachypnea are among the more fre-

quent symptoms of the poisoning ^ Apnea is one of the more frequent causes

of death®.

Azevedo et al^ observed that the pulmonary edema induced by tityustoxin (1.0

mg/kg) is more severe in female than in male rats; all rats that died due to the

toxin effects were female and showed hemorragic lung edema.

The present study was designed: (a) to observe the changes in the lung ede¬

ma caused by scorpion whole venom in male rats and in normal or ovariectomized

female rats treated or not with estrogen or progesterone; (b) to determine if young

rats are more susceptible to the venom lethal effects.

MATERIAL AND METHODS

Genetically similar adult Wistar female and male rats (180-250g, 2 or 3 months

old) and nevyly-ablactated male rats were used. Upon their arrival in the laborato-

ry (5 days before the beginning of the experiments), the rats were grouped, 5 per

plastic cage (40x34x17 cm) with free access to food and water.

The following substances were used: 17- beta- estradiol (Benzoginoestril-

SARSA), progesterone (Depo-Provera — Upjon) and peanut oil. The lyophilized

Tityus serrulatus scorpion venom from the Instituto Butantan, São Paulo, Brazil,

was stored at -20'’C and dissolved in 0.9% NaCI, in the concentration of 6.0

mg/ml. Solutions used in the experiments were diluted immediately before the

injection in the tail vein.

7. Influence of age on the lethallty induced by scorpion whole venom.

Venom dose-response curves were constructed for new-ablactate and adult

male rats. Different doses of venom were injected intravenousiy to six rats of each

group. As control, six adult or new-ablactate rats of each group received NaCI

0.9% (1 ml/kg, i.v). The animais were observed for 24 hr. The number of animais

that died was recorded. The method proposed by Litchfield and Wilcoxon^%as

used to construct dose-response curves, to determine the dose causing death

in 50% of the animais used (LD50) and to test for parallelism between the curves

obtained.

2. Influence of sex on the scorpion venom-induced lung edema.

Sixty female rats were ovariectomized at 55-60 days of age: rats were anesthe-

tized with pentobarbital plus ether; an incision of 1 cm was performed bilaterally

in the dorsal region of the animal body, dose to the last rib and the ovaries were

removed. Starting twenty-one days after surgery, the rats were divided into three

groups that were treated once a day for 5 days with 17-beta-estradiol (0.25

mg/day), progesterone (1.0 mg/day) or peanut oil (0.2 ml/day) subcutaneousiy.

In the morning of the 6th day each group was divided at random in two subgroups

which received intravenousiy 0.9% NaCI or 0.4 mg/kg of scorpion venom.

One group of 10 normal female rats received 0.4 mg/kg of scorpion venom

and another group of 11 normal female rats received 0.9% NaCI solution. And

finally, one group of 10 male rats received 0.4 mg/kg of scorpion venom and

another group of 9 males received 0.9% NaCI solution.

Sixty minutes after the injection of scorpion venom or 0.9% NaCI solution (con¬

trol groups), the rats were anesthetized with ether and exsanguinated. The lungs

were removed free from the trachea and weighed. The severity of the pulmonary

edema was estimated through the lung/body Index which was calculated by mul-

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

SANDOVAL, M.R.L., DORCE, V.A.C. The evenomation by Tityus serrulatus scorpion venom in the rat:

age and sex influence. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.l, p. 5-10, 1993.

tiplying the lung weight by 100 and dividing the result by the body weight^. The

data obtained were subjected to the ANOVA analyses of variance followed by Dun-

can's test. Significant differences were considered at the levei of p < 0,05.

RESULTS

7. Influence of the age on the lethality induced by scorpion whole venom.

The Table 1 shows the LD50 values obtained in the new-ablactate (0,63 mg/kg)

and in the aduits (0.56 mg/kg) rats. It was not observed a significant difference

between both values.

Few seconds after the i.v. administration of different doses of venom, the rats

started to show the symptoms of envenomation; excessive lacrimal and salivary

secretions, tremors, locomotion difficulty, cyanosis, prolonged periods of apnea,

muscular spasms, convulsions, and death. The appearance of symptoms was dose

dependent.

TABLE 1

Determination of the LD50^ of the scorpion whole venom in new-ablactate or

adult male rats (i.v., 24 h observation).

Group of rats

LD50

(mg/kg)

Slope^

LD50 ratio

New-ablactates

0.63

(0.48-0.82)

1.42

(1.00-2.02)

1.125

Aduits

0.56

(0.37-0.87)

1.78

(0.86-3.67)

1 — dose causing death in 50% of the rats used. 95% confidence limits in

parenthesis.

2 — Slopes of the dose-response curves.

2. Influence of sex on the scorpion venom-induced lung edema.

As may be seen in Table 2, scorpion venom (0.4 mg/kg) induced a similar pul-

monary edema into normal male and female rats (p > 0.05). The group of ovahec-

tomized rats treated with vehicle and injected with scorpion venom did not differ

from that of ovariectomized rats treated with vehicle and injected with 0.9% NaCl

(p < 0.05). Table 2 aiso shows that the ovariectomized rats treated with progester-

one did not present lung edema after the injection of scorpion venom (0.4 mg/kg).

However, the administration of the same dose of scorpion venom to estrogen treat¬

ed ovariectomized rats induced pulmonary edema (p < 0.05) that was more in-

tense than that observed in male, ovariectomized and normal female rats (p <

0.05, Table 2). Actually, 26.5 per cent of the ovariectomized rats treated with venom

(plus vehicle, estrogen or progesterone) died between 10-24 minutes after ven¬

om injection i.e. before the sacrifice time. However, it was not possible to estab-

lish a correlatipn between the severity of the lung edema and the period after which

death occurred.

1 SciELO

SANDOVAL, M.R.L., DORCE, V.A.C. The evenomation by Tityus serrulatus scorpion venom in the rat:

age and sex influence. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.1, p. 5-10, 1993.

TABLE 2

Lung/body index measured after the i.v. injection of scorpion whole venom

(0.4 mg/kg) in normal male and female rats or ovariectomized rats treated

during 5 days with vehicle (peanut oil, 0.2 ml/day), estrogen (0.25 mg/day)

or progesterone (1.0 mg/day).

Experimental

conditions

Number

of rats

Lung/body

index (mean ± SEM)

Normal male rats

0.9% NaCI

0.47

0,02

scorpion venom

0.64

0.05‘

Normal female rats

0.9% NaCI

0.47

0.01

scorpion venom

0,61

0.03*

Ovariectomized rats

vehicle -l- 0.9% NaCI

0.56

0.01

vehicle -t- scorpion venom

0.61

0.02

estrogen + 0.9% NaCI

0.56

0.02

estrogen -i- scorpion venom

0.77

0.05*«

progesterone + 0.9% NaCI

0.55

0.02

progesterone -E scorpion venom

0.57

0.02

significantiy different from its respective control group (p < 0.05, ANOVA

and Duncan's test).

significantiy different from male, ovariectomized and normal female groüps

treated with scorpion venom (p < 0.05, ANOVA and Duncan's test).

DISCUSSION

When inoculated by subcuteneous, intraperitoneal or intravenous route the scor¬

pion venom is rapidly absorved. Thus, the signs and symptoms of the envenom-

ation are rapidly Consolidated, However, the concentration needed for obtainning

the same effects by the three routes are sensibly different. For this reason the

venom LD50 was determined by the intravenous route since a smaller quantity

of venom was necessary to cause death.

It is known that the venom quantity that the scorpion T. serrulatus can inocu-

late in their victims is small. In this way, BucherI ^ reported the extraction of a

maximum of 4 mg of venom per escorpion through eíectric shock. It is belived

that this is the reason for the benignity the accidents in aduits. As the values of

the LD50 obtained in adult male and in new-ablactate rats did not show differ-

ences, it seems that the major severity observed of the accidents in children is

really induced by the greater quantity of venom inoculated per kilo of weight.

AIso relevant are the effects on the animal respiratory apparatus. Thus, it has

been reported that injection of scorpion whole venom^iAM tityustoxln^ induced

lung edema. The present study showed that the lung edema obtained in normal

male and female rats, Injected with T. serrulatus scorpion venom (0.4 mg/kg i.

V.) was similar. These data are in opposition to the observations of Azevedo et

al The use of a purified toxin, tityustoxin, and/or the estrus cycle phase of the

normal females involved in the study could be responsible for this discrepancy.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

SANDOVAL, M.R.L., DORCE, V.A.C. The evenomation by Tityus serrulatus scorpion venom in the rat:

age and sex influence. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.1, p. 5-10, 1993.

The presence of lung edema induced by scorpion venom was observed after

the estrogen replacement in ovariectomized rats. This edema was more intense

than the one devoloped by normal or ovariectomized femele and male rats.

It has been aiso showm that scorpion venom administration causes an

hemodynamic effect characterized by an abrupt and dramatic rise of systemic ar¬

terial pressure (afterload) due to the release of catecholamines with stimulation

of alpha adrenergic receptors; this effect plays an important role in the pathogen-

esis of acute pulmonary edema®. This acute arterial hypertension would evoke

a left ventricular failure and pulmonary edema®. A relative and temporary my-

ocardial hypoxia caused by catecholamines released by the venom toxins could

aIso play a role in the ventricular failurek2,

Another factor contributing to the genesis of the pulmonary edema would be

an increase in the blood venous return. This would induce an increase in preload

leading to pulmonary congestion®.

The effect of estrogens inducing retention of sait and water^® associated with

the scorpion venom effect could explain the potentiation of the lung edema ob¬

served in estrogen treated ovariectomized rats. Thus, estrogen induced hydric reten¬

tion could contribute to a ventricular overloading, causing a potentiation of the

lung edema.

In conclusion, the resuits of the present work show that age does not alter the

LD 50 of the scorpion venom in rats but they point to the fact that estrogen can

potentiate venom effects, so female rats in estrus phase appear to be more sus-

ceptible to the venom. Therefore, it seems worthwhile to proceed the study of

the scorpion envenomation of rats in the different phases of the physiological es¬

trus cycle.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors are indebted to Professora Zuleika P. Picarelli for her comments

on the manuscript. This work was supported by grants from CNPq (Conselho Na¬

cional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico).

RESUMO: Este trabalho teve por objetivo determinar se há diferença entre

as DL50 do veneno bruto do escorpião T. serrulatus obtidas em ratos

machos adultos e recém-desmamados e se há influência do sexo no

desenvolvimento do edema pulmonar induzido pelo mesmo veneno. As

DL50 obtidas para ratos machos adultos e recém-desmamados foram

similares. A injeção endovenosa do veneno induziu edema pulmonar

semelhante em ratos machos e fêmeas normais, enquanto ratas ovariec-

tomizadas e tratadas com estrógeno desenvolveram um edema pulmo¬

nar mais intenso. Os dados sugerem que o tratamento com estrógeno

pode facilitar o desenvolvimento do edema pulmonar.

UNITERMOS; Veneno de escorpião, edema pulmonar, DL50 em ratos,

ovariectomia.

REFERENCES

1. ALMEIDA, H.O., LIMA, E.G., FREIRE-MAIA, L. Mechanism of the acute pul¬

monary edema induced by intracerebroventricular injection of scorpion tox-

in (tityustoxin) in the unanesthetized rat. Toxicon, v. 74, p. 435-440, 1976.

2 3

5 6

11 12 13 14 15

SANDOVAL, M.R.L., DORCE, V.A.C. The evenomation by Tityus serrulatus scorpion venom in the rat:

age and sex jnfluence. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.1, p. 5-10, 1993.

2. AZEVEDO, A.D., SILVA, A.B., CUNHA-MELO, J.R., FREIRE-MAIA, L. Cardi¬

ovascular and respiratory effects induced by a purified scorpion toxin

(tityustoxin) in unanesthetized rats. Toxicon, v. 27, p. 753-759, 1983.

3. BERTKE, E.M., ATKINS, J.H. Effects of Centruroides scuipturatus venom

upon rattissue: a histopathologic study. Toxicon, v. 2, p. 205-209, 1964.

4. BUCHERL, W. Escorpionismo no Brasil. Mem. Inst. Butantan, v. 34, p. 9-24,

1969.

5. _ . Venomes of Titynae. In: BETTINI, S., ed. Arthropods venoms.

Berlin: Springer — Verlag, 1978. v. 74., p. 371-394.

6. _Classification, biology and venom extraction of scorpions. In:

BUCHERL, W., BUCKLEY, E., ed. Venomous animais and their venoms.

New York: Academic Press, 1978. v. 3, p. 317-347.

7. FREIRE-MAIA, L., CAMPOS, J.A. On the treatment of the cardiovascular

manifestations of scorpion envenomation. Toxicon, v. 25, p. 125-130,

1987.

8. __Patophysiology and treatment of scorpion poisoning. In: OWN-

BY, C.L., ODELL, G.V., ed. Natural toxins. Oxford: Pergamon Press, 1989.

p. 139-159.

9. FREIRE-MAIA, L., ALMEIDA, H.O., CUNHA-MELO, J.R., AZEVEDO, A.D.,

BARROSO, J. Mechanism of the pulmonary edema induced by intravenous

injection of scorpion toxin in the rat. Agents Action, v. 8, p. 113-118,

1978.

10. GUERON, M., OVSYSHCHER, I. What is the treatment for the cardiovascu¬

lar manifestations of scorpion envenomation? Toxicon, v. 25, p. 121-124,

1987.

11. LITCHFIELD, J.T., WILCOXON, F. A simplified method of evaluating dose-

effect experiments. J. Pharmacol. exp. Ther., v. 96, p. 99-113, 1949

12. MAGALHÃES, D. Escorpionismo. III. An. Fac. Med. B. Horizonte, v. 4, p.

1-84, 1935.

13. MURAD, F., HAYNES-JR., R.C. Estrogen and progestins. In: GILMAN, A.G.,

GOODMAN, L.S., RALL, T.W., MURAD, F., ed. Thepharmacologicalbasis

of therapeutics. New York: MacMillan, 1985. p. 1412-1439.

14. ROSSI, M.A., FERREIRA, A.L., PAIVA, S.M. Fine structures of pulmonary

changes induced by Brazilian scorpion venom. Arch. Pathol., v. 97, p.

284-288, 1974.

Mem. Inst. Butantan

V. 55, n. 1, p, 11-17, 1993.

INFLUÊNCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA DIGESTIÓN

EN CROTALUS DURISSUS TERRIFICUS (SERPENTES:

VIPERIDAE: CROTALINAE)

Flavio FRANCINI

Carlos S. GRISOLIA

Nestor O. STANCHI

Fábio O. PELUSO *

RESUMEN; se analizó para Crotalus durissus terrificus la duración de

la digestión bajo distintas temperaturas (25°C y 30°C). Para ei lote a

30°C, el tratamiento dei alimento hasta la deposición fue un 51% más

rápido que para el iote a 25°C (15 dias contra 24 en valores promedio).

A la temperatura más alta la frecuencia con que depusieron los anima-

les, fue un 50% mayor que en los de temperatura baja. A menor tem¬

peratura, la tendencia a acumular excretas de diferentes ingestas

(episodios alimentarios) en la misma deposición, fue mayor. A 25°C,

el 67% de los restos en la deposición correspondieron a una y dos in¬

gestas distintas; el 23% restante acumuló tres, cuatro y cinco ingestas.

Por otro lado, a 30°C, el 97% de las deposiciones correspondieron a

una y dos ingestas, siendo el 3% restante sólo para tres ingestas. No

se hallaron diferencias estadisticamente significativas, en cuanto al efecto

de la temperatura sobre la digestión, entre los sexos, peso de los ejem-

plares ni a diferentes edades de los mismos. Tampoco se comprobó in¬

cidência de la frecuencia de alimentación que pudiera actuar

conjuntamente con la temperatura en la variación de la velocidad de

digestión. Se analizó y comparó la aparición de diferentes restos óseos

y faneras en las deposiciones en ambos lotes.

PALABRAS CLAVE: Crotalus, digestión, temperatura, cautiverio

• Laboratorio y Museo de Animales Venenosos de la Facultad de Ciências Médicas de la

Universidad Nacional de La Plata.

Calles 60 y 120 La Plata (19001 — Argentina.

Recebido para publicação em 30.3.92 e aceito em 28.12.92.

2 3

5 6

11 12 13 14 15

FRANCINI, R, GRISOLIA, C.S., STANCHI, N.O., PELUSO, RO. Influencia de la temperatura sobre la

digestion en Crotalus durissus terrificus (Serpentes: Viperidae: Crotalinae). Mem. Inst. Butantan,

V. 55, n. 1, p. 11-17, 1993.

INTRODUCCION

Numerosos trabajos apuntalan la idea que, de los factores externos que afec-

tam el proceso de digestión en animales poiquilotermos, la temperatura ambien¬

te es el que tiene una influencia decisiva sobre el mismo (Para peces''^'''®;

anfibios'®'^®; tortugas®; ofidios^® y saurios^^.

En el caso de los reptiles, y en particular de los ofidios, la fisiologia digestiva

se halla enmarcada en tomas de alimento volumetricamente importantes en rela-

ción al peso dei animal y a intervalos irregulares, muchas veces con largos perío¬

dos de ayuno entre ingestas. A éstas sigue una respuesta termofílica de búsqueda

de un óptimo de temperatura para la digestión, comportamiento demostrado en

tortugas®, lagartos'''®, cocodrilos^ y ofidios®'"'''^'''®'''®'20'2i.22,24,25

La velocidad de digestión aumenta al aumentar la temperatura, posiblemente

en correspondência con un aumento de la secreción gástrica2'i'^'26.27

Temperaturas extremas, menores de 5°C y mayores de 35°C, afectan de mo¬

do importante el proceso digestivo y pueden resultar limitantes para la supervi-

vencia de los ofidios 2 °' 26 _ máxime cuando se consideran condiciones de

cautividad donde la actividad termofilica se ve limitada por las dimensiones dei

habitáculo. En nuestro caso se testeó la variación de la duración de la digestión

en función de la temperatura dentro dei rango térmico al cual están sometidos

dos animales en nuestro laboratorio.

Más allá de las conclusiones estrictamente concernientes al aspecto fisiológi¬

co de la relación Temperatura/Velocidad de digestión, es de suma importância

para un laboratorio productor de veneno considerar estos parâmetros en función

de la disminuíción de factores de stress que pueden afectar la supervivencia de

los ofidios sometidos a extracciones periódicas.

MATERIAL Y MÉTODO

Se trabajó con un stock de 30 ejemplares de Crotalus durissus terrificus de

diferentes peso y edad durante un período de cuatro meses. El stock fue dividido

en dos lotes de 15 ejemplares cada uno, sometidos a dos temperaturas: "alta”

(x 30°C) y "baja" (x 25°C). El biõterio fue mantenido a una humedad ambiente

promedio dei 75%, e iluminado con luz natural.

Los ofidios fueron alojados en cajas individuales de 50 x 50 x 18 cm, de acríli¬

co transparente, con tapa corrediza de alambre tejido, y con un bebedoro plásti¬

co con agua en forma permanente. El piso de la caja fue cubierto con una cama

de viruta de madeira de 3 cm de alto.

Con respecto a la alimentación, una vez a la semana se les entregó a los ofi¬

dios ratones vivos (Mus musculus) de 25 gr de peso promedio.

Por ingesta se considera todo el volumen de comida consumido en el mismo

episodio alimentado. Para poder relacionar la deposición con la ingesta semanal,

se ató nacimiento de la cola de los ratones una bolita plástica de 0,5 cm de diâ¬

metro, de diferente color para cada ingesta. De este modo pudo ser reconocida

con facilidad la ingesta a que corresponde la deposición. El tiempo de digestión

se consideró como el comprendido entre la alimentación y la aparición dei mar¬

cador en las heces.

Durante el período de desarrollo dei presente trabajo no se efectuaron extrac¬

ciones de veneno ni otras actividades que pudieran ejercer un stress adicional

a la cautividad.

1 SciELO

FRANCINI, R, GRISOLIA, C.S., STANCHl, N.O., PELUSO, RO. Influencia de la temperatura sobre la

digestion en Crotalus durissus terrificus (Serpentes: Viperidae: Crotalinae), Mem. Inst. Butantan,

V. 55, n. 1, p, 11-17, 1993.

Para el análisis de los datos se emplearon los estadísticos de correlación, error

standard y análisis de varianza según Ledesma y Kohan & Carro’^.

RESULTADOS

A) DURACION DE LA DIGESTION EN FUNCION DE LA TEMPERATURA: el aná¬

lisis de la interdependencia entre la temperatura y la duración dei trânsito digesti¬

vo, arrojó una correlación negativa de 0,86 con un error standart de 0,001. Al

estudiar el efecto de la temperatura entre los lotes, se observó una diferencia es-

tadisticamente significatica ( P 0,05) en el tiempo que media entre la ingesta y

la deposición. Para el lote a 25°C, el valor en dias dei trânsito fue de 24,78 como

promedio, mientras que para el lote a 30°C, el promedio fue de 15,86 dias (Tabla

I). Relacionado con esto, cuando se analizó la frecuencia de las deposiciones en

ambos lotes, se observó que, mientras el lote de temperatura baja, habiendo in¬

gerido alimento 143 veces, depuso 62 veces (0,43 deposiciones por ingesta), el

lote de temperatura alta, habiendo ingerido 128 veces depuso 108 veces (0,84

deposiciones por ingesta) (Tabla I).

Cuando se analizaron los colores de las marcas para estudiar las frecuencias

de ingestas diferentes por deposición, para el lote de temperatura baja, el 16,32%

de las veces se hallaron bolitas de un solo color (una sola ingesta), el 51% de

las veces, bolitas de dos colores (dos ingestas), el 18,3%, tres colores, el 8,1%

cuatro colores y el 6,3% cinco colores. Para el lote de temperatura alta, el 63,7%

de las veces apareció un solo color de bolitas, el 33,3%, bolitas de dos colores

y el 3% para tres colores. No se hallaron en este lote deposiciones con cuatro

o cinco colores distintos juntos (Tabla I).

Se analizó también la duración de la digestión de cada lote en relación al sexo,

peso y edades de los ejemplares, no encontrándose diferencias estadisticamente

significativas.

B) INFLUENCIA DE LA PERIODICIDAD DE LA ALIMENTACIÓN SOBRE LA DU¬

RACIÓN DE LA DIGESTIÓN: se comparó la duración dei trânsito digestivo bajo

condiciones de ingestas periódicas cada siete dias, con la duración de la diges¬

tión por ingestas aisladas (animales alimentados una vez depuesta la ingesta an¬

terior). Para ingestas aisladas el promedio fue de 14,36 dias para el lote de altas

temperaturas y 22,8 dias para bajas. Estos valores no difieren estadisticamente

de los hallados para los lotes alimentados periodicamente.

C) INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA TOMA DE ALIMENTO Y RE-

GURGITACION: no se observó diferencia en cuanto a la cantidad de presas acep-

tadas por ingesta entre los lotes. Para ambos casos, los animales engulleron el

97% de las presas ofrecidas. A las temperaturas consideradas, no hubo casos

de regurgitación.

D) PRESENCIA DE RESTOS OSEOS EN LAS DEPOSICIONES: se analizaron ma¬

croscopicamente las deposiciones de los ejemplares pertenecientes a ambos lo¬

tes, no encontrándose diferencia de grado de digestión de los restos óseos

hallados. En las heces de cada lote, se encontraron restos óseos en gran canti¬

dad, correspondientes a distintos tipos de huesos, desde cortos (carpo, tarso, vér¬

tebras) hasta largos (femur, tibia peroné, húmero, cúbito, radio, costillas), además

de cinturas y fragmentos de craneo con mandidulas enteras con dientes en posi-

1 SciELO

FRANCINI, R, GRISOLIA, C.S., STANCHI, N.O., PELUSO, F.O. Influencia de la temperatura sobre la

digestion en Crotalus durissus terrificus (Serpentes: Viperidae: Crotalinae). Mem. Inst. Butantan,

V. 55, n. 1, p. 11-17, 1993.

ción. Los huesos presentaron distintos grados de destrucción, tanto mayor cuan-

do más fino el espesor de los mismos, como por ejemplo costilias y huesos dei

techo craneal. En las deposiciones de los dos lotes se encontraron, además, fa-

neras (pelos y unas) en gran cantidad sin signos aparentes de acción digestiva

sobre ellos.'

TABELA 1

Cuadro comparativo de la influencia de la temperatura sobre algunos

aspectos de la fisiológia digestiva en Crotalus durissus terrificus

Duración trânsito intestinal en

periodicidac

25°C

X = 24,78 dias

función de la temperatura bajo

alimentaria

30°C

X = 15,86 dias

Frecuencia deposiciones por inge

25 °C

N° ingestas N° deposiciones

143 62

(0,43 depos/ingesta)

'sta en función de la temperatura

30° C

N° ingestas N° deposiciones

128 108

(0,84 depos/ingesta)

Frecuencia aparición inges

25 °C

16,3% — 1 ingesta

51,0% - 2 "

18,3%> - 3 "

8,1% - 4 "

6,3% ~ 5 "

tas distintas por deposición

30° C

63,7% — 1 ingesta

33,3% - 2 "

3,0% - 3 "

DISCUSION

Se observó que en Crotalus durissus terrificus, la duraclón de la digestión se

encuentra en función de la temperatura. El índice de correlación marca que la

interdependencia de ambas variables es importante y se presenta en proporción

inversa; esto es, cuando aumenta la temperatura disminuye la duración dei trân¬

sito digestivo. Esto fue comprobado también para otras especies de ofidios como

Vipera Natrix sp^^’^'^ y para otros grupos de reptiles tales como

tortugas®, lagartos''®’’'^ y cocodrilos^.

Al analizar el efecto de la temperatura entre los lotes, encontramos que a 30°C

la digestión se halla un 56% acelerada con respecto a 25°C, guarismos concor¬

dantes con los referidos por Nailleau para verias especies de Vipera a estas mis-

mas temperaturas^®.

Con respecto al análisis de las deposiciones, encontramos que a medidad que

aumenta la temperatura, la frecuencia con que deponen los animales es mayor.

Así, a 25°C se hallaron 0,43 deyecciones por ingesta mientras que a 30°C, las

deyecciones por ingesta fueron 0,84, un 51% mayor a las temperaturas altas con

respecto a las bajas. Esto se determina por la cantidad de marcas de colores dife¬

rentes, indicadores de restos de ingestas distintas, en la misma deposición. A mayor

tiempo de trânsito digestivo, hay una tendencia a acumular restos de ingestas

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

FRANCINI, R, GRISOLIA, C.S., STANCHI, N.O., PELUSO, RO. Influencia de la temperatura sobre la

digestion en Crotalus durissus terrificus (Serpentes: Viperidae: Crotalinae). Mem. Inst. Butantan,

V. 55, n. 1, p. 11-17, 1993.

diferentes en la misma deposición. A temperatura baja el mayor porcentaje co¬

rresponde a dos ingestas, y con valores no despreciables de cuatro y cinco in-

gestas en la misma deyección. Para temperatura alta, la tendencia a acumular

restos de ingestas distintas es mucho menor, corroborado por el mayor porcenta¬

je que en este caso corresponde a una sola ingesta, no apareciendo nunca cua¬

tro o cinco en la misma deposición. Comparando estos valores con los bailados

por Nailleau2° para varias especies dei género Vipera, se encontró que en Cro¬

talus sp sucede exactamente lo contrario. Mientras que en Crotalus sp la relación

entre la frecuencia de las heces con la temperatura está en proporción directa,

en Vipera sp se baila en proporción inversa.

Cuando se analizó la duración de la digestión en función de la temperatura,

se lo estudió tambén bajo el efecto simultâneo de otro factor, a saber, la técnica

alimentaria. Para eso, se consideró la influencia de la temperatura bajo condicio¬

nes de ingestas aisladas para neutralizar el efecto que pueda ejercer una nueva

presa sobre el proceso digestivo en curso. Bajo esas condiciones, la duración de

la digestión para cada lote no difirió significativamente con respecto a condicio¬

nes de alimentación periódica. Esta observación contradice lo expuesto por Tbo-

mas & Pougb^s quienes referien que el tiempo de defecación está influenciado

por una variedad de factores, siendo la frecuencia de alimentación uno de ellos.

En el análisis de la influencia de la temperatura sobre la toma de alimento y

regurgitación se observó que a las temperaturas que fueron mantenidos los lotes

no se producen alteraciones dei proceso fisiológico.

Tampoco revelaron diferencias en el grado de digestión de las presas, tal el aná¬

lisis macroscópico de los excrementos. Disminución de la' aceptación de las pre¬

sas y aún la suspención de la alimentación, o el vómito dei alimento, serían

frecuentes a temperaturas más bajas (menores de 10°C) y a temperaturas más

altas (mayores de 35 °C )^°'26 qyg igg utilizadas en el marco de este trabajo.

En un serpentário con finalidad de productión de veneno, es importante estu-

diar factores que afecten procesos fisiológicos para disminuir stress e incremen¬

tar la supervivencia de los ejemplares. Conocer la duración de la digestión a

distintas temperaturas, nos permite planificar las extracciones de veneno resguar¬

dando a los animales de un pico de stress durante el transcurso de este proceso

fisiológico. En trabajos anteriores realizados apuntando a maximizar la produción

se estudió el efecto dei ayuno sobre las cantidades de veneno obtenidas, encon-

trándose una correlación positiva'*'®. Mediante la regulación de la temperatura a

la que se mantienen los animales, ese ayuno además se convierte en un modo

de esperar a que el ejemplar se encuentre fuera de actividad digestiva al momen¬

to de ser manipuleado para la extracción.

CONCLUSIONES

La temperatura influye sobre la duración de la digestión de modo que a 30°C

Crotalus durissus terrificus, digiere un 51% más rápido que a 25 °C. Por otro la¬

do se observó que a 30 °C deponen más veces con respecto a la cantidad de

ingestas que a 25°C (a 30°C el doble de veces por ingesta que a 25°C). A 25°C

bay una tendencia mayor a acumular excretas de ingestas diferentes en las beces

que a 30°C.

Del análisis de otros factores que podrían actuar concomitantemente con la

temperatura, surge que la estratégia alimentaria (ofrecer presas aisladas vs perio¬

dicamente) no tiene influencia sobre la duración dei proceso. Durante un proceso

SciELO

10 11 12 13 14

FRANCINI, R, GRISOLIA, C.S., STANCHI, N.O., PELUSO, RO. Influencia de la temperatura sobre la

digestion en Crotalus durissus terrificus (Serpentes: Viperidae: Crotalinael. Mem. Inst. Butantan,

V. 55, n. 1, p, 11-17, 1993.

digestivo en curso la adquisición de nuevo alimento no modifica la velocidad con

que tiene lugar el mismo.

En el marco dei presente trabajo, dentro dei rango térmico considerado, no ca¬

be esperar casos de regurgitación dei alimento o diferencias en el grado de di-

gestión de las presas evidenciado en las deyecciones.

El manejo de la temperatura en el serpentário productor de veneno, asociado

a la técnica de extracción de la toxina, como es el ayuno prévio sobre los anima-

les, permite garantizar una digestión completa antes de la extracción, importante

ya que los ejemplares serán sometidos a un agudo pico de stress que puede, de

otro modo, alterar el mencionado proceso fisiológico e insidir negativamente so¬

bre la supervivencia de los mismos.

ABSTRACT: The duration of digestion under various temperatures (25°C

and 30°C) was analyzed in Crotalus durissus terrificus. Treatment of the

food until deposition was 51% faster in the sample at 30°C than in the

one at 25°C (15 days against 24 in average values). At the highest tem-

perature the deposition frequency was 50% higher than at the lowest

temperatura The tendency to accumulate the excretes of the various

food intake episodes was higher at the lowest temperature, At 25°C,

67% of the residues found in the deposition corresponded to one and

two different food intake episodes. The remaining 23% accumulated

three, four and five food intake episodes. On the other hand, at 30°C,

97% of the depositions corresponded to one and two food intake epi¬

sodes, the remaining 3% being only for three food intakes, As regards

the effect of temperature on digestion, no statistically significant differ-

ences were found in relation to sex, weight or age of the animais. The

frequency of food intake did not show any effect on the rate digestion

in conjunction with temperature. The appearance of various rest of bones,

fur and nails was aiso analyzed and compared in the depositions of both

samples.

KEYWORDS: Crotalus, digestion, temperature, captivity

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. BRADSHAW, S.D., GANS, C., SAINT GIRONS, H. Behavioral thermoregulation in

a Pygopodid lizard, Lialis burtonis. Copeia, p. 738-743, 1980.

2. DIEFENBACH, C.O. Gastric function in Caiman crocodilus (Crocodylia: Reptilia) I. Rate

of gastric digestion and gastric motility as a function of temperature. Comp.

Biochem. Physiol., v. 51A, p. 259-265, 1975.

3. FOX, V.M., MUSACCHIA, X.S. Notes on the pH of the digestive tract of Chrysemys

picta. Copeia, p. 337-339, 1959.

4. FRANCINI, F., PELUSO, F.O., GRISOLIA, C.S. Influencia dei ayuno sobre la produc-

ción de veneno en Bothrops alternatus (Ophidia: Viperidae: Crotalinael. Mem. Inst.

Butantan, v. 53, n. 2, p. 205-210, 1991.

5. GATTEN, R.E. Effect of nutritional status on the prefered body temperature of the

turties Pseudemys scripta and Terrapene ornata. Copeia, p. 912-917, 1974.

6. GREENWALD, O.E., KANTER, M.E. The effect of temperature and behavioral ther¬

moregulation on digestive efficiency and rete in corn snakes (Elaphe guttata gut-

tata). Physiol. Zool.,y. 52, p. 398-408, 1976.

7. GRISOLIA, C.S., PELUSO, F.O., STANCHI, N.O. Informe sobre la actividad dei

Laboratorio y Museo de Animales Venenosos de la Facultad de Ciências Médicas

de la Universidad Nacional de La Plata. Rev. argent. Prod. Anim., v. 6, n. 7/8,

p. 517-519, 1986.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

FRANCINI, R, GRISOLIA, C.S., STANCHI, N.O., PELUSO, RO. Influencia de la temperatura sobre la

digestion en Crotalus durissus terrificus (Serpentes: Viperidae: Crotalinae). Mem. Inst. Butantan,

V. 55, n. 1, p. 11-17, 1993.

8. GRISOLIA, C.S., STANCHI, N.O., PELUSO, F.O. Relación entre el período

de ayuno y cantidad de veneno extraído en cautiverio. Rev. argent. Prod.

Anim., V. 6, n. 7/8, p. 513-516, 1986.

9. HARLOW, H. J., HILLMAN, S., HOFFMAN, M. The effect of temperature on

digestion efficiency in the herbivorous lizard. Dipsosaurus dorsalis. J.

Comp. Physioi, v. 7 7 7, p. 1-6, 1976.

10. JOLY, J. Influence des basses temperatures sur cyclealimentaire de quel-

ques tritons trançais. Buli. Soc. Zool. Fr., v. 83, p. 128-131, 1958.

11. KITCHELL, J.F. Thermophilic and thermophobic responses of snakes in a

thermal gradient. Copeia, p. 189-191, 1969.

12. KOHAN, N.C., CARRO, J.M. Estadística aplicada. 5. ed. EUDEBA, 1972.

368p.

13. LEDESMA, D.A. Estadística médica. 2. ed. EUDEBA, 1980. 620p.

14. MACKAY, R.S. Observations on peristaltic activity versus temperature and

circadian rhytms in undisturbed Varanus flavescen and Ctenosaura pec-

tinata. Copeia, p. 252, 1968.

15. MOLNAR, R.G., TOLG, I. Relations between water temperature and gastric

digestion of largemouth bass, Micropterus salmoides. J. Fish. Res. Boi.

Can., V. 19, p. 1005-1012, 1962.

16. _. Experiments concerning gastric digestion of pike Lucioperca lu-

cioperca L. in relation to water temperature. Acta Biol. Hung., v. 13, p.

231-239, 1962.

17. NAULLEAU, G. Etude biotélémetriques de la thermoregulation chez Vipera

aspisiL.) élevéeen conditionsartificielles. J. Herpetol., v. 13, p. 203-208,

1979.

18. _. Action de la temperature sur la digestion chez les viperes es-

pagnolesdu genre Vipera. P. Cent. Pir. Biol. Exp., v. 13, p. 89-94, 1982.

19. _. The effect of temperature on digestion in Vipera aspis. J. Her¬

petol., V. 7 7, p. 166-170, 1983.

20. _. Action de la temperature sur la digestion chez cinq viperes euro-

péennesdu genre Vipera. Buli. Soc. Zool. France, v. 108, p. 47-58,1983.

21. NAULLEAU, G., MAROUES, M. Etude biotélémétrique préliminaire de la ther-

morégulation dela digestion chez Vipera aspis. C.R. Acad. Sei. Serie D,

V. 276, p. 3433-3436, 1973.

22. REGAL, P.J. Thermophilic response following feeding in certain reptiles. Co¬

peia, p. 588-590, 1966. ■

23. ROOT, H.D. Gastric digestion with hypothermia: observations and applica-

tions. [Thesis — University of Minnesota], p. 1-154, 1961.

24. SAINT GIRONS, H. Observations préliminaires sur la thermoregulation des

vipéres d'europe. Vie Milieu, v. 25, p. 137-168, 1975.

25. _. Thermoregulation comparee des viperes d'europe, Etude bio¬

télémétrique. Terre Vie, v. 32, p. 417-440, 1978.

26. SKOCZYLAS, R. Influence of temperature on gastric digestion in the grass

snake, Natrix natrixL. Comp. Biochem. Physioi., v. 33, p. 793-804, 1970.

27. _. Salivary and gastric juice secretions in the grass snake, Natrix

natrix L. Comp. Biochem. Physioi., v. 35, p. 885-903, 1970.

28. THOMAS, R.G., POUGH, F.H. The effect of rattlesnake venom on digestion

of prey. Toxicon, v. 7 7, p. 221-228, 1979.

29. WANGESTEEN, O.H., ROOT, H.D., SALMON, P.A., GRIFFEN, W.O. Depres-

sant action of local gastric hypothermia on gastric digestion. J.A.M.A.,

V. 169, p. 1601-1608, 1959.

SciELO

10 11 12 13 14 15

Mem. Inst. Butantan

V. 55, n. 1, p. 19-26, 1993.

EPIDEMIOLOGIA DO ACIDENTE POR ARANHAS DO GÊNERO

LOXOSCELES Heinecken & Lowe NO ESTADO DO PARANÁ

(Brasil)

Lindioneza Adriano RIBEIRO*

Vera Regina D. von EICKSTEDT»*

Gisélia Burigo Guimarães RÚBIO***

José Francisco KONOLSAISEN***

« «■ *

Zuhrer HANDAR»***

Marlene ENTRES****

» * « «

Vera A. Fischer Pires de CAMPOS*****

Miguel Tanús JORGE*

RESUMO: O elevado número de acidentes por aranhas do gênero Lo-

xosceles que tem sido notificado ao Ministério da Saúde pelo Estado

do Paraná (Brasil) motivou este estudo. Foram avaliados os registros do

Centro de Epidemiologia do Paraná e do Centro de Informação Toxico-

lógica de Curitiba e realizadas inspeções domiciliares em moradias de

acidentados. Os 923 casos de picada atribuídos a essas aranhas em

1989 e 1990 corresponderam a 52,7% dos envenenamentos por arac¬

nídeos naquele Estado e a 77,4% dos acidentes loxoscélicos no País

nos mesmos anos. Predominaram na região metropolitana de Curitiba

(91%), nos meses de outubro a março (73,9%). A aranha picou princi¬

palmente os membros inferiores e superiores (72,7%). Dos pacientes,

64,8% eram do sexo feminino e 75,2% tinham entre 10 e 50 anos de

idade. Em 604 casos (84,1%) dentre 718 em que o dado foi obtido, os

indivíduos picados chegaram às Unidades de Saúde depois de 12 ho¬

ras do acidente. Tratamento com soro (antiveneno) foi realizado em cerca

de um terço dos casos. A letalidade foi de 0,2% (2 óbitos) Loxosceles

T intermedia Mello-Leitão e L. laeta (Nicolet) foram as principais espécies

coletadas nos locais de acidentes. O loxoscelismo é, portanto, um pro-

Trabalho apresentado no IV*^ Pan American Symposioum on Animal, Plant and Microbial Toxins and II Sympo-

sium of the Brazilian Society on Toxinology, 1992, Campinas, Sâo Paulo, Brasil.

■ Hospital Vital Brazil. Instituto Butantan — CP 65 — 01059-970 — S3o Paulo — SP — Brasil.

■ * Seçao de Artrópodos Peçonhentos

■" • Centro de Epidemiologia do Paraná

Centro de informações Toxicológicas do Paraná

.Comissão Permanente de Coordenação e Controle de Acidentes por Animais Peçonhentos, São Paulo.

Recebido para publicação em 29.12.92 e aceito em 05.4.93.

2 3

5 6

11 12 13 14 15

RIBEIRO, L.A. et al. Epidemiologia do acidente por aranhas do gênero Loxosceles Heinecken & Lowe

no Estado do Paraná (Brasil), Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.1, p, 19-26, 1993.

blema importante de saúde pública, sendo preocupante devido ao alto

índice de acidentes e à elevada infestação intradomiciliar dessa aranha.

UNITERMOS: Acidentes por aranhas, loxoscelismo, epidemiologia de aci¬

dentes aracnídicos, Loxosceles Heinecken & Lowe.

INTRODUÇÃO

Dos 4.636 acidentes por aranhas notificados no período 1988-1989 ao Minis¬

tério da Saúde pelas 27 unidades federadas do Brasil, 956 (20,62%) foram atri¬

buídos a aranhas do gênero Loxosceles^.

Até recentemente, os dados do Hospital Vital Brazil, (Instituto Butantan), onde

foi feito 0 primeiro diagnóstico clínico de loxoscelismo^, e que atende anualmente

cerca de 50 casos de acidentes provocados por essas aranhas na região metro¬

politana de São Paulo A 6 ,i 2 _ constituíam a base do conhecimento desse tipo de

intoxicação no País. Em 1989, Mello Guimarães et al. ® mencionaram 64 aciden¬

tes loxoscélicos atendidos de janeiro de 1987 a dezembro de 1988 no Hospital

de Pronto Socorro Municipal de Porto Alegre; e em 1990 Mello da Silva et al.

em um levantamento retrospectivo dos registros do Centro de Informação Toxl-

cológica do Rio Grande do Sul (CT/SSMA/RS), referiram 116 casos de loxoscelis¬

mo notificados por este Estado durante 1989. Neste último trabalho é enfatizado

que 72,8% dos acidentes tinham ocorrido na área metropolitana de Porto Ale¬

gre. No ano de 1985 um dos autores (VRE) recebeu do Dr, Dalton Luiz Bertoluzzi,

para identificação, duas aranhas coletadas na residência de uma menina de 4

anos, que foi a óbito no Hospital São João Batista Ltda., Criciúma, SC, com insu¬

ficiência renal por picada de Loxosceles. As aranhas foram identificadas como

L. laeta (Nicolet). Posteriormente, por solicitação do Centro de Informação Toxi-

cológlca de Florianópolis e do Hospital Infantil de Lajes, a mesma autora identifi¬

cou outros exemplares capturados em domicílios de pacientes picados em Içara,

Criciúma e Florianópolis, como Loxosceles laeta e L. intermedia Mello-Leitão. Em

Lajes, aranhas do gênero Loxosceles estão sendo comumente encontradas em

casas e apartamentos e têm provocado acidentes humanos freqüentes (Fenilli,

R., com. pessoal).

No período 1989/90 o Centro de Epidemiologia do Paraná (CEPI) notificou ao

Ministério da Saúde 923 casos de loxoscelismo. Devido a esse alto índice de aci¬

dentes e à requisição de grande número de ampolas de soro para o tratamento

específico, a Comissão de Coordenação e Controle dos Acidentes por Animais

Peçonhentos do Estado de São Paulo solicitou a duas das autoras (LAR e VRE)

parecer sobre o assunto e a Secretaria Estadual de Saúde do Paraná e o Instituto

Butantan firmaram convênio para analisar o problema. Neste artigo são apresen¬

tados os primeiros resultados desse estudo.

MATERIAL E MÉTODO

Foram avaliadas as planilhas de notificação de acidentes por aracnídeos, ocorri¬

dos nos anos de 1989 e 1990, encaminhadas ao Ministério da Saúde pelo Centro

de Epidemiologia do Paraná. Analisaram-se dados relativos às seguintes va-

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

RIBEIRO, L.A. et al. Epidemiologia do acidente por aranhas do gênero Loxosceles Heinecken & Lowe

no Estado do Paraná (Brasil). Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.1, p. 19-26, 1993.

riáveis referentes aos aciíjentes loxoscélicos: identificação do aracnídeo; local de

ocorrência e distribuição mensal dos acidentes; idade e sexo do paciente; região

anatômica picada; intervalo de tempo entre o acidente e o atendimento médico

no local que realizou a notificação; tratamento instituído e evolução clínica do ca¬

so. Foram identificadas aranhas apresentadas pelos pacientes como causadoras

dos acidentes ou semelhantes a elas, que se encontravam depositadas no Centro

de Epidemiologia do Paraná e no Centro de Informação Toxicológica. Foram tam¬

bém analisadas amostras de exemplares capturadas pelos autores em inspeções

domiciliares em Curitiba. Os locais de ocorrência de acidentes foram assinalados

em um mapa da região.

RESULTADOS

Os 923 casos de loxoscelismo notificados ao Ministério da Saúde pelo Paraná

nos anos de 1989 e 1990 corresponderam a 52,7% dos acidentes provocados por

aracnídeos, no mesmo período de tempo, naquele Estado (Tabela 1) e predomina¬

ram (73,9%) nos meses de outubro a março (Fig. 1).

Quinhentos e noventa e oito pacientes (64,8%) eram do sexo feminino e a maioria

(75,2%) tinha entre 10 e 50 anos de idade (Tabela 2).

A maioria das picadas se deu nos membros inferiores (42,9%) e superiores

(29,8%) não tendo sido freqüentes nos pés/tornozelos e nas mãos (Tabela 3), co¬

mo costuma ocorrer nos acidentes por outras aranhas.

Em 604 casos (65,4%), os picados chegaram às Unidades de Saúde depois

de 12 horas do acidente (Tabela 4).

Quanto ao tratamento, foi possível obter informação em 732 (79,3%) casos.

Em 342 (46,6%) foi utilizada soroterapia específica (SAA ou SAL), os demais fo¬

ram tratados com corticosteróides (29,7%) ou apenas com medicamentos sinto¬

máticos (18,8%). Foram administradas 1794 ampolas de antiveneno nos pacientes

(média de 5,2 ampolas por paciente). A letalidade foi de 0,2% (2 óbitos).

Q mapeamento dos locais de ocorrência dos acidentes demonstrou que no pe¬

ríodo analisado eles predominaram (91,0%) na região metropolitana de Curitiba

(83% na Capital e 8% nas cidades vizinhas) e que o loxoscelismo está dissemina¬

do em todas as zonas urbanas da Capital. A identificação das aranhas indicou que

a espécie predominante é L. intermedia Mello-Leitão e que L. iaeta (Nicolet), tam¬

bém encontrada nos domicílios e áreas peridomiciliares, tem distribuição restrita.

TABELA 1

Distribuição dos acidentes segundo o aracnídeo causador

(Paraná, 1989 e 1990).

Aracnídeo

número

Aranhas

Loxosceles spp.

923

52,7

Phoneutria spp.

318

18,1

Lycosa spp.

4,2

Caranguejeira

'30

1,7

Escorpiões

4,8

Não identificados

298

17,0

Qutros

1,5

Total

1753

100,0

RIBEIRO, L.A. et al. Epidemiologia do acidente por aranhas do gênero Loxosceles Heinecken & Lowe

no Estado do Paraná (Brasil). Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.1, p. 19-26, 1993.

Número de caeos

120

100

J F M A M

1989 ■ 28 29 32 24 20

11 6 8 27 43 68 46

1990^ 68 72 60 48 23 25 17 12 24 70 112 50

MESES

Fig. 1: Distribuição mensal dos acidentes loxoscélicos no Paraná

TABELA 2

Distribuição dos acidentes por Loxosceles spp. segundo a idade dos

pacientes (Paraná, 1989 e 1990).

Idade

Número

% Número médio de

casos/ano idade

0-5

5,4

10,0

5-10

4,2

7,8

10 — 20

102

11,1

10,2

20 - 30

257

27,8

25,7

30 - 40

210

22,8

21,0

40 - 50

125

13,5

12,5

50 - 60

8,2

7,6

60 e -F

4,8

—

Sem informação

2,2

—

Total

923

100,0

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

RIBEIRO, L.A. et al. Epidemiologia do acidente por aranhas do gênero Loxosceles Heinecken & Lowe

no Estado do Paraná (Brasil). Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.l, p. 19-26, 1993.

TABELA 3

Distribuição dos acidentes provocados por Loxosceles segundo a região

anatômica picada (Paraná, 1989 e 1990).

Região anatômica

Número

Membros inferiores

Pé/Tornozelo

6,2

Perna

217

23,5

Joelho/Coxa

107

11,6

Não especificado

1,6

Subtotal

396

42,9

Membros superiores

Mão

4,5

Antebraço

1,5

Cotovelo/Braço

180

19,5

Não especificado

1,4

Subtotal

248

26,9

Tronco

113

12,3

Pescoço

1,7

Cabeça

8,0

Não especificada

8,2

Total

923

100,0

TABELA 4

Distribuição dos acidentes por Loxosceles spp

. segundo o

intervalo de tempo

entre a picada e o atendimento médico (Paraná, 1989 e 1990).

Intervalo

Número

% acumulada

(horas)

1 - 3

4,2

3-6

2,6

6,8

6-12

5,5

12,3

12-24

142

15,4

27,7

24 - 48

192

20,8

48,5

48 e -E

270

29,3

77,8

Não informado

205

22,2

100,0

Total

923

100,0

SciELO

10 11 12 13 14 15

RIBEIRO, L.A. et al. Epidemiologia do acidente por aranhas do gênero Loxosceles Heinecken & Lowe

no Estado do Paraná (Brasil). Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.1, p. 19-26, 1993.

DISCUSSÃO

A situação encontrada no Paraná, conforme dados do presente trabalho, dife¬

re da que é considerada peculiar ao loxoscelismo nas diversas partes do mundo,

ou seja, ocorrência de um baixo índice de acidentes mesmo em áreas com gran¬

de densidade de aranhas^. O Paraná é o estado brasileiro que notifica o maior

número de acidentes loxoscélicos e esse número vem crescendo progressivamente.

No período 1988-1989 foram 595 casos, que corresponderam a 62,2% das noti¬

ficações de acidentes por Loxosceles spp. e em 1989 e 1990 o total de casos

chegou a 923, perfazendo 77,4% dos acidentes no País^. Os dados atualmente

disponíveis demonstram uma nítida regionalização do loxoscelismo. Ele se con¬

centra na região sul do Brasil e no Paraná constitui a forma mais importante de

araneísmo, ao contrário de São Paulo, onde menos de 10% dos acidentes araneí-

dicos são atribuídos a espécies de Loxosceles^'^. A prevalência dos acidentes na

região metropolitana de Curitiba, a ampla disseminação da aranha e o fato de

a infestação ser predominantemente intradomiciliar, como ficou evidenciado, exi¬

gem a adoção de medidas preventivas de acidentes e de controle das aranhas.

E necessário diminuir os criadouros e inviabilizar a propagação dessas aranhas

para outras áreas urbanizadas, do Brasil e de países limítrofes ou não, como tem

ocorrido com espécies de algumas regiões do mundo. ^ também necessá¬

ria uma avaliação dos fatores ambientais que estão favorecendo a infestação e

de aspectos biológicos da espécie L. intermedia que, conforme foi verificado, é

a predominante.

A distribuição mensal dos acidentes, com maior incidência nos períodos mais

quentes do ano, é semelhante ao que ocorre no Estado de São Paulo®.

A picada de aranhas do gênero Loxosce/es tende a ocorrer principalmente em

pessoas do sexo, feminino,®, o que se deve, provavelmente, à frequência maior

de acidentes nos domicílios®^'’'^®. A percentagem de picadas envolvendo pessoas

desse sexo, segundo dados do presente estudo, foi ainda maior do que a relatada

por outros autores®'’'*'’'®.

A maioria das picadas se deu nas regiões proximais dos membros inferiores

e superiores e no tronco. Diferentemente dos acidentes por Phoneutria, Lycosa

ou escorpião em que predominam picadas nas mãos e pés®, as provocadas por

Loxosceles são mais comuns nos braços e nas pernas®'®.

A maioria dos pacientes procurou os serviços médicos que notificaram o aci¬

dente seis ou mais horas após, o que está de acordo com a literatura. Esta provi¬

dência costuma ser tardia porque, ao contrário do que ocorre com os acidentados

por Phoneutria^ e Lycosa''^, a picada por Loxosceles muitas vezes não é percebi¬

da, a dor tende a iniciar-se tardiamente e a suspeita de se tratar de acidente arac-

nídico pode não acontecer.

Menos de 30% dos pacientes avaliados receberam soro antiaracnídico ou an-

tiloxoscélico. Isto se deve, provavelmente, à conduta de não se administrar o soro

em casos de atendimento tardio, recomendada pelo Centro de Informação Toxi-

cológica do Paraná.

A frequência com que os acidentes ocorrem no Estado do Paraná mostra a

necessidade de conhecimento mais aprofundado da distribuição das espécies de

Loxosceles na região, das espécies predominantes e da epidemiologia do acidente.

AGRADECIMENTO

Os autores agradecem o apoio do Programa Nacional de Controle de Aciden¬

tes por Animais Peçonhentos do Ministério da Saúde (Dr. Francisco Anilton Alves

Araújo — Gerente-Técnico)

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

RIBEIRO, L.A. et al. Epidemiologia do acidente por aranhas do gênero Loxosceles Heinecken & Lowe

no Estado do Paraná (Brasil). Mem. Inst. Butantan, v. 55, n,1, p. 19-26, 1993.

ABSTRACT: The high number of Loxosceles bites in the State of Paraná,

notified to the Ministry of Health in 1989, warrants this study. A total

of 923 cases was registered in the Centro de Epidemiologia do Paraná

and this number corresponded to 52.7% of the arachnidic accidents

reported to the Center. Loxosceles bites were predominant in the me-

tropolitan region of Curitiba (83% occurred in the capital and 8% in

neighboring towns). The highest incidence was from October to March

(73.9%). Most of the victims (64.8%) were females and 75.2% were

between 10 and 50 years old. Spider bites were most common on the

lower (42.9%) and upper (29.8%) extremities but bites on the foot/ankie

and the hand were unusual (6.2% and 5.3%, respectively). More than

60% of the victims arrived at the Health Unit 12 hr after the bite. Treat-

ment with specific serum was carried out in approximately one third of

the patients. The lethality was 0,2% (two deaths). Identification of spi-

ders at the moment of the bite or shortiy thereafter showed that Loxos¬

celes Intermedia Mello-Leitão and the cosmopolitan Loxosceles laeta

(Nicolet) were the main species involved.

KEYWORDS: Necrotic arachnidism, epidemiology of arachnidism, Lo¬

xosceles Heinecken & Lowe.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. ALBUQUERQUE, M.J,, PIRES DE CAMPQS, V.F., RIBEIRQ, L.A., TAKAQ-

KA, N.Y. Epidemiological and clinicai aspects of accidents due to spiders

in São Paulo State, Brazii, in 1988. Toxicon, v. 28, p. 599, 1990.

2. ARAÚJQ, F.A.A., RESENDE, C.C. Araneísmo: análise epidemiológica. Mi¬

nistério da Saúde, Fundação Nacional da Saúde, Coordenação de Con¬

trole de Zoonoses e Animais Peçonhentos, 1991.

3. CARDQSQ, J.L.C., DE CILLQ, D.M. Primeiro diagnóstico de Loxoscelismo

na casuística do Hospital Vital Brazii (HVB). Mem. Inst. Butantan, v. 52,

p. 81, 1990.

4. CARDQSQ, J.L.C., FRANCA, F.Q.S., EICKSTEDT, V.R.D., BQRGES, I., NQ-

GUEIRA, M.T. Loxoscelismo; estudo de 242 casos (1980-1984). Revta.

Soc. bras. Toxico!., v. 7, p.58-60, 1988.

5. GERTSCH, W.J., ENNIK, F. The spider genus Loxosceles in North America,

Centro America, and West Indies (Araneae, Loxoscelidae). Buli. Amer.

mus. nat. Hist., v. 175, p. 264-360, 1983.

6. JQRGE, M.T., EICKSTEDT, V.R.D., KNYSAK, I., FISMAN, L.F.Z., RIBEIRQ,

L.A. Acidentes por picada de aranha. Arq. bras. med., v. 65, p. 457-468,

1991.

7. JQRGE, M.T., RIBEIRQ, L.A. Acidentes por animais peçonhentos. In:

AMATQ-NETQ, V., BALDY, J.L.C. Doenças transmissíveis. 3. ed. São

Paulo: Sarvier, 1989. p. 133-141,

8. JQRGE, M.T., RIBEIRQ, L.A. Epidemiologia do acidente por aranha do gê¬

nero Loxosceles, estudo prospectivo de 70 casos. In: CQNGRESSQ DA

SQCIEDADE BRASILEIRA DE MEDICINA TRQPICAL, 26, 1990, Natal (RN).

Anais ... Natal: Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 1990. p. 103.

9. MELLQ GUIMARÃES, S.V., SILVA, C.A.M., SCHEID, M.M. Acidentes loxos-

célicos em Porto Alegre — RS. Rev. Soc. bras. ToxicoL, v. 2, 1989, Trab.

5,42.

10, MELLQ DA SILVA, C.A. TQRRES, J.B., MARQUES, M.G.B., NICQLELLA,

A.D.R. Aspectos epidemiológicos e clínicos de acidentes por Loxosceles

sp. no Sul do Brasil. Mem. Inst. Butantan, v. 52, p. 80-81, 1990.

cin

SciELO

10 11 12 13 14 15

RIBEIRO, L.A. et al. Epidemiologia do acidente por aranhas do gênero Loxosceles Heinecken & Lowe

no Estado do Paraná (Brasil). Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.l, p. 19-26, 1993.

11. NEWLANDS, G. A new violin spider from Johannesburg with nota on its me¬

dicai and epidemiological importance. Zeitschr. ang. zool., v. 68, p.

357-365, 1981.

12. PIESCO, R.V., CARDOSO, J.L.C., RIBEIRO, L.A., EICKSTEDT, V.R.D. Lo-

xoscelismo — 241 casos: estudo epidemiológico e clínico. In; CONGRES¬

SO BRASILEIRO DE TOXICOLOGIA 3, 1983, Belo Horizonte. Anais ... Belo

Horizonte: Sociedade Brasileira de Toxicologia, 1983. p. 107.

13. RIBEIRO, L.A., JORGE, M.T., PIESCO, R.V., NISHIOKA, S.A. Wolf spider

bites in São Paulo, Brazil: a clinicai and epidemiological study of 515 ca¬

ses. Toxicon, V. 28, p. 715-717, 1990.

14. SCHENONE, H., RUBIO, S., VILLARROEL, F., ROJAS, R. Epidemiologia y

curso clínico dei loxoscelismo. Estúdio de 133 casos causados por la mor¬

dedura de la araria de los rincones Loxosceles laeta. Boi. Chile. Parasit.,

V. 30 p. 6-17, 1975.

15. SCHENONE, H., SAAVEDRA, T., ROJAS, A., VILLARROEL, F. Loxoscelis¬

mo en Chile. Estúdios epidemiológicos, clínicos y experimentales. Rev.

Inst. Med. trop. São Paulo, v. 37, p. 403-415, 1989.

16. SCHENONE, H., SUAREZ, G. Venoms of Scytodidae. genus Loxosceles. In:

BETTINI, S. Arthropod venoms. Berlin: Springer-Verlag, 1978. p. 147-275.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

Mem. Inst. Butantan

V. 55, n. 1, p. 27-32, 1993.

DIAGNOSIS AND TREATMENT OF ACARIASIS IN MICE

Fernando SOGORB S.

Sueli Blanes DAMY

Ana Paula ROCHA DA SILVA

Ubimara Pereira RODRIGUES

Luziani CHAGURI

ABSTRACTS: The efficacy and possible toxic effects of the five acarici-

des were analysed in their control of Myobia musculi and Myocoptes

musculinus, in mice colony with a 50% incidence of these parasited.

The result suggest that the control can be obtained by treatment with

dichiorvos at 0,007%, malathion at 2% and monossulfiram at 12,5%,

with 5 immersion baths at intervala of 7 days.

KEYWORDS: Dichiorvos, malathion, monossulfiram

INTRODUCTION

Myobia musculi and Myocoptes musculinus, arachnids of the subclass Acari,

parasites of mice pertaining to the suborders Prostigmata and Astigmata respec-

tively, are with frequency found in conventional colonies^'®.

The pathological effects caused by these ectoparasites vary with strain, sex,

age, and individual differences in sensibility, as well as with the type of mating

used. Slight infestations in general are not apparent and the severe ones may cause

traumatic dermatitis, alopecia, itching and increase of the mitotic activity of the

dermal epithelium'’.

Myocoptes musculinus affect the region of the cheek, basis of the tail, inguinal

and between the auricular pinna, and may disperse over the whole back. They

provoke a graying of the pelage, with a progressiva increase of the affected area,

ioss of weight, emaciation, cachexia and eventually death. AH the life cycle oc-

curs within the pelage and demands 14 days to complete, feeding on the dermal

tissue®.

From the Instituto Butantan, Biotério Central, Av. Vital Brasil, 1500, CEP 05503-900, São Paulo, Brazil.

Recebido para publicação em 09.11,92 e aceito em 12.4.93

2 3

5 6

11 12 13 14 15

SOGORB S., F., DAMY, S.B., ROCHA DA SILVA, A.P., RODRIGUES, U.P., CHAGURI, L. Diagnosis and

treatment ot acariasis in mice. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n. 1, p. 27-32, 1993

The Myobia musculi are localized in the cervix, shoulder and forelegs. They

create a type of itch that is considered the most specific of mice^®. All stages

of the life cicie occur in the pelage, requering 23 days to complete, feeding on

extracellular fluid'®'''®'''®'^®

In the control of these agents, different compounds were used, specially or-

ganophosphorized anticholinesterasics. The characteristic pharmacological effects

of the anticholinesterasics primarily are due to the inhibition of inactivation of the

acetylcholinesterasis in the centers of cholinergic transmission, occuring, in con-

sequence, accumulation and supervening the actions of the endogenous acetyl-

choline released as by nervous cholinergic impulses, as, in less quantity, by

continuous extravation during the resting phase^^-^®.

These compounds are in general liquids highly soluble in lipids, undergoing rapid

absorption by nearly all ducts, inclusive the digestive tube, as \A/ell, as through

the skin and the mucous membranes, after the contact with the liquid form, and

through the lung after inhalation of the vapors or dust and aerosol ”'''T 2 o

Elimination occurs through the urine in form of metabolic degradation products.

Between the time of absorption and elimination there are variable periods during

which the original compound or its metabolics continue combined with plasm

and tissue proteins intervening in their metabolism hydrolytic as well as oxidative

enzymes”'''3'2°.

Among these anticholinesterasic organophosphorate compounds the follow-

ing were used in the control of these acaridiasis: lindano [1,2,3,4,5,6 hexachlorocy-

clohexane], an organochiorate that presents as characteristics a rapid distribution

through the organism after absorption, concentrating itself in the adipose tissues,

specially in the brain and liver'^. Diazinon [0,0 dietil 0-(2-isopropil-4 methil-

6-pirimidyl)], proportion of SULFOTEPP, that by an oxidation process, during as

improper storage, produces TEPP, a compound endowed with a high toxicity^®.

Malathion [0,0-dimethyl S-(ethyl 1,2-dicarboetoxi)], dithiophosphorate, shows

aiso toxic impurities for several species of mammals, including man, rat and mouse.

These are formed by exposition of the product to ultraviolet light or by storage

at temperaturas more than 40°C. The more common impurity 0,0,S- TMP, ap-

plied experimentally in mice, decreased the humoral and cell mediated immune

responses. However, studies performed using concentrations of 2% and 8%,

showed that the immune system of Balb/c mice, 8 weeks of age, did not

change'®. It is stili observed, that Malathion is less toxic to mammals and birds

than to insects, because in the superior animais its biotransformation into active

Products is quicker^F

Variability of reaction to a determined drug by animais of different species may

be due, at least partiatly, to variations in the capacity of biotransformation. There

may be differences in the degradation velocity, what brings on variations in the

effect intensity, leading to a quantitatively different answer”.

Dichiorvos (DDVPI [0,0-dimethyl-2,2- dichlorovinilphosphate], chlo-

rophosphorate, have a pharmacological action similar to that a malathion. Toxico-

logic studies using 500 mg of the product each kg of ration, suppiied "ad libitum"

to mice, showed that the serie cholinesterasis levei of the animais was half the

value lound in the not treated Controls, remaining low for several days^'2°.

Compounds based on sulphur, as tetraethyltiuram monosulphuric acid

(monosulfiram), are constituted by fine christals, containing about 36% of sul¬

phur in an organic combination, insoluble in water, however quite soluble In alco-

hol and some oils, devoid of serious collateral effects\ have a keratolytic actions

that constitutes the basis of its therapeutic property. In order to exert a germicidal

action, it must be converted into pentatonic acid. Presumably the oxidation of sul-

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

SOGORB S„ R, DAMY, S.B., ROCHA DA SILVA, A.P., RODRIGUES, U.R, CHAGURI, L. Diagnosis and

treatment of acariasis In mice. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n. 1, p. 27-32, 1993

phur to pentatonic acid is accompanied by microorganisms and epidermal cells

when appiied over the skin’^.

Therefore, considering that parasitism of the laboratory mice by M.musculinus

and M.musculi, although not representing risk to the handiing individuais^, in-

terfers in the reproductive process and in more extended experiments, the infesta-

tions may become more intense, weakening the animais and modify potencially

the resuits’®, there may occur secondary infections by microorganisms'’, besides

being considered vectors of Philalitomosoides carini and of several riquetsias, the

present paper had as its objective to test the efficacy of different acaricides in

the control of these agents.

MATERIAL AND METHODS

Mice of the "swiss" variety were used, maintained in popypropylene cages

with pine wood shavings, changed twice a week. All material used was sterilized

by humild heat^.

The animais were maintained in an acciimatized room, with a temperature of

22°C and a light/darkness cycle of '12 hours. Water and the balanced ration in

form of pellets were suppiied "ad libitum”.

For the ectoparasite research, the mice were sacrificed by cervical desloca-

tion, placed on Petri dishes with a black paper basis, placed in an ice box for half

an hour, and then exposed to a heat source, represented by an eletric light source.

After a few minutes, the parasites that left the body, could be seen with the naked

eye on the black paper or at the top of the hair, when examined with an entomo-

logic magnifying glass (Wild - Heerbrugg M5) with a minimum of 60 augmen-

tations.

The following acaricides were used, diluted in water. Lindano at 2% (1*), di-

azinon at 0,06% (2*), malathion at 2% (3*), dichiorvos at 0,007%’ (4*) and

monosulfiram at 12,5% (5*) described in the introduction.

The baths were prepared in the dilutions indicated in the introduction, and the

mice were held with pincers, were totally submerged in the liquid. The intervals

between baths were of 7 days, repeated for three times. The ration was removed

and replaced six hours later, the drinking water through was maintained.

Trademark:

Rodane EC20

Diazinon

Malatol 100E

Nuvan 1000CE

Tetmosol

Rhodia - Merieu

Ciba-Geigy

Cyanamid

Ciba-Geigy

Welcome-ICI

RESULTS

The resuits of the 5 acaricides are represented in Table 1.

The mice treated with lindano and diazinon died a few hours after the bath

with the first product and up to the 5th day after the bath with Diazinon.

After the resuits of Tabela 1, 3 groups were formed each with 200 couples of

mice in reproduction age, and each group submitted to the treatments with the

quimical products approved in the first test, and the animais were observed for

6 months (Table 2).

SciELO

10 11 12 13 14 15

SOGORB S,, R, DAMY, S.B„ ROCHA DA SILVA, A.R, RODRIGUES, U.P., CHAGURI, L. Diagnosis and

treatment of acariasis in mice. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n. 1, p. 27-32, 1993

During the whole period of observation, 20 mice for month with 3 weeks of

age were examined for the ectoparasite research, originating from each group

treated with the different products. The animais were sacrificed and observed under

the entomologic magnifying glass, as described under Material and Methods, no

presence of ectoparasites was verified for 6 months and for more than one year

no more tipical lesions appeared.

TABLE 1

Activity of lindano, diazinon, malathion, dichiorvos (DDVP) and monosulfiram

as acaricides in mice, examined after 3 baths, with intervals of 7 days.

PRODUCT

Aquous

dilution

No. of

animais

Persistency of

the parasite

% survival

Lindano

2,000

Diazinon

0,060

Malathion

2,000

0/60

100

Dichiorvos

0,007

0/60

100

Monosulfiram

12,50

0/60

100

Control

31/60*

30/60**

* parasitims by M. musculinus (52,8%)

** parasitism by M. musculi (50%)

TABLE 2

Persistency of the parasitism by M.musculinus and M.musculi after the

treatment with dichiorvos, malathion and monosulfiram in 200 couples of

adult mice submitted to 3 baths a 7 days interval.

MONTHS

PRODUCT

Aquous

dilution

1 °

2°

3°

4°

5“

6°

Dichiorvos

0,007%

Malathion

2,000%

Monosulfiram

12,50%

DISCUSSION

The colonies of mice may contain M. musculi and M.musculinus without clini¬

cai manifestation, due to genetic factors that regulate the equilibrium of the acar-

idal populations since different mouse strains show variable sensitivityT^.

In the parasited animais, the hairs become opaque by functional disturbancy

of the sebaceous glands. As a result of the pruritus, occur epithelial erosions

through functional disturbance of sebaceous glands.

SOGORB S., R, DAMY, S.B., ROCHA DA SILVA, A.P., RODRIGUES, U.P., CHAGURI, L Diagnosis and

treatment of acariasis In mice. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n. 1, p. 27-32, 1993

Our resuits showed that the products lindano and diazinon, with the used dilu-

tions, were lethal for the mice. With the first, the bathed animais died a few hours

after the treatment, and with the second lot, deaths occured up to the 5th subse¬

quente day.

The animais treated with dichiorvos showed a recurrence of 7% from the 3rd

month on after the treatment, only the males with characteristic lesions and

presence of M. musculi ln the sacrificed animais. These resuits are in accordance

with the literature as for the sensibility difference betwéen sexes and the necessi-

ty of a repetition of the treatment^^

The use of dichiorvos in different forms of treatment^^T^^z presented satisfac-

tory resuits in the control of acarids and the treatment did not affect the size and

the frequency of the hatch, as for the gestation period^.

Studies done with the use of malathion in different concentration showed satis-

factory resuits in the control of the mange mites, and no colateral effects and

alterations of the immune System of mice^'®'’’^, and agree with the resuits ob-

served in Tables 1 and 2.

Monosulfiram in the indicated dilution eliminated the mites and did not cause

any recurrence during the whole observation period. By owning a keratolyte, acarid

and germicide action, being devoid of colateral effects^'’^ it may be selected as

an inocous and efficaclous product for treatment of acaridiasis.

CONCLUSIONS

The ectoparasites M. musculi and M. musculinus can be controlled in mouse

colonies by treatments with dichiorvos at 0,007%, malathion at 2% and monosul¬

firam at 12,5% by five immersions baths at 7 days interval.

ACKNOWLEDGEMENTS

Our thanks to Ms. Sibilly Heller for the translation.

RESUMO: Foram analisados a eficácia e os possíveis efeitos tóxicos de

5 acaricidas, no controle de Myobia musculi e Myocoptes musculinus,

em colônia de camundongos com 50% de incidência destes ectoparasi-

tas. Os resultados sugerem que o controle pode ser obtido pelo tratamen¬

to com dichiorvos a 0,007%, malathion a 2% e monossulfiram a 12,5%,

com 5 banhos de imersão, em intervalos de 7 dias.

UNITERMOS: Dichiorvos, malathion, monossulfiram

REFERENCES

1. BELDA, W. Tratamento pelo monosulfiram: nova solução para problema de

escabiose. Rev. Bras. Clin. Ter., v. 8, n. 4, p. 309-312, 1965.

2. CASEBOLT, S.B. et al. Effect of dichiorvos treatment on mouse reproduc-

tion. Lab. An. Sei., v. 40, n. 1, p. 65-67, 1990.

3 CONSTANTIN, M, L. Effects of insecticides on acariasis in mice. Lab. An,

V. 6, p. 279-286, 1972,

4. CSIZA, C. K., MACMARTIN, D. N. Technical notes. Apparent acaridal der-

matitis in C57BL/6 Nya mouse colony. Lab. An. Sei, v. 26, n. 5, p.

781-787, 1976.

2 3

5 6

11 12 13 14 15

SOGORB S., R, DAMY, S.B., ROCHA DA SILVA, A.R, RODRIGUES, U.P., CHAGURI, L. Diagnosis and

treatment of acariasis in mice. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n. 1, p. 27-32, 1993

5. DAMY, S. B. et al. Esterilização de materiais de biotério pelo calor úmido.

Mem. Inst. Butantan, v. 52, n. 1, p. 5-10, 1990.

6. DAVIS, R. Control of the myocoptic mange mite Myocoptes musculinus

(Koch) on laboratory mice. J. Ec. Ent., v. 50, n. 5, p. 595-596, 1957.

7. FLYNN, R. J. et al. Pathogen status of commercialy produced laboratory

mice. Lab. An. Care., v. 15, p. 440-447, 1965.

8. _. Parasites of laboratory animais, lowa: The lowa State Univer-

sity, 1973. 883 p.

9. FRASER, J. et al. The use of pelleted dichiorvos in the control of murine aca¬

riasis. Lab. An., v, 8, p. 211-21A, 1974.

10. FRIEDMAN, S., WEISBROTFI, S. H. The parasitic ecology of the rodent mi¬

te Myobia musculiW. Life cycle. Lab. An., v. 27, n. 1, p. 34-37, 1977.

11. GIESBRECHT, A. M. Fatores que alteram os efeitos de medicamentos. In:

ZANINI, A. C., OGA, S., eds. Farmacologia aplicada. São Paulo: Athe-

neu, 1979. p. 65-72.

12. FIARVEY, S. C. Antiseptics and disinfectantes; fungicides; ectoparasiticides.

S., GILMAN, A. G., ed. Pharmacological basis of the-

New York: Macmillan, 1985. p. 959-979.

In: Toxicologia. São Paulo: Manole, 1987.

In: GOODMAN, L,

rapeutics .1 . ed.

13. LARINI, L. Inseticida

p. 152-158.

14. MULLINK, J. W. M. A. Ratas y ratones. In: FI1ME, J. M., ODONOGFIUE,

P. N., ed. Patologia de los animales de laboratorio. Zaragoza: Acribia,

1985. p. 63-100.

15. RELFORD, R. L. et al. Effects of a commercial malathion dip preparation on

the cellular and humoral immune response of Balb/c. Lab. An. ScL, v.

39, n. 1, p. 56-59, 1989.

16. SAIZ MORENO, L. et al. Animales de laboratorio: producción, manejo y con¬

trol sanitario. Madrid: Serv. Pub. Agrarias, 1983. 530 p.

17. SCIVOLETO, R. Sistema nervoso autônomo. In: ZANINI, A. C., OGA, S.,

ed. Farmacologia aplicada. São Paulo: Atheneu, 1979. p. 107-143.

18. SMITFI, A. W. El raton. 2. ed. Rio de Janeiro: Centro Panamericano de Fie-

bre Aftosa, 1976. 243 p.

19. STONER, R. D., FIALE, W. M. A method for eradication of the mite Myo¬

coptes musculinus from laboratory mice. J. Ec. Ent., v. 46, n. 4, p.

692-693, 1953.

20. TAYLOR, R. D., FIALE, W. M. Anticholinesterase agents. In: GOODMAN,

L. S., GILMAN, A. G., ed. The pharmacological basis of therapeutics. 7.

ed. New York: MacMillan, 1985. p. 110-129.

21. WATSON, D. P. The effect to the mite Myocoptes musculinus on the skin

of the white laboratory mouse and its control. Parasitology, v. 51, p.

373-378, 1961.

22. WEISBROTFI, S. Fl. et al. The parasitic ecology of the rodent mite Myobia

musculi. 111. Lesion in certain host strain. Lab. An. Sei., v. 26, n. 5, p.

725-733, 1976.

23. WFIITELEY, Fl. J., NORTON, D. L. The effect of Myobia musculi on the epi-

dermis and hair regrowth cicie in the ageing CBA mouse. J. Pathol. Bac-

teriol, v. 83, p. 509-514, 1962.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

Mem. Inst. Butantan

V. 55, n. 1, p. 33-36, 1993.

OVARIAN CYCLE OF THE SNAKE BOTHROPS JARARACA

Thélia R.F. JANEIRO-CINQUINI*

Frederico Fontoura LEINZ*

Eduardo Cunha FARIAS**

ABSTRACT: The reproductive cycle of Bothrops jararaca was studied

through the observation of the ovarian foilicles and eggs of 111 snakes

during the period of one year. Vitellogenesis was observed during Au-

tumn and Winter, and ovulation probably occurred at the beginning of

Spring. Pregnancy was verified from November to March. The smallest

gravid female measured 76,0 cm in snout-vent length.

KEYWORDS: Serpente, reprodução, ciclo ovariano.

INTRODUCTION

The knowledge of reproductive cycles of tropical and sub-tropical snakes is

scarce, specially when compared to that of snakes from temperate regions

(Shine”'’^; Kofron^).

Murphy and Mitchel^ observed the reproduction of several species of the ge-

nus Bothrops in captivity, and Solórzano and Cerdas’'’ described the reproduc¬

tive activity of several crotaline species in nature.

According to Fitch"^, the reproductive cycle involves coordinated modifications

of the morphology, physiology and behavior of the species. In the female, the main

morphological changes occur within the ovaries and oviducts, where the foilicles

ripen and synthesize vitellus up to the eventual ovulation.

Considering the existence of only a few data on the reproductive biology of

Bothrops jararaca (Sazima^), our aim is the characterization of the ovarian cycle

of this species, through the observation of the growth and ripening of the ovarian

foilicles and eggs.

■Laboratório de Herpetologia, Instituto Butantan. Av. Vital Brasil, 1500 - CEP 05503-900 - S. Paulo, SP - Brasil

••Departamento de Histologia e Embriologia, ICB-USP

Recebido para publicação em 08.12.92 e aceito em 04.5.93.

2 3

5 6

11 12 13 14 15

JANEIRO-CINQUINI, T.R.F., LEINZ, F.F., FARIAS, E.C. Ovarian cycle of the snake Bothrops jararaca.

Mem. Inst. Butantan, v. 55, n. 1, p. 33-36, 1993.

MATERIAL AND METHODS

Ovariesand oviductsof 111 adultfemale Bothrops jararaca írom the South and

Southeast regions of Brazil were examined in the "Seção de Venenos" of the In¬

stituto Butantan during the period of one year. The female reproductive systenn

was dissected and the ovarian foilicles and eggs measured with a caliper ruie "in

situ".

The means of the ovarian foilicle diameters were assembled into four groups:

Class l-smaller than 0.5 cm in diameter; Class, II — 0.6 to 1.0 cm; Class III —

1.1 to 2.0 cm; Class IV — 2.1 to 3.0 cm. The eggs were classified only by the

mean of the diameters.

The presence or absence of sperm in the reproductive system of the females

was determined by microscopy of the luminal content of the oviduct.

RESULTS

The seasonal variation of the diameters of the ovarian foilicles and eggs of the

snakes Bothrops jararaca is shown in Fig. 1.

Ovarian foilicles of Class I dont were founded in some exemplaries during April,

July and August, but foilicles of Classes II were observed during the whole year.

Ovarian foilicles of the Classes III and IV occurred during the period from April

to September. They were at the stage of vitellogenesis and their maximum di¬

ameter was 3.0 cm. The presence of eggs was vehfied at the end of Spring and

Summer.

Of a total of 111 examined females, 45 were gravid: 18 in Springtime and 27

in Summer, in different stages of embryogenesis.

The smallest gravid female measured 76.0 cm in snout-vent length.

DISCUSSION

The lack of data on the reproductive cycle of snakes from the tropical and sub¬

tropical regions, where the seasons are not well defined, induced many research-

ers to believe in a nonexistence of a reproductive synchronism for these reptiles

(Seigel and Ford'°). However, in our experience of monthly observation of ovaries

and oviducts of 111 female Bothrops jararaca during one year, we verified the ex-

istence of a well-defined reproductive cycle in this species.

In snakes of temperate regions, foilicular growth starts at the end of Summer,

is interrupted during hibernation, and returns to grow at an accelerated rate in

Spring (Aldridge’; Licht^). In Bothrops jararaca, foilicles of Classes III and IV were

found in Autumn and Winter, suggesting a continuous growth aiso in these

seasons.

In the northern hemisphere, the different phases of the reproductive cycle of

most of the snakes are well defined. Ovulation and fertilization occur at the end

of Spring, and births happen at the end of Summer and beginning of Autumn

(Seigel and Ford'°). In the species under study, the ovulation probably occurs in

the Spring, since, after this time, no mature foilicles are found within the ovary,

whereas eggs are found in the oviduct.

Studies of Thamnophis sirtalis parietaUs (Bona-Galo and Licht^; Licht^) sug-

gested that the mating could be a stimulus to vitellogenesis and ovulation. In the

specimens of Bothrops jararaca that presented Class III and Class IV foilicles, mobil

spermatozoids were detected in the oviduct which was not the case in specimens

with eggs and foilicles of Classes I and II.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

JANEIRO-CINQUINI, T.R.F., LEINZ, F.F., FARIAS, E.C. Ovarian cycle of the snake Bothrops jararaca.

Mem. Inst. Butantan, v. 55, n. 1, p. 33-36, 1993.

MONTHS

Fig. 1: Seasonal change in foilicle diameter of B. Jararaca during 1985.

The females of snakes from tropical regions are in an advanced State of preg-

nancy in the hotter and more humid seasons of the year, the birth of youngs aiso

occurring at this time. In the species under study, the presence of eggs with em-

bryos at different stages of development was aIso detected in the hot and humid

months. According to Shine'' and Vinegar''*, the more constant temperature of

this period guarantee a normal development of the embryos.

CONCLUSION

1 — In Bothrops jararaca, the reproductive period is seasonal, occurring only

once per year; eggs and embryos are only observed during the hot and humid

periods of the year.

SciELO

10 11 12 13 14 15

JANEIRO-CINQUINI, T.R.F., LEINZ, F.F., FARIAS, E.C. Ovarian cycle of the snake Bothrops jararaca.

Mem. Inst. Butantan, v. 55, n. 1, p. 33-36, 1993.

RESUMO: O ciclo reprodutivo de Bothrops jararaca foi estudado através

da observação dos folículos ovarianos e ovos de 111 serpentes durante

o período de um ano. A vitelogênese foi observada durante o outono

e inverno, ocorrendo a ovulação provavelmente no início da primavera.

A prenhez foi constatada de novembro até março. A menor fêmea prenhe

media 76,0 cm de comprimento rostro-anal.

UNITERMOS: Serpente, reprodução, ciclo ovariano.

REFERENCES

1. ALDRIDGE, R.D. Female reproductive of cycles the snakes Arizona elegans

and Crotalus viridis ln new México. J.HerpetoL, y. 73, p. 187-192, 1979.

2. AMARAL, A. Contribuição para o conhecimento dos ofídios do Brasil. Mem.

Inst. Butantan. Anexos de Ofiologia, v. 7, p. 1-88, 1921.

3. BON A-GALO, A., LICHT, P. Effects of temperature on sexual receptivity and

ovarian recrudescence in the garter snake Thamnophis sirtalis parietalis.

Herpetologica, v. 39, p. 173-182, 1983

4. FITCH, FI.S. Reproductive cycles in tropical reptiles. Occas. Pap. Mus. Nat.

Hist. Univ. Kansas, v. 96, p. 1-53, 1982.

5. KOFRON, C.P. Female reproductive cycle of the neotropical snaileating snake

Sibon sanniolaln northern Yucatan, México. Copeia, p. 963-969, 1983.

6. LELOUP, P. Various aspects of venomous snake breeding on a large scale.

Acta Zool. Pathol. Antverpiensia, v. 78, p. 177-198, 1984.

7. LICFIT, P. Reptiles. In: LAMMING, G. E., ed. Marshalls physiology of

reproduction. Edinburgh: Churchill Livingston, 1984. v. 1, p. 206-282.

8. MURPFIY, J. B., MITCHELL, L. A. Miscellaneous note on the reproductive

biology of reptiles. Thirteen varieties of the genus Bothrops (Serpentes,

Crotalidae). Acta ZooL Pathol. Antverpiensia, v. 78, p. 177-198, 1984.

9. SAZIMA, I. Um estudo de biologia comportamental de jararaca [Bothrops

jararaca) com uso de marcas naturais. Mem. Inst. Butantan, v. 50, n.

3, p. 83-99, 1988.

10. SEIGEL, R.A., FORD, N. B. Reproductive ecology. In: Snakes ecology

and evolutionary biology. Toronto: Macmillan, 1987. chap. 8, p. 210-252.

11. SHINE, R. Flabitats, diets and sympatry in snakes; a study from Australia.

Can. J. Zool. (In press), 1977.

12. _Comparative ecology of three Australian snake species of the ge¬

nus Cacop/i/s (Serpentes, Elapidae). Copeia, p. 831-838, 1980.

13. _Ecology of eastern Australian whipsnake of the genus Desmania.

J. Herpetol., v. 14, p. 381-389, 1980.

14. SOLÓRZANO, A., CERDAS, L. Biologia reproductiva de la cascabel Cen-

troamericana Crotalus d. durissus (Serpentes, Viperidae) en Costa Rica.

Bev. Biol. Trop., v. 36, p. 221-226, 1987.

15. VINEGAR, A. Evolutionary implications of temperature induced anomalies

of development in snake embryos. Herpetologica, v. 30, p. 72-74, 1974.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

BOLETIM DE

BIOTECNOLOGIA

VOLUME 4 - 1993

ISSN 0103-6548

Secretaria de Estado da Saúde

Coordenação dos Institutos de Pesquisa

Instituto Butantan

COMISSÃO EDITORIAL

Rosalvo Guidolin

Wilmar Dias da Silva

Isaias Raw

Henrique Moisés Canter

Luiz Sebastião Prigenzi

Renata Lara Paes de Barros

SUMÁRIO

Otimização do processo de purificação industrial de toxoide tetânico por gel filtração.

Improvement in the industrial purification of tetanus toxoid by gel filtration.

Sally M.A. PRADO, Mary D.C. VANCETTO, José M. de OLIVEIRA, Fernando FRATELLI, Sandra

de J.D. MATHIAS, Hisako G. HIGASHI. 3

Esquema de hiperimunização eqüina mais conveniente à produção de plasma antiveneno Botrópico-

-Crotálico.

A more suitable equine hyperimmunization schedule for antivenom Bothrops-Crotalus plasma production.

Celso P CARICATI, Rosalvo GUIDOLIN, Ivone K. YAMAGUSHI, Josefina F. MORAIS, Wilmar DIAS

DA SILVA, Hisako G. HIGASHI. 9

BHK cell growth on microcarriers in a bioreactor.

Crescimento de células BHK em microcarregadores utilizando bioreactores.

Ronaldo Z. MENDONÇA, Carlos A. PEREIRA.

Boi. BiotecnoL, v. 4, p. 1-16, 1993.

2 3

5 6

11 12 13 14 15

Boi. Biotecnol.

V. 4, p. 3-8, 1993

OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO DE PURIFICAÇÃO INDUSTRIAL

DÉ TOXÓIDE TETÂNICO POR GEL FILTRAÇÃO

Sally Müller Affonso PRADO *

Mary Dalva Caparroz VANCETTO *

José Marcos de OLIVEIRA *

Fernando FRATELLI *

Sandra de Jesus Delgado MATHIAS *

Hisako Gondo HIGASHI **

RESUMO: A metodologia industrial para obtenção de Toxóide Tetânico

(T.T.) atual, consiste na pré-precipitação pelo (NH 4)2 SO 4 seguida de

gel filtração em Sephadex G-50, com a qual obtém-se grau médio de

pureza de 2.300 Lf/mgNP, sendo que o mínimo exigido pela O.M.S. é

1.000 Lf/mgNP. Visando basicamente a diminuição do tempo emprega¬

do no processo de purificação do T.T., utilizamos resinas cromatográfi-

cas de 2“ e 3“ geração, 0 Sephacryl S-100HR e 0 Superdex 75 prep

grade, respectivamente, que possibilitaram a eliminação da etapa de pré-

-precipitaçâo pelo (NH 4)2 SO 4 obtendo-se resultados com grau de pu¬

reza ao redor de 3.000Lf/mgNR A atividade imunogênica destes produtos

quando adsorvidos pelo Al (OHIg em concentração de 15Lf/ml foi de

4,5UI/ml em cobaios. A O.M.S. recomenda que 0 T.T. induza a forma¬

ção de no mínimo 2UI/ml nestes animais. O rendimento do processo

de purificação foi de 88,46%, que é similar ao obtido no processo atual.

A metodologia introduzida permitiu a diminuição do tempo empregado

neste processamento assim como a possibilidade de trabalhar-se com

purificação em sistema fechado (coluna cromatográfica).

UNITERMOS: Purificação, toxina, toxóide tetânico, gel filtração, Sephacryl

S-100HR, Superdex 75 prep grade.

INTRODUÇÃO

Vários métodos para purificação de toxina e anatoxina tetânica tem sido

descritos^'®'^'®’^°'^' rnas poucos podem ser aplicados em escala industrial para

* Seção de Vacinas Anaeróbicas do Instituto Butantan

■ ■ Divisão de Desenvolvimento Tecnológico e ProduçSo do Instituto Butantan. Av. Vital Brasil, 1500 - CEP 05503-900

- S. Paulo, SP. - Brasil. Suporte Técnico: Assessoria Científica da Pharmacia - Brasil

Recebido para publicação em 04.12.92 e aceito em 07.4.93.

2 3

5 6

11 12 13 14 15

PRADO, S.M.A, et al. Otimização do processo de purificação industrial de toxóide tetânico por gel

filtração. Boi. Biotecnol., v. 4, p. 3-8, 1993.

a produção de Toxóide Tetânico para uso humano. A importância desta purifica¬

ção baseia-se fundamentalmente na eliminação de substâncias alergênicas que

causariam uma sensibilização no organismo receptor quando da profilaxia contra

0 tétano.

A eficiência dos adjuvantes minerais utilizados nestes toxóides purificados é

maior pois diminui-se o fator de competição entre proteínas específicas e não

específicas na fase de adsorção^.

De acordo com as Normas da Organização Mundial da Saúde (W.H.O.) as ana-

toxinas tetânicas (A.T.T.), destinadas à produção de vacinas para uso humano,

devem apresentar um grau de pureza igual ou maior do que 1.000Lf/mg de nitro¬

gênio protéico'^.

A metodologia utilizada por nosso laboratório consiste na ultrafiltração mole¬

cular (lOKd), pré-precipitação pelo sulfato de amónio e gel filtração em Sepha-

dex G-50, com a qual obtém-se grau médio de pureza de 2.300Lf/mg NP

Visando basicamente a diminuição do tempo empregado np processo de purifi¬

cação do Toxóide Tetânico, nos propusemos verificar a possibilidade de eliminar

a etapa de pré-precipitação pelo sulfato de amónio, substituindo-a pela gel filtra¬

ção nas resinas de 2® e 3® geração, Sephacryl S-100HR e Superdex 75 prep gra¬

de, respectivamente (Pharmacia LKB)^.

MATERIAL E MÉTODOS

OBTENÇÃO DE TOXINA TETÂNICA (T.T.):

Lotes de 360 litros produzidos por processo fermentativo^ utilizando a cepa

Clostridium íefan/Harvard-Caracas, desenvolvida em meio Müeller modificado por

Latham^.

OBTENÇÃO DE ÃNATOXINÃ TETÂNICÃ (Ã.T.T.):

Ãtravés da atividade destoxificante de 10%o v/v de formalina, durante 30 dias

a 37°C, sobre as T.T previamente concentradas 6 a 10 vezes por ultrafiltração

molecular (lOKd) e esterilizadas por filtração através de cartuchos de 0,22u.

PURIFICÃÇÃO DÃ ANÃTOXINÃ TETÂNICA (A.T.T.):

30 litros de A.T.T. eram lavados com 60 litros de água destilada e concentra¬

dos em sistema Peilicon (Millipore) com membrana de lOKd, recolhíamos 3 amos¬

tras para proceder à purificação pelos métodos abaixo descritos;

MÉTODO A: A amostra era precipitada com sulfato de amónio à 33% e ultracen-

trifugada. Após a diálise e nova filtração tangencial que reduzia o volume cerca

de 10 vezes, a A.T.T. era introduzida em coluha de Sephadex G-50 (Pharmacia

BCP 252/60) e eluída com solução fisiológica tamponada pH 6,8”.

MÉTODO B: A amostra era aplicada em uma coluna (Pharmacia XK 26/70) com

Sephacryl S-100HR, equilibrada com solução fisiológica tamponada pH 7,0 com

fluxo de 1,5ml / minuto. O volume de amostra aplicado correspondia a 1/3 do

volume total da coluna. Absorção ultravioleta a 280nm foi empregada como indi¬

cação aproximada da concentração de proteínas.

MÉTODO C: A metodologia é similar àquela utilizada no Método B, onde apenas

substituiu-se a resina Sephacryl S-100HR pelo Superdex 75 prep grade.

TESTE DE CONTROLE DO PROCESSAMENTO DE PURIFICAÇÃO:

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

PRADO, S.M.A. et al. Otimização do processo de purificação industrial de toxóide tetânico por gel

filtração. Boi. Biotecnol., v. 4, p. 3-8, 1993.

7 - DETERMINAÇÃO DO LIMITE DE ELOCULAÇÁO (Lf): conforme preconizado

pela W.H.0.9' 'T '

2 - DETERMINAÇÃO DO NITROGÊNIO PROTEICO: avaliação quantitativa de ni¬

trogênio protéico e do nitrogênio não protéico pelo método Kjeldahl'^.

3 - DETERMINÃÇÃO DE EORMALDEIDO RESIDUAL: determinação quantitativa

de formaldeído, em ppm. O máximo permitido é de 200 ppm'^.

4 - DETERMINAÇÃO DÃ PUREZÃ ÃNTIGÊNIOÃ: é expressa através da relação

do valor em Lf/ml e a concentração em mg de nitrogênio protéico/ml. A A.T.T.

deverá ter pelo menos I.OOOLf/mg de nitrogênio protéico’^.

5 - PROVA DE TOXICIDADE ESPECIEICA: conforme preconizada pela W.H.O.''2,

6 - PROVA DE ATIVIDADE IMUNOGÊNICA: através do Método Americano (NIH)^^.

RESULTADOS

Os resultados cromatográficos obtidos através dos métodos A, B e C estão

expressos nas Tabelas 1 e 2.

As separações cromatográficas de A.T.T. pelas resinas Sephacryl S-100HR e

Superdex 75 prep grade encontram-se nas Fig. 1 e 2 respectivamente.

Todas as amostras submetidas à Prova de Toxicidade Específica apresentaram

resultados negativos,ou seja, atóxicas.

A Prova de Atividade Imunogênica das A.T.T. purificadas teve resultados iguais

ou maiores que 3,OUI/ml, sendo que, o título mínimo deve ser de pelo menos

2UI/mPT

TABELA 1

Resultados de purificação através de gel filtração em Sephadex G-50

(método A) e em Sephacryl S-100HR (método B)

A.T.T.

Lf TOTAL

Lf/mg N

RENDIMENTO

FORMALDEÍDO

xlO-3

Protéico

ug/ml

INICIAL

15.6

923

880

SEPHACRYL S-lOOHR **

13.8

3000

88.5

5.8

INICIAL

10800

620

890

SEPHACRYL S-100HR **

91.53

2755

92.6

5.4

SEPHADEX G-50 *

10320

1651

92.8

7.6

INICIAL

9900

471

640

SEPHACRYL S-100HR**

115.24

5469

99.6

SEPHADEX G-50 *

9200

2063

97.3

4.4

Purificação de A.T.T. pelo método A

Purificação de A.T.T. pelo método B

SciELO

10 11 12 13 14 15

PRADO, S.M.A. et al. Otimização do processo de purificação industrial de toxóide tetânico por gel

filtração. Boi. Biotecnol., v. 4, p. 3-8, 1993.

TABELA 2

Resultados de purificação através de gel filtração em Sephadex G-50

(método A) e em Superdex 75 prep grade (método C)

A.T.T.

Lf TOTAL Lf/mg N

xlO'^ Protéico

RENDIMENTO

FORMALDEÍDO

ug/ml

INICIAL

9900

471

640

SUPERDEX 75‘*

105

2500

SEPHADEX G-50*

9200

2063

97.3

4.4

INICIAL

18750

925

900

SUPERDEX 75**

162.5

2156

97.6

5.6

SEPHADEX G-50*

14664

1677

INICIAL

18560

617

540

SUPERDEX 75**

105,3

2238

100

3.4

SEPHADEX G-50*

18048

1979

98.1

* Purificação de A.T.T. pelo método A

‘ * Purificação de A.T.T, pelo método C

A—280nm

Fig. 1: Gel filtração de ATT em Sephacryl S-100HR

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

PRADO, S.M.A. et al. Otimização do processo de purificação industrial de toxóide tetânico por gel

filtração. Boi. Biotecnol., v. 4, p. 3-8, 1993.

A metodologia industrial para obtenção de Toxóide Tetânico utilizada no Insti¬

tuto Butantan consiste basicamente em uma pré-precipitação pelo sulfato de amó¬

nio seguida de gel filtração em Sephadex G-50 com a qual obtém-se grau médio

de pureza de 2.300Lf/mgNP”. O tempo empregado neste processo de purifica¬

ção é de 4 dias, sendo que 50% deste tempo consiste na precipitação pelo sulfa¬

to de amónio, ultracentrifugações e diálise.

Utilizando as resinas cromatográficas Sephacryl S-100HR e Superdex 75 prep

grade, verificamos que foi possível eliminar o uso do sulfato de amónio, permitin¬

do a diminuição do tempo empregado neste processo assim como, a possibilida¬

de de trabalhar-se com purificação em sistema fechado (coluna cromatográfica).

Pelos resultados obtidos verificamos que o grau de pureza do produto é maior

quando utilizamos as resinas Sephacryl S-100HR e Superdex 75 prep grade (Ta¬

belas 1 e 2), (Fig. 1 e 2) e nos permitem sugerir como método industrial prático

e económico para purificação de Toxóide Tetânico.

DISCUSSÃO

A purificação de Toxóide Tetânico para uso humano é de grande importância,

pois permite eliminar componentes inespecíficos desnecessários a imunidade con¬

tra o tétano, também é importante quando este imunógeno é associado a outras

vacinas de uso freqüente na atualidade.

■AGRADECIIVIENTOS

Aos funcionários da Seção de Vacinas Anaeróbicas pela colaboração no de¬

correr do desenvolvimento do presente trabalho.

ABSTRACT: The use of Sephacryl-SlOOHR and Superdex 75 prep grade

for preparing tetanus toxoid deleted the (NH 4)2 SO 4 precipitation step

SciELO

10 11 12 13 14 15

PRADO, S.M.A. et al. Otimização do processo de purificação industrial de toxóide tetânico por gel

filtração. Boi. Biotecnol., v. 4, p. 3-8, 1993.

A-280nm _

-1

60 80 100 120 140

Numero do Tubo

Fig. 2: Gel filtração de ATT em Superdex 75 prep grade

DISCUSSÃO

A purificação de Toxóide Tetânico para uso humano é de grande importância,

pois permite eliminar componentes inespecíficos desnecessários a imunidade con¬

tra 0 tétano, também é importante quando este imunógeno é associado a outras

vacinas de uso freqüente na atualidade.

A metodologia industrial para obtenção de Toxóide Tetânico utilizada no Insti¬

tuto Butantan consiste basicamente em uma pré-precipitação pelo sulfato de amó¬

nio seguida de gel filtração em Sephadex G-50 com a qual obtém-se grau médio

de pureza de 2.300Lf/mgNP”. O tempo empregado neste processo de purifica¬

ção é de 4 dias, sendo que 50% deste tempo consiste na precipitação pelo sulfa¬

to de amónio, ultracentrifugações e diálise.

Utilizando as resinas cromatográficas Sephacryl S-100HR e Superdex 75 prep

grade, verificamos que foi possível eliminar o uso do sulfato de amónio, permitin¬

do a diminuição do tempo empregado neste processo assim como, a possibilida¬

de de trabalhar-se com purificação em sistema fechado (coluna cromatográfica).

Pelos resultados obtidos verificamos que o grau de pureza do produto é maior

quando utilizamos as resinas Sephacryl S-100HR e Superdex 75 prep grade (Ta¬

belas 1 e 2), (Fig. 1 e 2) e nos permitem sugerir como método industrial prático

e econômico para purificação de Toxóide Tetânico.

AGRADECIMENTOS

Aos funcionários da Seção de Vacinas Anaeróbicas pela colaboração no de¬

correr do desenvolvimento do presente trabalho.

ABSTRACT: The use of Sephacryl-SlOOHR and Superdex 75 prep grade

for preparlng tetanus toxoid deleted the (NH 4)2 ^^4 precipitation step

2 3

5 6

11 12 13 14 15

PRADO, S.M.A. et al. Otimização do processo de purificação industrial de toxóide tetânico por gel

filtração. Boi. Biotecnol., v. 4, p. 3-8, 1993.

and resulted in a final preparation with a degree of purity pf about

3000Lf/mg NP. The material was very immunogenic in guinea pigs. The

yield of the purification method was of 88,46% similar to the obtained

by the classical industrial process. The new methodology is time saving

and allowed to works in a closed system (chromatographic column).

KEYWORDS: Purification, toxins, tetanus toxoids, gel filtration, Sephacryl-

-S100HR, Superdex 75 prep grade.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. BIZZINI, B., TURPIN, A., BAYMOND, M. Production et purification de la to-

xine tetanique. Ann. Inst. Pasteur, v. 116, p. 686-71 1, 1969.

2. GEL filtration: theory and practice. Pharmacia LKB Biotecnology. A B.

S-75182. Uppsala, Sweden, 1991.

3. HERMET, P. Van. Vaccine production as a unit process. Prog. Ind. Micro-

biol, V. 13, p. 248-260, 1974.

4. LARS, H. et al. Properties, in theory and practice, of novel gel filtration me¬

dia forstand liquid chromatography. J. Chromatogr., v. 476, p. 329-344,

1989.

5. LATHAM, W.C., BENT, B.F., LEVINE, L. Tetanus toxin production in the

absence of protein. AppI. Microbiol., v. 10, p. 146-152, 1962.

6. LATHAM, W.C. et al. Purification and characterization of tetanus toxoid and

toxin. J. Immunol., v. 95, n. 3, p. 487-493, 1965.

7. _. Preparative procedure for the purification of toxoid by gel filtra¬

tion. AppI. Microbiol., v. 15, n. 3, p. 616-621, 1967.

8. LEVINE, L., STONE, J. L. The purification of tetanus toxoid by ammonium

sulfate fractionation. J. Immunol., v. 67, p. 235-241, 1951.

9. LYING, G., WEISS BETZON, M. The quantitative estimation of diphteria and

tetanus toxins: I — The floculation testand Lf — definition. J. Biol. Stand.,

V. 15, p. 27-37, 1987.

10. OZUTSUMI, K. et al. Rapid, simplified method for production and purifica¬

tion of tetanus toxins. AppI. Environ. Microbiol., v. 49, n. 4, p. 939-943,

1985.

11. PRADO, S. M. A., VANCETTO, M. D. C., FRATELLI, F., PRAL, M. M., OLI¬

VEIRA, J. M., HIGASHI, H. G. Purificação industrial de toxóide tetânico

por gel filtração. Boi. Biotecnol., v. 3, p. 11-16, 1992.

1 2. WORLD HEALTH ORGANIZATION. Manual for the production and control

of vaccines: tetanus toxoids. Geneva: W.H.O., 1977.

Boi. Biotecnol.

V. 4, p. 9-12, 1993

ESQUEMA DE HIPERIMUNIZACÃO EQÜINA MAIS

CONVENIENTE À PRODUÇÃO DE PLASMA ANTIVENENO

BOTRÓPICO-CROTÁLICO

Celso Pereira CARICATI ♦

Rosalvo GUIDOLIN **

Ivone Kazuko YAMAGUSHI **

Josefina Farina MORAIS **

Wilmar DIAS DA SILVA ***

Hisako Gondo HIGASHI ****

« « * «

RESUMO: Na hiperimunização mista de cavalos com antígenos botró-

pícos e crotálicos é possível que a ação proteolítica dos venenos botró-

picos degrade, mesmo que parcialmente, os venenos crotálicos quando,

misturados antes da inoculação nos eqüinos. Esta atividade botrópico-

-proteolítica pode ser um dos fatores responsáveis pelas reduções pela

metade, aproximadamente, seja dos títulos soroneutralizantes médios

seja da porcentagem de animais que respondem ao estímulo imunogê-

nico a ambos os venenos, se comparados com aqueles obtidos nos ani¬

mais inoculados com os mesmos venenos isolados e em dias diferentes.

UNITERMOS: Venenos, hiperimunização botrópico-crotálico, atividade

proteolítica.

INTRODUÇÃO

Os soros antivenenos botrópico-crotálico são de utilidade nos casos em que

há dúvidas sobre o gênero ao qual pertence a serpente responsável pelo aciden¬

te. Tais dúvidas podem ocorrer ou porque a captura do ofídio não foi realizada

e as lesões locais do acidente sejam bizarras ou por falta de conhecimento da

pessoa que estiver socorrendo o acidentado.

• Seção de Obtenção de Plasmas Hiperimunes, Instituto Butantan

• • Seção de Concentração e Fracionamento de Soros, Instituto Butantan

• • ■ Laboratório Especial de Imunoquimica, Instituto Butantan

Divisão de Desenvolvimento Tecnológico e Produção do Instituto Butantan - Av. Vital Brasil, 1500

CEP 05503-900 - São Paulo, SP - Brasil

Recebido para publicação em 28.01.93 e aceito em 03.05.93

2 3

5 6

11 12 13 14 15

CARICATI, C.P., GUIDOLIN, R., YAMAGUSHI, I.K., MORAIS, J.R, DIAS DA SILVA, W., HIGASHI, HG,

Esquema de hiperimunizaçâo equina mais conveniente à produção de plasma antiveneno Botrópico-

-Crotálico. Boi. Biotecnol., v. 4, p, 9-12, 1993.

A produção do antiveneno botrópico-crotálico era feita por inoculação em ca¬

valos, de mistura de venenos botrópicos e crotálicos. Os soros obtidos, via de re¬

gra, apresentavam títulos baixos de anticorpos antiveneno crotálico. 0 enrique¬

cimento desses soros com o anticrotálico exige o uso de preparações muito po¬

tentes para evitar a diluição dos anticorpos botrópicos. Tendo em vista que os ve¬

nenos botrópicos são ricos em enzimas proteolítlcas^-^, potencialmente capazes

de clivar a crotoxina'* e torná-la menos imunogênica, foi delineado esquema de

imunização dos cavalos, injetando-os com os venenos botrópicos e crotálicos iso¬

lados e em diferentes locais. Os respectivos títulos neutralizantes foram determi¬

nados pelo método de Vital Brasil'. Os resultados foram comparados tanto do

ponto de vista de títulos quanto do de porcentagens de animais que responderam

a ambos os antígenos. Todos os animais eram soroprodutores e submetidos a di¬

versas reimunizações com os venenos botrópicos e crotálicos antes destas expe¬

riências.

MATERIAL E MÉTODOS

CAVALOS: Aqimais de raça indefinida, pesando ao redor de 350 quilos, com qua¬

tro a oito anos de idade por ocasião do início da hiperimunizaçâo. Todos os animais

eram soroprodutores e submetidos a diversas reimunizações com os venenos bo¬

trópicos e crotálicos antes destas experiências.

ANTÍGENO: Venenos botrópicos — obtidos de sete espécies do gênero botrópico

(B. jararaca, B. jararacussu, B. neuwiedi, B. pradoi, B. cotiara, B. alternatuse B. moo-

jeni), misturados na proporção de 50% de 6. jararaca e 8,33% de cada um dos

seis venenos mencionados. Os venenos, até o momento da preparação dos antí¬

genos, foram conservados em estado seco (seco a vácuo) e a 4°C.

Venenos crotálicos — venenos de Crotalus durissus terrificus e de Crotalus du-

rissus coilineatus, misturados na proporção de 50% de cada uma das espécies.

A técnica de conservação foi a mesma descrita para os venenos botrópicos.

ESOUEMAS DE REIMUNIZAÇÃO UTILIZADOS

TABELA 1

Esquemas de reimunização: mg de venenos, volume de salina e de adjuvante

de Freund Incompleto inoculado e espaço de tempo entre as inoculações.

ESQUEMA

DIA

11“

12“

13“

(M)

(Ml

VENENO

S.OmgB+S.OmgC

2.5mgB+2,5mgC

2,5mgB+2,5mgC

E 1

SAUNA

5ml

lOmI

lAFII

ADJUVANTE

5ml

“

—

“

DIA

7“

14“

16“

VENENO

5,0mgC

5,0mgB

5,0mgC

5,0mgB

SALINA

5ml

lOmI

(AFII

lAFI)

ADJUVANTE

5ml

B - botrópico - C - crotálico - M - mistura - lAFII - Adjuvante de Freund Incompleto.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

CARICATI, C.P., GUIDOLIN, R., YAMAGUSHI, I.K., MORAIS, J.F., DIAS DA SILVA, W., HIGASHI, H.G.

Esquema de hiperimunizaçâo eqüina mais conveniente à produção de plasma antiveneno Botrópico-

-Crotálico. Boi. Biotecnol., v. 4, p. 9-12, 1993.

Os antígenos foram inoculados na região dorsal dos animais e os volumes totais

subdivididos em três partes e cada uma delas injetada por via subcutânea, em pontos

diferentes, distando, aproximadamente, de 20cm cada ponto.

Os títulos de antivenenos foram determinados 10 dias após a última inoculação

em cada esquema. Os números de cavalos envolvidos nas observações foram os

seguintes: esquema tradicional utilizado pelo Instituto Butantan (E 1), 250 cava¬

los; esquema proposto (E 2), 55 cavalos.

Os animais foram constantemente alimentados com sete quilos diários de ra¬

ção balanceada (22% de proteína), capim verde ou feno (dependendo da época)

e água "ad libitum”.

SANGRIAS PARA PRODUÇÃO; O sangue foi extraído por punção da veia jugular,

na proporção de 4% em relação ao peso dos animais (2% iniciais e 2% após 48

horas), e coletados em bolsas plásticas contendo 400 ml de solução anticoagu-

lante isotônica (1,47% de dextrose, 4,8% de citrato de sódio e 1,47% de ácido

cítrico).

DOSEAMENTO: Para a determinação dos títulos soroneutralizantes (SN) dos anti¬

venenos, foi utilizado 0 método de Vital BraziP.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados obtidos com os diferentes esquemas de reimunização encontram-

-se na Tab. 2.

TABELA 2

Títulos SN de cavalos submetidos a diferentes esquemas de reimunização

com venenos botrópicos e crotálicos.

ESQUEMAS

NÚMERO

ANIMAIS

títulos 'SN MÉDIOS % DE ANIMAIS

COM TiTULOS SN

BOTRÓPICO

CROTÁLICO

BOTRÓPICO

CROTÁLICO

SOMENTE

BOTRÓPICO

E 1

250

1,23

0,28

35,7

64,2

1,87

0,57

79,2

20,8

• mg de venenos de referência IB. jararaca e C. d. íe/z/feosf neutralizados por ml de plasma. SN - Soroneutralizante.

Pelo exame da Tab. 2, observa-se que E 2 proporcionou um aumento de 103,5%

no título SN do antiveneno crotálico em relação ao esquema que vinha sendo apli¬

cado. Deve, ainda, ser ressaltada a porcentagem de animais que respondem a am¬

bos os estímulos imunogênicos (botrópico e crotálico), substancialmente

aumentada.

• Supõe-se que os resultados superiores de SN, obtidos com a fração crotálica

pela aplicação do E 2, estariam ligados à ausência de atividade proteolítica dos

venenos botrópicos^''’^ que poderia agir sobre o antígeno(s) crotálico quando mis¬

turados mesmo sendo o material mantido a 4°C antes da inoculação.

No que diz respeito ao consumo de venenos exigido pelo E 2, nas condições

destas experiências, em relação ao E 1, ele foi 20% menor.

SciELO

10 11 12 13 14 15

CARICATI, C.P., GUIDOLIN, R., YAMAGUSHI, I.K„ MORAIS, J.F., DIAS DA SILVA, W., HIGASHI, H.G.

Esquema de hiperimunizaçâo eqüina mais conveniente à produção de plasma antiveneno Botrópico-

-Crotálico. Boi. Biotecnol., v. 4, p, 9-12, 1993.

ABSTRACT: In the h.orse's mixed hyperimmunization with Bothrops Cro-

fa/us Venoms it is possible that the Soíhrops venom's proteolytic action

degenarates pari of the Crofa/us venom if lhey are mixed before inocu-

lation, probably this proteolytic activity is one of the factors responsa-

ble by seroneutralization titer reduction and animais that reply to Crotalus

and Bothrops immunogenic stimulation, when compared with the re-

sults obtained with the same venoms inoculated separately and in dif-

ferent days.

KEYWORDS: Venoms Bothrops-Crotalus hyperimmunization, proteoly¬

tic activity.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 .

BRAZIL, V. Dosagem do valor antitóxico dos serums antipeçonhentos. Trib.

med. (Rio de Janeiro), v. 14, n. 3, p. 39, 1908.

DEUTSCH, H.F., DINIZ, C.R. Some proteolytic activities of snakes venoms.

J. biol. chem., v. 216, p. 17, 1955.

FARMACOPEIA dos Estados Unidos do Brasil. 2. ed. São Paulo: Siqueira,

1959. p. 1034.

IWANAGA, S., SUZUKI, T. Enzimes in snakes. In: LEE, C. Y. Snake venoms.

Berlin: Springer-Verlag, 1979, Cap.21, p.684 (Handbook of experimen¬

tal pharmacology, 52).

KOCHOLATY, W.F., LIDFORD, E.B., DAYLY, J.G., BILLINGS, T.A. Toxicity

and some enzymatic properties and activities in the venom of Crotalinae,

Elapidae and Vipiridae. Toxicon, v.9, p.31, 1971.

MEBS, D. A comparative study of enzyme activities in snake venoms. Inst.

J. Biochem., v. 1, p. 335, 1970.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

Boi. Biotecnol.

V. 4, p. 13-16, 1993

BHK CELL GROWTH ON MICROCARRIERS IN A BIOREACTOR

Ronaldo Z. MENDONÇA

Carlos A. PEREIRA «

ABSTRACT: BHK21C13 an VERO cells were cultivated on microcarriers

in a 5 liters bioreactor. The BHK21C13 cell concentration increased gra-

dually to a peak of 1.5 x 10® cells/ml after 4 days of culture, and that

of VERO cells reached a peak of 5 x 10® cells/ml after 6 days of culture.

The BHK21C13 cells were shown to grow faster than VERO cells, and

after 4 days of culture, about 98% of microcarriers were totally covered

of BHK21C13 cells, when only about 35% of them were totally covered

of VERO cells. This procedure was found to be efficlent to prepare the-

se cell cultures in concentrations high enough to allow its utilization as

a substract for virus growth and veterinarian or human vaccines pro-

duction.

KEYWORDS: BHK21C13 cells, bioreactor, microcarriers

The BHK21 clone 13 (BHK21C13) cells have been used for the preparation of

several different vaccines of veterinary use, such as foot and mouth disease and

rabies. These cells can grow in suspension and bioreactors of large volumes have

been utilized by the veterinarian vaccine manufactors for its production^^.

A great diversity of cell cultures of mammalian 2 , 3 . 4 , 15,16 gvian origin^'® as well

as human diploid cell”''^ and heteroploid cell lines®-'^ are currentiy used today as

substract for human vaccine production. Montagnon et al 1984a and 1984b®'®

developed a large-scale methodology for VERO cell culture and production of vac¬

cines in this cell line, which has been recommended by the World Health Organi-

zation as a substract for human vaccine production, such as rabies and

poliomielitis’®. Recentiy, Rifky, 1987'® utilized a low capacity bioreactor of 5 liters,

allowing the preparation of VERO cell cultures in suspension, to vaccine production.

Laboratório de Imunologia Virai Instituto Butantan — Sâo Paulo — 05503-900 — S. Paulo, SP — Brazil

• To whom correspondence should be addressed

Recebido para publicação em 01.03,93 e aceito em 03.05.93.

2 3

5 6

11 12 13 14 15

MENDONÇA, R.Z., PEREIRA, C.A. BHK cell growth on microcarriers in a bioreactor. Boi. Biotecnol.,

V. 4, p. 13-16, 1993.

It is of great interest, the standardization of simplified methods of cell cultures

to prepare vaccines for veterinarian as well as human use, suitable for developing

countries where high tecnology infrastructure is still not available and where several

virai diseases are usually endemic.

Microcarriers (Cytodex I — Pharmacia) at a concentration of 2 mg/ml were

washed three times in phosphate buffered saline (PBS) without Ca + '*’ and Mg + +

and autoclaved at 120°C for 30 minutes. After cooling at room temperatura, they

were incubated with 200 ml of fetal calf serum (FCS) for 30 minutes. The cells

were then added and mantained at 37°C and 50 rpm.

BHK21C13 cells, obtained from the Instituto Pasteur, Sâo Paulo, Brasil, ánd VERO

cells obtained from the Pfizer Laboratories, São Paulo, Brasil, were cultivated in

Leibovitz (L15) médium, suppiemented with 2 mM of glutamine and containing

5% fetal calf serum (FCS). A cell bank prepared with these cells was used in all

the experiments. The cells were grown in monolayer cultures (Roux bottles) or

in suspension, using a Ceiligen Cell Culture System (New Brunswick Scientific

Co., Ltda.), with work capacity of 3.7 liters, coritaining 2mg/ml of microcarriers

(Cytodex I — Pharmacia). Suspensions of 8 x 10'^ cells/ml in L15 médium, and

5% FCS, were added to the bioreactor maintained at 37°C and 50 rpm. The

microcarriers were daily collected, observed at the microscope and the cells count-

ed in a Neubauer chamber.

Fig. 1. Kinetics of BHK21C13 and VERO cell growth (A) and attachment (B) to microcarri¬

ers in a 5 liters bioreactor. 2 mg/ml of microcarriers suspended in 3.7 liters of médium

in a bioreator, were inoculated with 8 x 10'^ BHK21C13 (□) or VERO cells ( a ). The cul¬

tures were performed at 37°C and 50 rpm and different times after, samples were taken,

the percents of microcarriers totally covered by cells were evaluated by microscopical ob-

servation, and the number of cells, expressed as Logra of cells/ml, was obtained by count-

ing the cells after separation from the microcarriers by trypsin treatment.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

MENDONÇA, R.Z., PEREIRA, C.A. BHK cell growth on microcarriers in a bioreactor. Boi. Biotecnol.,

V. 4, p. 13-16, 1993.

As shown in Figure IA, the BHK21C13 cell concentration increased gradually

to a peak of 1.5 x 10® cells/ml after 4 days of culture and remained high until day

7 of culture. The VERO cell growth paralleled that of BHK21C13 cells, but the cell

concentration was always lower, reaching a peak of 5 x 10® cells after 6 days of

culture. The data in figure 1B confirm that on figure IA, showing that after 4 days

of culture about 98% of microcarriers were totally covered of BHK21C13 cells,

when oniy about 35% of microcarriers were totally covered of VERO cells. A high

percent (about 80%) of microcarriers totally covered of VERO cells were observed

oniy after 7 days of culture.

Different types of cell cultured vaccines have been padronized and used in sever-

al countries^i°'''^''Ti7,i8,i9^ in order to replace those prepared in animal tissues,

which often continues to be used in developing countries. Recentiy-developed

vaccines can oniy be produced in cell cultures, which constitute a technology

that many countries are not able to easily acquire or develop, due to high costs

or lack of suitable infrastructure.

With the aim to develop a methodology that permits the establishment of cell

cultures, and consequentiy the production of vaccines for veterinarian or human

use, we carried on the technological studies presented in this paper. We describe

a methodology that permits the production of veterinarian vaccines with BHK21C13

cells, as well as human vaccines with VERO cells, in a small and simple to handie

bioreactor. This methodology is suitable for countries that do not dispose of high

infrastructure and where several diseases, that can be avoided by vaccination, are

endemic and the need of a local production of good vaccines is important.

ACKNOWLEDGEMENTS

This Work was supported by grants from the European Economic Community

(EEC TS2*0190-F. EDB) and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de S.

Paulo (FAPESP). C. A. Pereira is a recipient of CNPq research fellowship. The authors

are grateful to A. C. Barbosa and M. L. Silva for their technical assistance.

RESUMO: Células BHK21C13 e VERO foram cultivadas em microcarre-

gadores em um bioreator de 5 litros. A concentração de células BHK21C13

aumentou gradualmente atingindo um pico de 1.5 x 10® células/ml após

4 dias de cultura, e a concentração de células VERO alcançou um pico

de 5 X 10® células/ml após 6 dias de cultura. As células BFIK21C13 apre¬

sentaram um crescimento mais rápido do que o apresentado pelas célu¬

las VERO, e após 4 dias de cultura aproximadamente 98% dos

microcarregadores mostraram-se totalmente cobertos de células

BHK21C13, quando apenas aproximadamente 35% deles mostraram-se

totalmente cobertos de células VERO. Este processo mostrou-se eficiente

para o preparo destas culturas celulares em concentrações altas o sufi¬

ciente para permitir sua utilização como substrato para o crescimento

de vírus e produção de vacinas para uso veterinário e humano.

UNITERMOS: Células BHK21C13, bioreator, microcarregador

REFERENCES

1. ARAI, Y.T., OGATA, T., OYA, A. Studies on japanese produced chick em-

bryo cell culture rabies vaccines. Am. J. Trop. Med. Hyg., v. 44, p.

131-134, 1991.

2 3

5 6

11 12 13 14 15

MENDONÇA, R.Z., PEREIRA, C.A. BHK cell growth on microcarriers in a bioreactor. Boi. Biotecnol.,

V. 4, p. 13-16, 1993.

2. ATANASIU, P., TSIANG, H., GAMET, A. Nouveau vaccin antirabique hu-

main de culture cellulaire primaire. Ann. Microbiol. Ilnst. Pasteur)., v.

125B, p. 419-432, 1974.

3. BERLIN, B.S., MITCHELL, J.R., BURGOYNE, G.H., OLESON, D., BROW,

W.E., GOSWICK, C., MCCULLOUGH, N.B. Rhesus diploid rabies vacci-

ne (adsorbeb). A new rabies vaccine. Resuits of initial clinicai studies of

preexposure vaccination. J. Amer. Ass., v. 247, p. 1726-1728, 1982.

4. BURGOYNE, G.H., KAJIYA, K.D., BROWN, D.W., MITCHELL, J.R. Rhesus

diploid rabies vaccine (adsorbed): a new rabies vaccine using FRhL-2 cells.

J. Infect. Dis., v. 152, p. 204-210, 1985.

5. KONDO, A., TAKASHIMA,Y., SUZUKI, M. Inactivated rabies vaccine of chick

embryo cell culture origin. Symp. Ser. Immunobiol. Stand., v. 21, p.

182-189, 1974.

6 . MONTAGNON, B.J., FANGET, B., NICOLAS, A.J. The large scale cultiva-

tion of VERO cells in microcarrier culture for virus vaccine production. Pre-

liminary resuits for killed poliovirus vaccine. Dev. Biol. Stand., v. 47, p.

55-64, 1981.

7. _FOURNIER, P., VINCENT-FALOUET, J.C. A new rabies vacci¬

ne for human use: preliminary report. In: CONGRESS RABIES IN THE TRO-

PICS, Tunis. Proceedings, [s.n.t.] p. 3-6, 1983.

8 . ______ VINCENT-FALOUET, J.C., FANGET, B. Thousand litres scale

microcarrier culture of VERO cells. Dev. Biol. Stand., v. 55, p. 37-42,

1984.

9. _FANGET, B., VINCENT-FALOUET, J.C. Industrial-scale produc¬

tion of inactivated poliovirus vaccine prepared by culture of VERO cells

on microcarriers. Rev. Infect. Dist., v. 6, p. 210-213, 1984.

10. MERED, B., ALBRECHT, HOPE, E. HOPPS, PETRICCIANI, J.C., SALK, J.

Propagation of poliovirus in microcarrier cultures of three monkey cell li-

nes. J. Biol. Standard., v. 9, p. 137-145, 1981.

11. PLOTKIN, S.A. Vaccine production in human diploid cell strain. Am. J. Epi-

demiol., V. 94, p. 303-306, 1971.

12. _Rabies vaccine prepared in human cell culture: progress and

perspectives. Rev. Infect. Dist., v. 2, p. 443-447, 1980.

13. RIFKY, M. EL-KARAMANI. Production in VERO cells of an inactivated rabies

vaccine from strain FRV/K for animal and human use. Acta Viroi, v. 31,

p. 321-328, 1987.

14. ROUMIANTZEFF, M., AJAN, N., MONTAGNON, B., VINCENT FALOUET,

J.C. Rabies vaccine produced in cell culture. Ann. Inst. Pasteur. Viroi,

V. 136E, p. 413-424, 1985.

15. SUREAU, P., PERRIN, P., HORAUD, F. A rabies vaccine produced in a non-

-tumorogenic rabbitcell line. Dev. Biol. Stand., v. 60, p. 133-139, 1985.

16. VAN WEZEI, A.L., VAN STEENIS, G. Production of an inactivated rabies vac¬

cine in primary dog kidney cells. Dev. Biol. Stand., v. 40, p. 69-75, 1978.

17. WORLD HEALTH ORGANIZATION. Transfer of technology for rabies vacci¬

ne production: new strains available for VERO and BHK cells culture. Buli.

WHO., p. 65-941, 1987.

18. _Requeriments for continous cell lines used for biological subs-

tances. WHO Tech. Rep. Ser., n. 745, p. 99-115, 1987.

19. _ Acceptability of cell substracts for production of biologicals.

WHO Tech. Rep. Ser., n. 747, p. 5-24, 1987.

SciELO

10 11 12 13 14 15 16

COMPOSIÇÃO, FOTOLITOE IMPRESSÃO

IMPRENSA OFICIAI

DO ESTADO SAIMESP

Rua da Mooca, 1921 — Fone: 291-3344

Vendas, ramais; 257 e 325

Telex; 011-34557 - OOSP

Caixa Postal: 8231 — Sdo Paulo

C.Q.C. (M.F.) N.« 48.066.047/0001-84

GOVERNO DE SÃO PAULO

CUNS’UUIM^J UM fUtUHi} Mt LHUM

SciELO

INSTRUÇÕES AOS AUTORES

1. Somente serão aceitos trabalhos inéditos e que se destinem exclusivamente à revista. É proibida

a reprodução com fins lucrativos. Os artigos de revisão serão publicados a convite da Comissão

Editorial.

2. Os trabalhos deverão ser redigidos em português, inglês ou francês, datilografados preferencial¬

mente em máquina elétrica, em espaço duplo em 3 (três) vias, em papel formato ofício e numera¬

dos no ângulo superior direito.

3. No preparo do original será observada, sempre que possível, a seguinte estrutura: Página de ros¬

to: título do artigo, nome(s) do(s) autorfes) e filiação científica. Texto: introdução, material e mé¬

todos, resultados, discussão, conclusões, agradecimentos e referência bibliográfica. Material de

referência: resumos (em português e inglês); unitermos: palavras ou expressões que identificam

o conteúdo do artigo; devem set incluídas até um limite máximo de três, em português e inglês.

4. As referências bibliográficas deverão ser ordenadas alfabeticamente e numeradas.

Exemplos;

Para livros: autor, título, edição, local de publicação, editor, ano, páginas.

7. BIER,0. Microbiologia e imunologia. 24. ed. São Paulo: Melhoramentos, 1985.1234p.

Para artigos: autor, título do artigo, título do periódico, volume, página inicial e final, ano.

8. MACHADO, J.C., SILVEIRA F?, J.F. Obtenção experimental da pancreatite hemorrágica aguda

no cão por veneno escorpiônico. Mem. Inst. Butantan, v.40/41, p. 1-9, 1976/77.

As citações no texto devem ser por números-índices correspondentes às respectivas referências

bibliográficas.

Exemplos:

...âcyuiiuu voi iwo auiuico

5. As ilustrações (fotos, tabelas, gráficos etc.) deverão ser originais e acompanhadas de legendas

explicativas. As legendas serão numeradas e reunidas em folha à parle. Os desenhos deverão ser

a nanquim e as fotografias bem nítidas, trazendo no verso o nome do autor e a indicação numéri¬

ca da ordem a ser obedecida no texto. As ilustrações deverão ser organizadas de modo a permitir

sua reprodução dentro da mancha da revista (22 x 12,5cm).

6. Os artigos deverão conter no máximo 6 (seis) ilustrações (branco e preto). De cada trabalho serão

impressas 30 (trinta) separatas, sendo 10 para a Biblioteca do Instituto e 20 para os autores.

7. Os textos originais não serão devolvidos e os originais das ilustrações estarão à disposição dos

autores.

INSTRUCTIONS TO AUTHORS

1. Manuscripts subrnitted to the Editorial Board should be unpublished texts and should not be un-

der consideration for publication elsowhere. Reproduction for commercial purposes is not allo-

wed The Editorial Board will plan the publication of revision articles.

2. The original and hvo copies of papers should be typewritten in Portuguese, English or French, double

spaced, on typmg paper (31 x 21cml. Pages should be numbered consecutively at the upper right

corner.

3. The following structure should be considered in the preparation of lhe manuscript: Titie page:

with article titie, name of aulhof(s), professional address Text: with introduction, material and me-

thods, resuits, discussion, conclusions, acknowledgments, references, abstracts (in Portuguese

and English), and keywords. A maxirnal number of 03 keywords should be included in Portuguese

and English.

4. References in alphabetical order should be numbered consecutively.

Examples:

Books:

7. BIER, 0. Microbiologia e imunologia. 24 ed. São Paulo: Melhoramentos, 1985. 1234p.

Articles:

8. MACHADO,J.C., SILVEIRA F“, J.F. Obtenção experimental da pancreatite hemorrágica aguda

no cão por veneno escorpiônico Mem. Inst. Butantan. v.40/41, p. 1-9, 1976/77.

Citations in the text should be identified by the reference number.

Examples:

...método derivado de simplificação de armadilha de Disney'

...segunda vários autores'^''^’'*

5. Illustrations (photographs, tables, figures etc.) should be the originais and legends should be sub-

mitted typewritten on a separate sheet. Line-drawings should be with China ink and photographs

must be of top quality. On lhe back of each figure of photograph the name of the author(s) should

be lightly written and the number indicating the sequence in the text. Illustrations should fit in

a page measuring 22 x 12,5cm.

6. No more than 6 illustrations will be accepted and photographs should be black and white. Thirty

reprints of each article are provided without charge, and 10 will be kept at the library.

7. Subrnitted manuscripts will not be returned to the author(s) but the original illustrations are availa-

ble to author(s) by request.

2 3

5 6

11 12 13 14 15