CRYPTOGAMIE

Mycologie

ANCIENNE REVUE DE MYCOLOGIE

Fondée par R. Heim en 1936

Directeur scientifique: Mme J. Nicot

Secrétaire de Rédaction: M. Bruno Dennetière

Editeur: A.D.A.C. - 12 rue Buffon F-75005 Paris.

BUREAU DE RÉDACTION

Ecologie et Phytopathologie: G. Durrieu (Laboratoire Botanique et Forestier, 39 Allées

Jules Guesde, F-31062 Toulouse Cedex) - Systématique: P. Joly (Laboratoire de Cryptogamie,

Muséum National d'Histoire Naturelle, 12 rue Buffon, F-75005 Paris) - Physiologie: G.

Manachère (Laboratoire de Mycologie, Université de Lyon I, 43 bd du 11 Novembre 1918,

F-69622 Villeurbanne Cedex) - Cytologie: D. Zickler (Laboratoire de Génétique, Université Paris

Sud, Centre d'Orsay, Bât. 400, F-91405 Orsay) - Autres spécialités: M.F. Roquebert (Laboratoi-

re de Cryptogamie, Muséum National d'Histoire Naturelle, 12 rue Buffon, F-75005 Paris).

COMITÉ DE LECTURE

J. Boidin (Lyon), J. Chevaugeon (Orsay), J. Fayret (Toulouse), W. Gams (Baarn), G.L.

Hennebert (Louvain-la-Neuve), Ch. Montant (Toulouse), Cl. Moreau (Brest), D.N. Pegler (Kew),

B. Sutton (Kew), G. Turian (Genève).

MANUSCRITS

Les manuscrits doivent être adressés directement à un membre du Bureau de Rédaction,

choisi pour sa spécialité. Le Bureau peut demander l'avis d'un lecteur, même s'il n'appartient pas

au Comité de Lecture. Bien qu'étant une revue de langue française, les articles rédigés en anglais,

allemand, italien et espagnol sont acceptés. Les disquettes de micro-ordinateur (ІВМ, ІВМ сот-

patible, et Macintosh) sont vivement souhaitées. Les recommandations aux auteurs sont publiées

dans le fascicule 1 de chaque tome. Les auteurs recevront 25 tirés-à-part gratuits; les exemplaires

supplémentaires seront à leur charge.

5 DES ABONNEMENTS Tome 15, 1994

CRYPTOGAMIE comprend trois sections: Algologie, Bryologie-Lichénologie, Mycologie.

Pour une section: France: (326 F ht) 332,85 Ftic - Étranger: 357,00 F

Pour les 3 sections: France: (918 F ht) 937,28 F ttc - Étranger: 1000,00 F

Paiement par chèque bancaire ou postal à l'ordre de:

A.D.A.C. - CRYPTOGAMIE (CCP La Source 34 764 05 S),

adressé à: A.D.A.C. 12, rue Buffon, F-75005 Paris.

CRYPTOGAMIE, Mycologie est indexé par Biological Abstracts, Current Contents,

Publications bibliographiques du CNRS (Pascal).

ЛА ыз ر‎ т. Source : MNHN. Paris .

CRYPTOGAMIE

MYCOLOGIE

TOME 15 FASCICULE 2 1994

CONTENTS

A. MICHAUT, M.J. JACQUIER, F. BOUCHET, M.G. DIJOUX, L. LE MEN, P.

BOUCHET - Study of antifungal properties of different brominated

compounds extracted from a Terebellid polychetous Annelid, Thelepus

setosus from Kerguelen islands. ...... aie

LA. EL KADY, A.Y. ABDEL-MALLEK, S.S.M. EL MARAGHY, and H.A.H.

HASSAN - Toxigenic moulds in pesticide treated liquid medium...

G.L. HENNEBERT, S. PASCAL et M. COSYNS - Incompatibility interactions

between homocaryons of the bifactorial Basidiomycete Lenzites

betulinus. A sexual repulsive pheromone ?...

A-L.E. MAHMOUD and S.A. OMAR. - Enzymatic activity and mycotoxin-

producing potential of fungi isolated from rotted lemon:

J. CHECA, M.N. BLANCO y J.M. BARRASA. - ae of some Pyrenomycetes

sensu lato from Menorca. .

J. BOIDIN et G. GILLES - Basidiomycetes A from Réunion

Island. XVIII Sistotremateae. .

F. BEKHOUCHE, A. BRETON et B. GAILLARD-MARTINIE - Cellulolytic

fungi from dry areas of Algerian Sahara and assessment of their

cellulolytic activity. .

Bibliography. ......

BIBL. DU

MUSEUM

117

125

133

141

149

Bibliothèque Centrale Muséum

3 3001 00226856

ШІ

Source = ORE Paris

Source : MNHN. Paris

Cryptogamie, Mycol. 1994, 15 (2): 67-74 67

ETUDE DE L'ACTION ANTIFONGIQUE

DE DIFFÉRENTS COMPOSÉS BROMÉS EXTRAITS

D'UN ANNÉLIDE POLYCHÈTE

DES ÎLES KERGUELEN : THELEPUS SETOSUS.

A. MICHAUT ', M.J. JACQUIER *, F. BOUCHET '*,

M.G. DIJOUX °, L. LE MEN', P. BOUCHET'*

' Laboratoire de Biologie Végétale et de Cryptogamie.

? Laboratoire de Pharmacognosie, U.R.A 492 du C.N.R.S

"Equipe de Parasitologie associée à l'U.R.A 1415 du C.N.R.S.

„(U.F.R de Pharmacie de l'Université de Reims).

Membres du Groupe d'Etudes et de Recherches

en Biologie des Eaux (G.E.R.B.E).

RÉSUMÉ - Les essais in vitro sur diverses souches de micromycètes montrent que la thélépine,

composé bromophénolique extrait de Thelepus setosus, Annélide polychète récolté dans l'archipel

des Kerguelen (France), possède une activité antifongique. D'autres composés bromophénoliques,

dérivés de substances élaborées à l'état naturel par Thelepus setosus, en particulier le 3,5-dibromo-4-

hydroxybenzyl methyl ether, présentent aussi une activité antifongique.

ABSTRACT - In vitro assays on various strains of micromycetes show that thelepin, a brominated

compound extracted from a Terebellid polychaetous Annelid, Thelepus setosus, very abundant in the

Kerguelen archipelago (Subantarctic Province), has antifungal properties. Another brominated

compound, 3,5-dibromo-4-hydroxybenzyl methyl ether, derived from natural compounds present in

Thelepus setosus, also appears to possess antifungal activity.

MOTS-CLÉS - Antifongique, micromycètes, Dermatophytes, Annélides polychètes, Bromophénol,

Kerguelen.

INTRODUCTION

Thelepus setosus est un Annélide polychète de la famille des Terebellidae

(Saint-Joseph, 1898), présent depuis les régions tempérées de l'hémisphère nord

jusqu'aux zones australes. Comme beaucoup d'organismes vivant dans ces régions,

ceux-ci se distinguent souvent par leur taille particulièrement développée.

Divers travaux concernant la biologie et la reproduction de Thelepus setosus,

ont été effectués sur des spécimens provenant de l'Archipel des Kerguelen, (Terres

Australes et Antarctiques Françaises) (Duchene 1983, 1984, 1985, 1990).

Dès 1975, Higa et Scheuer avaient montré la présence de divers composés

bromés élaborés chez des exemplaires de Thelepus setosus prélevés à Kaneohe Bay,

dans les Iles Hawai. Parmi eux, la thélépine, composé voisin de la griséofulvine utilisée

Source : MNHN, Paris

68 A. MICHAUT et al.

en thérapeutique humaine et animale dans le traitement des teignes et des

dermatophyties, était supposée détenir une activité antifongique (Grove 1963), mais

aucun auteur n'en avait apporté la preuve expérimentale.

D'autres études portant sur les bromophénols élaborés par divers Annélides et

des hémichordés (Sheikh et Djerassi 1975, King 1986), avaient permis de mettre en

évidence la présence de composés voisins dans les tubes et le mucus de ces organismes.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Des échantillons de Thelepus setosus ont été prélevés en plongée par 3-5 m de

fond au site de Port-Raymond (Archipel des Kerguelen); les corps et les filaments ont

été séparés et conservés par lyophilisation. Les quantités récoltées sont de 28,8 g de

corps et 4,35 g de filaments lyophilisés.

A/ Obtention et chromatographies des extraits :

- Extraits totaux

- Les extraits totaux de filaments et de corps sont préparés suivant un double

protocole, Chaque lot est séparé en deux fractions :

- L'une d'elle est traitée par le chloroforme selon la méthode de Т. Ніра

et P.J. Scheuer (1975) : double extraction par le chloroforme pendant 2 heures, sous

agitation magnétique à température ambiante, suivie d'une filtration sur verre fritté de

porosité 3. La solution obtenue est évaporée à sec sous pression réduite à 40°C

(rendement : corps = 9,05%, filaments = 12,14%).

- L'autre fraction est extraite à deux reprises par le méthanol absolu sous

agitation magnétique à température ambiante pendant 2 heures. Après filtration, la

solution obtenue est évaporée dans les mêmes conditions (rendement : corps = 6,07%,

filaments = 9,79%).

Les extraits méthanolique et chloroformique ainsi obtenus ont fait l'objet d'une

chromatographie sur couche mince (plaque Whatman K6F) dans le mélange

chloroforme-ether de pétrole 10 %.

- Fractionnement de l'extrait total

L'extrait méthanolique (0,35 g) obtenu à partir des filaments bruts lyophilisés

est chromatographié sur une colonne de 20 g de silice en vue de séparer les principaux

constituants.

L'élution est faite successivement par l'éther puis par le chloroforme. Les

produits obtenus sont purifiés par chromatographie sur couche épaisse (plaque

Whatman PK6F).

B/ Etude de l'activité antifongique :

Les souches utilisées sont :

- Des dermatophytes pathogènes: Microsporum gypseum, Microsporum canis,

Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes.

Source : MNHN, Paris

ACTION ANTIFONGIQUE DE THELEPUS SETOSUS (ANNÉLIDES) 69

- Des saprophytes et parasites des végétaux: Verticillium sp, Fusarium sp,

Pseudocercosporella herpotrichoides, Botrytis sp.

- Une levure : Candida albicans

Pour étudier l'action des différentes fractions sur les champignons filamenteux,

100 ul d'une dilution de concentration connue sont mélangés avec 2 ml de milieu de

culture de Sabouraud maintenu en surfusion à 45°C dans des boites de Pétri de 3 cm de

diamétre.

Aprés refroidissement et solidification du milieu les boites sont ensemencées

en deux points avec les différentes souches de dermatophytes puis mises à l'étuve à 23°

C. La lecture est réalisée après 9 jours de culture.

Les fractions présentant une activité sur les Dermatophytes sont ensuite

essayées sur les autres souches de champignons filamenteux, suivant le même

protocole

Pour la levure Candida albicans, 100 pl d'une suspension standardisée de

cellules sont mélangés dans des boites de Pétri de 3 cm de diamètre avec 2 ml de milieu

de culture glucosé gélosé à l'extrait de levure, maintenu en surfusion à 45°C et

contenant 100 pl de la fraction à tester.

Après refroidissement, les boites sont mises à l'étuve à 25°C. La lecture est

faite après 48h de culture.

N.B : Les différents essais sont réalisés dans la limite des quantités de produits

obtenues par chromatographie sur colonne.

RÉSULTATS

La chromatographie sur couche mince de l'extrait méthanolique de filaments

laisse apparaître 5 fractions (F1 à F5). Ces produits ont pu être isolés après frac-

tionnement sur colonne de gel de silice et purification sur couche épaisse (Figure 1).

"| |

| |

ң | BER

Lag r Er]

Figure 1 : Fractions obtenues par chromatographie sur colonne d'un extrait méthanolique de 0.35 g

de filaments de Thelepus setosus.

Figure 1 : Fractions separated by column extraction of a methanol extract (0,35 g) of Thelepus

setosus.

MNHN,

70 A. MICHAUT et al.

En revanche l'extrait chloroformique ne fait apparaitre que 4 taches,

correspondant aux fractions F2 à F5 précédentes (Figure 2). La fraction Fl a

pratiquement disparu.

Solvant CHCI3- Ether de Pétrole 1096

@ #06

è © 220,56

8 Y os

8 @ RE023

Rf: 0,20

Filaments — Fl F2 F3 F4 FS

снсіҙ =>

MeOH

Figure 2: Chromatographie sur plaque WHATMAN KG6F des extraits chloroformiques et

méthanoliques de Thelepus setosus.

Figure 2: Plate chromatography of chloroformic and methanolic extract of Thelepus setosus.

Chaque fraction est isolée et essayée sur les différentes souches fongiques. Les

essais sont d'abord menés sur Microsporum gypseum, (tableau 1). Trois fractions

présentent une activité antifongique (F1, F4, F5).

- Une étude plus approfondie a pu être effectuée à partir des fractions F1 et F4,

(tableau 2).

Source : MNHN, Paris

ACTION ANTIFONGIQUE DE THELEPUS SETOSUS (ANNÉLIDES) 71

Témoin SMFI SM F2 SM F3 SMF4 | SMFS

Microsporum | ++++++ 0 +++ +++ 0 0

gypseum

Tableau 1: Action des différentes fractions obtenues à partir de l'extrait méthanolique de filaments de

Thelepus setosus sur Microsporum gypseum.

Table 1: Action on Microsporum gypseum of the different fractions obtained from a methanolic

extract of Thelepus setosus tentacles.

Témoin SMFI SM F4

MeOH 2,5 mg/ml 5 mg/ml

Microsporum gypseum HH 0 0

Microsporum canis HH 0 0

Trichophyton mentagrophytes ++ 0 +44

Trichophyton rubrum ++ 0 0

Verticillium sp. ee 0 TERRE

Fusarium sp. TORRE ++ ++

Botrytis sp. жәке + HH

Pseudocercosporella herpotrichoides H+ 0 ++

Tableau 2: Action de solutions méthanoliques des fractions F1 et F4 sur les différentes souches de

micromycètes.

Table 2: Action of a methanolic solution of the fractions Fl and F4 on the different strains of

micromycètes.

On peut constater que la croissance de l'ensemble des souches, hormis celles de

Fusarium et Botrytis, est inhibée par la fraction F1 à la concentration de 125 ug/ml de

milieu de culture. La substance F4 n'a provoqué qu'une inhibition partielle des souches

de Dermatophytes à la concentration de 250 pg/ml de milieu de culture.

En revanche, aucune inhibition des souches de Candida albicans par l'extrait Fl

n'est observée, mêmes aux concentrations de 2,5 mg et 5 mg/ml de milieu.

Cette étude a pu être complétée par l'analyse chimique des différentes fractions.

Les caractéristiques spectrales des principaux composés obtenus, résumées dans le

tableau 3, permettent de déceler la présence de quatre composés principaux ( Tableau

4).

DISCUSSION

En 1987, Wooding et coll. reprenant les travaux de Higa et Scheuer (1975),

avaient montré l'existence de composés bromés dans de nombreux organismes marins

en particulier des annélides.

Ultérieurement Goerke et coll, (1991) ont précisé la répartition de ces

métabolites bromés dans les différents organes de Thelepus setosus.

Source : MNHN, Paris

72 A. MICHAUT et al.

FI F2 F4 FS

SM.M* 296 547 282 468

UV 205-209-225-286- | 206-209-224-285- 211-221-285-291 | 206-224-260-

Imax 293 291 285-291.

(MeOH)

RMN1H | 47,45 ppm(2H,S) | 47,45 ppm (2H,S) à 7,50 ppm (2H,s)

4,35 ppm (2H,S) 4,40 ppm (2H,S) 4,60 ppm (2H,s)

3,40 ppm (3H.S)

RMANPC| С, 1487ppm CH 1314 ppm C, 149ppm

©, 1312 ppm CBr 109,8 ppm C> 130,5 ppm

Са 109,7 ppm CH» 70,6 ppm. Ca 110,1 ppm

C, 134,5 ppm C, 1354 ppm

СН, 72,8 ppm CH» 62,7 ppm

OCH; 58,1 ppm

setosus.

Tableau 3 : Caractéristiques spectrales des principaux composés isolés des filaments de Thelepus

Table 3 : Spectral characteristics of the main compounds extracted from Thelepus setosus tentacles,

Fractio | Dénominations Auteurs Formules

3,5-dibromo-4-

F1 hydroxybenzyl MASSIOT.

methyl ether

bis(3,5-dibromo-4- GOERKE

F2 | hydroxybenzyl) ether et WEBER.

(1991)

alcool 3,5-dibromo-4- | HIGA et SCHEUER. OH

F4 | hydroxy benzylique (1975)

в Bi

Thélépine = HIGA et SCHEUER Br

FS | spiro-p-quinol ether (1975)

HO’

Br Br

Tableau 4 : Dénominations et formules des principaux composés isolés de Thelepus setosus.

Table 4 : Denomination and developped structure of the principal compounds extracted from

Thelepus setosus.

Source : MNHN, Paris

ACTION ANTIFONGIQUE DE THELEPUS SETOSUS (ANNELIDES) 73

Ainsi l'activité de la thélépine a-t-elle pu être confirmée expérimentalement.

Cette substance exerce bien une activité fongistatique sur la croissance de Microsporum

&ypseum à des concentrations de 125 g/ml dans le milieu de culture.

- Nous avons pu également constater que l'activité antifongique n'appartient pas

seulement à la thélépine, mais aussi à un certain nombre d'autres composés bromés

extraits des filaments de Thelepus setosus, les extraits de corps sont totalement

dépourvus d'activité.

L'un de ces composés, le 3-5 dibromo-4-hydroxybenzyl methyl ether, exerce

une activité antifongique à une concentration voisine de celle de la thélépine. Cette

molécule, décrite partiellement par Wooding et coll. (1987), Goerke et coll. (1991), est

considérée par ces derniers comme un produit artéfactuel se formant lors de l'extraction

par le méthanol. Ceci est confirmé par le fait qu'elle n'apparaît qu'à l'état de traces dans

les extraits chloroformiques, alors qu'elle se forme en abondance lors du traitement par

le méthanol.

Un autre composé, identifié comme l'alcool 3-5-dibromo-4-hydroxy benzylique

a été décrit en 1975 par Higa et Scheuer. Lui aussi présente une activité antifongique.

Cette activité est moins importante que celle des deux composés précédents mais reste

cependant non négligeable.

Ainsi l'étude chimique et pharmacologique des extraits d'un invertébré marin a-

telle pu mener à la mise en évidence d'un nouveau type de molécules exergant des

propriétés antifongiques in vitro à des concentrations relativement faibles, voisines de

celles de la griséofulvine.

REMERCIEMENTS.

- .C Duchene, Laboratoire Arago, Banyuls / mer.

- Le Laboratoire de Mycologie de l'Institut Pasteur, Dr C. De Bièvre, (Souches de

Dermatophytes et Saprophytes)

= Le Service de Protection des Végétaux de Reims, Mr D. Pinconnet, (Souches parasites de

végétaux).

BIBLIOGRAPHIE

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Polychète) à Kerguelen, province subantarctique. Vie er Milieu 33 : 65-77.

DUCHENE J.C., 1984 -Données descriptives sur le macrobenthos annélidien dans le golfe du

Morbihan, Kerguelen. C.N.F.R.A (Comité National Français des Recherches Antarctiques),

No. 55 : 75-94.

DUCHENE J.C., 1985 - Comparative studies of respiration in a north temperate and a subantarctic

population of Thelepus setosus (Annelida : Polychaeta). Marine Biol. of Polar Regions and

Effects of Stress on Marine Organisms. Edited by. J. S. Gray and M. E. Christiansen.

Whiley : 247-258

Source : MNHN. Paris

74 A. MICHAUT et al.

DUCHENE J.C., 1990 - Impact de la croissance sur la reproduction : Modélisation chez une

Annélide Polychète. Océanis, 16 : 163-178.

GOERKE H. and WEBER K., 1991 - Concentrations and localization of brominated metabolites in

the genus Thelepus (Polychaeta: Terebellidae). Comp. Biochem. Physio Vol. 99B, N°.1 :

203-206.

GROVE J.F., 1963 - Griseofulvin. Quarterly Reviews, Chem. Soc. 17 : 1-19.

НІСА T. and SCHEUER P.J., 1975 - Constituents of the marine annelid Thelepus setosus.

Tetrahedron 31 : 2379-2381.

KING G.M., 1986 - Inhibition of microbial activity in marine sediments by a bromophenol from a

hemichordate. Nature 323 : 257-259

MASSIOT G. 1993 - Communication personnelle

SAINT-JOSEPH (Baron de), 1898 - Annélides Polychétes des Cótes de France. Ann. Sc. Nat. Zool.,

8, (V).

SHEIKH Y.M. and DJERASSI C.,1975 - 2,6-Dibromophenol and 2,4,6-tribromophenols-antiseptic

secondary metabolites of Phonoropsis viridis . Experientia 31 : 265-266.

WOODING S.A., WALLA M.D. and LINCOLN D.E., 1987 - Occurrence of brominated compounds

in soft-bottom benthic organisms. J. exp. Mar. Biol. Ecol. 107 : 209-217.

Source : MNHN, Paris

TOXIGENIC MOULDS

IN PESTICIDE-TREATED LIQUID MEDIUM

LA. EL-KADY, A.Y. ABDEL-MALLEK, S.S.M. EL-MARAGHY

and H.A.H. HASSAN

Botany Department, Faculty of Science, Assiut University,

Assiut, Egypt.

ABSTRACT - The effect of different concentrations (10-100 ug ml") of four pesticides (three

fungicides and one insecticide) on production of three different mycotoxins in liquid medium was

examined. Two toxigenic isolates producing citrinin (Penicillium chrysogenum and P. corylophilum),

one producing ochratoxin A (P. funiculosum) and one producing zearalenone (Fusarium

moniliforme) were selected in this study. The insecticide Actellic did not affect the mycotoxins

production by tested isolates at any dose used. Ochratoxin A and zearalenone formation was

completely inhibited by 50 and 100 pg ml* of each of the three fungicides used (Vitavax-Captan,

Rizolex-T and Sumisclex). Rizolex-T (at 100 ug ml" ) completely inhibited citrinin production by

both P. chrysogenum and P. corylophilum. On the other hand, Sumisclex (at 100 ug ml" also) did not

affect citrinin synthesis by P. chrysogenum but completely inhibited its formation by P.

corylophilum.

RÉSUMÉ - Les effets de différentes concentrations (10-100 ug ml") de quatre pesticides (trois

fongicides et un insecticide) ont été étudiés sur la production en milieu liquide de trois mycotoxines

différentes. Cette étude a été menée sur deux isolats producteur de citrinine (Penicillium

chrysogenum et P. corylophilum), un isolat producteur d'ochratoxine A (P. funiculosum) et un isolat

producteur de zéaralénone (Fusarium moniliforme). L'insecticide (Actellic) n’affecte pas la

production de mycotoxines quelle que soit la dose utilisée. La production d’ochratoxine A et de

Zéaralénone est complétement inhibée par des doses de 50 ug ml' de chacun des trois fungicides

étudiés (Vitavax-Captan, Rizolex-T et Sumisclex). Le Rizolex-T, à la concentration de 100 pg ml"

inhibe totalement la production de citrinine par P. chrysogenum ou P. corylophilum, alors qu'à la

même concentration, le Sumisclex inhibe la production de citrinine par P. corylophilum mais ne

présente pas d'action sur la production par P. chrysogenum.

KEY WORDS - Citrinin, Ochratoxin A, Zearalenone, Pesticides, Toxigenic moulds.

INTRODUCTION

Mycotoxin contamination of grains and seeds is a serious economic and health

hazard to both livestock and human population, The presence of these highly toxic

substances in a variety of foods and feeds has led to extensive research concerning their

production, detoxification and incidence. A lot of research has been done on the effect

of fungistatics (natural or manufactured ones), fungicides and insecticides on fungal

growth and toxigenesis, in regard to protection of foods, feeds and feedstuffs (Bell &

Source : MNHN, Paris

76 A. EL-KADY

Doupnik, 1970; Vandergraft et al., 1973a,b, 1975; Wu & Ayres, 1974; Draughon &

Ayres, 1978, 1980; Bean & Southall, 1983; Draughon, 1983; Draughon & Churchville,

1985).

In the present investigation, the effect of four pesticides on formation of each of

citrinin, ochratoxin А and zearalenone by the respective toxigenic moulds in liquid

culture medium was studied.

MATERIALS AND METHODS

Cultures of four toxigenic fungal species namely Penicillium chrysogenum

Thom, P. corylophilum Dierckx (citrinin producers), P. funiculosum Thom (ochratoxin

A producer) and Fusarium moniliforme Sheldon (zearalenone producer) isolated from

pesticide-free corn grains (Hasan, 1988) were selected as test organisms. Fifty ml

portions of yeast extract peptone-Czapek's supplemented medium (of the following

composition:glucose, 10; peptone, 10; NaNO, , 2; K, HPO,, l; yeast extract, 1; KCI, 0.5;

MgSO* 7H, 0, 0.5; FeSO, .7H, 0, 10.01; g/liter of distilled water, the final pH was

adjusted to 6.0 using 0.1 N HCI) were dispensed into each of 250 ml Erlenmeyer conical

flasks. Four pesticides were used in this investigation viz:Vitavax-Captan (5,6-dihydro-

2 methyl-1,4- oxathin-3-carboxanilido/N-(trichloromethylthio)-4-cyclohexene-l,2 dicar-

boximide), Rizolex T (0,0-dimethyl-0-(2,6- dichloro-4-methyl phenyl) phosphoro-

thioate/Bis (dimethyl thiocarbomoyl) disulphide), Sumisclex (N-3,5-dichloro- phenyl)-

12-dimethyl) cyclopropane-l, 2-dicarboximide) and Actellic (0,0-dimethyl-0-(2-

dimethyl amino-6-methyl-pyrimidin ,-4-yl) phosphorothioate. Each pesticide in

acetone: sterile distilled water (1:10, v/v) was added to the sterilized medium (before

inoculation of the fungus) at three different concentrations 10,50 and 100 pg ml’,

calculated as active ingredient. The solvent without pesticide was added to the control

treatment also. One ml aliquots of the spore suspension of 1-2 week-old cultures of the

test organisms were inoculated under aseptic conditions into the flasks. Four flasks

were used for each treatment and control. The cultures were incubated at 28*C for 7

days as stationary cultivation. The mycelial dry weight of two flasks was determined by

collecting the mycelial mats of the fungus, washed twice with distilled water, dried

over night at 85°C, allowed to cool in a desiccator and then weighed. The content of

each other two flasks was extracted and analysed for the respective mycotoxins of the

test organisms.

Extraction of mycotoxins from fungal cultures

At the end of incubation period, the contents of each flasks (medium +

mycelium) were homogenized with 100 ml of chloroform for 5 min in a high speed

blender (16000 r.p.m.). For citrinin extraction, the culture medium was acidified to pH

2-3 using 6 N HCI before homogenisation. The extraction procedure was repeated 3

times. The combined chloroform extracts were washed with distilled water, dried over

anhydrous sodium sulphate, filtered and concentrated under vacuum to near dryness,

and diluted to | ml with chloroform.

Source : MNHN, Paris

PESTICIDE AND PRODUCTION OF MYCOTOXINS 77

Detection of mycotoxins

Chromatographic analysis of the chloroform extracts was achieved on precoated

silica gel plate type 60, F 254 (Merck). The samples were applied as 0.01 ml solution

using micropipettes, and the spots were dried during application with a flow of cold air.

Different standard mycotoxin references (purchased from Makor Chemical Ltd.

Jerusalem, Israel) were used. The potential lower limit of visual detection is ranged

from 0.02-0.2 ppm. Thin layer plates were developed in both toluene: ethylacetate:

formic acid (6:3:1, v/v/v) and chloroform: methanol (97:3, v/v) and treated according to

the methods of Scott et al. (1970), and Gimeno (1979). Citrinin fluoresces lemon yellow

under long wave UV light (Saito et al., 1971), while ochratoxin A fluoresces greenish-

blue (Broce, 1970). Zearalenone was determined quantitatively according to Mirocha et

al. (1974).

RESULTS AND DISCUSSION

The results in table 1 show the effects of four pesticides when incorporated into

liquid medium at 10,50 and 100 ug ml" on the mycelial growth and production of

citrinin, ochratoxin A and zearalenone by toxigenic moulds. Vitavax-captan inhibited

the mycelial dry weight of P. chrysogenum (at 100 ug ml"), P.funiculosum (at 50 and

100 ug ml" ) and F. moniliforme (at the three concentrations tested). The mycelial dry

weight of P. funiculosum and F. moniliforme was reduced at 50 and 100 ug mI" of

Rizolex-T, respectively. Sumisclex reduced the mycelial dry weight of P. corylophilum,

P. funiculosum (using the three doses used) and F. moniliforme (using 100 pg ml-1).

The insecticide Actellic did not affect the mycelial dry weight of any tested fungal

species.

Rizolex-T proved to be the most effective pesticide tested for inhibiting citrinin

production (table 1). Rizolex-T composed of two components, Rizolex

(organophosphate group of fungicides) and Thiram (dithiocarbamate group), The

results obtained in this investigation are in harmony with the finding of Draughon &

Ayres (1978). They reported that of 13 compounds tested, the organophosphate

insecticides Malathion, Diazinon, Dichlorvos and Naled proved to be the most effective

for inhibiting citrinin production by Penicillium citrinum Nrrl 5927.

The fungicide Sumisclex proved to be the second most effective pesticide tested

for preventing citrinin production. This fungicide completely inhibited citrinin

production by Penicillium corylophilum when added to the culture medium at 50 pg

ml’, but it did not affect citrinin production by the other test organism (P.

chrysogenum). Various effects of a given pesticide on production of certain mycotoxins

by different strains of fungi were previously recorded. Bell & Doupnik (1970) screened

some chemical used in foods or feeds as preservatives for prevention of Aspergillus

flavus and A. parasiticus and aflatoxin accumulation in peanut pods. They reported that

results varied from complete inhibition of fungi with no aflatoxin produced to aflatoxin

found in amounts up to twice that of the control. Vandegraft et al. (1973a) also reported

that insecticide treatment of wheat both increased and decreased aflatoxin and

ochratoxin production depending on the fungal strains used.

Source : MNHN, Paris

A. EL-KADY

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Source : MNHN, Paris

PESTICIDE AND PRODUCTION OF MYCOTOXINS 79

At concentration of 50 ug ml" both Vitavax-Captan and Rizolex-T inhibited

ochratoxin A production. Sumisclex proved to be the most effective pesticides tested, it

prevented ochratoxin A formation when added to the culture medium at 10 ug ml" . The

ability to inhibit ochratoxin A synthesis at lower concentrations was a desirable

attribute because of the rapidity of deterioration of the pesticide in the environment. At

the same concentration (10 pg ml” ) both Vitavax-Captan and Rizolex-T stimulated

production of ochratoxin A by P. funiculosum. Stimulation of toxin formation was

previously recorded when some pesticides were used for prevention of these toxins.

Draughon (1983) and Bean and Southall (1983) found that some insecticides (Dursban &

Nellite) and herbicides (Pyridazinones) increased aflatoxin production by A. flavus and

A. parasiticus. Draughon (1983) warned that certain insecticides now being applied to

crops for insect control could stimulate growth and aflatoxin production by the

toxigenic moulds.

Various insecticides and fumigants have been used , to treat stored grains in an

effort to reduce contamination with mycotoxins. None of the insecticides or fumigants

reduced ochratoxins formation by inoculated fungi to make their use practical

(Vandegraft et al, 1973 a,b). However, Vandegraft et al. (1975) reported that both

ammonia and 1% propionic acid reduced mould growth and subsequent ochratoxin

formation by A. ochraceus Nrrl 3174. It has been established that addition of caffeine to

microbiological media at levels > 1 mg/ml inhibits aflatoxin and ochratoxin A

production while theophylline and theobromine have little activity (Buchanan &

Fletcher, 1978; Buchanan et al., 1978; 1982).

Wu & Ayres (1974) studied the effect of the organophosphate Dichlorvos on the

production of ochratoxin A by different strains of A. ochraceus grown in liquid medium

and on corn. Production of ochratoxin A was reduced by a concentration of 1 mg/100 ml

of medium or g of corn and the reduction varied from 21 to 29%. When the

concentration of Dichlorvos was 10 mg/l00 ml or g of substrate, ochratoxin A

production was reduced by 42-72% depending on fungal strain and substrate.

Production of zearalenone by Fusarium moniliforme was completely inhibited

by the addition of Vitavax-Captan and Sumisclex at concentration of 50 ug ml".

However, Rizolex-T proved to be the most effective of the different pesticides tested.

Zearalenone production was completely inhibited at l0 ug mI" of Rizolex-T. Screening

for the ability of different isolates of F. moniliforme isolated from Egyptian cereal

grains and cotton seeds indicated that about 31% and 3796 of the total isolates produced

zearalenone, respectively (El-Kady & El-Maraghy, 1982). The results obtained in this

investigation agree with those obtained in many previous investigations. Previously

reported work which screened selected pesticides for their ability to inhibit zearalenone

production demonstrated that this toxin was completely inhibited by organophosphate

pesticides Naled (Dibrom), Dichlorvos, EPN, Fonofos (Dyfonate), Fensulphothion

(Dasanit) and Malathion (Wolf et al., 1972, Wolf & Mirocha, 1973; Rao & Harein, 1973;

Berisford & Ayres, 1976a,b; Draughon & Churchville, 1985), carbamate and

dithiocarbamate pesticides Metalkamate (Bux), Carbaryl (Sevin), Carbofuran (Furadan)

and Maneb (Dithan M-22) (Draughon & Churchville, 1985).

Since Rizolex-T and Sumisclex have been found to inhibit not only aflatoxin

formation but also citrinin, ochratoxin A and zearalenone. All of these compounds are

synthesized via polyketide metabolic pathways. Rizolex-T and Sumisclex as well as

Source : MNHN, Paris

80 A. EL-KADY

other pesticides may inhibit a key enzyme(s) in polyketide pathways and perhaps

inhibit synthesis of other fungal metabolites which follow this pathway. Evidently,

some characteristics of Rizolex-T and Sumisclex make them highly toxic to a diverse

group of fungi.

Although the insecticide Actellic is one of the organophosphate insecticides

family, however this insecticide proved to be inactive for control the production of any

of the toxins under investigation (citrinin, ochratoxin A and zearalenone). Various

workers have reported that organophosphate group of insecticides vary in their ability

to inhibit production of aflatoxin, citrinin and zearalenone (Draughon & Ayres, 1980).

The phosphate group present in the insecticide Actellic as P=S group. It has been

previously reported that organophosphate fungicides have specific structural features

associated with antifungal activity. Unlike insect, fungi cannot oxidize the bond P=S to

P=0 and therefore, pesticides having the P=S structural feature are generally inactive

against fungi unless the phosphate group is bonded to nitrogen HN-P-S (Cremyln,

1978).

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INTERACTIONS D'INCOMPATIBILITÉ ENTRE

HOMOCARYONS DU BASIDIOMYCÈTE BIFACTORIEL

LENZITES BETULINUS.

UNE PHÉROMONE DE RÉPULSION SEXUELLE?

Grégoire L. HENNEBERT*, Sophie PASCAL* & Max COSYNS**

* Mycothèque de l'Université Catholique de Louvain, Louvain-la-Neuve,

** Centre de Recherche sur les Réflexes Corticaux, Bruxelles

ABSTRACT. The tetrapolarity and multiallelism of Lenzites betulinus are confirmed as established

by Vandendries and Brodie in 1932. The genotype of the four compatibility groups is re-attributed

after detection by retroconfrontation of heterocaryosis in A=B¥ confrontations. The phenotypes of

interactions between hemi-compatible homocaryons, particularly that of "sexual barrier” (A¥B=), are

redescribed. The hyphothesis of a gazeous production as the agent of mutual sexual repulsion by

Vandendries and Brodie is revised as a repulsive pheromone production.

RÉSUMÉ. La tétrapolarité et le multiallélisme de Lenzites betulinus établis par Vandendries et

Brodie en 1932 sont confirmés. Le génotype des 4 groupes de compatibilité est réattribué apres

détection par rétroconfrontation de l'hétérocaryose dans les confrontations A#B=. Les phénotypes

des interactions entre homocaryons hémi-compatibles, en particulier celui de "barrage sexuel"

(A#B=), sont redécrit. L'hypothése de Vandendries et Brodie de l'intervention d'émanations gazeuses

dans la répulsion sexuelle mutuelle est revue comme celle d'une phéromone de répulsion.

MOTS CLÉS- Lenzites betulinus, incompatibilité, barrage, hormone, phéromone, sexualité.

INTRODUCTION

Lenzites betulinus (L.:Fr.)Fr. est un champignon basidiomycète bifactoriel

tétrapolaire (Vandendries & Brodie, 1933a, 1933b, 1933c). Une espèce bifactorielle est

celle dont la fertilité est contrôlée par deux facteurs d'incompatibilité A et B (Kniep,

1920; Papazian, 1950; Parag, 1965a; Casselton 1978; Boidin, 1980). Un facteur est un

complexe de gènes tandis que les allèles représentent les différents états alternatifs d'un

gène (C.A. Raper, 1978).

A et B sont des facteurs d'incompatibilité non liés mais composés chacun de

deux loci Aa et AB, Ba et BB liés entre eux et composés de plusieurs gènes

(Raudaskoski, 1973). Ceux-ci sont sous forme d'au moins deux allèles. Deux souches

sont compatibles quand elles possèdent des alléles différents dans au moins un des

deux loci composant chaque facteur (J.R. Raper 1966; Koltin, 1978; C.A. Raper, 1985,

Casselton, 1978). On parle de hémi-compatibilité ("hemi-compatibility", Parag, 1965a;

Dick, 1965) entre deux souches lorsque celles-ci ne différent que par un des deux

Source : MNHN, Paris

84 G. HENNEBERT et al.

facteurs A ou B, les allèles de l'autre facteur étant identiques. Sauf cas particuliers, des

souches sont incompatibles quand les allèles des deux facteurs sont identiques

(Papazian, 1950; Parag, 1965a).

La fonction des facteurs A ou B a été proposée pour la première fois par Oort

(1929, 1930), mais plus tard dans un sens inverse par Fulton (1950). Depuis, il est

généralement admis que le facteur A génère et régule l'appariement des noyaux, la

division nucléaire conjuguée et la formation de l'anse ou boucle d'anastomose. Le

facteur B régule la migration nucléaire du noyau "envahisseur" vers les hyphes apicaux

du thalle envahi et l'anastomose des anses cellulaires (Day, 1965; J.R. Raper, 1966;

C.A. Raper, 1978). Ces facteurs sont activés lorsqu'ils sont présents sous des formes

alléliques différentes dans les deux noyaux partenaires (Smythe, 1973; Niederpruem,

1980). Ni l'activation du facteur A, ni celle du facteur B n'est capable, seule, de former

un dicaryon fertile. Les mécanismes cellulaires qu'initient les facteurs A et B activés se

combinent afin de former une structure dicaryotique (J.R. Raper, 1966; Casselton,

1978; C.A. Raper, 1983).

Le mycélium issu d'une spore méiotique est dit mycélium monosperme,

mycélium primaire, mycélium haploïde (Vandendries, 1923a), mycélium mono-

caryotique ou "monocaryon" (Papazian, 1950), ne possédant que des noyaux isolés

issus du noyau unique de la basidiospore, ou encore mycélium homocaryotique, à

noyau d'un seul type, ou "homocaryon", terme que préfère Parag (1965a). La fusion de

deux homocaryons donne un mycélium secondaire. Si les homocaryons sont

compatibles, ce mycélium secondaire est dicaryotique, à noyaux appariés. S'ils sont

hémi-compatibles et donnent un mycélium secondaire, celui-ci est un hétérocaryon,

dont les articles contiennent des noyaux non appariés en nombre variable (Koltin &

Flexer, 1969).

La formation d'un dicaryon entre deux hyphes compatibles d'une espèce

tétrapolaire, telle que Schizophyllum commune, débute par la fusion somatique des

deux hyphes. Après quelques heures, les allèles du facteur B des deux noyaux

partenaires interagissent par un mécanisme encore mal connu et les fonctions

dépendant du facteur B s'ensuivent. Il y a augmentation de la production d'enzymes

hydrolytiques spécifiques, principalement de R-glucanase, qui entrainent la dissolution

des septa et la migration nucléaire vers les hyphes apicaux. Pendant cette période, la

croissance des hyphes se ralentit. Quand les noyaux "envahisseurs" ont atteint les

hyphes apicaux (40 heures plus tard environ), la fonction du facteur A est initiée. La R-

glucanase est inhibée et la paroi des septas est restaurée. La croissance normale des

hyphes est rétablie. Les noyaux s'apparient et se divisent de manière conjuguée. L'anse

d'anastomose se forme à chaque article du mycélium. Finalement, le facteur B

intervient dans l'anastomose des anses avec la cellule proximale. Dans la formation du

dicaryon, les deux facteurs agissent donc alternativement. De la fusion somatique à

l'établissement d'un dicaryon stable, le processus peut prendre 2 à 5 jours. Le rôle du

facteur B dans la formation de l'hétérocaryon issu d'homocaryons hémi-compatibles à

facteur B différent est également celui de la dissolution enzymatique des septa

permettant la migration nucléaire (Koltin & Flexer, 1969; Raudaskoski, 1973;

Mayfield, 1974; Marchant & Wessels, 1974; Casselton 1978; C.A. Raper, 1983; Kues

& Casselton, 1992).

Source : MNHN, Paris

BARRAGE SEXUEL CHEZ LENZITES BETULINUS 85

Dans cet article, les quatre groupes de compatibilité d'homocaryons de

Lenzites betulinus isolés d’un même carpophore ont été reconnus et leur génotype de

compatibilité sexuelle déterminé sur la base des interactions manifestées lors des

confrontations et des rétroconfrontations. Ces interactions sont observées et décrites,

compte tenu des données déjà acquises. Ensuite, l'énigme que représente l'interaction

dite de “barrage sexuel” (Vandendries, 1931, 1932a, 1932b; Vandendries & Brodie,

1933a, 1933b, 1933c) entre homocaryons ayant leur facteur d'incompatibilité B

identique est reconsidérée. L'hypothèse explicative de la formation de ces barrages,

formulée par Vandendries & Brodie (1933c) et Vandendries (1934a), est revue à la

lumière de nos observations et des connaissances actuelles.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Origine des souches

Des homocaryons de trois récoltes différentes de Lenzites betulinus ont été

obtenues par isolement monosperme: (1) MUCL 38100: carpophore, récolté par A.

Fraiture, le 5 décembre 1992, dans le bois de Rasbeed, Villers-sur-Semois, Belgique

(homocaryons MUCL 38101 à 38116); (2) MUCL 31428: carpophore , récolté par A.

Hennebert en novembre 1990 en Forêt de Soignes, Rouge Cloître, Auderghem,

Belgique (homocaryons MUCL 31429, 31433, 31435 et 34842, représentant les 4

groupes de compatibilité); (3) MUCL 38118: carpophore récolté par E. Berger en

décembre 1992, en Forêt de Soignes, Boisfort, Belgique (homocaryons MUCL 38549,

38550, 38551 et 38552, représentant les 4 groupes de compatibilité).

Confrontations

Les homocaryons sont confrontés deux à deux afin de déterminer le groupe de

compatibilité auquel ils appartiennent. Deux implants d'environ 3 mm de côté,

provenant respectivement des deux homocaryons à confronter, sont déposés sur milieu

gélosé à 2% d'extrait de malt (MA2%), dans une boîte de Petri, à une distance de 7 à 10

mm. De plus, chaque homocaryon est confronté à lui-même. La croissance des deux

colonies l'une vers l'autre est mesurée et observée à la loupe stéréoscopique ou sous le

microscope après 40h, 52h et 64h d'incubation et photographiée après dix jours.

Rétroconfrontations

La procédure de détermination des facteurs d'incompatibilité consiste dans

une première confrontation entre les homocaryons hémi-compatibles et la

confrontation en retour de chaque mycélium confronté avec l'homocaryon compatible

du partenaire hémi-compatible afin d'en vérifier l'hétérocaryose (Papazian, 1950; Eger,

1978, Desai & Peerally, 1994). La compatibilité de retour prouve l'hétérocaryose et

donc l'activation du facteur B par des allèles différents (В+) dont la fonction est de

commander la migration du noyau "envahisseur" ("migrating or migrant nucleus",

Snider, 1965; "foreign nucleus", Mayfield, 1974) jusque dans les hyphes apicaux lors

de la première confrontation des deux souches hémi-compatibles.

Source : MNHN, Paris

86 G. HENNEBERT et al.

Lorsque deux souches hémi-compatibles sont confrontées, l'alternative

suivante se présente. Ou bien les allèles du facteur A sont différents et ceux du facteur

B identiques dans les deux homocaryons, le noyau partenaire, après fusion somatique

des hyphes, ne migre pas vers les hyphes apicaux, mais des fausses boucles (anses non

anastomosées et sans noyau) peuvent être observées dans la zone de confrontation. Ou

bien les allèles du facteur B sont différents et ceux du facteur A identiques dans les

deux homocaryons, la migration du noyau envahisseur vers les hyphes apicaux

s'effectue après fusion somatique, par dissolution des septa, sans formation ni de

fausses ni de vraies boucles dans la zone de confrontation et dans le mycélium.

Exemples

(1) le confrontation A1B1x A2B1 (B commun)

implants prélevés A1B1(?+A2B1) ou A2B1(2+A1B1)

rétroconfrontation x A1B2 x A2B2

observation incompatibilité

résultat implants = homocaryons A1B1 et A2B1

(2) le confrontation A1B1 x A1B2 (B différent)

implants prélevés A1B1(?+A1B2) ou A1B2(?+A1B1)

rétroconfrontation x A2BI x A2B2

observation compatibilité

résultat implants = hétérocaryons A1B1(+A1B2) et A1B2(+A1B1)

Un homocaryon par groupe de compatibilité est choisi pour l'essai. Les

homocaryons hémi-compatibles entre eux sont confrontés par paire selon les quatre

combinaisons possibles sur milieu MA2% dans une boîte de Petri, à une distance de 7 à

10 mm et incubés.

Dans un délai court de 3 à 7 jours suivant l'espèce, un implant est prélevé de

chaque mycélium 1 et 2 à l'opposé de la zone de contact. Dans certains cas, il importe

de veiller à ce que limplant prélevé ne contienne pas d'hyphes provenant de

l'homocaryon partenaire. On confronte dans une nouvelle boîte de Pétri l'implant du

mycélium 1 à un implant d'une souche 3 totalement compatible avec la souche 2 (et

donc hémi-compatible avec la souche 1). Dans une seconde boîte, on confronte

l'implant du mycélium 2 à un implant d'une souche 4 compatible avec la souche 1 (et

donc hémi-compatible avec la souche 2).

Conformément à l'alternative ci-dessus, les résultats de la rétroconfrontation

sont les suivants. S'il n'y a pas compatibilité en rétroconfrontation les deux

homocaryons hemi-compatibles confrontés sont A#B=. S'il y a compatibilité les

homocaryons hémi-compatibles confrontés sont A-Bz.

Notons qu'il est nécessaire d'effectuer les rétroconfrontations sur chacun des

mycéliums confrontés, afin de mettre éventuellement en évidence une hétérocaryose

unilatérale.

De la conclusion tirée, on déduit les génotypes de compatibilité mis en

oeuvre. Compte tenu de la différence allélique à appliquer aux hémi-compatibles, la

première attribution du numéro des allèles est arbitraire dans la descendance d'un

Source : MNHN, Paris

BARRAGE SEXUEL CHEZ LENZITES BETULINUS 87

premier carpophore donné. Le croisement de cette première lignée avec les lignées de

carpophores différents permet de déterminer les allèles communs. La détermination des

groupes et des génotypes de compatibilité restent nécessaires dans chaque lignée à

allèles différents.

Observation du mycélium en confrontation in vivo

L'emploi d'une membrane de collodion permet par sa transparence une

observation facile du mycélium en croissance sous le microscope. Ces membranes sont

préparées comme suit (P. Lanquetin, communication personnelle). Une solution de 3 g

de nitrocellulose dans 60 ml d'éther diéthylique et 35 ml d'alcool éthylique est déposée

sur une lame de microscope préalablement lavée dans de l'alcool éthylique absolu et

munie de deux petits carrés de gaze à ses extrémités. Aprés séchage à l'air pendant

quelques minutes, les lames sont immergées dans de l'alcool à 70%, et les films y sont

détachés des lames et stockés. Ces membranes de collodion sont destinées à recouvrir

une goutte de malt liquide déposée sur lame microscopique stérile et inoculée à une

distance d'environ 1 cm des deux souches à confronter. L'oxygene diffuse à travers la

membrane et permet une croissance aisée du mycélium. L'inoculum provient d'une

préculture en milieu liquide à 26 d'extrait de malt. Les lames inoculées et recouvertes

de collodion sont maintenues en condition stérile, sur un support de verre, en boîte de

Petri garnie d'un papier filtre humide. Une technique similaire utilise des bandes de

fine feuille de cellophane préstérilisées dans de l'eau.

Mesure de la vitesse de croissance

Un implant de 6 mm de diamètre de mycélium jeune est déposé au centre de

2 boîtes de Petri d'un diamètre de 14 cm, sur milieu MA2% et à température ambiante

(20°C). Le diamètre des colonies est mesuré chaque 24 heures dans deux sens opposés

jusqu'à ce que les colonies aient atteint la marge de la boîte. La première mesure,

effectuée à 48 heures, sert de valeur zéro et sera déduite des valeurs mesurées par la

suite.

GÉNOTYPE ET PHÉNOTYPE DES HOMOCARYONS, DICARYONS

ET HÉTÉROCARYONS DE LENZITES BETULINUS

Résultats

1. Détermination des groupes de compatibilité

Seize homocaryons isolés du carpophore MUCL 38100 de Lenzites betulinus

ont été confrontés deux à deux. Après une dizaine de jours, quatre types d'interaction

sont observés et permettent le regroupement des homocaryons en quatre groupes

prouvant la présence des facteurs d'incompatibilité A et B. La présence d'anses

d'anastomose a été vérifiée en tous les cas au microscope. Les quatre interactions

observées sont reprises dans le Tableau 1.

Les quatre interactions observées s'y définissent comme suit.

Source : MNHN, Paris

88 G. HENNEBERT et al.

+: compatibilité entre les deux souches, présence d'anses complètes d'anastomose.

+ : hémi-compatibilité, formation d'un barrage avec répulsion des hyphes aériens,

fusions somatiques et présence de fausses boucles dans la zone de barrage. Le

symbole + est similaire à celui proposé et utilisé par Vandendries (1931, 1932a,

1933a) et Vandendries & Brodie (1933c).

- : hémi-compatibilité, phénotype "plat", réduction de la croissance, inhibition du

développement d'hyphes aériens et absence de fausses boucles.

= : incompatibilité (entre souches du même groupe de compatibilité), mélange des

mycéliums sans formation de ligne de démarcation, ni réduction de croissance, ni

fausses boucles

Les facteurs allélomorphes indiqués au Tableau 1 pour chaque groupe de

compatibilité n'ont été déterminés qu'après rétroconfrontation.

Lenzites betulinus est donc effectivement un basidiomycète bifactoriel

tétrapolaire comme déterminé par Vandendries & Brodie (1933a, 1933b, 1933c).

2. Détermination du génotype des groupes de compatibilité par rétroconfrontation

Un homocaryon par groupe de compatibilité I, II, III et IV a été retenu pour

confrontation et rétroconfrontation: MUCL 38103, 38109, 38107 et 38111

respectivement, issus du méme carpophore MUCL 38100.

Seules les confrontations caractérisées par des interactions d'hémi-

compatibilité + ou - sont effectuées. Elles entrainent ou non la migration unilatérale où

bilatérale de noyaux partenaires dans le mycélium opposé et une hétérocaryose.

(1х Ш) MUCL 38103 x 38107 interaction +

(Ix ID) MUCL 38103 x 38109 interaction -

(IV x ID MUCL 38111 x 38107 interaction -

(IV x II) MUCL 38111 x 38109 interaction +

Aprés 7 jours de confrontation, les rétroconfrontations sont effectuées entre

les huit mycéliums de premiére confrontation marqués d'une astérisque

(potentiellement enrichis d'un noyau étranger) et les souches compatibles de ce dernier.

(IxII) MUCL 38103* (+ 238107) x 38109 (П) compatible de 38107

MUCL 38107* (+ 738103) х 38111 (IV) compatible de 38103

(IxI) | MUCL 38103* (+ 238109) x 38107 (Ш) compatible de 38109

MUCL 38109* (+ 738103) х 38111 (ІУ) compatible de 38103

(IV x II) MUCL 38111* (+ 738107) x 38109 (П) compatible de 38107

MUCL 38107* (+ ?38111) x 38103 (I) compatible de 38111

(IV x ID) MUCL 38111* (+ 238109) x 38107 (Ш) compatible de 38109

MUCL 38109* (+ 238111) x 38103 (I) compatible de 38111

Après 21 jours de rétroconfrontation, la présence (+) ou l'absence (-) de

boucles d'anastomose est observée (Tableau 2).

Source : MNHN, Paris

BARRAGE SEXUEL CHEZ LENZITES BETULINUS 89

Tableau 1. Confrontation des homocaryons MUCL 38101 à 38116 issus du même carpophore

MUCL 38100

GROUPEI | GROUPEI | GROUPE III | GROUPE IV

(AIBI) (A1B2) (A2B1) (A2B2)

M IAE BA Е Е 35

U eS SEE eS

С it p] od ot | s Jod pta este et e Ы

L 0|o|1[1]0[|0|0|1|0 1 1] 1|0|0|0|1

3|s[|0|6|1|4]|9|3|7)2]4]5|2|5 6| 1

Go| 3803, | =) =) espe pese perse [os [es re

o 38108 jp e Тер ee) eode [oio pop oio ы ese Meer oi

P | 38110 Maa ае

38116 NTE EE EEE EAE

с 38101 = sss ++ +++ اچ‎ ++

Е +

o | 38104 НЕЕ ЕНЕ

Р | 38109 SIEGE

38113 Ext pe prs pes rg rc psg pes

Il IL

G | 38107 sheet tn nr

o | 38112 =l=/=|-]-]-]-

р 38114 == |-|- |: |-

38115 |

G | 38102 ===

о | 38105 = |= |=

Р | 38106 SIE

38111 [| =

Source : MNHN, Paris

90 G. HENNEBERT et al.

Tableau 2. Rétroconfrontation de mycéliums hémi-compatibles de Lenzites betulinus MUCL 38100

Premiere confrontation Seconde confrontation Résultat de

(rétroconfrontation) rétroconfrontation

(Lx Ш) 38103 x 38107 38103* x 38109 (I) E

38107* x 38111 (IV) Е

(Lx II) 38103 x 38109 38103* x 38107 (III) 8

38109* x 38111 (IV) +

(IV x ID) 38111 x 38107 38111* x 38109 (I *

38107* x 38103 (I) +

(V x ID) 38111 x 38109 38111* x 38107 (III) :

38109* x 38103 (1) Е

La compatibi indique que les mycéliums testés sont hétérocaryotiques et

que les groupes I et II, de méme que les groupes III et IV, different par leur facteur B,

tandis que les groupes I et III, comme les groupes Il et IV, diffèrent par leur facteur A.

Ces derniéres combinaisons I x III et II x IV sont précisément celles qui ont développé

un barrage sexuel.

Dès lors les homocaryons de Lenzites betulinus classés en quatre groupes

peuvent se voir attribuer les facteurs d'incompatibilité donnés dans le Tableau 3 à partir

d'une première attribution arbitraire du géntoype A1B1 à un des quatre groupes, devant

toutefois respecter dans l'attribution des alléles aux autres groupes le fait que

l'hétérocaryose par migration nucléaire est convenue comme due 4 A=B#. Si nous

choisissons, en l'absence de souches de référence, d’attribuer le génotype A1B1 aux

souches du groupe 1, les autres génotypes sont les suivants.

Tableau 3. Génotypes des groupes de compatibilité chez Lenzites betulinus MUCL 38100

Groupe homocaryons facteurs d'incompatibilité

І 38103, 38108, AIBI

38110, 38116

П 38101, 38104, AIB2

38109, 38113

Ш 38107, 38112, А2В1

38114,38115

IV 38102, 38105, A2B2

38106, 38111

Si nos observations sont exactement conformes et même complètent celles de

Vandendries & Brodie (1933a, 1933b, 1933c) et Vandendries (1934b), les génotypes

attribués aux homocaryons sont tels que les formules de confrontation entre hémi-

compatibles sont exactement inverses de telle sorte que le barrage sexuel se forme

entre souches A#B= et non A=B# comme l'avaient décidé ces auteurs.

Source : MNHN, Paris

BARRAGE SEXUEL CHEZ LENZITES BETULINUS 91

3. Caractérisation des homocaryons en confrontation et des hétérocaryons

Le phénotype cultural des homocaryons de Lenzites betulinus en culture pure

correspond exactement aux descriptions de Nobles (1948), Stalpers (1978) et Ryvarden

& Gilbertson (1993).

Tableau 4. Caractéres phénotypiques des différentes confrontations.

Génotypes A#B# A#B= A=B#

Interaction en + + - -

confrontation démarcation répulsion "plat" mélange

puis mélange barrage

Caractères mycélium mycélium primaire mycélium mélange des 2

culturaux secondaire aérien dense, hétérocaryotique homocaryons

grumeleux bourrelets de barrage, aérien ténu, mycélium aérien

feutré quelques hyphes feutrage "plat", dense,

blanc-crème | rampants dans la zone pas de barrage pas de barrage

de confrontation

morphologiques | anses complètes fausses boucles pas de boucles pas de boucles

d'anastomose

cytologiques fusions fusions somatiques, | fusions somatiques, | homocaryons

somatiques, hétérocaryon limité à hétérocaryon B#

copulation, quelques cellules, stable,

mycélium instable, pas de migration des noyaux

dicaryotique migration de noyaux

Croissance de ralentie ralentie ralentie inchangée

l'homocaryon

Croissance du augmentée - lente

| produit (Fig.1) (Fig. 2)

La vitesse de croissance sur milieu gélosé en phase exponentielle varie

quelque peu d'un homocaryon à l'autre (Fig. 1 & 3). Le Tableau 4 résume les caractères

phénotypiques observés lors des confrontations d'homocaryons.

Les hétérocaryons à noyaux de facteur A commun et B différent produits lors

de ces confrontations ont été isolés et retenus: MUCL 38559 = 38103(+38109), MUCL

38560 = 38107(+38111), MUCL 38561 = 38109(+38103), et MUCL 38562 =

38111(+38107).

Repiqués à plusieurs reprises, ces hétérocaryons se montrent stables, ne

retournant pas au génotype ni au phénotype de l'un ou l'autre des homocaryons

parentaux. Ils gardent un phénotype moins dense, de type plat ("flat"), pratiquement

dépourvu d'hyphes aériens et leur génotype reste hétérocaryotique. Leur vitesse de

croissance est plus faible que celle des homocaryons correspondants (Fig. 3). Leur

vitesse moyenne de croissance n'atteint que 160 um/heure tandis que celle d'un

homocaryon s'élève à 250 um/heure.

Source : MNHN, Paris

92 G. HENNEBERT et al.

B — — 38107 1

E —9— 38107« 38109 A2B1« 5A1B2

404 y —— 38109 A1B2

Е ——9—— 38109 >38107 A1B2<>A2B1

È —a— 38564 = 38107x38109 A2B1xA1B2

304

20 +

104

temps (heures)

o r > т т т т

o 25 50 75 100 125 150 175 200

Fig. l. - Courbes de croissances comparées des homocaryons seuls, des homocaryons en

confrontation de compatibilité et du dicaryon.

4. Confrontation d'homocaryons issus de carpophores différents

Des homocaryons isolés de trois lignées différentes de Lenzites betulinus ont

été confrontés. Tous les croisements effectués ont été compatibles, des anses

d'anastomose étant formées à tous les septas des mycéliums partenaires aprés une

dizaine de jours d'incubation. Les facteurs d'incompatibilité A et B sont donc présents

dans les 3 lignées étudiées sous 6 alleles différents. Les alleles 1 et 2 ont été attribués

aux facteurs A et B de la lignée MUCL 38100, les alléles 3 et 4 aux facteurs A et B de

la lignée MUCL 31428 et les allèles 5 et 6 aux facteurs A et B de la lignée MUCL

38118.

Discussion

1. La fonction des facteurs A et B et l'attribution des génotypes

L'attibution des génotypes AB, ab, Ab, aB ou A1B1, A2B2, AIB2, A2BI aux

souches des quatre groupes de compatibilité serait purement arbitaire, vingt quatre

Source : MNHN, Paris

404

304

204

BARRAGE SEXUEL CHEZ LENZITES BETULINUS 93

38109 A182

38109« 538111 AID2xA2B2

38109< >38103 AIB2xA1B1

38109 (+38103)

38109< >38107 A1B2xA2B1

Croissance (mm)

temps (heures)

т т т

25 50 75 100 125 150 175 200

Fig. 2 - Courbes de croissance comparées de l'homocaryon 38109 seul et de l'homocaryon 38109

dans diverses confrontations vis-à-vis de 38107, 38103 et 38111

combinaisons étant possibles, s'il n'existait deux principes qui permettent de réduire

l'arbitraire à quatre combinaisons possibles et d'assurer la cohérence dans les études

d'une même espèce et d'espèces différentes: (1) Les croisements fertiles d'homocaryons

hétérothalles résultent toujours du croisement A#B#. (2) Les croisements stériles autres

qu'isogéniques (A=B=), donc hémi-compatibles de formule A#B= ou A=B# seront de

formule A=B# lorsqu'ils forment un hétérocaryon stable.

Oort (1929) reconnaît la tétrapolarité du Coprinus fimetarius et en caractérise

les quatre groupes de compatibilité par des phénotypes différents. Il est le premier à

lier les barrages entre hémi-compatibles aux facteurs d'incompatibilité. Analysant les

résultats de ses croisements de souches monospermes de Coprinus fimetarius et ceux

obtenus par Vandendries (1927) chez Coprinus micaceus et pensant devoir tenir

compte de la variabilité de certaines interactions que Kniep (1929) attribue

arbitrairement au facteur A#, Oort (1929, 1930) attribue à ses souches et aux souches

de Vandendries un génotype qui le conduit à lier les barrages sexuels qu'il observe

entre hémi-compatibles aux combinaisons ABxAb et aBxab, donc de formule A=B#,

Source : MNHN, Paris

94 G. HENNEBERT et al.

38103 AIBI

38107 A2B1

38109 A1B2

38111 A2B2

38559 A1B1 (+ A1B2)

38560 A2B1 (+ A2B2)

38561 A1B2 (+ A1B1)

38562 A2B2 (+ A2B1)

404

Croissance (mm)

20 +

temps (heures)

0 25 50 75 100 125 150 175 200

Fig. 3. - Courbes de croissance comparées des homocaryons et hétérocaryons par les facteurs de

compatibilité À commun et B différent résultant des croisements avec barrage.

affirmant toutefois ne pas savoir lequel des facteurs A= ou B+ est responsable des

barrages. Sa décision résulte en tous cas d'un choix arbitraire. Eut-il pris une autre

décision, les barrages sexuels observés eussent été attribués à la combinaison A#B=.

Prenant comme critères les phénotypes décrits par Oort (1929) dans les

interactions hémi-compatibles (A#B=: croissance ralentie, inhibition des hyphes

aériens, pas de ligne de séparation, : répulsion mutuelle, zone de barrage,

croissance et feutrage normal), Vandendries (1931, 1932a, 1932b, 1933a, 1933b),

Vandendries & Brodie (1933a, 1933b, 1933c), Vandendries dans tous ses travaux

ultérieurs, Brodie (1936, 1948), Quintanilha (1935) Quintanilha & Pinto-Lopes (1950)

et d'autres adoptèrent les génotypes fixés par Oort (1929, 1930) pour les différents

phénotypes culturaux obtenus lors des confrontations.

De plus, Oort (1930, p. 109, tab. 7) fut apparemment le premier à appliquer la

rétroconfrontation entre des souches hémi-compatibles déjà confrontées et les souches

homocaryotiques. Il observe ainsi chez Coprinus fimetarius que les croisements

auxquels il donne la formule A#B= produisent un "Mischmyzel" (hétérocaryon) et sont

associés à une réduction de la croissance et une inhibition des hyphes aériens tandis

Source : MNHN, Paris

BARRAGE SEXUEL CHEZ LENZITES BETULINUS 95

que les croisements auxquels il donne la formule A=B# maintiennent le mycélium

primaire sans mélange ("keine Mischmyzel") séparés par une forte répulsion mutuelle.

Par cette rétroconfrontation, Oort ajoutait un nouveau critère, celui de l'hétérocaryose,

dans la reconnaissance des interactions entre hémi-incompatibles et l'attribution de leur

formule génotypique.

Malencontreusement, une attribution inverse des génotypes, en opposition

directe à celle de Oort (1929, 1930) et des auteurs qui l'ont suivi jusque Brodie (1948)

est due, apparemment, à Fulton (1950). En effet, reprenant les travaux de Brodie

(1948) sur Cyathus stercoreus mais ne pouvant donner à ses souches les génotypes des

souches reçues de Brodie, celles-ci étant mortes, Fulton (1950) décida arbitrairement et

sans tenir compte des nombreux travaux antérieurs, des génotypes de ses souches. Elle

donna la formule A=B¥ aux souches hémi-compatibles formant un hétérocaryon et la

formule A#B= à l'interaction caractérisée par une "ligne de démarcation" (barrage) et

des fausses boucles alors que Oort (1929), puis Vandendries(1932a) et Brodie (1948)

l'avaient sur la base de ces caractères attribué à A=B#. Papazian (1949, 1950) adopte

l'option de Fulton, décrivant la formation d'un barrage chez Schizophyllum commune

sous la formule A#B= et conséquemment la réduction du développement mycélien qu'il

caractérise comme "flat" à la formule A=B#.

Il est surprenant que J.R. Raper (1966) reprenant de manière détaillée, à la p.

58 de son traité "Genetics of Sexuality in Higher Fungi", les travaux de Oort (1929,

1930) et, a la page 64, ceux de Vandendries & Brodie (1933c) et Brodie (1936) sur

Lenzites betulinus, y cite des formules génotypiques d'interaction entre homocaryons

inverses des formules originales données par ces auteurs, sans noter l'inversion, ni en

donner l'origine ni la justification.

Cela étant et ne pouvant plus être corrigé, les fonctions acceptées ici pour les

facteurs A et B seront celles de la génétique établie depuis 1950.

L'hétérocaryose attribuée au facteur Bs chez les homocaryons hémi-

compatibles est détectée par le test de rétroconfrontation (Papazian, 1950). Par ce test

Papazian reconnaît l'hétérocaryose engendrée et propagée par la migration unilatérale

ou bilatérale d'un noyau "envahisseur" hémi-compatible jusque dans les hyphes apicaux

due au facteur B# (Parag, 1965a; Snider, 1965; Mayfield, 1974) et démontre la stabilité

du mycélium hétérocaryotique formé. Par le même test il démontre également la

formation d'une hétérocaryose instable de formule A#B=, limitée à quelques hyphes

dans la zone de barrage sans propagation vers les hyphes apicaux. Le méme test a été

utilisé chez Armillaria mellea par Darmono & Burdsall (1992), chez Coprinus

castaneus par Desai & Peerally (1994).

La rétroconfrontation appliquée à Lenzites betulinus sur la base de la fonction

donnée au facteur B depuis 1950, a montré que les génotypes des homocaryons hémi-

compatibles formant un barrage sont A#B=.

2. Les quatre phénotypes d'interaction entre homocaryons

Quatre phénotypes d'interaction entre homocaryons ont été décrits par Oort

(1929), confirmés et précisés par d'autres (Papazian, 1949, 1950; Fulton, 1950). Ils se

Source : MNHN, Paris

96 G. HENNEBERT et al.

retrouvent comme suit chez Lenzites betulinus (Vandendries & Brodie 1933a, 1933b,

1933с).

A#B#: arrét initial de croissance, faible ligne de démarcation masquée ensuite par un

mycélium dicaryotique vigoureux à croissance accélérée, boucles d'anastomose.

A-Bz: réduction de croissance, inhibition des hyphes aériens, aspect "plat", hétéro-

caryose, pas de fausses boucles.

AsB-: répulsion mutuelle, barrage sexuel, bourrelets marginaux d'hyphes recourbés

entremélés, zone de barrage traversée de quelques hyphes à fausses boucles, croissance

légèrement ralentie.

A-B-: croissance et feutrage mycélien des homocaryons, mélange mycélien,

croissance normale.

1° A#B# Compatibilité par facteurs A et B différents. Formation d'un dikaryon

(Photo 1)

Les homocaryons compatibles de Lenzites betulinus réduisent fortement leur

croissance dès le contact en formant une ligne de démarcation qui persite durant deux

jours. Pendant ce temps il y a fusions somatiques, migration et appariement de noyaux

La ligne de démarcation est ensuite masquée par le développement vigoureux d'un

mycélium dicaryotique à croissance rapide (Fig. 1) et à boucles d'anastomose

complètes.

2° A=B#: Hémi-compatibilité par facteur B différent. Phénotype "plat". Hétérocaryon

Bz (Photo 2)

Le phénotype "plat" ("flat", Papazian, 1950) est observé chez Lenzites

betulinus avec feutrage d'hyphes aériens moins dense que celui des homokaryons

isolés, et étant très faible par endroits. Il n'y a pas formation de barrage, ni formation

de vraies ou de fausses boucles mais il y a hétérocaryotisation des deux mycéliums

confrontés. La croissance des homocaryons confrontés est plus faible que celle des

mêmes homocaryons cultivés isolément (Fig. 2).

Les fusions somatiques sont de faible fréquence évaluée à 0.7 % des contacts

hyphaux chez Schizophyllum commune (Ahmad & Miles 1970a). Les hétérocaryons

bilatéraux produits chez Lenzites betulinus sont stables comme le sont ceux de

Schizophyllum commune (Papazian, 1950) ou d'Echinodontium tinctorium (Wilson,

1990). Isolés ils conservent le même phénotype "plat" et leur génotype propre. Ils

résultent d'une migration bilatérale de noyaux "envahisseurs" de chaque partenaire dans

l'autre (Dick, 1965; Snider, 1965; Raudaskoski, 1973). La migration bilatérale n'est pas

un fait général. La migration est parfois unilatérale, un seul hétérocaryon étant formé,

comme chez Cyathus stercoreus (Brodie, 1948), ou limitée à la ligne de confrontation

comme chez Coprinus sassii (Kemp, 1974). Une migration nucléaire bilatérale а été

aussi observée chez Armillaria mellea (Darmono & Burdsall, 1992).

Chez Lenzites betulinus, une diminution sensible de la vitesse de croissance

est observée dans les homocaryons en cours d'envahissement par le noyau étranger lors

de la confrontation, comparés aux mêmes homocaryons en culture isolée, C'est la

même vitesse réduite de croissance qui caractérise l'hétérocaryon B# cultivé isolément.

Ce fait a été confirmé chez les divers hétérocaryons B# obtenus. Papazian (1950) n'a

Source : MNHN, Paris

BARRAGE SEXUEL CHEZ LENZITES BETULINUS 97

Photos 1-4. Phénotypes d'interaction entre homocaryons de Lenzites betulinus compatibles (I),

hémi-compatibles avec hétérocaryose (2), hémi-compatibles avec répulsion (3) et incompatibles (4).

pas mentionné cette croissance réduite de l'hétérocaryon B# chez Schizophyllum

commune mais Parag (1965a) et Anderson & Deppe (1976) la mettent en évidence, de

même que Marmeisse (1988) chez Agrocybe aegerita. Anderson & Deppe (1976) et

С.А. Raper (1983) montrent aussi que le taux de croissance pondérale de l'hétérocaryon

B# de Schizophyllum commune est réduit à la moitié du taux de croissance des

homocaryons isolés et du dicaryon de la même lignée.

Koltin & Flexer (1969) décrivent l'hétérocaryon B# de Schizophyllum

commune comme composé de cellules anucléées, uninucléées, binucléées et multi-

nucléées. Le désordre de la répartition des noyaux dans les cellules de l'hétérocaryon

résulterait du mouvement des noyaux de cellule à cellule à travers les septa dégradés.

Les noyaux n'y sont pas appariés et se divisent de façon asynchrone, puisque le facteur

A responsable de la division conjuguée des noyaux est inactif (C.A. Raper, 1983; Kues

& Casselton, 1992). La présence de ces noyaux hémi-compatibles, leur répartition et

leur division désordonnées pourraient être le frein de la croissance de l'hétérocaryon.

Source : MNHN, Paris

98 G. HENNEBERT et al.

3° A#B=: Hémi-compatibilité par facteur A différent. Phénotype "barrage sexuel"

(Photo 3)

Le phénotype observé est celui décrit par Vandendries & Brodie (1933a,

1933b, 1933c) et Vandendries (1934b), une interaction d'"antagonisme sexuel"

(Vandendries, 1923a), de "barrage sexuel" (Vandendries, 1931) marquée par la

"répulsion" des hyphes aériens (Vandendries & Brodie, 1933c).

Dans la zone d'interaction des deux homocaryons, des hyphes rampent sur

l'agar et forment un entrelas mycélien léger. Des fusions d'hyphes par anastomose

somatique et des fausses boucles formées par les quelques cellules proches de

l'anastomose y ont été observées. Des prélèvements sous loupe stéréoscopique d'hyphes

solitaires dans la zone de barrage n'ont permis l'isolement que de mycélium

homocaryotique de l'un ou l'autre des génotypes parentaux.

Seulement après une semaine de confrontation, un barrage est visible à l'oeil

nu. Les hyphes aériens se "repoussent" et s'incurvent de manière désordonnée formant

de chaque cóté de la zone d'interaction des bourrelets mycéliens distants de 2 mm. La

répulsion affecte de maniere beaucoup plus marquée les hyphes aériens que les hyphes

rampants ou intramatriciels. Le mycélium produit par les homocaryons en

confrontation est plus abondant que celui des mémes homocaryons cultivés isolément.

Sur toute la colonie comme dans les bourrelets du barrage, les hyphes se croisent et

s'entremélent. Ils ne poussent de façon linéaire qu'à la marge en croissance en dehors

du front de confrontation. La croissance des homocaryons confrontés est plus faible

que celle des mémes souches isolées.

La formation de barrage sexuel a été observée chez d'autres espèces

basidiomycètes tétrapolaires tels Panaeolus campanulatus (Vandendries, 1923a,

1923b), Coprinus micaceus (Vandendries, 1927), Coprinus fimetarius (Oort, 1930),

Panaeolus papilionaceus (Vandendries, 1931), Pleurotus columbinus (Vandendries,

1932a, 1932b), Pleurotus ostreatus et Coriolus zonatus (Vandendries, 1933b),

Deconica coprophila (Vandendries, 1937a, 1937b), Schizophyllum commune (Papazian,

1950), Auricularia cornea (Wong & Wells, 1987), Echinodontium tinctorium (Wilson,

1990), Marasmius rotula et Marasmius pyrocephalus (Gordon & Petersen, 1991),

Agrocybe aegerita (Marmeisse, 1991).

La formation de fausses boucles caractérise ces interactions hémi-

compatibles (Day, 1965; Dick, 1965; Casselton, 1978; Casselton & Economou, 1985;

Marmeisse, 1991). Elles prouvent l'existence de fusions somatiques entre les hyphes

hémi-compatibles. Des cellules hétérocaryotiques se forment donc, par fusion, sur la

ligne de confrontation. La migration nucléaire des noyaux étrangers vers les hyphes

apicaux ne s'effectue cependant pas, comme cela fut observé chez Schizophyllum

commune (Papazian, 1950; Ellingboe, 1964; Parag, 1965a; Koltin & Flexer, 1969;

Niederpruem, 1980), chez Coprinus lagopus (Smythe, 1973) ou chez Armillaria mellea

(Darmono & Burdsall, 1992). Il en est de même chez Lenzites betulinus, comme le

prouve le test de rétroconfrontation. D'ailleurs, nos observations comme celles de

Papazian (1950) montrent que l'hérérocaryon est instable.

Vandendries & Brodie (1933a, 1933b, 1933c), Vandendries (1934b) et Brodie

(1936), s'ils ont observé quelques hyphes rampant sur la gélose et traversant la zone de

Source : MNHN, Paris

BARRAGE SEXUEL CHEZ LENZITES BETULINUS 99

barrage, n'ont pas observé de fusions ni la présence des fausses boucles dans la zone de

barrage.

4° A=B=: Incompatibilité par facteurs À et B communs (Photo 4)

Lors de leur confrontation les homocaryons de même génotype ne montrent

pas un phénotype autre que le leur propre. Les mycéliums se mélangent. Aucune anse

d'anastomose ni fausse boucle n'a été observée. Leur vitesse de croissance n'est pas

modifiée.

Ce phénomène d''overlap' ou "hyphal massing" est connu chez

Schizophyllum commune (Papazian, 1950) ou chez Echinodontium tinctorium (Wilson,

1990), contrairement à d'autres basidiomycètes tétrapolaires où un phénomène appelé

"barrier" se produit (Wilson, 1990), simplement marqué par une ligne de démarcation

lorsque les mycéliums confrontés ne sont pas de la méme souche.

Dans la zone de rencontre des deux mycéliums, il y a parfois fusions

somatiques et formation de cellules hétérocaryotiques (chez Schizophyllum commune,

Ellingboe, 1964; Parag, 1965a; Ahmad & Miles, 1970a; Casselton, 1978; Niederpruem,

1980; C.A. Raper, 1983; chez Armillaria mellea, Darmono & Burdsall, 1992; chez

Coprinus lagopus, Smythe, 1973; chez Agrocybe aegerita, Marmeisse, 1991). Koltin &

Flexer (1969) ne trouve cependant pas plus de 0.4% des contacts entre hyphes donnant

des fusions somatiques chez Schizophyllum commune. Yl n'y a pas migration nucléaire

et ces cellules hétérocaryotiques sont instables, retournant vers l'un des génotypes

parentaux lorsqu'elles sont repiquées (chezCoprinus lagopus, Smythe, 1973; chez

Schizophyllum commune, Parag, 1965a; chez Agrocybe aegerita, Marmeisse, 1991).

3. Confrontation des homocaryons issus de carpophores différents

Le multiallélisme intraspécifique de Lenzites betulinus a été établi par

Vandendries (1934b) et confirmé par Brodie (1936) et le présent travail. Le

multiallélisme des gènes composant les facteurs d'incompatibilité A et B est connue

chez de nombreuses espèces de basidiomycètes tétrapolaires, telles Coprinus fimetarius

(Oort, 1930), Schizophyllum commune (Papazian, 1950; Boidin, 1986), Echinodontium

tinctorium (Wilson, 1990), Agrocybe aegerita (Noël et al., 1991), Serpula lacrymans

(Schmidt & Moreth-Kebernik, 1991), ou bipolaires tel Marasmius oreades (Mallet &

Harrison, 1988).

Le multiallélisme et l'interfertilité entre isolats ou lignées d'origine différente

serait un critère du concept biologique d'espèce (Kühner, 1977; Boidin, 1986). Ce

concept d'espèce pourrait cependant ne pas être absolu, une incompatibilité végétative

Ou somatique entre mycéliums devenus génétiquement différents ("incompatibilité

hétérogénique" et "incompatibilité hétérocaryotique") pouvant grâce à un mécanisme

de reconnaissance mutuelle self/non self diviser l'espèce en individus ("races

géographiques", Vandendries, 1929) en voie de spéciation (Day, 1978; Todd & Rayner,

1980; Kemp, 1980). Cette incompatibilité somatique est souvent à l'origine de

manifestations morphologiques telles que barrages, aversions, zones neutres, lignes de

démarcations (Todd & Rayner, 1980). Ces manifestations n'ont pas été observées entre

les 3 lignées de Lenzites betulinus.

Source: MNHN, Paris

100 G. HENNEBERT et al

LE MÉCANISME DE FORMATION DU BARRAGE SEXUEL

CHEZ LENZITES BETULINUS

La formation d'un barrage sexuel, expression d'une répulsion sexuelle entre

thalles hémi-compatibles à facteur A# et B=, n'est pas un caractère général des

basidiomycètes tétrapolaires. Par contre la conjugaison sexuelle résulte dans divers

groupes de champignons d'un phénomène d'attraction attribué à des phéromones

d'attraction et de différenciation (Abe er al. 1975). Des phéromones de répulsion, si

elles existent, sont encore inconnues. Aussi le barrage sexuel des basidiomycètes

constitue-t-il une énigme digne d'intérêt.

1. L'hypothèse d'émanations gazeuses de Vandendries et Brodie

Vandendries & Brodie (1933c) ont amplement expérimenté la formation du

barrage chez Lenzites betulinus, observé et illustré la répulsion mutuelle des hyphes

aériens se manifestant par la modification de leur polarité de croissance et leur

courbure désordonnée et proposé une première hypothèse explicative. Etant donné la

formation de tels barrages alors qu'un contact mycélien entre les deux homocaryons

confrontés était supposé rendu impossible par l'interposition de cloisons de nature

diverse étanche et non, Vandendries & Brodie (1933c, 1933d) pensèrent d'abord que le

barrage était dû à des "radiations" émises par chacun des mycéliums confrontés.

Cependant, Vandendries (1934a) poursuivant ses expérimentations, publie dans une

note rectificative l'hypothèse reprise ensuite par Brodie (1936) d''émanations gazeuses"

agissant d'une souche sur l'autre "par la voie de l'air" de l'enceinte de culture. Ensuite

Cosyns, senior auteur du présent travail, avec la collaboration de Vandendries dans des

essais non publiés réalisés de 1934 à 1937, met en évidence par condensation à basse

température la production dans l'enceinte de culture de Lenzites betulinus d'une

substance volatile exerçant un effet réducteur de la croissance. D'autre part par la

fixation cytologique de nombreux hyphes apicaux, il observe une désorientation du

plan de mitose du noyau dans les hyphes ayant subi une courbure suite à la répulsion

sexuelle en bordure du barrage, suggérant par là une réponse génétique de la cellule à

l'agent de répulsion sexuelle.

L'hypothèse d'"émanations gazeuses" devrait aujourdhui se traduire en termes

de “hormone ou phéromone volatile de répulsion sexuelle”, dont la production et la

spécificité seraient contrôlées par les facteurs génétiques d'incompatibilité A et B. Une

telle hormone ou phéromone provoquerait, lors de la confrontation de deux

homocaryons hémi-compatibles B=, un phénomène de répulsion mutuelle se

manifestant à distance principalement par une modification de l'orientation de

croissance des hyphes aériens (Vandendries & Brodie, 1933c), l'effet de répulsion étant

moins net sur les hyphes rampant à la surface du substrat dans la zone d'interaction,

voire nul sur les hyphes intramatriciels. Cet effet aboutirait à la formation des

bourrelets mycéliens délimitant les deux côtés du barrage. La substance dénommée ici

phéromone est supposée volatile pour servir de communication entre hyphes aériens.

D'action hormonale sans doute, elle n'est peut-être pas une seule molécule mais

pourrait consister en une cascade de molécules dont une seule serait volatile et de

communication, une autre de fonction hormonale.

Source : MNHN, Paris

BARRAGE SEXUEL CHEZ LENZITES BETULINUS 101

Y a-t-il nécessité d'un contact préalable entre les mycéliums pour la

formation du barrage? Dans des essais récents, aucun barrage n'a pu être observé en

absence de contact d'hyphes dans la zone de barrage. Lorsque deux de nos

homocaryons, hémi-compatibles par le facteur B commun, MUCL 38103 et 38107, ont

été implantés dans les deux compartiments contigus d'une boîte de Petri en

polyéthylène divisée par une cloison de même matière dépassant la surface de l'agar de

3 à 6 mm, et incubées à température de 20°C, 12°C, 9°C et 4°C, aucun barrage n'a été

observé. Les hyphes de chaque souche finissent par "grimper" sur la paroi après cinq

ou six jours, et se rejoindre à son sommet. Deux homocaryons quelconques,

compatibles, hémi-compatibles par le facteur A commun ou incompatibles, se

comportent de façon identique dans les mêmes circonstances. Cet insuccès trouve peut-

être sa raison dans la variabilité de l'intensité de la répulsion, mesurée par la largeur du

barrage, que Brodie (1936) a montrée entre des souches d'origine différente et entre des

souches de même origine selon leur état de conservation en culture artificielle. En effet

Brodie (1936) a observé chez des souches récemment isolées la formation de barrages

sexuels de près de 10 mm de large. Nos souches, âgées de deux ans lors de l'essai, n'ont

jamais donné de barrage excédant 2 mm.

D'autre part, poursuivant les essais antérieurs de Cosyns et Vandendries, des

essais de capture par adsorption des substances volatiles produites par le champignon

dans l'enceinte de culture et leur analyse par chromatographie en phase gazeuse

indiquent déjà l'existence d'une trentaine de composés de nature et d'activité encore

indéterminées.

Phéromones d'attraction sexuelle, nature et fonction

Pour tenter de comprendre les mécanismes possibles d'action de phéromones

de répulsion sexuelle, si elles existent, il est utile de considérer brièvement les

phéromones d'attraction sexuelle. Les phéromones d'attraction entre partenaires sexuels

compatibles des champignons ont déjà été étudiées chez les Oomycètes, les

Zygomycètes, les Ascomycètes et les Basidiomycètes. Ces substances émises à

distance par un seul ou chacun à tour de rôle des partenaires sexuels seraient reçues par

des récepteurs protéiques spécifiques situés en surface des parois hyphales. J.R. Raper

(1952), Van den Ende (1983), Gooday (1983b) ont successivement résumé les

connaissances sur les phéromones sexuelles des champignons et les systémes de

communication entre partenaires.

Chez les Oomycètes, en particulier les Saprolégnacées du genre Achlya, JR.

Raper (1939) a démontré l'induction hormonale par les hyphes femelles de la formation

de filaments anthéridiens porteurs de gamétes chez les hyphes máles, puis l'émission

par ces anthéridies d'une hormone complémentaire induisant le développement des

oogones chez les hyphes femelles. Cette morphogenèse induite à distance

s'accompagne d'une attraction réciproque. Ces phéromones, alors appelées anthéridiol

et oogoniol, ont plus tard été identifiées comme des stérols dont le fucostérol est

précurseur (Van den Ende, 1983).

Chez les Zygomycètes, le zygotropisme des Mucorales Mucor mucedo et

Blackeslea trispora est connu depuis longtemps comme le résultat de l'action

d'hormones agissant à distance, ou phéromones, spécifiques à chaque polarité sexuelle

(Banbury, 1954). Depuis 1971, ces "hormones volatiles zygotropiques" sont reconnues

Source : MNHN, Paris

102 G. HENNEBERT et al.

de nature terpénoïde et identifiées à six acides trisporiques. De même les précurseurs,

dénommés "prohormones", spécifiques à chaque génotype sexuel ont été identifiés

(Bu'Lock er al., 1974, 1976). Van den Ende (1978) a fait le point sur ces recherches .

Chez les Ascomycètes, des phéromones d'attraction sont identifiées chez

plusieurs espèces telles que Saccharomyces cerevisiae, Neurospora crassa, Sordaria

macrospora et d'autres. Levi (1956) découvre l'action d'hormones sexuelles diffusibles

agissant à distance, appelées "factor a” et "factor a", dans le croisement fertile des

génotypes a et & de Saccharomyces cerevisiae. Cette action consiste dans l'arrêt du

bourgeonnement, un gonflement, l'élongation des cellules partenaires, l'attraction de

l'une vers l'autre et la fusion. L'attraction entre cellules de sexe opposé conduit à

l'agglutination des cellules et la floculation dans le cas des levures (Brock, 1958). Le

"factor œ" est un mélange de 4 peptides comprenant de la méthionine. Le "factor a",

beaucoup plus hydrophobe, est un famesyl-ondécapeptide dépourvu de méthionine. Ces

deux phéromones ont été synthétisées. Les génes a et Q correspondants ont été

identifiés (Gooday, 1983b). Le mécanisme de réception du signal et de sa transmission

dans la cellule est connu (Sprague, 1991).

Chez les Basidiomycétes, peu de phéromones sont connues. L'action de

phéromones diffusibles de conjugaison est démontrée par Bandoni (1965) chez

Tremella mesenterica. Classées comme "érogènes" par Machlis (1972), ces

phéromones sont analysées par Reid (1974) qui les caractérise comme de petits

peptides non polaires de poids moléculaire inférieur à 1000 et isolées par Sakagami er

al. (1979, 1981) qui les dénomment trémérogéne A-10 et a-13. Chez Rhotosporidium

toruloides, espéce bipolaire unifactorielle, deux phéromones sexuelles diffusibles, des

farnesyl-ondécapeptides (lipopeptides) dénommés rhodotorucine A et a, sont isolées et

déterminées par Tsuchiya er al. (1978) comme spécifiques des génotypes A et a. La

phéromone rhodotorucine A est reçue et hydrolysée au niveau de l'enveloppe cellulaire

du partenaire a par une enzyme membranaire spécifique thiol-peptidase (Miyakawa et

al., 1982; Jeong et al., 1987). Ce métabolisme spécifique de la rhodotorucine A est

activé par l'ion Ca2+ et constitue la réaction signal de la réception de l'information

hormonale commandant la différenciation morphogénétique sexuelle. Celle-ci passe

par l'inhibition temporaire du bourgeonnement végétatif et de la mitose, puis par le

développement d'un tube copulateur orienté vers la cellule partenaire A et qui

fusionnera avec elle (Tsuchiya er al,, 1978; Jeong et al,. 1987). Les précurseurs de la

thodotorucine A sont codés par trois génes spécifiques du génotype A absents dans le

génotype a (Akada et al., 1989)

Spécificité des hyphes aériens

Le fait que la phéromone de répulsion agisse seulement ou plus efficacement

sur les hyphes aériens que sur les hyphes rampants, impliquerait une différence de

composition ou de comportement de la paroi de ces hyphes.

Pour recevoir le message de la phéromone, la paroi des hyphes aériens devrait

contenir des récepteurs probablement protéiques capables de la reconnaître

spécifiquement. La fixation de la phéromone sur ces récepteurs, réaction peut-être

similaire à l'agglutination antigène-anticorps, activerait par une chaîne cytoplasmique

intermédiaire une cascade de gènes agissant sur les microtubules nucléaires ou

Source : MNHN, Paris

BARRAGE SEXUEL CHEZ LENZITES BETULINUS 103

cytoplasmiques ou sur le plan de mitose et modifiant finalement l'axe de croissance.

Cette réponse aboutirait ainsi à l'expression du barrage mycélien.

Il se pourrait également que les récepteurs spécifiques de la phéromone soient

des protéines spécifiques situées au niveau de la membrane nucléaire (C.A. Raper,

1983). La phéromone devrait alors traverser librement la paroi et la membrane

cellulaire pour diffuser dans le cytoplasme jusqu'au noyau.

Les hyphes rampants, ne possédant pas ces récepteurs ou les possédant

partiellement inactivés par un inhibiteur, ne seraient pas ou peu soumis à l'influence de

la phéromone. Ils continueraient a croître les uns vers les autres à la surface du

substrat, à se mêler et à fusionner.

On sait que la production de mycélium aérien est dépendante des facteurs

d'incompatibilité comme le prouve la réduction importante du mycélium aérien dans ce

qui est appelé le phénotype “plat” de l'hétérocaryon A=BZ chez Lenzites betulinus (nos

observations) ou Schizophyllum commune (Papazian, 1950). Ce phénotype a été

également obtenu par mutation chez Endothia parasitica, ascomycéte homothalle

(Anagnostakis, 1984).

Par ailleurs une différence dans la régulation probablement génétique de la

production d'hydrophobines serait à l'origine de l'émergence des hyphes aériens

(Wessels, 1992). Il s'agit de petites protéines hydrophobes, riches en cystéine, qui sont

excrétées dans le milieu de culture par les hyphes submergés mais s'accumulent dans

les parois des hyphes aériens. Elles y forment des complexes hautement insolubles.

Cette accumulation de différentes hydrophobines dans les parois ou leur diffusion dans

le milieu pourrait conférer aux hyphes des propriétés spécifiques de surface et

déterminer leur croissance aérienne.

Il est également possible que la différence de réponse des hyphes à l'action de

la phéromone soit due simplement au degré d'hydratation de la paroi cellulaire. La

paroi des hyphes rampants, en contact permanent avec l'agar, est fortement hydratée et

enflée et ses composants diffusés dans le substrat immédiat (Roquebert & Minter,

1984). Ces conditions peuvent inactiver la réception de la phéromone.

L'orientation de croissance. Le róle des organelles cellulaires

Le cytoplasme de l'extrémité des hyphes apicaux en croissance est chargé de

vésicules en mouvement permanent autour du corps de Spitzen. Ces vésicules et le

corps de Spitzen sont responsable de la synthése des composants de la membrane et de

la paroi cellulaire. Ils sont riches en polysaccharides et en enzymes, en particulier la

chitine synthétase. Des microtubules cytoplasmiques orientés selon l'axe de croissance

sont mélés aux vésicules apicales. Ces microtubules sont identiques aux microtubules

nucléaires associés au noyau. En deça de ces organelles apicales, des mitochondries

allongées se maintiennent orientées vers le sommet de croissance de l'hyphe et assurent

pr la respiration l'énergie nécessaire à la croissance de l'hyphe.

Microtubules cytoplasmiques, vésicules, corps de Spitzen se déplacent en

position subapicale lors d'une déviation de l'axe de croissance ou disparaissent dès

l'arrêt de la croissance (Grove, 1978). L'orientation de la croissance est donc en relation

directe avec la position de ces organelles (Howard, 1981; Gooday, 1983a). Lors de la

formation de l'anse d'anastomose, les vésicules et microtubules disparaissent de l'apex

Source : MNHN, Paris

104 G. HENNEBERT et al.

de l'hyphe et se retrouvent au point de croissance de l'anse à la base de la cellule. Il y a

alors arrêt de la croissance apicale.

Il est de plus en plus probable que les microtubules ont un rôle dans la

croissance de l'hyphe et son orientation, dans la division nucléaire et dans l'activité de

synthèse et de sécrétion des vésicules, mais on ne connaît pas le mécanisme de leur

fonctionnement ni le rôle du génome (Gooday, 1978). Une réorientation des

microtubules cytoplasmiques est observée en réponse de l'hyphe en croissance à la

nature et au relief du substrat, induisant la formation des appressoria chez Uromyces

(Bourrett et al., 1987) indiquant qu'ils seraient les récepteurs probables des signaux

protéiques de la paroi.

L'orientation de croissance des hyphes apicaux est contrólée génétiquement.

De méme la croissance linéaire des branches subitement déviée de son axe pour

devenir collatérale dans la formation des rhizomorphes est sous contróle génétique

(Rayner et al., 1985) On sait aussi que certains champignons croissent à la surface du

substrat non de façon linéaire mais de façon spiralée. Quelle que soit l'orientation de la

surface et les conditions exterieures, le sens de la spirale reste inchangé, suggérant qu'il

est sous contrôle cytoplasmique ou nucléaire (Madelin ег а!., 1978). Le phénomène qui

n'est apparent que sur un substrat solide telle une gélose à 3% serait le résultat d'une

rotation permanente de l'hyphe autour de son axe de croissance et serait déterminé

génétiquement (Trinci er al., 1979; Trinci, 1984).

La croissance linéaire des hyphes apicaux à la surface d'un milieu de culture

est normalement réglée à la fois par un chimiotropisme vers les nutriments et un

autotropisme tendant à limiter la concurrence entre hyphes. Cet équilibre est sans doute

contrôlé génétiquement, puisqu'il peut être sujet à mutation (Trinci, 1984). L'apport

d'oxygène à l'extrémité d'hyphes dévie ceux-ci vers la source, par une courbure qui fait

suite à une activité respiratoire différente des mitochondries, au déplacement de celles-

ci et des microtubules, et au déplacement du corps de Spitzen et des vésicules

(Robinson, 1973).

Trinci (1978) a déjà suggéré la possibilité d'une relation cytoplasmique entre

le mouvement des noyaux dans la cellule apicale et la croissance apicale de l'hyphe.

Girbardt (1968), Raudaskoski (1972) et Girbardt & Hadrich (1975) montrent que le

mouvement des noyaux après mitose lors de la migration nucléaire et l'initiation de la

croissance des boucles d'anastomose sont en relation avec les mouvements des

microtubules. Ces relations tendraient à appuyer les observations déjà mentionnées de

Cosyns.

Action d'agents chimiques extérieurs sur l'orientation de croissance

La déviation de l'axe de croissance des hyphes apicaux aériens observée dans

la formation des bourrelets mycéliens en bordure du barrage sexuel de Basidiomycètes

serait donc gouvernée par un déplacement des vésicules et microtubules cytoplas-

miques en conjonction possible avec un mouvement des noyaux. Mais l'origine et le

mécanisme de la commande de la migration des organelles sont inconnus. Que ce

déplacement soit une réponse à un agent chimique extérieur réceptionné en surface de

la cellule apicale (telle une phéromone) ou è un agent chimique parvenu à la cellule

apicale par voie interne, cette réponse est fournie et transmise aux vésicules soit

Source : MNHN, Paris

BARRAGE SEXUEL CHEZ LENZITES BETULINUS 105

directement par le cytoplasme, soit par le noyau qui transmet l'ordre par voie

cytoplasmiquee (Ojha & Dutta, 1978).

Rayner & Webber (1984) distinguent parmi les interactions d'antagonisme

observées entre mycéliums d'espèces fongiques différentes confrontées en culture,

celles qui n'impliquent pas de contact entre hyphes de celles où il y a contact. Dans le

premier cas ils invoquent non seulement l'action à distance de substances volatiles ou

diffusibles, mais aussi lorsque l'inhibition est réciproque, un échange réciproque de

signaux chimiques entre opposants. Ces substances peuvent être fongitoxiques ou

antibiotiques ou des phéromones. Lorsqu'une inhibition suit un contact entre hyphes

sans fusion somatique, l'interférence hyphale aboutissant à l'inhibition doit commencer

par une reconnaissance de surface entre hyphes (Ikediugwu, et al., 1970; Rayner &

Webber, 1984).

Il est connu que des Basidiomycètes produisent dans leur phase gazeuse des

substances volatiles à effet fongitoxique, tels le cyanure d'hydrogène ou l'éthylène

(Hutchinson, 1971). Nous savons que Lenzites betulinus émet dans la phase gazeuse de

son enceinte de culture de nombreux métabolites volatiles.

Des agents antifongiques tels que la griséofulvine (appelée "curling factor",

Brian et al, 1946) agissent sur les protéines constitutives des microtubules,

cytoplasmiques ou nucléaires, et dévient l'axe de croissance (Robertson, 1965;

Raudaskoski & Huttenen, 1977). La podophyllotoxine inhibe la formation des protéines

microtubulaires et trouble de ce fait la migration nucléaire (Ormerod et al., 1976). Le

carbamate de méthyl-benzimidazol (bénomyl) inhibe la tubuline des microtubules,

dissout les vésicules, déplace les mitochondries, arrête la croissance et bloque la mitose

(Howard & Aist, 1980; Gooday, 1983a, Jochova et aL, 1993). Des métabolites

fongiques dénommés cytochalasines ont parmi leurs effets celui de troubler la

croisssance en désordonnant le dépôt des substances de synthèse de la paroi (Gooday,

1983). Ces faits indiquent comme probables des relations génétiques entre la mitose,

les microtubules nucléaires, les microtubules cytoplasmiques et l'orientation de

croissance et l'action d'agents extérieurs sur l'orientation de la croissance hyphale

Courants inoniques intracellulaires et champ électrique superficiel.

Le galvanotropisme.

Divers auteurs de 1970 à 1980 ont mis en évidence des courants ioniques

intracellulaires de K*, Ма” et Ca?* établissant un gradient décroissant de potentiel

entre la zone subapicale et l'extrémité de l'hyphe avec un effet sur l'orientation de la

croissance en fonction de la présence extérieure d'ions (Gooday, 1983a).

Le mécanisme de polarisation de la croissance de l'hyphe et en particulier du

transport directionnel des vésicules dans l'hyphe n'est pas encore élucidé (Prosser,

1993). Le rôle des microtubules cytoplasmiques comme rails dans ce déplacement est

mis en doute par Temperli et al. (1991). Il suggère que d'autres facteurs entrent en jeu:

les courants électriques développés par le mouvement des ions à travers l'hyphe

entraineraient les vésicules de paroi par auto-électrophorèse et les gradients ioniques

dans le cytoplasme auraient un rôle dans le maintien de cette organisation polarisée. On

Sait qu'une certaine concentration de l'inonophore calcique peut arrêter la formation et

la migration des vésicules, la synthèse de la chitine et l'élongation de l'hyphe (Temperli

Source : MNHN, Paris

106 G. HENNEBERT et al.

et al., 1991). Des courants électriques intracellulaires seraient en effet engendrés par

l'absorption apicale d'ions positifs et leur expulsion dans une région distale de l'hyphe

(Gow, 1984). Ce flux électrique interne développerait un potentiel électrique à la

surface de l'hyphe et expliquerait le "galvanotropisme" des hyphes induisant une

modification de leur orientation de croissance en réponse à un champ électrique externe

(Prosser, 1993; Lever et al., 1994). On ne pourrait donc exclure a priori un róle du

champ électrique cellulaire dans la répulsion mutuelle des hyphes hémi-compatibles

A#B=.

2. Hypothèse d'une production intracellulaire d'une substance morphogénétique

active diffusant à travers le cytoplasme.

Nos observations montrent en effet que la formation des bourrelets de barrage

a lieu après un contact préalable entre hyphes rampants des deux homocaryons

confrontés conduisant à un certain nombre de fusions somatiques. Après la fusion

somatique des hyphes, la reconnaissance intracellulaire des facteurs d'incompatibilité

dans la cellule hétérocaryotique A#B= ainsi formée pourrait induire un signal chimique

spécifique agissant au niveau des cellules apicales des hyphes aériens du mycélium

partenaire.

Cette hypothèse pourrait exclure l'existence d'une phéromone ou serait à la

base de son induction. Après fusion et reconnaissance mutuelle des facteurs

d'incompatibilité, la production de deux substances diffusibles serait induite

réciproquement par chaque noyau hémi-compatible dans la cellule hétérocaryotique

formée. Ces substances une fois activées par couplage migreraient de cellule en cellule

à travers le septum gráce au flux cytoplasmique traversant les cellules jusque dans les

hyphes apicaux. Une fois les hyphes apicaux atteints, la croissance de l'hyphe se

poursuivrait en présence de ces substances actives susceptibles d'agir sur le plan de

mitose ou la position des microtubules et des vésicules, les hyphes auraient alors leur

axe de croissance modifié. Ils se recourberaient et formeraient les bourrelets mycéliens.

Dans cette hypothèse, toute l'information passerait par l'intermédiaire du

cytoplasme, et la formation des bourrelets de barrage n'aurait lieu que dans un second

temps, un ou deux jours aprés la fusion des hyphes rampants, le temps nécessaire à la

reconnaissance des facteurs d'incompatibilité, à l'induction et la production de la

substance active et son transfert jusqu'aux hyphes apicaux. En effet nous n'avons pu

mettre en évidence le développement d'un barrage durant les 60 premières heures après

confrontation des deux souches hémi-compatibles par le facteur B commun, alors que

les hyphes rampants se rencontrent et fusionnent déjà 24 heures après la mise en

confrontation. Cependant le transfert de cette substance active induite jusqu'aux hyphes

apicaux reste problématique étant donné l'absence d'une migration nucléaire dans la

confrontation A#B=.

Contrôle des fusions somatiques

Chez les Basidiomycètes tétrapolaires, la plupart des auteurs (Dick, 1965;

JR. Raper, 1966; Sicari & Ellingboe, 1967; Raudaskoski, 1973; Nguyen &

Niederpruem, 1983; C.A. Raper, 1983; Casselton, 1978; Giasson er al., 1989;

Marmeisse, 1991; Novotny et al., 1991; Kues & Casselton, 1992) s'accordent à dire

Source : MNHN, Paris

BARRAGE SEXUEL CHEZ LENZITES BETULINUS 107

qu'il n'y a pas d'interdit à la fusion somatique et que la reconnaissance des facteurs

d'incompatibilité s'effectue intracellulairement à travers le cytoplasme, aprés la fusion.

Cependant moins de 5% des contacts entre hyphes donne lieu à une fusion

(Admad & Miles, 1970a; Aylmore & Todd, 1984; Todd & Aylmore, 1985). Quelques

auteurs proposent l'existence d'un contrôle des fusions par les facteurs

d'incompatibilité. Ahmad & Miles (1970) observent chez Schizophyllum commune que

le pourcentage déjà faible de 3% des contacts mycéliens conduisant en une fusion entre

deux homocaryons diminue à 0.7% lorsque le facteur A est commun. Smythe (1973)

remarque aussi chez Coprinus lagopus que les fusions observées dans toutes les

combinaisons d'homocaryons montrent une fréquence en relation avec les génotypes de

compatibilité en contact, et la plus faible fréquence en présence d'homocaryons As et

B=.

Le mécanisme conduisant au contact des hyphes avant la fusion somatique est

soit "télémorphotique", c'est-à-dire induisant à distance la formation latérale d'un apex

hyphal, soit "tropique" attirant à distance l'extrémité d'un hyphe proche, au besoin par

linduction de la courbure de celui-ci (Ainsworth & Rayner, 1989). Nguyen &

Niederpruem (1984) et Ahmad & Miles (1970b) constatent que les hyphes de parte-

naires compatibles s'attirent entre eux par chimiotropisme grâce à une substance

sécrétée dans le milieu au point d'incurver leur direction de croissance de l'un vers

l'autre. D'autre part Smythe (1973) déduit de la haute teneur en coenzyme Q10 au

moment de la fusion l'existence d'un contrôle enzymatique des fusions par les facteurs

de compatibilité s'exerçant avant, pendant ou aprés les contacts d'hyphes.

Mécanisme de réception aprés fusion somatique

Il est clairement établi que des fusions somatiques entre hyphes de génotypes

compatibles, hémi-compatibles et incompatibles se produisent (Kohler, 1929, 1930;

Sicari & Ellingboe, 1967; Smythe, 1973).

Raper & Esser (1961) ont montré l'existence de protéines spécifiques propres

aux homocaryons. Dick (1965), présumant ces protéines en relation avec les enzymes

concernées dans la migration nucléaire et la formation des boucles d'anastomose

(A#B#), à suggéré leur dépendance génétique aux facteurs d'incompatibilité, les

appelant "protéines d'incompatibilité" et leur attribuant le rôle soit de précurseur, soit

de contrôle de la chaîne de réactions responsable de la dicaryose. Sachant que les

facteurs d'incompatibilité comportent des gènes de reconnaissance allélique et des

gènes de fonction, il devrait exister des "protéines alléliques" en interaction avec ces

protéines de contrôle (Parag, 1965a, 1965b). Des études génétiques ultérieures ont

précisé en effet que chaque locus a et B des deux facteurs A et B sont constitués d'une

sous-unité de reconnaissance et d'une sous-unité de contrôle. La sous-unité de

reconnaissance représentée par un alléle donné s'exprime dans un produit inactif s'il est

seul ou couplé à son semblable ("homoduplexe", C.A. Raper, 1978) mais actif s'il est

couplé au produit d'un allèle différent devenant un "hétéroduplexe" agissant alors sur la

différenciation cellulaire, la dissolution des septa et la morphogenèse (Raper & Raper,

1973; Wessels, 1978). Cet hétéroduplexe se fixerait alors sur des séquences spéficiques

de l'ADN des noyaux, provoquant l'expression des fonctions contrôlées par les facteurs

d'incompatibilité (C.A. Raper, 1983; Novotny et al., 1991; Kues & Casselton, 1992).

Source : MNHN, Paris

108 G. HENNEBERT et al.

Cette action n'est manifeste que dans les 2 ou 3 jours apres la reconnaissance self/non

self. Les profils électrophorétiques des protéines cellulaires et des isoenzymes

d'homocaryons et d'hétérocaryons de même lignée montrent des différences suggérant

que ces substances actives pouraient être protéiques (Wessels, 1978). Certes ces études

ont visé principalement la compréhension du mécanisme de migration nucléaire dans la

formation du dicaryon et de l'hétérocayion A=B#. Mais elles montrent que cette

reconnaissance allélique et le processus morphogénétique qui s'en suit sont un

mécanisme intracellulaire survenant lors de toute fusion somatique (C.A. Raper, 1978).

Après contact et fusion des hyphes, l'évolution des cytoplasmes maintenant

en continuité dépendra de la reconnaissance self/non self. Dans le cas d'une

incompatibilité génétique, deux réponses sont possibles: l'acceptation ou le rejet. Le

choix entre ces options varie selon les cas et un transfert de gène ("gene flow") ou une

compétition s'en suivra (Ainsworth & Rayner, 1989). Dans le cas d'une fusion A=B#, il

faut noter que s'il y a induction d'une substance morphogénétique jusque dans les

articles apicaux des hyphes, sa transmission doit être associée à la migration nucléaire

puisqu'il semble qu'il n'y à pas d'échange пі de migration de mitochondries ni de

cytoplasme étranger après la fusion somatique (Casselton & Economou, 1985). Rayner

& Coates (1986) montrent cependant chez Stereum hirsutum qu'un facteur régulateur

de morphogenèse de nature cytoplasmique, mobile et transmissible entre homocaryons

pourrait exister sans qu'il y ait migration nucléaire.

Dans le cas de la confrontation A#B= formant le barrage sexuel, l'absence de

migration de noyau et l'instabilité de l'hétérocaryon formé limité à quelques cellules

des hyphes fusionnés semblent indiquer qu'il y a rejet mutuel et dès lors peu de chance

pour un transfert de gène ou le transfert d'un facteur cytoplasmique de signalisation à

fonction morphogénétique qui atteindrait les cellules apicales des hyphes aériens du

mycélium partenaire pour en modifier l'axe de croissance.

3. L'hypothèse de l' induction d'une phéromone de répulsion après une

reconnaissance préalable par contact d'hyphes

Dans l'hypothèse de la production d'une phéromone ou hormone de répulsion

sexuelle agissant à distance sur l'orientation de croissance des hyphes du mycélium

opposé, une reconnaissance préalable de la nature génétique hémi-compatible A_B=

doit avoir lieu. Ou cette reconnaissance a lieu au niveau des hyphes aériens et à

distance, ou elle a lieu lors du contact d'hyphes sur et dans le substrat de culture.

Comme il est apparu qu'un certain contrôle de la fusion somatique doit exister

lors des contacts d'hyphes, et que des actions télémorphotiques entre hyphes confrontés

ont été observées (Ainsworth & Rayner, 1989), il est nécessaire de supposer pour les

comprendre l'existence d'un reconnaissance génétique self/nonself entre hyphes proches

où en contact dans le milieu de culture. Que la reconnaissance se fasse entre hyphes à

distance, elle se ferait par une phéromone de reconnaissance à distance diffusible dans

le milieu aqueux et forcément à fonction d'attraction et qui ne serait pas la phéromone

de répulsion sexuelle. Que la reconnaissance ait lieu lors du contact entre hyphes, il

s'agirait d'un mécanisme indépendant faisant suite à une attraction préalable entre

hyphes ou une rencontre d'hyphes sans attraction.

Source : MNHN, Paris

BARRAGE SEXUEL CHEZ LENZITES BETULINUS 109

Cette reconnaissance opérée par chacun des partenaires induirait en lui-même

une substance messagère mobile, transmissible par le courant cytoplasmique jusqu'à

ses hyphes apicaux aériens où la cascade phéromonale de répulsion serait induite,

Cette ajustement de l'hypothèse de Vandendries d''émanations gazeuses" que

nous disons de nature phéromonale agissant particulièrement au niveau des hyphes

aériens et impliquant une reconnaissance génétique préalable par les hyphes rampants

et intramatriciels expliquerait le délai observé de plus de deux jours dans l'apparition

du barrage sexuel.

CONCLUSION

Les observations de Vandendries et de Brodie sur la tétrapolarité sexuelle de

Lenzites betulinus et les interactions d'incompatibilité sexuelle, en particulier le barrage

sexuel, ont été confirmées. Cependant, en accord avec une décision arbitraire

généralement acceptée mais inverse de la décision originale adoptée par Oort (1929),

sur les fonctions génétiques respectives des facteurs A et B et grâce à la technique de

rétroconfrontation pour déceler la migration nucléaire due à l'activité du facteur B, il

est établi que la réaction de barrage sexuel est le fait de l'activité du facteur A (allèles

A différents) associée à l'inactivité du facteur B (allèles B identiques). Le

multiallélisme déjà observé chez Lenzites betulinus est également confirmé.

L'hypothèse de Vandendries d'une action à distance et réciproque

d''émanations gazeuses" entre mycéliums hémi-compatibles de facteur A différent et B.

commun devant fournir une explication à la répulsion mutuelle des hyphes de part et

d'autre du barrage est amendée et reformulée à la lumière des connaissances actuelles.

L'hypothèse de Vandendries serait celle de l'existence d'une phéromone de répulsion

sexuelle, Si un mécanisme entièrement intracellulaire induite chez le partenaire au

départ d'une reconnaissance lors des fusions somatiques, l'hypothèse revue de

Vandendries d'une phéromone de répulsion apparaît comme l'hypothèse la plus

probable si la production de cette phéromone résulte de la reconnaissance génétique

préalable de l'autre par chacun des partenaires. .

Comme le remarquent justement Rayner et al. (1984), trop peu d'études

depuis celle de Vandendries & Brodie (1933c) ont porté sur les interactions mycé-

liennes entre homocaryons hémi-compatibles chez les Basidiomycètes.

REMERCIEMENTS

Nous remercions le Professeur Emérite J. Boidin, de Lyon et la Professeur Marie-France

Roquebert du Laboratoire de Cryptogamie du Muséum, Paris, pour la lecture de notre manuscrit et.

leurs heureuses suggestions.

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ENZYMATIC ACTIVITY AND MYCOTOXIN-PRODUCING

POTENTIAL OF FUNGI ISOLATED FROM ROTTED LEMONS

A.-L.E. MAHMOUD and S.A. OMAR

Department of Botany, Faculty of Science, University of Assiut, Assiut, Egypt.

ABSTRACT - Nine species related to seven genera were recovered from rotting lemon (Citrus limon

Syn.) fruits. Alternaria alternata appeared to be the main causer of lemon rot followed by

Aspergillus flavus and A. niger. From the isolated fungi, 37 isolates were screened for their ability to

produce some enzymes on solid media. Data clearly showed that not all the tested isolates were only

able to produce cellulase but most of them were also good producers of this enzyme.In addition to

cellulase, pectin lyase (PL) and poly-galacturonase (PG) production were also verified by many of

these isolates. During screening for mycotoxigenicity of the isolated fungi on liquid medium, 17 out

of 43 isolates were toxigenic. Alternaria alternata produced alternariol (AOH) and alternariol

monomethyl ‘ether (AME) and A. flavus produced aflatoxins B, and B,. Alternaria toxins and

aflatoxins B, and B, were also produced in healthy lemon fruits infected with toxigenic isolates of

Alternaria alternata and A. flavus, respectively. The presence of these mycotoxins in infected lemons

may constitute a potential hazard to human health.

RÉSUMÉ - Neuf espèces fongiques appartenant à sept genres ont été isolées de citrons moisis (Citrus

limon Syn.). Alternaria alternata apparaît ĉtre le principal agent responsable du pourrissement des

citrons, suivi de Aspergillus flavus et A. niger. 37 isolats ont été testés afin de déterminer leur

aptitude à produire des enzymes sur milieu solide. Les résultats montrent clairement que non

seulement la totalité des isolats produisaient des cellulases, mais étaient en plus de bons producteurs.

En plus des cellulases, pour de nombreux isolats les productions de pectine lyase (PL) et de

polygalacturosase (PG) ont pu être mises en évidence. 17 des 43 isolats se sont également montrés

producteurs de mycotoxines en milieu liquide. Alternaria alternata produit de l’alternariol

monomethyl ether (AME) et Aspergillus flavus produit des aflatoxines B, et B,. Les toxines de

l'Alrernaria et les aflatoxines B, et B, étaient également produites sur citrons sains respectivement

pour A. alternata et A. flavus. La mise en évidence de ces mycotoxines pourrait indiquer l'existence

d'un risque potentiel pour la santé humaine résultant de la consommation de citrons.

INTRODUCTION

Fungal spores are usually present on many important fruits and vegetables

which may become visibly infected, particularly after the tissues are weakened.

Extensive deterioration results in huge economic loss.

Aspergillus spp., Fusarium sp. and Rhizopus oryzae were isolated from oranges

(Fawole & Odunfa, 1992). Different Penicillium species were recorded as a cause of

decay of citrus fruits (Kursanoff & Alexeyeva, 1938; Wei, 1940). Citrus fruits are also

known to be affected by Alternaria rot (Singh, 1980; Stinson et al., 1981).

Source : MNHN, Paris

118

. MAHMOUD and S.A OMAR

The relative ease with these fungi carry out the pathogenicity is directly linked

to their capability to produce some extracellular enzymes. The role of cell-wall

degrading enzymes during pathogenesis is well documented (Albersheim et al., 1969;

Mehta et al., 1974).

In addition to deteriorated fruits, some toxic fungal metabolites may be

produced. It has been documented (Wildman et al., 1967), that a number of fruits and

fruit juices support aflatoxin production in appreciable quantity. The experimental

production of aflatoxins in citrus fruits have been reported by different workers (Singh

& Sinha, 1982; Varma, 1985). Different mycotoxins were produced in fungi- infected

oranges and lemons (Stinsons et al., 1981).

The physiological studies on fungi causing lemon rot in Egypt are scarce.

Hence, this work was designed to study the mycoflora which cause this disease. In

addition, enzymatic activity and mycotoxin-producing potential of these fungi were

also assessed.

MATERIALS AND METHODS

Source of samples. A total of 50 samples of lemon (Citrus limon Syn.) with

surface lesions from fungal infection were collected from lemon fields, Faculty of

Agriculture, Assiut University, Assiut, Egypt.

Isolation and identification of moulds. Tissue fragments were excised from

lesions of infected fruits and were plated on Czapek's dextrose agar medium

supplemented with rose bengal (65 ppm) as abacteriostatic agent (Smith & Dawson,

1944), Inoculated plates were incubated for 7-10 1days at 28°C. The resulting moulds

were isolated and identified.

Enzymatic activity of the isolated fungi. Thirty seven fungal isolates from

fungi recovered during this investigation were screened for their ability to produce

some enzymes on solid media. These fungi were Acremonium strictum, Alternaria

alternata, Aspergillus flavus, A. fumigatus, A. niger, Cochliobolus spicifer, Mucor

hiemalis, Penicillium italicum and Ulocladium atrum.

Cellulase activity was studied by using the method described by Eggins & Pugh

(1962). The tested fungi were grown on medium contained (gm/L), Ammonium

sulphate, 0.5; L-asparagine, 0.5; Potassium dihydrogen phosphate, 1.0; Potassium

chloride, 0.5; magnesium sulphate, 0.2; Calcium chloride, 0.1; yeast extract, 0.5; Agar,

20 and Cellulose, 10. After 7 days incubation at 28°C, plates were flooded with chloro-

iodide of zinc. The uncoloured zone gave a measure of the cellulolytic power of the

fungi

Isolates were screened on MP-7 and MP-5 media of Hankin et al. (1971) for

pectin lyase (PL) and polygalacturonase (PG), respectively. After growth of organisms

for 7 days at 28°C. Pectolytic activities on both media were determined by flooding

plates with 7 mol/L HC] solution. This precipitate intact pectin. Pectolytic moulds were

thus surrounded by clear zones against an opaque medium. The extent of zone of

clearing around moulds was used as a measure of the degree of pectolytic activity.

Mycotoxin-producing potential of the isolated fungi. Fifteen isolates of both

Alternaria alternata and Aspergillus flavus, 17 isolates of A. niger and 2 isolates of

Source : MNHN, Paris

PHYSIOLOGY OF LEMON ROTTING FUNGI 119

each of A. fumigatus, Cochliobolus spicifer and Penicillium italicum were screened for

their ability to produce mycotoxins on yeast extract sucrose medium (YES).

Erlenmeyer flasks (250 ml), each containing 50 ml of YES medium were inoculated by

the examined fungi and were incubated as stationary cultures at 28°C for 10 days. Two

replicates of each isolate were analyzed.

At the end of the incubation period, the contents of each flask were

homogenized with 50 ml chloroform for 5 min in a high speed blender (18000 g).

Extraction was repeated three times. The combined chloroform extract was washed

with distilled water, dried over anhydrous sodium sulphate, filtered and dried to near

dryness on a rotary evaporator. The residue was diluted with chloroform to one ml. The

chloroform solution was analysed for the presence of different mycotoxins using thin-

layer chromatography as described by Gimeno (1979). With A. fumigatus, the extract

was analysed for the presence of gliotoxin by spraying plates with silver nitrate solution

(Taylor, 1967). In case of Alternaria, liquid cultures were extracted twice with ethyl

acetate (30 ml) by overnight shaking at dark and filtration. The two extracts were

combined, dried (anhydr- ous sod. sulphate), evaporated under reduced pressure, and

the residue dissolved in | ml of methylene chloride for TLC analysis.

TLC analysis was performed on precoated silica gel plates of Kieselgel G type

60 (MERCK) by using (chloroform: acetone) (88:12) and (toluene:ethylacetate:90%

formic acid) (60:30:10) as solvent systems. Alternariol (AOH) and alternariol

monomethyl ether (AME) were visualized under long wave length UV light with their

characteristic fluorescence (Visconti et al., 1986). Standards of AOH and AME were

purchased from Sigma Chemical Comp., U.S.A.

Mycotoxin production in infected healthy lemons. The toxigenic isolates of

both Alternaria alternata and Aspergillus flavus which produced mycotoxins in YES

medium were inoculated into the surface of healthy lemons. The inoculation was

performed by placing a square block of Czapek's dextrose agar medium with the fungal

spores in a window-shaped wound on lemon (Vinas et al., 1992). Inoculated fruits were

placed in plastic bags with one end left open and incubated at 28 + 1°C for 15 days

(Stinson et al., 1981).

Extraction procedures and TLC analysis. The decayed tissue was cut from

infected fruits and homogonized at top speed in the warring blender for 2 min. In case

of Alternaria, the homogenized tissue was adjusted to pH 2.0 by adding 2 N HCl. A

certain volume of (chloroform: ethanol) (4:1) (v/v), about twice the weight of the fruit

was added, The mixture was again homogenized for 2 min. These mixtures were

centrifuged for 10 min at 2500 g to break the emulsion and to separate the mixture into

distinct layers (Stinson et al., 1981). The organic phase containing the toxins was dried

over anhydrous sodium sulphate, filtered, evaporated and redissolved in 2 ml of

methanol for TLC analysis according to Gimeno (1979) for aflatoxins and Visconti et

al. (1986) for Alternaria toxins.

RESULTS AND DISCUSSION

Results presented in Table I revealed that 9 species related to 7 genera were

recovered from rotted lemon fruits. It was obvious that Alternaria alternata was the

Source : MNHN, Paris

120 A-L.E. MAHMOUD and S.A. OMAR

main causer of lemon rot followed by Aspergillus flavus and A. niger. The numbers of

cases of isolation of these fungi were high. These results are in agreement with those of

Singh (1980) and Stinson et al. (1981) who published that citrus fruits such as lemons are

affected by Alternaria rot. In a similar study, Vinas et al. (1992) found that 81.9% of 110

strains of Alternaria isolated from 157 decayed apples belonged to the species A.

alternata.

No. of

Genera and species isolates

Alternaria alternata (Fr.) Keissler 36

Aspergillus flavus Link 31

A. niger Tan Tieghem 26

A. fumigatus Fresenius 3

Ulocladium atrum Preuss 5

Cochliobolus spicifer Nelson 5

Penicillium italicum Wehmer 4

Mucor hiemalis Wehmer 3

Acremonium strictum W.Gams 2

Table 1: Number of cases of isolation (out of 50 samples) of fungal genera and species recovered

from rotted lemon fruits

Tableau I: Nombre d'isolements (50 essais) des différentes espèces sur citrons moisis.

In Nigeria, Fawole & Odunfa (1992) found that the aspergilli, of which A. flavus

and À. niger were the most dominant, formed the largest group of fungi causing decay

of citrus fruits.

The other identified fungi were A. fumigatus, Cochliobolus spicifer, Ulocladium

atrum, Penicillium italicum, Mucor hiemalis , and Acremonium strictum. Many of these

fungi were previously isolated from rotted citrus and other fruits (Kursanoff &

Alexeyeva, 1938; Thompson & Eribo, 1984; Fawole & Odunfa, 1992).

The ability of 37 fungi isolated from rotted lemons, to produce enzymes on

solid media is shown in Table 2. The term "production" means here both synthesis of

the enzyme by the fungus and its activity in the medium after it is "produced". From

the data, it was apparent that the tested fungi were more able to produce cellulases than

pectinases (PL and PG).

Results also clearly show that not only all the tested fungi were able to produce

cellulase but also most of them were good producers of this enzyme. Among test fungi,

A. flavus exhibited the highest ability in cellulase production followed by A. niger. It is

worthmentioning that the enzymatic ability differs from fungal species to another and

even between isolates of the same species. These results are in agreement with those of

Source : MNHN, Paris

PHYSIOLOGY OF LEMON ROTTING FUNGI

121

Moubasher & Mazen (1991) who published that most of fungal isolates related to 92

species proved to be active to utilize cellulase but with different degrees. Similar

results were obtained by different authors (Stewart & Walsh, 1972; Gomes et al., 1989).

Data in Table II indicate that the production of pectolytic enzymes was verified

by many of the examined fungi. This could be attributed to the fact that pectic

No. of Pectin Polygalact-

Organisms tested Cellulase lyase uronase

isolates (PL) (PG)

N° Activity N Activity N Activity

Acremonium strictum 1 1 + 1 - 1 -

Alternaria alternata 10 а + 4 +++ 2 thee

5 ++ 4 + 3 ++

1 + 1 + 4 +

1 - 1 -

Aspergillus flavus 10 а + 4 +++ 1 +++

2 +++ 4 ++ 4 ++

2 ++ $ + 4 +

2 + 1 - 1 -

A. fumigatus 2 І + р ++ 2 ++

1 +++ 1

A. niger 7 2 ++ 2 eee 1 ++

з +++ 1 +++ 5 +

1 ++ 3 + 1 -

1 + 1 -

Cochliobolus spicifer 2 277 ЖҰТ De 1

1 »

Mucor hiemalis 1 1 + 1 + 1 -

Penicillium italicum 2 1 +++ 1 ++ 1

1 - 1 - 1

Ulocladium atrum 2 Di ALE %0 оя 1 ++

1 i:

Number of isolates +++ , high activity

* , low activity ++++ | very high activity

+ , fair activity

no activity

Table II: Enzymatic activities of some fungi isolated from rotted lemon

Tableau II: Activité enzymatique des espèces fongiques isolées de citrons moisis.

substances are known to enhance pectic enzyme production (Fogarty & Kelly, 1983). In

the present investigation, some isolates related to Aspergillus proved to be good

producers of pectinases. Many species of Aspergillus are known to be pectolytic and are

Source : MNHN. Paris

122 A-L.E. MAHMOUD and S.A. OMAR

in fact the usual source of industrial pectinases (Blain, 1975; Barbesgaard, 1977; Fawole

& Odunfa, 1992).

One isolate of each of Acremonium strictum, Alternaria alternata, A. flavus, A.

niger and P. italicum did not show any pectolytic activity during this study (Table II).

During screening for mycotoxigenicity of fungi isolated from rotted lemons, 17

out of 43 isolates were toxigenic (Table III). The toxigenic isolates were related to

Alternaria alternata (9 isolates) and A. flavus (8 isolates). With the remaining tested

fungi namely A. fumigatus, A. niger, Cochliobolus spicifer and P. italicum.

No. of No. of Mycotoxins

Organism tested toxigenic detected

isolates isolates

Alternaria alternata 15 9 Alternariol (AOH)

& Alternariol

monomethyl ether

(AME)

Aspergillus flavus 15 8 Aflatoxins B,& B,

A. fumigatus 2 - -

A. niger 7 - -

Cochliobolus spicifer 2 - =

Penicillium italicum 2 = 5

Table III: Mycotoxin-producing potential of some fungi isolated from rotted lemons.

Tableau III - Mycotoxines produites par les espèces fongiques isolées de citrons moisis.

Alternaria alternata was the main mycotoxin producer where 60% of its

isolates produced toxins. 2 isolates produced alternariol (AOH) and one isolate

produced alternariol monomethyl ethers [AME] whereas 6 isolates produced both AOH

and AME. These results are in accordance with those of Vinas et al. (1992) who

reported that Alternaria isolated from decayed apples produced AOH and AME on

yeast extract sucrose medium. They found that among the examined isolates, 14.7%

produced AOH and 22.6% produced AME.

From 15 isolates of A. flavus, 18 isolates produced aflatoxins B and B . 2

isolates produced aflatoxin B and 6 isolates produced aflatoxins B and B. Our data are

in agreement with those of Varma & Verma (1987) who found that 3 isolates of A.

flavus out of 7 isolates from oranges were aflatoxigenic. The association of

aflatoxigenic species such as A. flavus and A. parasiticus with citrus fruits was

previously reported (Nolte & Vanloeseeke, 1940;Varma, 1985).

The ability of toxigenic isolates of both Alternaria alternata and A. flavus to

produce mycotoxins in healthy lemons were shown in Table IV. From 9 isolates of

Alternaria alternata, 16 isolates produced AOH and AME. These findings are in good

agreement with those of Stinson et al. (1981) who found that AOH and AME were the

predominant mycotoxins which were produced in Alternaria- infected oranges and

lemons. These toxins were also the major mycotoxins produced in apple and other

fruits infected with Alternaria spp. (Stinson et al., 1980).

Source : MNHN, Paris

PHYSIOLOGY OF LEMON ROTTING FUNGI 123

No. of No. of Mycotoxins

Toxigenic fungus tasted + ve detected

isolates ^ isolates

Alternaria alternata 9 6 Alternariol (AOH)

& Alternariol

monomethyl ether

(AME)

Aspergillus flavus 8 3 Aflatoxins B,6 B,

Table IV: Ability of toxigenic fungi to produce mycotoxins on healty lemons.

Tableau IV: Capacité des espèces fongiques isolées à produire des mycotoxines sur citrons sains.

Three isolates (37.5%) of toxigenic A. flavus produced aflatoxins B and B in

lemons. The experimental production of aflatoxins in citrus fruits and fruit juice such as

mosambi (Citrus sinensis), orange (C. reticulata) and lemon (C.limon Syn.) have been

reported by other workers (Singh & Sinha, 1982; Varma, 1985).

The comparatively lower yield of aflatoxins by toxigenic isolates in lemons

than the yeast extract sucrose liquid medium may be due to the presence of citric acid

and citrus oil (Alderman & Marth, 1976). Keffard (1966) reported the presence of acids

(5-6%) in lemon with the dominance of citric acid. Citric acid supports growth but not

aflatoxin production (Davis & Diener, 1968).

Results obtained during this study clearly indicated that fungi isolated from

rotted lemons had a high ability to produce cell-wall degrading enzymes which are

important in breakdown of organic matter and in fruits deterioration. In addition, the

production of some mycotoxins in infected lemons may constitute a potential hazard to

human health. The possibility exists that contaminated fruits may be incorporated into

processed products, such as juice and preserves, through faulty sorting procedures or

neglect and thus constitute a potential health hazard.

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Source : MNHN, Paris

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ESTUDIO SOBRE PYRENOMYCETES SENSU LATO

DE MENORCA'

J. CHECA, M.N. BLANCO y J.M. BARRASA

Departamento de Biología vegetal, Universidad de Alcalá de Henares.

28871 Alcalá de Henares. Madrid.

RESUMEN - Se realiza un catálogo comentado de 14 táxones de pirenomicetes sensu laro, pertenecientes a

los órdenes Diaporthales, Diatrypales, Dothideales, Sordariales y Xylariales, encontrados sobre restos de

flora mediterránea en la isla de Menorca, que resultaron ser nuevas citas o especies poco citadas en la

micoflora española.

PALABRAS CLAVE - Pyrenomycetes, corología, Menorca, España.

ABSTRACT - A checklist containing 14 new taxa or rarely recorded to Spain of Pyrenomycetes sensu lato,

growing on different plant debris of the mediterranean flora from Menorca and included in Diaporthales,

Diatrypales, Dothideales, Sordariales and Xylariales, is given.

KEY WORDS - Pyrenomycetes, chorology, Menorca, Spain.

INTRODUCCION

El Proyecto de investigación "Flora Micolégica Ibérica" pretende realizar un

catálogo actualizado de las especies de hongos de la Península Ibérica y Baleares. De manera

general, los pirenomicetes sensu lato asociados a la vegetación mediterránea o referidos a

diversas regiones de nuestra geografía, han sido escasamente estudiados y no existen datos

suficientes que permitan alcanzar un conocimiento real de la micoflora en dichas áreas

geográficas. La presente relación de especies de pirenomicetes encontrados sobre restos de

plantas de marcado caracter mediterráneo, procedentes de diversas localidades de la isla de

Menorca, contribuirá a ampliar el conocimiento de las afinidades de estos hongos por el tipo

de sustrato y su diversidad en dicha región. Por otro lado, ciertas observaciones referentes a

Caracteres taxonómicos y morfológicos, servirán para una adecuada identificación de los

táxones tratados y su diferenciación con los más estrechamente emparentados.

Los trabajos previos más relevantes sobre pirenomicetes llevados a cabo en el

archipiélago balear, se deben a Knoche (1921) y Malengon & Bertault (1972). Además, un

catálogo de ascomicetes de las islas Baleares que incluye 132 especies, de las que 35

Corresponden a pirenomicetes, ha sido recientemente realizado por Arroyo et al. (1990).

"Trabajo financiado por la DGICYT y el CSIC con cargo al proyecto Flora Micológica Ibérica (PR87-0370).

Source : MNHN, Paris

126 J. CHECA, M.N. BLANCO y J.M. BARRASA

En el presente trabajo se citan y comentan 14 especies de pirenomicetes que

constituyen nuevas citas para la micoflora española.

MATERIAL Y METODOS

El material estudiado fue recolectado durante la IV Campaña Micológica

programada por el Proyecto "Flora Micológica Ibérica", y llevada a cabo entre el 17 y 19 de

noviembre de 1990 en la isla de Menorca. Dicho material procede de las ocho localidades

siguientes: Binifamis, Cala Caldana, Es Grau, La Vall, Salayor, Santa Catalina, Santa

Eulalietal y Son Morell.

Las preparaciones se han montado en agua destilada o KOH al 2% y las fotografías

han sido realizadas en un microscopio Nikon modelo Labophot, con sistema de

microfotografía incorporado Nikon modelo AFX-DX.

El material estudiado se encuentra depositado en el herbario del Departamento de

Biología Vegetal de la Universidad de Alcalá de Henares (AH).

TABLA 1

Citas bibliograficas previas de pyrenomycetes s. lato en menorca

Capnodium elaeophilum Prill. Moret & Nadal (1984)

Diaporthe perexigua Sace. González Fragoso (1919)

Hysterium angustatum Alb. & Schwein. Malençon & Bertault (1972)

Phyllachora graminis (Pers.) Fuckel Jorstad (1962)

Pleospora herbarum (Fr.) Rabenh. ex Ces. & de Not. | González Fragoso (1919)

Pleurage curvula (de Bary) Kuntze.. Malengon & Bertault (1972)

Rhaphidophora terebinthi Fabre. Malençon & Bertault (1972)

Venturia inaequalis Cooke Cardona (1979)

MATERIAL ESTUDIADO

Loculoascomycetes

Orden Dothideales

Famillia Herpotrichiellaceae

Capronia moravica (Petrak) E. Müller, O. Petrini, P. Fisher, G.J. Samuels & A.Y. Rossman

= Herpotrichiella moravica Petrak

MENORCA: La Vall, Ciutdadella, 30TEE8033, en hojas de Olea europea, J. Checa, 17-XI-

1990, AH 14581; ibidem, en tallos de Scirpus spp., 17-X1-1990, AH 14579.

Los géneros Capronia y Acanthostigmella, constituyen actualmente la familia

Herpotrichiellaceae Munk, que fue estudiada por Miiller et al. (1987), basándose

principalmente en la variabilidad esporal y en las relaciones anamorfo-teleomorfo.

C. moravica, es una especie típica de Fagus. Nuestro material procede de

vegetación mediterránea, sin embargo la descripción coincide con Munk (1957).

Source : MNHN, Paris

PYRENOMYCETES DE MENORCA 127

Familia Leptosphaeriaceae

Leptosphaeria sicula Sacc. & Beltrani

Figs. 3-5

MENORCA: Son Morell, Ciutdadella, 31TEE7531, en cladodios secos de Opuntia ficus-

indica, J. Checa, 17-X1-1990, AH 14630.

Caracterizada por el hábitat y sus esporas claviformes (23-26 x 5-6 mm), con

Cuatro células apicales cortas y tres caudales más largas, débilmente constreñidas. Los

ascomas presentan una ancha base y una depresión apical con un prominente ostiolo

cilíndrico.

Especies próximas son L. tetonensis (Ell. & Ev.) Rehm, L. artemisiae (Fuckel)

Auersw., Lhelminthospora (Ces.) Ces. & de Not., L. hipanica Checa & Moreno (Holm,

1957; Shoemaker, 1984; Checa & Moreno, 1987) y L. opuntiae Dodge. Todas ellas se

diferencian de L. sicula por variaciones en el tamaño de las esporas y en el número de septos.

L tetonensis, tiene ascésporas constrefiidas en un septo supramedio, con 2 septos

transversales en la parte superior y 3 en la parte basal que es más larga. L. artemisiae, tiene

esporas constreñidas en el medio, con 2 septos en la parte superior y 2 en la inferior. L.

helminthospora presenta esporas con 3 septos en la porción superior y 45 en la inferior.L.

hispanica presenta 7-(8) septos con constricción en el medio y apéndices globosos terminales.

Por último, L. opuntiae, comparte el hábitat con L. sicula, pero únicamente posee 3 septos

esporales (Dodge, 1937).

Leptosphaeria tetonensis (Ell. & Ev.) Rehm

Figs. 6-7

MENORCA: Sta. Catalina, carretera Fornells a Mahón, en restos leñosos de Ficus carica, J.

Checa, 12-XI-1990, AH 14629.

La descripción coincide con Holm (1957) y Shoemaker (1984).

Familia Lophiostomataceae

Lophiostoma vicinum (Sacc.) Sacc.

Figs. 10-11

MENORCA: La Vall, Ciutdadella, 31TEE8033, en ramas de Quercus ilex, J. Checa, 17-XI-

1990, AH 14644.

Especie caracterizada por sus esporas bicelulares, pigmentadas, finamente

punteadas, con la porción superior ensanchada junto al septo.

Se trata de una especie poco comün (Holm & K. Holm, 1988). En España sélo se

conoce con anterioridad del noroeste peninsular (González Fragoso, 1926). El sustrato

característico de esta especie es Quercus (de donde proceden las citas espariolas), Salix y

Populus (Chester & Bell, 1970).

Familia Phaeosphaeriaceae

Phaeosphaeria herpotrichoides (de Not.) L.Holm

= Leptosphaeria herpotrichoides de Not.

Figs. 1-2

MENORCA: Sta. Catalina, carretera de Fornells a Mahôn, en restos leñosos de Ficus carica,

E. Descals, 12-X1-1990, AH 14598.

Source : MNHN, Paris

128 J. CHECA, M.N. BLANCO y J.M. BARRASA

Figs. 1-9.- 1-2: Phaeosphaeria herpotrichoides (de Not) L.Holm, ascósporas. 3-5: Leptosphaeria sicula

басс. & Beltrani, asco y ascósporas. 6-7: Leptosphaeria tetonensis (Ell. & Ev.) Rehm, ascósporas. 8-9:

Phaeosphaeria typharum (Desm.) L Holm, ascos y ascósporas (barras- 10 mm).

Source : MNHN, Paris

PYRENOMYCETES DE MENORCA 129

Sólo citada en una ocasión en la micoflora española, procedente de Zaragoza

(Alfaro, 1955).

Phaeosphaeria typharum (Desm.) L.Holm

= Leptosphaeria typharum (Desm.) P.Karsten

Figs. 8-9

*MENORCA: Es Grau, En tallos de Typha angustifolia, J. Webster, 12-XI-1990, AH 14642.

El táxon más próximo citado en España corresponde a L. typharum ssp.

papyrogena Sacc. (Urrfes, 1941).

Pyrenomycetes s.str.

Orden Diaporthales

Familia Valsaceae

Valsa ceratosperma (Tode:Fr.) Maire

MENORCA: Binifamis, Alayor, 319FE0128, en ramas de Cistus albidus, J. Checa, 15-XI-

1990, AH 14603.

Coincide con la descripción de Spielman (1985).

Orden Diatrypales

Familia Diatrypaceae

Cryptosphaeria lignyota (Fr.:Fr.) Auersw.

MENORCA: Sta. Eulalietal, Mercadal, 31SEE9725, en tallos de Lonicera periclymenun, J.

Checa, 16-XI-1990, AH 14626.

Citada con anterioridad en Populus sp. (Glawe & Rogers, 1984; Rappaz, 1987). Es

próxima a C. eunomia (Fr.:Fr.) Fuckel, de la que se diferencia por el tamaño esporal (7-8 x 2-

2.5 mm) y por la ausencia de una línea entostromática ventral definida.

Eutypa abscondita (Mont.) F. Rappaz

MENORCA: Salayor, Son Bou, 31SEE9117, en tallos de Daucus sp., 1. Сһеса, 16-ХІ-1990,

AH14656.

Especie característica de Daucus sp. (Rappaz, 1987).

Orden Hypocreales

Familia Niessliaceae

Trichosphaerella decipiens E. Bommer

MENORCA: Es Grau, en tallos de Juncus acutus, J. Webster, 12-X1-1990, AH 14643.

Especie común en angiospermas. Se diferencia de T. ceratophora (Höhnel)

E.Müller, por la presencia en esta última de setas ramificadas (Müller & Arx, 1962).

Orden Sordariales

Familia Lasiosphaeriaceae

Podospora horridula (Sacc.) Dennis & S. Francis

Figs. 12-15

MENORCA: Son Morell, Ciutdadella, 31TEE7531, en cladodios secos de Opuntia ficus-

indica, J. Checa, 17-X1-1990, AH-14533.

Source : MNHN, Paris

130 J. CHECA, M.N. BLANCO y J.M. BARRASA

Figs.10-16.- 10-11:Lophiostoma vicinum (Sacc.) Sacc., asco y ascósporas. 12-15: Podospora horridula

(Sacc.) Dennis & S. Francis, 12; ascos y ascósporas, 13; ascóspora inmadura mostrando el apéndice, 14;

ascóspora madura con apéndice y opérculo, 15; ascóspora madura sin apéndice. 16: Anthostomella tomicum

(Lév.) Sacc., ascos y asc6sporas. Figs. 10-11, 13-16 (barras= 10 mm), Fig.12 (barra= 40mm).

Source : MNHN, Paris

PYRENOMYCETES DE MENORCA 131

Se caracteriza por fructificar en restos de Opuntia sp. (Francis & Sparrow, 1984),

lo que la diferencia de las demás especies del género, fundamentalmente coprófilas.

Ascósporas (34-44 x 13-16 mm) pardas, elipsoidales y curvadas en vista lateral, con un

opérculo en un extremo y un apéndice hialino en el otro, que desaparece al madurar.

Chaetosphaeria inaequalis (Grove) W. Gams & Hol.-Jech.

MENORCA: La Vall, Ciutdadella, 31TEE7531, en restos leñosos de Ficus carica, J. Checa,

17-X1-1990, AH 14652.

Taxon cosmopolita, cuyo anamorfo (Gonytrichum caesicum var. caesicum), està

presente también sobre el sustrato.

Orden Xylariales

Familia Xylariaceae

Anthostomella tomicum (Lév.) Sace.

Fig. 16

MENORCA: La Vall, Ciutdadella, 31TEE8033, en tallos de Scirpus sp., J. Checa, 17-XI-

1990, AH 14578.

Se diferencia fácilmente por sus grandes peritecios (616 x 770 um) y el largo pie

del asco (30 um) (Francis, 1975). Taxon principalmente asociado a especies de Scirpus.

Hypoxylon conostomum Mont.

MENORCA: Binifamis,, 31SFE0128, en ramas de Pistacia lentiscus, J. Checa, 15-X1-1990,

AH 14597; ídem, AH 14597; ibídem, en restos leñosos de Olea europea var, sylvestris, 15-

ХІ-1990, АН 14596.

Especie encuadrada en la sección Primo-Cinerea, subsección Papillata (Miller,

1961). Sus ascomas semiglobosos, rojizos cuando jóvenes y negros en la madurez, y esporas

con una línea germinativa helicoidal, constituyen los caracteres más representativos de esta

especie.

Las citas previas de H. conostomum, sobre restos de madera en la Guayana

francesa y Venezuela (Miller, 1961) y Puerto Rico (Rogers, 1978), indican una distribución

tropical. Sin embargo, cierta afinidad por la vegetación mediterránea y una distribución

extratropical, se ponen de manifiesto con las citas aquí presentadas.

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Source : MNHN, Paris

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BASIDIOMYCÈTES APHYLLOPHORALES DE L’ILE

DE LA RÉUNION.

XVIII LES SISTOTREMATEAE

Jacques BOIDIN' et Gérard GILLES?

117 ше Duguesclin, 69006 Lyon, France

* 109 rue des Rosiers, 40400 Tartas

RÉSUMÉ - Sont traités les genres Sistotrema, Sistotremastrum, Sistotremella et Galzinia. Dix

espèces sont signalées dont deux nouvelles: Sistotrema cadetii et Sistotremella cystidiolophora.

ABSTRACT - Here the genera Sistotrema, Sistotremastrum, Sistotremella and Galzinia are dealt

Ten species are mentioned among them two new species: Sistotrema cadetii and Sistotremella

cystidiolophora

MOTS-CLÉS - Sistotrema, Sistotremastrum, Sistotremella, Galzinia; systématique.

Nous poursuivons l'étude des Aphyllophorales de cette île de l'Océan Indien

Les lieux de récolte seront dénommés comme dans les articles précédents (voir Boidin

& Gilles, 1991), et la numérotation des espèces prend la suite de la dernière publication

(Boidin, Lanquetin & Gilles, 1993).

Une révision des Sistotremateae Parmasto d’Europe est en cours de publication

dans le Bulletin de la Société Mycologique de France (Voir Boidin & Gilles, 1994), où

seront proposées des clés de détermination comprenant toutes les espèces du monde

suffisamment décrites. Nous nous contenterons donc, ci-dessous, de présenter

brièvement les espèces déjà connues rencontrées à la Réunion, et décrirons deux

espèces nouvelles: Sistotrema cadetii et Sistotremella cystidiolophora, espèces qui ont

été placées dans les clés que nous venons d'évoquer.

Clé des Sistotrema de la Réunion

1 - Basides à 4-6, 4-8 ou 6-8 stérigmates

1 - Basides à 4 stérigmates au maximum

2 - Sans cystidioles ni gloéocystides; petites basides urniformes, 12-20-(25) x 4,5-6 um

prés de la base; spores subréniformes 5,2-6,5 x 2,7-3,7 um.

111 - Sistotrema quadroporun

2- Des cystidioles ou des gloéocystides; spores et basides plus grandes . S

E E ELM СП ШЕ ЕЕ ПІ оп

spores ellipsoides 9,5-11 x 5-6 um 114 - Sistotremella cystidiolophora n. sp.

Source : MNHN, Paris

134 J, BOIDIN et G. GILLES

3 - Gloéocystides, 40-75 x 6,5-9,5 um; spores cylindriques 9,5-11 x 4-5,5 um.

н . 116 - Hyphoderma (ex Galzinia) occidentale

4 - Spores tétraédriques . .112 - Sistotrema subtrigonospermum

4 - Spores ellipsoides, cylindriques ou allantoides .. 5.10;

5 - Basides subtubulaires peu étranglées à mi-l hauteurs spores ellipsoïdes 4,5-6 x 2 3

UM...... .113 - Sistotremastrum cf. suecicum

5 - Basides nettement urniformes. 6

6 - Spores à paroi ferme et cyanophile, ellipsoides, 3,5-4,2-(5) x 2-2,8 um

. 115 - Sistotremella perpusilla

Ді

10 - Sistotrema aff. octosporum

108 - Sistotrema cadetii n. sp.

6 - Spores à paroi mince, non cyanophile.

7 - Spores subfusiformes, 3,8-5 x 2-2,5 um.

7 - Spores cylindriques ou allantoides..

8 - Spores allantoides élancées, 7-9 x 1,8-2,5 um.

8 - Spores ne dépassant pas 6um de longueur..

9 - Basidiome lisse; spores suballantoides, 3,5-4,5 x 1,2-1,75 um.

.109 - Sistotrema cf. oblongisporum

9 Basidiome grandinioïde à odontioïde, riche en cristaux; spores 3,7-5 x 2-2,5 um ......

107 - Sistotrema brinkmannii

A-LE GENRE SISTOTREMA PERS.:FR 1821

107 - Sistotrema brinkmannii (Bres.) J. Erikss. stricto sensu.

Deux récoltes nettement grandinioides, riches en cristaux, aux spores

cylindriques déprimées, 3,7-5 x 2-2,5 um sont à signaler: LY 11561, sur souche,

Palmistes II; 11574, sur branches au sol, même secteur, donc à environ 1200m.

d'altitude.

108 - Sistotrema cadetii nov. sp. Pl. 1C

Jacens, tenue, laeve, adhaerens, cinereo-album, margine pruinosa. Hyphae

basilares x 2,5-4,5 um, fibulatae, pariete tenui. Basidia uniformia, collo elongato ubi

таша, 25-32 х 4,5-5 ит summo, x 5-6 um demissius, (6)-8 sterigmatibus. Sporae

suballantoideae, 7-9 x 1,8-2,5 um. Holotypus LY 11459.

Etalé, mince, lisse, adhérent, blanc grisátre (5 YR 7,2/2) (Munsell, 1954) à

marge pruineuse; en herbier discontinu mais non poruleux sous forte loupe.

Hyphes nombreuses, x 2,5-4,5 um, bouclées, à paroi mince, au contenu un peu

gras. Basidioles nettement urniformes puis basides allongées, 25-32 x 4,5-5 um au

sommet, à long col étroit, x 5-6 um vers le bas, à (6)-8 sterigmates. Spores cylindriques

de face, suballantoides de profil, (6,3)-7-9-(10) x 1,8-2,5 pm; X = 7,81 +/- 0,82 x 2,12

+/-0,18.

Récolte: LY 11459, holotype, sur Stellia sp., PK 9,5 à Bébour 111, leg. Th. Cadet, 30

avril 1985.

Cette récolte rappelle S. suballantosporum Hallenb. 1980 de l'Iran par ses

spores et ses basides, mais elle n’est pas pelliculaire et ses hyphes ne sont pas

ampullacées ni à paroi épaissie, ni groupées en cordonnets. De ce fait, elle ressemble

Source : MNHN, Paris

APHYLLOPHORALES DE LA RÉUNION 135

10 um

Planche I - C: Sistotrema cadetii LY 11459, holotype; Ob: Sistotrema cf. oblongisporum, LY 11178;

Oc: Sistotrema aff. octosporum LY 11202; Q: S. quadrisporum LY 11814: S: S. subtrigonospermum

LY 11254; S.c: Sistotremella cystidiolophora LY 11429, holotype; Su: Sistotremastrum cf. suecicum,

LY 14246; H: Hyphoderma (ex Galzinia) occidentale (Rogers), LY 11437.

Source : MNHN, Paris

136 J. BOIDIN et G. GILLES

davantage à la récolte « Romell 3963 » des Corticiaceae of N. Europe (p. 1373, fig.

716). Nous dédions cette espèce à son récolteur, le Professeur Thérésien CADET, qui,

au cours de sa vie malheureusement trop brève, a fait progresser la connaissance et la

défense de la végétation de la Réunion, nous a accueilli dans son île et aidé à

reconnaître les bois supports de nos Aphyllophorales.

109 - Sistotrema cf. oblongisporum Christians. & Hauersl. in Christ. Dansk Bot. Ark.

19: 82, fig. 61, 1960; Eriksson et al. Cort. N. Europe 7: 1345, fig. 695-696, 1984;

Hallenberg, Mycotaxon 21: 396, fig. 3, 1984; Boidin & Gilles, Bull. Soc. Mycol. France

110: pl. 4, fig. 0 (sous presse).

Etalé, lisse, blanc, trés mince, trés poruleux sous la loupe, avec marge amincie;

aspect de forte pruine en herbier.

Quelques hyphes inférieures, régulières, bouclées, x 2,5-3 um, au contenu un

peu gras. Basides urniformes petites, 10-14 x 3-3,5 um au sommet, x 4-4,5 um plus bas,

à (6)-8 stérigmates. Spores allantoides, 3,5-4,5 x 1,2-1,75 um, lisses. (PL. 1, Ob)

Récoltes: toutes sur branches récemment élaguées de Cryptomeria japonica: LY 11178,

Cilaos V-85, 11246, Cilaos X-85, donc entre 1.400 et 1.500 m d'altitude.

Ces récoltes ont les caractéres: spores allantoides, hyphes étroites, ... de S.

oblongisporum; toutefois, les basides et les spores sont plus petites qu'en Europe (pour

Eriksson et al. les spores mesurent (4,5)-5-6 x 1,5-2 um) comme cela arrive souvent

pour les récoltes de pays chauds.

110 - Sistotrema aff. octosporum (Schroet.) Hallenb. in Eriksson et al. Cort. N Europe

7: 1349, 1984.

Etalé, lisse, finement poruleux sous la loupe, à marge atténuée un peu

pulvérulente, blanc sale ou légèrement jaunátre (2,5 Y 8/2, 8/2,5).

Sur quelques hyphes inférieures, x 4-5,5 um, régulières, bouclées, à paroi mince

ou à peine ferme, contenant de petites gouttes huileuses, naissent des hyphes sous-

hyméniales peu distinctes, irrégulieres, x 3-4 um. Basides urniformes, 10-17 x 3,5-4 um

au sommet, 4,5-6 um plus bas, à 8 stérigmates. Spores étroitement fusiformes, à

tendance amygdaliforme, 3,8-5 x 2-2,5 шп (РІ. 1, Ос).

Récolte: LY 11202, sur Lantana camara, Cilaos V1II-85, altitude 1400 m.

Cette unique récolte s'apparente au S. octosporum européen sensu Eriksson et

al. (1984), mais en diffère par ses basides à 8 stérigmates, ses spores plus minces et à

tendance amygdaliforme. Par la taille des spores et le nombre de stérigmates, elle est

plus proche du S. commune J. Erikss. tel que le décrit Christiansen (1960, p. 82), espèce

mise en synonymie avec S. octosporum dans les Corticiaceae of N. Europe.

111 - Sistotrema quadrisporum Hallenb. & Hjortst. Mycotaxon 31: 442, fig. 3, 6 mai

1988 (ou S. hispanicum Duenas, Ryv. & Tell. apud Duenas & Tell. Ruizia 5: 130, 1988,

dont la date exacte de parution n'est pas connue).

Nous ne pouvons citer qu'une récolte, jeune et non encore grandinioide, aux

basides à 4 stérigmates, aux spores oblongues de face, cylindriques faiblement

déprimées de profil, 5,2-6,5 x 2,8-3,7 um, binucléées. x = 5,60 +/- 0,36 x 3,22 +/- 0,21;

R+ 1,74. (PL 1, Q).

Source : MNHN. Paris

APHYLLOPHORALES DE LA RÉUNION 137

Récolte: LY 11814, sur Rubus alcaefolius, Maïdo, octobre 1985, leg. Y. Chamard.

112 - Sistotrema subtrigonospermum Rogers, Univ. lowa St. N.H. 17: 22, pl. 2, fig.

10, 1935; Eriksson et al. Cort. N. Europe 7: 1365, fig. 709, 1984.

Cette espéce américaine trés bien caractérisée par ses spores tétraédriques est

connue en Europe, et a été ramassée à la Réunion: LY 11185, sur grosse branche

pourrie au sol, Cilaos VINI-85; 11254, Cilaos X-85; 11361, sur légumineuse, Etang salé-

85; 14408, le Tremblet-90. Si les deux premières récoltes ont été faites en altitude, les

deux dernières l’ont été, au contraire, près des côtes.

B - LE GENRE SISTOTREMASTRUM J. ERIKSS.

Symb. Bor. Upsal. 16: 62, 1958.

113 - Sistotremastrum cf. suecicum Litsch. apud Erikss., loc. cit.; Eriksson et al.

Cort. N. Europe 7: 1377, fig. 719, 1984.

Les quatre récoltes citées ci-dessous rappellent le S. suecicum. Toutefois les

basides sont ici plus trapues, 12-17 x 5,5-6 um au sommet et portent 5 à 8 stérigmates,

les hyphes sont plus larges, x 3-4 um, et surtout, les spores ellipsoïdes sont plus

épaisses, (4)-4,7-5,5-(6) x 2,7-3,2 um. En 1984, Eriksson et al. notent: « basidia ...

usually with 6, less often 4 sterigmata », et spores «4,5-6 x 1,5-2 m narrowly

ellipsoid ». Remarquons cependant qu’en 1958, J. Eriksson notait « (4)-6-8 stérigmata »

et surtout que les spores de la figure 719, si l'on se réfère à l'échelle qui les

accompagne, font, en fait, 4,6-5,6 x 2,4-2,7 um, ce qui se rapproche de nos mesures.

(PL. 1, Su)

Récoltes: LY 11617, sur bois trés dégradé, Bébour I-85; 14080, sur Ganoderma

pourrissant, Maido-I-90; 14084, sur la souche portant le Ganoderma méme endroit;

14246, sur gros bois au sol, Palmistes VI-90.

C - LE GENRE SISTOTREMELLA HJORTST

in Erikss et al.: Corticiaceae of N. Europe 7: 1379, 1984.

Ce genre se distingue du genre Sistorrema par ses spores à paroi ferme et

cyanophile.

114 - Sistotremella cystidiolophora sp. nov. Pl. 1, S.c.

Jacens, tenuis, laevis, cinereo-alba. Hyphae angustae, fibulatae, tunica tenui.

Multae cystidiolae basi inflatae dein subcylindricae angustae, 45-60 x 6-9 um. Basidia

urniformia, 20-30 x 5,8-7 um collo longo, 4 sterigmatibus. Sporae ellipsoideae, 9,5-11

x 5-6 um valde metachromaticae, satis cyanophilae. Holotypus LY 11429.

Etalé, mince, continu, blanc grisátre, à marge rapidement amincie.

Hyphes peu nombreuses, difficiles à dissocier, étroites, x 1-3 um, à paroi mince,

avec boucles difficiles à bien voir. Nombreuses cystidioles renflées près de la base, puis

étroites, subcylindriques, parfois un peu moniliformes près du sommet, (30)-45-60 x 6-

9 um; leur paroi est un peu ferme dans la partie basale renflée. Basides urniformes 20-

Source : MNHN, Paris

138 J, BOIDIN et G. GILLES

30 x 5,8-7 um au sommet, 7-9 um plus bas, à 4 stérigmates longs de 5-6 um. Spores

ellipsoides, 9,5-11 x 5-6 um; X = 10,35 +/- 0,38 x 5,40 +/- 0,24; leur paroi est lisse, un

peu épaisse, très métachromatique au bleu de crésyl et assez cyanophile.

Récolte: LY 11429, sur Nastus borbonicus, Maïdo 1-85.

Par la forme et la taille de ses spores et basides, cette espèce rappelle le

Sistotrema intermedium Hjortst., mais s’en distingue par ses cystidioles, ses hyphes peu

distinctes à paroi très mince, ses spores à paroi ferme et cyanophile. Ce dernier

caractère nous oblige à placer notre espèce dans le genre Sistotremella qui ne

comprenait, jusqu'ici, que des espèces à petites basides portant 6-8 stérigmates.

Comme le genre Sistotrema, il faut l'élargir pour y inclure cette espèce à 4 stérigmates,

et, qui plus est, porteuse de cystidioles.

115 - Sistotremella perpusilla Hjortst. in Erikss. et al. Cort. N. Europe 7: 1381, fig.

721,1984.

Nous ne redécrirons pas cette petite espèce bien connue en Europe.

Récoltes: LY 12483, sur Cryptomeria japonica, Bébour 1-87; 12512, sur Philippia sp.,

Textor-87.

D-LE GENRE GALZINIA BOURD.

Ass. Fr. Avanc. Sc. 45: 577, 1922

Aucune vraie récolte de Galzinia n’est à signaler. Toutefois LY 11437, sur

Nastus borbonicus, route du Maïdo, vers 1680 m, 28 avril 1985 correspond au Galzinia

occidentalis Rogers 1944. Après hésitations, car nous ne connaissons pas la disposition

des fuseaux méiotiques dans la baside des Galzinia, nous avons transféré cette espèce

dans le genre Hyphoderma, car elle ressemble beaucoup à certains Hyphoderma et

notamment à H. subdefinitum Erikss. & Strid 1975, aux basides dites suburniformes par

ses auteurs. Le genre Hyphoderma ayant été traité antérieurement a la Réunion (Boidin

& Gilles, 1991), nous décrirons ici cet ex-Galzinia, qu'il faudrait ajouter dans notre clé,

en bas de la page 99, à 19-, après l'Hyphoderma sp. LY 14312; il se distingue de ce

dernier par un basidiome lisse, des basides suburniformes, plus longues et non

piquetées de cristaux à l’état jeune...

116 - Hyphoderma occidentale (Rogers) Boid. & Gilles, Bull. Soc. Mycol. France,

sous presse; Galzinia occidentalis Rogers, Mycologia 36: 102, fig. 14, 1944.

Etalé, très mince, blanc grisâtre (10 YR 7,5/1), à marge indifférenciée,

discontinu sous forte loupe.

Coupe haute de 60 pm environ, faite de quelques hyphes inférieures peu

régulières, vite collapsées, à paroi mince, aux cloisons bouclées assez rapprochées,

larges de 2,5-3,5 um. Leptocystides cylindriques, obtuses, au contenu homogène SA.,

37-75 x 6,5-9,5 um, à paroi mince. Basides utriformes à suburniformes, 22-30 x 6-7 um

au sommet, 7,5-9 um près de la base, à 4 stérigmates en doigt de gant quand ils sont

jeunes. Spores cylindriques ou oblongues, 9,5-11,2 x 4-5-(5,5) um; X = 10,40 +/- 0,55

x 4,49 +/- 0,20. (PI. 1, H)

Source : MNHN, Paris

APHYLLOPHORALES DE LA RÉUNION 139

Cette récolte Réunionnaise montre des basides et des spores un peu plus petites

que celles des récoltes Frangaises (Boidin & Gilles, sous presse) cas fréquemment

constaté entre récoltes des pays chauds et des pays tempérés.

Nos remerciements s'adressent à Jean-Claude Léger pour ses traductions latines.

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Source : MNHN, Paris

Source : MNHN. Paris

Cryptogamie, Mycol. 1994, 15 (2): 141-147 141

CHAMPIGNONS CELLULOLYTIQUES DU SOL

DES ZONES ARIDES DU SAHARA ALGÉRIEN

MISE EN ÉVIDENCE DE L'ACTIVITÉ CELLULASIQUE

Farida BEKHOUCHE , André BRETON’, Brigitte GAILLARD-MARTINIE*

' Laboratoire de Microbiologie, Institut INATAA, Université de Constantine,

Route Ain El Bey, Constantine, Algérie.

? Laboratoire de Microbiologie, INRA, Centre de Recherche

de Clermont-Ferrand - Theix, 63122 Saint-Genés Champanelle.

RÉSUMÉ - 38 espèces de micromycètes ont été isolées de six échantillons de sol saharien issus de

différentes localités (Biskra, Touggourt et Ouargla). Ces espèces (mésophiles) appartiennent aux

groupes des Phycomycètes, Deuteromycètes et Ascomycètes. Le test de cellulolyse, selon la

technique de Tansey (1971), nous a permis de retenir une souche cellulolytique inédite de

Lasiobolidium orbiculoides. Ce test a révélé deux types d’hydrolyse:

* une hydrolyse franche, dans le cas d'Aspergillus terreus qui au bout de 90 jours, atteint

une cellulolyse de 50 mm de hauteur.

* une hydrolyse graduelle, dans le cas de Lasiobolidium orbiculoides, qui atteint en 90 jours

une zone de lyse de 16,5 mm de hauteur.

ABSTRACT - Thirty eight fungal species were isolated from six samples of soil collected from

following saharan localities: Biskra, Touggourt and Ouargla. Species identified are mesophiles

representing Phycomycetes, Deuteromycetes and Ascomycetes. Following Tansey’s technic (1971)

the cellulolysis test permitted to select a cellulolytic strain of the ascomycete Lasiobolidium

orbicularis. The test conducted in a test tube revealed two types of hydrolyses:

* A straight way type as with Aspergillus terreus which in 90 days reached a cellulolyse of

50 mm high.

* A gradual type as with Lasiobolidium orbicularis which reaches 16,5 mm high in 90 days.

MOTS-CLÉS - Champignons, isolement, identification, sol saharien, cellulose, cellulolyse.

INTRODUCTION

Bien que défavorisés sur le plan climatique, les sols désertiques peuvent abriter

des espèces fongiques relativement variées.

Des centaines d'espèces appartenant aux groupes des Deutéromycètes,

Ascomycètes et Phycomycètes ont fait l’objet d’études dans différents sols désertiques

de I’ Afrique, de l'Asie et des Etats-Unis (Domsh et al., 1980).

Sur les champignons coprophiles du sud algérien, poursuivant les travaux de

Faurel et Schotter (1964a, 1964b - 1965), Locquin-Linard (1988) a recensé plus de 300

espèces coprophiles dans les zones arides et semi-arides du Nord de I’ Afrique.

Source : MNHN, Paris

142 F. BEKHOUCHE et al.

Dans les sols désertiques d'Egypte, Mouchacca (1982) a pu mettre en évidence

la présence d'une centaine d'espèces fongiques.

Pour cela, nous nous sommes intéressés à l'étude des micromycètes des sols

sahariens et à une évaluation de leur activité cellulasique.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

1. Localisation des sols analysés

Six échantillons de sol ont été prélevés en avril 1985 selon la technique de

Guillemat et Montegut (1965) dans les régions de Zibans (Région de Biskra) et d’oued

Righ (Région de Touggourt et Ouargla).

- Zone des Zibans: Région de Biskra

Sol A: Commune de Farfar, sol de sable fin non irrigué, pourvu d'un couvert végétal.

Sol B: Commune de Benchagroune, sol sablonneux, irrigué, couvert d'une couche de

sel en surface avec végétation.

Sol С: Commune de Tamarine, sol irrigué, couvert d'une couche de sel en surface avec

végétation.

Sol D: Commune de Tamarine, sol irrigué, avec un couvert végétal.

- Zone d'oued Righ: Région de Ouargla

Sol E: Commune de Ouargla, sol peu irrigué avec une végétation pauvre.

Sol Е: Commune d’El-Rouisset, sol irrigué avec présence de végétation.

Les échantillons de sols ont été conservés à température ambiante durant 30

jours.

2. Technique d’isolement et d'identification

Les échantillons étudiés ont été mis en suspension dans une solution isotonique

A 9%o de NaCl et les dilutions de 10* et 10? ont été effectuées. Pour chaque milieu

d'isolement utilisé, dix boites de Pétri furent ensemencées avec 0,5 ml de suspension

réparti en surface.

Trois milieux nutritifs ont été employés:

- le milieu d'Emerson: favorable au développement des micromycétes

thermophiles (50°C) et mésophiles (25°C et 37°C) (Tansey & Jack, 1977).

- le milieu d’Eggins: utilisé au pH de la composition d’origine pH = 5 et à pH =

4 avec addition d'acide lactique, aux températures d'incubations de 37°C et 50°C

(Botton et al., 1985).

- le milieu extrait de malt (MEA): enrichi ou non en saccharose aux

températures d'incubations de 25°C, 37°C et 50°C (Botton et al., 1985).

Tous ces milieux de cultures sont additionnés de Streptomycine (100 mg/l) et de

pénicilline G (50 mg/l).

Le dénombrement des souches observées est évalué en nombre de colonies par

gramme d'échantillons de sol analysé.

L'évaluation des activités cellulolytique a été réalisé par la méthode de Tansey

(1971), avec incubation des cultures à 25°C et 37°C.

Source : MNHN, Paris

CHAMPIGNONS CELLULOLYTIQUES DU SAHARA 143

RÉSULTATS ET DISCUSSION

- Fréquence des espèces observées

Des six échantillons de sol saharien étudiés, nous avons isolé un total de 38

taxons mésophiles appartenant aux groupes des Phycomycètes (3 espèces) des

Ascomycètes (8 espèces) et des Deutéromycètes (26 espèces) (Tableau 1).

Le nombre d'espèces isolées par échantillon de sol varie entre 6 et 13.

Nous avons constaté une forte densité fongique dans les sols A, D et F

caractérisés par une absence apparente de sel. Les sols B et C, au contraire, présentent

un nombre d'espèces relativement faible, probablement en raison de la présence de

NaCl. Le sel est considéré comme un facteur limitant pour le développement des

champignons dans le sol (Dubost, 1966,). Le résultat le plus faible s'observe dans

l'échantillon de sol E, qui présente d'autre facteurs limitant que le sel: manque d'eau et

une végétation pauvre.

Parmi les espèces recensées, seules, Aspergillus niger, Aspergillus terreus et

Penicillium chrysogenum sont présents dans les six sols. Les autres espèces ont une

distribution limitée à un ou deux sols. Les 38 espèces mésophiles détectées ont été

signalées dans les sols désertiques d'autres pays (Domsh et al., 1980); 27 de ces 38

espèces sont présentes dans certains sols arides de l'Egypte, avec comme dans notre cas

une fréquence élevée pour Aspergillus niger, A. terreus et Penicillium chrysogenum

(Mouchacca, 1982). Cette distribution floristique comporte également une espèce plus

largement répandue dans les excréments prélevés dans les régions arides du Nord de

l'Afrique: Lasiobolidium orbicularis. En effet Locquin-Linard (1988) a trouvé cet

Ascomycète dans 66% des 213 lots de divers échantillons de matières fécales d'origine

animale.

Par contre dans les sols du Sahara il est apparemment moins fréquent, surtout

présent dans l'échantillon F. Mouchacca (1982) signale également dans son étude un

Lasiobolidium non déterminé isolé d'un sol aride d'Egypte.

- Activité cellulolytique des souches isolées

Les résultats des activités cellulolytiques, évaluées après 30 jours d'incubation

suivant la méthode de Tansey (1971), révélent que 19 espéces s'avérent plus ou moins

cellulolytique avec, quelquefois, des réponses variables pour les souches d’une même

espèce. Ceci s'observe en particulier pour Penicillium chrysogenum (Tableau 2).

D'autre part deux types d'hydrolyses ont pu être observées:

* Une hydrolyse graduelle (G) qui s'effectue progressivement en direction

centrifuge: Emericella rugulosa et de Lasiobolidium orbiculoides.

* Une hydrolyse franche (F) qui apparait trés nette et qui se manifeste plus

rapidement: Aspergillus fumigatus, Aspergillus ochraceus et Aspergillus terreus.

Cette différence pourrait résulter d'une diffusion plus ou moins rapide du

complexe enzymatique dans le milieu (Tansey, 1971).

Parmi les 19 taxons cellulolytiques, les plus performantes à 37°C se révèlent

être Emericella rugulosa et Thielavia microspora et à 25°C: Aspergillus ochraceus,

Lasiobolidium orbiculoides et Fusarium solani. Seuls, Aspergillus terreus et

Aspergillus fumigatus sont très actifs à 37°C et à 25°C.

Source : MNHN, Paris

144

F. BEKHOUCHE et al.

Tableau I - Espèce observée à 25 et 37°C et nombre respectif de colonies/g de sol.

Table I - Species isolated at 25 and 37°C and the respective number of colonies/g of soil.

Espèces isolées

BISKRA

TOUGGOURT

OUARGLA

A B

с D

E F

Absidia corymbifera

410

Mortierella sp.

Rhizopus nigricans

Byssochlamys sp.

210

Emericella rugulosa

Eurotium amstelodami

Eurotium sp.

0,4 10°

Gymnascella aurantiaca

0,4 10°

Lasiobolidium orbiculoides

Microascus trigonosporus

2 10

Thielavia microspora

0,2 10°

Acremonium furcatum

0,8 10°

A. strictum

1410

A. sp.

0,2 10°

Aspergillus flavipes

A. fumigatus

A. niger

10,7 10°

2.6 10

0,2 10° 0,3 10°

A. ochraceus

0,7 10°

A. terreus

1.6 10° 10°

0,2 10

Botryotrichum piluliferum

610

Fusarium culmorum

210

F. oxysporum

0,710:

F. solani

210

Penicillium cyclopium

410

P. chrysogenum

0,7 10°

0410 0710

P. variabile

210

P. oxalicum

0,7 10°

P.sp.1

P.sp.2

Scopulariopsis chartarum

210°

Alternaria sp.

0,7 10°

Gilmaniella macrospora

0,7 10°

Stachybotrys chartarum.

0710

Ulocladium atrum

410

0,7 10°

U. chartarum.

410 0,7 10°

Myurothecium roridum

Phoma herbarum

210

[ Mycelium sterile

Les lettres A, B, C, D, E, F correspondent aux échantillons de sol.

Source : MNHN, Paris

CHAMPIGNONS CELLULOLYTIQUES DU SAHARA 145

Tableau II - Hauteur d'hydrolyse (mm) aprés différents temps d'incubation.

Table II - High measure of the hydrolysis after different time of incubation.

Hauteur d' Hydrolyse en mm

Espèces cellulolytiques H | Sjours | 10jours | 20jours | 30jours

Emericella rugulosa (B) а 4 8 9 12

Gymnascella aurantiaca (F) Gi 2 3 3 3

Lasiobolidium orbiculoides (Е) G 4 7 9 13

Thielavia microspora (C) F 1 1 2 7

Th. microspora (F) Е 2 і 4 5 8

Aspergillus flavipes (A) Е 3 5 5

À. fumigatus (A) Е 45 8 10 15

‘A. niger (D) G D 2 2 2

A. niger (E) a 1 1 2 2

A. ochraceus (D) F 4 8 1s 17

A. terreus (A) F 5 8 9 15

A. terreus (В) F 6 10 12 15

A. terreus (C) ae 45 29 11 15

A. terreus (F) F 5 6 13 15

Fusarium oxysporum (D) G Е 2 5 6

F. solani (D) F 2 6 10 13

Penicillium chrysogenum (Е) G 2 EE IE 12

P. chrysogenum (A) Е 2 SR 10

P. chrysogenum (E) G - Sena osa 10

Н: Туре d'hydrolyse; G: Graduelle; F: Franche. Les lettres entre parenthése (F, A, D et E)

correspondent aux échantillons de sol à partir desquels l'espèce a été isolée.

Divers travaux mentionnent également les fortes activités cellulolytiques de nos

espéces les plus performantes (Prakash et Saksena (1952); Reese et Levinson (1952);

Bassa et Ghose, 1960; Pugh, 1966; Agrawal (1971) et Gochenaur (1975).

Quelques souches des espéces les plus cellulolytiques ont été conservées en

tubes de Tansey pendant une durée de trois mois. Aprés ce temps d’incubation, les

zones de lyse atteignaient 50 mm pour Aspergillus terreus et Aspergillus ochraceus.

En revanche, pour Lasiobolidium orbiculoïdes la hauteur de lyse restait limitée

à 16,5 mm dès le premier mois (Tableau 3). L'activité cellulolytique de cet ascomycète

n'a jamais fait l'objet d'une étude en raison de sa description récente (Mallock et Cain,

1971) mais il avait été signalé auparavant par Faurel et Schotter (1964, 1964b) sous le

nom d'Anixa Walbrothii Fuckel.

Source : MNHN, Paris

146 F. BEKHOUCHE et al.

Tableau III - Synthèse des données relatives aux souches les plus cellulolytiques.

Table III - Synthesis of data for the most cellulolytic strains.

Hauteur de lyse en mm

Espèces sélectionnées H 30 jours | 90 jours

Aspergillus terreus (F) Е 15 50

À. fumigatus (A) EEE 26

A. ochraceus (D) F 17 50

Fusarium solani (D) F 13 37

Lasiobolidium orbiculoides (E) G 13 165

Penicillium chrysogenum (E) F 12 20

H: Type d'hydrolyse graduelle. G: graduelle; F: franche. Les lettres entre parenthèse (F, A, D et E)

correspondent aux échantillons de sol à partir desquels l'espèce a été isolée

CONCLUSION

Le test de Tansey nous a permis de sélectionner deux espèces présentant une

activité cellulasique marquée: Aspergillus terreus a été retenu pour sa meilleure

aptitude à dégrader la cellulose. Il a été retenu comme souche de référence.

Lasiobolidium orbicularis orbiculoides a été sélectionné en raison de son

activité cellulolytique inédite et pour sa découverte dans les zones arides de l'Afrique

du nord. Ce champignon est en fait un organisme coprophile, qui se développe mieux

sur les excréments de divers animaux, en particulier gazelles et dromadaires (Locquin-

Linard, 1988).

Enfin dans une prochaine publication nous tenterons de caractériser les

propriétés particuliéres de différentes enzymes composant l'équipement cellulolytique

de ces deux espèces.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

AGRAWAL S.C., 1971 - The cellulolytic capacity of some litter, Fungi-phytar, B-aires, 28: 169-175.

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BOTTON B., BRETON A., FEVRE M., GUY Ph., LARPEN J.P. et VEAU P., 1985 - Moisissures

utiles et nuisibles: importance industrielle. Ed. Masson. Paris.

DOMSH K.H., GAMES W., ANDERSON T.H., 1980 - Compendium of soil fungi. Vol. IMI.

Academic Press, London.

DUBOST D., 1966 - Les champignons des sols salés de l'ouest algérien. II Tolérance au Nacl. Bull.

Soc. Hist. Nat. Afri. du Nord 57: 130-144,

FAUREL L. et SCHOTTER G., 1964a - Notes mycologiques II, quelques champignons coprophiles

des environs d'Alger. Rev. Mycol. 29, 4: 267-283

Source : MNHN, Paris

CHAMPIGNONS CELLULOLYTIQUES DU SAHARA 147

FAUREL L. et SCHOTTER G., 1964b - Notes mycologiques III, quelques champignons coprophiles

du Sud Algérois. Rev. Mycol. 29, 4: 284-295.

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central et notamment de la Tefedest. Rev. Mycol. 30 (3): 141-164.

GOCHENAUR S.E., 1975 - Distribution patterns of mesophilous and thermophilous microfungi in

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GUILLEMAT J. et MONTEGUT J., 1965 - Contribution à l'étude de la microflore fongique des sols

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LOCQUIN-LINARD M., 1988 - Etude de la mycoflore coprophile des zones arides et semi arides du

Nord de l'Afrique. Thèse de doctorat. Université Pierre et Marie Curie Paris 6.

MOUCHACCA J., 1982 - Etude analytique de la mycoflore de quelques sols des régions arides de

l'Egypte. Thèse de doctorat ès sciences, Université Pierre et Marie Curie Paris 6.

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typhoideum) Straws by fungi commonly found in allahabed soils. Proc. Indian Acad. Sci., B,

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PUGH G.J.F., 1966 - Cellulose decomposing fungi isolated from soils near Madras. J. Indian Bot.

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situ and in vitro, Rev. Mycol.: 69: 563-578.

Source : MNHN, Paris

Source : MNHN. Paris

Cryptogamie, Mycol, 1994, 15 (2): 149-151 149

ANALYSES BIBLIOGRAPHIQUES

MATHUR S. B. & CUNFER B. M. (Eds.): Seed-Borne Diseases and Seed Health

Testing of Wheat. Danish Government Institute of Seed Pathology for Developing

Countries, Hellerup, Danemark, 1993, 168 pp. Price US$ 45, including postage.

Les deux éditeurs de cet intéressant ouvrage sont connus pour leurs apports

personnels aux récents progrés réalisés dans notre connaissance de la pathologie des

semences des cultures vivrières. Le premier est depuis longtemps responsable du célè-

bre Institut danois de pathologie des semences des pays en voie de développement, dont

il a été le maítre d'oeuvre; le second, actuellement Professeur de pathologie végétale à

l'Université de Géorgie, s'est toujours consacré à l'étude des pathogènes des semences

des céréales à petits grains.

Les maladies des semences du blé furent parmi les premières pathologies végé-

tales à être étudiées de manière scientifique. Si des progrès immenses ont été réalisés

depuis, un effort considérable reste encore à fournir dans ce domaine, en particulier

pour appréhender le rôle des inoculats des pathogènes des semences dans l'épidémio-

logie de chaque maladie, Cet axe de recherche exige une meilleure connnaissance

générale des organismes responsables des désordres phytopathologiques, le développe-

ment de méthodes optimales et non sophistiquées d'évaluation des pathologies induites

et, enfin, la mise en place de modes appropriées de lutte nécessitant un usage limité de

moyens chimiques de traitement.

Cet ouvrage correspond à une étude d'ensemble, mais actualisée, des maladies

des semences du blé. Il comporte quatorze chapitres, rédigés chacun, par un spécialiste

de réputation internationale. Ces chapitres traitent de 28 affections induites par des

champignons, des bactéries, des virus ou des nématodes. Chaque partie présente des

informations sur l'identité du pathogéne responsable d'une pathologie, la répartition

géographique de la maladie et les symptómes correspondants ainsi que leur

manifestation dans le temps; le texte fournit également des informations sur les procé-

dures d'évaluation de la qualité sanitaire des semences et, enfin, des techniques de

contróle appropriées. Chaque chapitre est soutenu par une liste de références bibliogra-

phiques spécifique, relativement exhaustive. L'ouvrage est illustré avec une iconogra-

phie importante; celle-ci comporte 77 planches en couleur, la plupart de bonne qualité,

19 planches en noir et blanc et six diagrames descriptifs de certains cycles de maladies.

Cet ouvrage a été conçu à l'intention de tous les spécialistes intéressés par la

culture industrielle du blé, une production agricole dont l'importance économique et

stratégique tend à s'accentuer. Il intéressera en particulier les chercheurs et techniciens

des secteurs de production des semences, également le personnel administratif impliqué

dans l'élaboration et l'application des normes sanitaire de qualité pour les semences du

blé. Détail interéssant pour les responsables des pays en développement, la présence

Source : MNHN, Paris

150 ANALYSES BIBLIOGRAPHIQUES

d'informations sur les méthodes d'études moins récentes permettant de tester et de

contrôler la "santé" des semences de blé.

La présentation de l'ouvrage a été soignée. Le texte est clair, de lecture aisée et

l'iconographie est abondante et bien ciblée. C'est une source importante d'informations

qui devrait grandement stimuler les recherches, dans les diverses disciplines de la

pathologie des semences du blé.

Jean Mouchacca

PEGLER D. N., BODDY L., ING B. & KIRK P. M. (Eds.): Fungi of Europe: Investi-

gation, Recording and Conservation. Proceedings of the XI Congress of European

Mycologists, Royal Botanic Gardens, KEW, 322 pp., 1993.

Le XI Congrès Mycologique Européen s'est tenu, et pour la première fois, en

Angleterre au Royal Botanic Gardens, KEW, du 7 au 11 septembre 1992, grâce aux

efforts déployés par les mycologues de cette institution, avec l'assistance des membres

de la British Mycological Society et du CAB International Mycological Institute. C’est

également la premiére fois que cette manifestation mycologique avait lieu depuis la

chute du mur de Berlin. Ce Congrès est donc particulièrement marquant puisqu'il à

servi de forum pour les mycologues des pays européens occidentaux et orientaux, après

une longue période de séparation politique et donc d'absence de communication. Près

de deux cents spécialistes représentant vingt-huit pays européens, ont répondu à l'appel

des organisateurs.

Ce volume est consacré aux contributions présentées lors de ce Congrès. Celui-

ci se distingue des réunions similaires précédentes par la sélection d'un thème spécifi-

que pour cette réunion. La thématique retenue pour ce XI Congrès avait comme intitulé

"Champignons d'Europe: Recherche, Cartographie et Conservation". Ce choix avait

pour objectif de favoriser l'émergence d'une approche commune, face aux nombreux

problèmes que suscitent le cas des espèces fongiques en voie de disparition; en corol-

laire, l'urgente nécessité de définir des mesures de conservation, surtout durant la pé-

riode actuelle ou de multiples menaces pèsent sur l'environnement en Europe.

L'ouvrage commence par une courte préface, rédigée par le Directeur du Royal

Botanic Gardens mettant l'accent sur l'importance, souvent peu soulignée, du rôle éco-

logique des champignons. Suit une introduction détaillée des objectifs et des particula-

rités du XI Congrès, présentée par les deux premiers des quatre éditeurs. Le corps du

livre réunit les contributions présentées lors des trois symposia qui se sont déroulés

autour des thèmes respectifs suivants: Localisation et Cartographie des Champignons,

Champignons dans les Ecosystèmes Européens et Conservation des Champignons

Européens.

Les cinq contributions du premier chapitre analysent les problèmes liés aux

essais d'enregistrement et de cartographie des espèces fongiques. La nécessité de con-

Source : MNHN, Paris

ANALYSES BIBLIOGRAPHIQUES 151

cevoir un sytème de saisie et de traitement des informations à vocation internationale

n'est plus à souligner; en particulier, si l'on souhaite intégrer en un ensemble cohérent

les données collectées dans chaque pays européen. Cette démarche est un préalable

pour l'élaboration de textes administratifs visant à la préservation d'espèces fongiques.

Dans ce domaine, un effort marquant se réalise actuellement en France, grâce à la

participation bénévole de nombreux amateurs éclairés, au projet national de cartogra-

phie des champignons.

L'étude des champignons des écosystémes européens a fait l'objet de seize

importantes contributions. Ces travaux soulignent l'extraordinaire diversité des habitats

prévalents en Europe, de la méditerrannée aux confins subarctiques. Certaines de ces

contributions sont l'oeuvre de spécialistes originaires de l'Europe orientale et dont l'aire

d'étude s'étend quelquefois jusqu'aux plaines sibériennes. Le dernier chapitre considère

à travers les sept textes présentés, les besoins résultant des observations contenues dans

les travaux des deux chapites précédents. Ont été ainsi abordés les mesures appropriées

de conservation, l'impact de la pollution atmosphérique sur les champignons mycorrhi-

ziens en Europe Centrale et les problèmes gravitant autour de la cueillette d'espèces

consommables dans les pays européens à forte tradition de mycophagie.

La masse importante d'informations contenues dans les vingt-trois documents

synthétiques de cet ouvrage apportent un éclairage nouveau sur la biogéographie et la

diversité présente des interactions hótes-champignons. Dans cette perspective, un as-

pect intéréssant et original généralement peu abordé, a concerné le "parasitisme" de

certains discomycètes vis à vis d'espèces de bryophytes dans l'ex Tchécoslovaquie;

selon son auteur Mirko Svrcek, spécialiste réputé des Discomycètes, l'aire de répartition

de quelques espèces de ce groupement est actuellement en voie de régression rapide

dans ce pays. Il reste à signaler que la réunion du Conseil Européen de Conservation

des Champignons, lors de ce congrès, a permis de débattre d'une liste des espèces euro-

péennes classée rouge et donc les plus menacées. Enfin, le prochain Congrès Européen

confirmera si des progrès sensibles ont vu le jour dans ce domaine.

Jean Mouchacca

BIBL. DU

MUSEUM

PARIS /

АА Souto: MNHN Para

Commission paritaire 16-1-1986 - N° 58611 - Dépôt légal 2° trimestre 1994 - Imprimerie F. Paillart

"Sortie des presses le 30 juin 1994 - Imprimé en France

Éditeur : A.D.A.C. (Association des Amis des Cryptogames)

Président : D. Lamy; Secrétaire : B. Dennetière

Trésorier : E. Bury: Directeur de la publication : H. Causse

Source : MNHN, Paris

CRYPTOGAMIE

Diffusion de CRYPTOGAMIE

LE PÉRIODIQUE FRANÇAIS

CONSACRÉ A LA CRYPTOGAMIE

CRYPTOGAMIE est un périodique édité

par l'A.D.A.C. (Association des Amis des

Cryptogames), dont le siége est au Labo-

ratoire de Cryptogamie du Muséum Na-

tional d'Histoire Naturelle. Les cher-

cheurs de tous pays y publient leurs

travaux en français, allemand, anglais, es-

pagnol et italien, aprés accord des

Comités de Lecture constitués de

spécialistes de réputation internationale.

CRYPTOGAMIE propose trois sections:

Cryptogamie, Algologie

Cryptogamie, Mycologie

Cryptogamie, Bryologie-Lichénologie

Chaque section publie 4 numéros par an

(Чгаре: 450 exemplaires).

THE FRENCH JOURNAL

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published by A.D.A.C. (Association des

Amis des Cryptogames), settled at Labo-

ratoire de Cryptogamie, Muséum National

d'Histoire Naturelle. Research workers

from the whole world publish their papers

in French, German, English, Spanish and

Italian, after acceptation by a selection

commettee that comprises experts of inter-

national renown.

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Cryptogamie, Algologie

Cryptogamie, Mycologie

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Each section publishes 4 numbers a year

(printing: 450 ех.).

Europe

Шлтше OJ Australie

Amérique E Asie

Origine des 453 articles publiés de 1986 à 1991

Œ Français

Anglais

espagnol Ш italien

LJ Allemand.

Source : MNHN, Paris

SOMMAIRE

A. MICHAUT, M.J. JACQUIER, F. BOUCHET, M.G. DUOUX, L. LE MEN, P.

BOUCHET - Etude de l'action antifongique de différents composés

bromés extraits d'un annélide polychète des îles Kerguelen а

setosus...

LA. EL KADY, A.Y. ABDEL-MALLEK, S.S.M, EL MARAGHY, and H.A.H.

HASSAN - Toxigenic moulds in pesticide treated liquid medium...

G.L. HENNEBERT, S. PASCAL et M. COSYNS - Interactions d'incompatibilité

entre homocaryons du Basidiomyctte bifactoriel Lenzites betulinus. Une

phéromone de répulsion sexuelle? A

A-L.E. MAHMOUD and S.A. OMAR - Enzymatic activity and mycotoxin-

producing potential of fungi isolated from rotted lemons wee

J. CHECA, M.N, BLANCO y J.M. BARRASA - rca DOREM

sensu lato de Menorca. ....

J. BOIDIN et G GILLES - mee Aphyllophorales de l'ile de la

Réunion. XVIII les Sistotremateae. . de

F. BEKHOUCHE, A. BRETON et B. GAILLARD-MARTINIE - Champignons

cellulolytiques du sol des zones arides du sahara algérien. Mise en

évidence de l'activité cellulasique. … УЕ

Analyses bibliographiques. ....

Cryptogamie, Mycol. 1994, 15 (2): 67-153.

141

149