SOMMAIRE

A. PARGUEY-LEDUC, C. MONTANT et M. KULIFAJ — Morphologie

et structure de l'ascocarpe adulte du Tuber melanosporum Vitt. (Truffe

noire du Périgord, Discomycétes).........., TM NM 173

J.E. HENNI — Évaluation de l'efficacité de certains champignons antago-

nistes vis-à-vis de Verticillium dahliae Klebahn. ................ 203

L. NAJIM — Contrôle morphogénétique de la différenciation des sclérotes

de Sclerotinia fructigena :1-Etudes physiologiques......... PNE OC

A. ROLDAN, E. DESCALS and M. HONRUBIA — Notes on Tetracladium

арієпзе ошса EES Ие 219

B.Ch. BEHBOUDI, H. EBRAHIMZADEH et G. HADADTCHI — Contróle

de la formation des rhizomorphes d’Armillariella mellea (Vahl. ex Fr.)

Karst. par l’alternative nitrate-ammonium et certains acides aminés ... 227

A.LI. ABDEL-HAFEZ and H.M.M. EL-SHAROUNY — Seasonal fluctua-

tions of fungi in Egyptian soil receiving city sewage effluents ....... 235

CONTENTS

A. PARGUEY-LEDUC, C. MONTANT et M. KULIFAJ — Morphology

and structure of adult ascocarp in Tuber melanosporum Vitt. (Black

Périgord Truffle). (in French) ...........,......., nl 173

J-E. HENNI — Determination of the effectivity of certain fungi antagonist

icillium dahliae Klebahn. (in French)

L. NAJIM — Morphogenetic control of sclerotia differentiation in Sclero-

tinia fructigena, - 1 Physicological studies. (in French) ..........., 209

A. ROLDAN, E. DESCALS and M. HONRUBIA — Notes on Tetracladium

apiense Sinclair and Eicker .........,.........,... Ent КОЛУ

B.Ch. BEHBOUDI, H. EBRAHIMZADEH et G. HADADTCHI — Forma-

tion of Armillariella mellea (Vahl. ex Fr.) Karst. rhizomorphs con-

trolled by nitrate-ammonium alternative and some amino-acids. (in

ECD cp rape M EUM I E 227

A.LI. ABDEL-HAFEZ and H.M.M. EL-SHAROUNY — Seasonal fluctua-

tions of fungi in Egyptian soil receiving city sewage effluents ....... 235

Source : MNHN, Paris

CRYPTOGAMIE

MYCOLOGIE

TOME 8 Fascicule 3 1987

Ancienne Revue de Mycologie. Dirigée par Roger HEIM

DIRECTEUR SCIENTIFIQUE : Madame J. NICOT

SECRÉTAIRE DE RÉDACTION : Mme M.C. BOISSELIER. ÉDITEUR : A.D.A.C.

Publié avec le concours du Muséum National d'Histoire Naturelle

CRYPTOGAMIE, MYCOLOGIE est indexé par : Biological Abstracts, Current Contents,

Publications bibliographiques du CDST (Pascal)

Bibliothèque Centrale Muséum

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Cryptogamie, Mycol. 1987, 8 (3) : 173-202 173

MORPHOLOGIE ET STRUCTURE DE L'ASCOCARPE ADULTE

DU TUBER MELANOSPORUM VITT.

(Truffe noire du Périgord, Discomycétes)

par A. PARGUEY-LEDUC*, C. MONTANT** et M. KULIFAJ**

RESUME — Les ascocarpes du Tuber melanosporum présentent des caractères tout à fait

originaux par rapport à ceux des apothécies des Pezizales; plus ou moins globuleux, et non

cupuliformes, ils sont constitués par une volumineuse glébe interne (veines fertiles associées

à des veines stériles) et un mince péridium externe, à écailles de divers types. Dans la glèbe,

l'hyménium est également atypique : les asgues, globuleux, sont dissociés des paraphyses;

ces dernières se prolongent, en outre, par un réseau arachnoide dans les veines stériles.

Ces caractères ajoutés à ceux, tout aussi singuliers, de l'ascosporogénèse, des asques et

des ascospores, permettent de supposer qu'à partir d'une forme ancestrale commune, se

seraient détachés deux phylums : l'un conduisant aux Pézizales relativement peu évolućes,

et l'autre aux Tubérales diversement évoluées.

SUMMARY. — Compared with those of Pezizales, Tuber melanosporum ascocarps display

particularly original characters : more or less globular, non discoid, they are constituted

by a voluminous internal gleba (fertile and vegetative veins) and a thin external peridium

(made of various types of scales). Within the gleba, the hymenium is also atypical : globular

asci and paraphyses are dissociated and the latter ones are prolonged in sterile veins by an

arachnoid net-work.

These former characters, as atypical as those of ascosporogenesis, asci and ascospores,

let suppose that two phyletic lines could have derived from an ancestral form, the first one

leading to non evolved Pezizales, the second one to variously evolved Tuberales.

MOTS CLES : ascocarpes, hyménium, Tubérales, Tuber.

La Truffe noire du Perigord (Tuber melanosporum Vitt.), espèce essentielle-

ment française, et probablement le champignon le plus estimé en France, n'a,

paradoxalement, été que fort peu étudiée d'un point de vue scientifique. En

effet, aprés les études déjà anciennes de VITTADINI (1831), TULASNE &

TULASNE (1851, 1862), CHATIN (1869, 1892), FERRY de la BELLONE

* Laboratoire de Cryptogamie, Université Pierre et Marie Curie - 9, Quai Saint-Bernard -

75252 Paris Cedex 05 - France.

** Laboratoire de Cryptogamie, Université Paul Sabatier - 118, Route de Narbonne - 31602

Toulouse Cedex - France.

Source : MNHN, Paris

174 A. PARGUEY-LEDUC, C. MONTANT et M. KULIFAJ

(1888), DANGEARD (1895-96), FISCHER (1897), MATTIROLO (1903),

cette Truffe a été longtemps délaissée par les mycologues, et c’est seulement

depuis une vingtaine d'années qu'un regain d'intérét scientifique se manifeste

pour ce curieux Champignon, considéré pourtant comme l'un des fleurons de

la gastronomie française.

Depuis 1869, divers travaux — dont la liste ci-après n'est pas exhaustive —

permettent une meilleure approche de la biologie, si complexe, du Tuber mela-

nosporum. En particulier, un certain nombre d'observations écologiques ont

été rapportées (BONFANTE & al., 1971; GUILLAUME, 1972; DELMAS &

POITOU, 1973; ROUQUEROL & PAYRE, 1974-1975 a et b; REBIERE, 1981;

DELMAS, 1983; BARON, 1984; JACQUET, inédit). Des publications relatives

à la germination des ascospores (MELENDEZ-HOWELL & CAILLEUX, 1971;

GRENTE & al., 1972: ROUQUEROL & PAYRE, 1974-1975b) et à des essais de

culture (FONTANA, 1971; CHEVALIER, 1972; ROUQUEROL & PAYRE,

1974-1975a; KULIFAJ, 1984), ont permis une meilleure approche des pro-

blèmes de mycorhization des racines d’arbres par le mycélium de Truffe (PA-

LENZONA, 1969; CHEVALIER, 1972; PALENZONA & al., 1972; CHEVA-

LIER & al., 1973; DELMAS & POITOU, 1973, 1978; GRENTE & DELMAS,

1974:ROUQUEROL & PAYRE, 1974-1975 a et b; CHEVALIER & DESMAS,

1975, 1977 a et b; CHEVALIER & GRENTE, 1978; CHEVALIER & al., 1982;

JACQUET, inédit). Enfin, depuis peu, ont été effectuées des études physiolo-

giques (KULIFAJ, 1984) et ultrastructurales (PARGUEY-LEDUC & JANEX-

FAVRE, 1981; SCANNERINI & BONFANTE-FASOLO, 1982; JANEX-FAVRE

& PARGUEY-LEDUC, 1983; PARGUEY-LEDUC & al., 1987).

Mais de nombreux points relatifs à la biologie du Tuber melanosporum

demeurent encore Enigmatigues et des lacunes persistent, en particulier en ce

qui concerne la formation et l'évolution de la «Truffe». Rappelons que ce terme,

tel qu'il est usuellement employé, ne désigne que la fructification du Champi-

gnon, dont la partie végétative (mycélium, mycorhizes) demeure dans le sol

lors des prélèvements. Pour nommer cette fructification à asques, nous emploie-

rons, suivant ainsi la terminologie de CHADEFAUD (1960, 1963), le terme

d'ascocarpe plutôt que celui, ancien, de tubercule ou celui de carpophore, pour-

tant généralement utilisé, mais qui doit être au plus réservé aux fructifications

à basides (= basidiocarpes).

D'un point de vue ontogénique et structural, l'ascocarpe du Tuber melano-

sporum n’a fait l’objet que de très peu d'observations et celles-ci sont, de plus,

soit trés anciennes (DANGEARD, 1895-96), soit trés fragmentaires (CHAZE,

1950).

C'est pourquoi, dans le cadre d'une étude générale sur la structure évolutive

des Hypogés, nous nous efforçons d'éclaircir certains de ces points. Nous avons

déjà apporté quelques précisions sur l'évolution de l'ascocarpe (PARGUEY-

LEDUC & al., 1984) — et en particulier sur le stade apothécioide (PARGUEY-

LEDUC & al., 1985) dont l'existence n'était pas connue jusque là — ainsi que sur

la formation et l'évolution des ascospores (PARGUEY-LEDUC & al., 1987).

Dans le présent article, nous rapportons nos observations sur l'ascocarpe adulte,

Source - MNHN, Paris

L'ASCOCARPE DU TUBER MELANOSPORUM VITT. 175

qui, contrairement à ce qu'on pourrait penser, est fort mal connu dans le détail.

Les dessins qui en ont été donnés sont trés anciens (TULASNE & TULASNE,

1851, 1862; CHATIN, 1892; FISCHER, 1897) et les photographies, générale-

ment prises sur le terrain, ne montrent les Truffes que dans leur aspect brut,

à peine dégagées de leur gangue terreuse.

TECHNIQUES*

Pour reconnaitre les différents types morphologiques d’ascocarpes, plusieurs

lots de Truffes ont été examinés à la loupe binoculaire; les uns ont été récoltées

par nous-mêmes **, suivant la technique déjà exposée (MONTANT & al., 1983;

KULIFAJ, 1984) et les autres nous ont été aimablement procurées par la maison

PEBEYRE.

Un brossage et un lavage soigneux doivent être effectués avant toute observa-

tion afin d'óter la terre qui demeure entre les écailles et qui les masque partiel-

lement.

La structure des ascocarpes a été observée in toto aprés simple section verti-

cale axiale et, dans le détail, sur des coupes sériées. Pour ce faire, de petits cubes

ont été prélevés, soit en périphérie, soit à l'intérieur de l'ascocarpe. Ils ont été

fixés par le mélange de Westbrook et inclus dans la paraffine avant d'étre coupés

au microtome, a 5 um d'épaisseur. Les coupes, aprés leur dépose sur des lames,

ont été colorées à l'hématoxyline ferrique, selon la technique de Heidenhain,

puis à l'éosine à 1 %. Nous avons également utilisé pour certaines études cyto-

logiques des coupes semi-fines réalisées à l'ultramicrotome et colorées par là

pyronine.

Nous rapporterons d’abord nos observations sur la morphologie et la structure

de l'ascocarpe adulte, puis décrirons en détail la structure des veines de la glèbe

et enfin, les trois types morphologiques d'écailles reconnus.

I. — MORPHOLOGIE ET STRUCTURE DE L'ASCOCARPE ADULTE

Les Truffes que nous avons examinées pour cette étude ont été récoltées au

cours des hivers 1984 et 1985 et présentaient toutes des caractères adultes,

c'est-à-dire que la majorité des asques contenait déjà des ascospores mûres,

brunes et échinulées. Mais si elles étaient mûres «scientifiquement» parlant, elles

ne l'étaient pas obligatoirement du point de vue commercial; en effet, les asco-

carpes atteignent ce stade adulte généralement plusieurs semaines, voire plu-

sieurs mois, avant d'acquérir les qualités organoleptiques qui les rendent com-

* Nous avons plaisir à remercier M. AVNAIM, J. BIDOUX, C. FOURNIGAULT et N.

JAMPSIN pour leur précieuse et amicale collaboration.

** Nous remercions vivement R. GLEIZE et L, FIOC de nous avoir laissé le libre accès à

leurs truffiéres.

Source : MNHN, Paris

176 A. PARGUEY-LEDUC, C. MONTANT et M. KULIFAJ

mercialisables, celles-ci n'apparaissant que très tardivement, jusqu'à 290 jours

aprés leur formation (résultats inédits).

1) Aspect morphologique.

L'ascocarpe adulte (Fig. 1) noir mat et verruqueux, présente une forme

parfois globuleuse (Fig. 1, A), mais le plus souvent oblongue (Fig. 1, B) ou réni-

forme. En vieillissant, il devient fréquemment bosselé, quelquefois méme dif-

forme, du fait, d'une part de l'alternance d'humidification et de dessication

entraînant une irrégularité dans la croissance, et d'autre part des différences de

Fig. 1 — Différents types morphologiques d'ascocarpes. A. Ascocarpe (poids : 4,55 gr) à

grosses écailles pyramidales; B. Ascocarpe (poids : 6,65 gr) à petites écailles pyramidales;

C. Ascocarpe (poids : 8,38 gr) à grandes écailles planes. Échelle : 1 cm.

Fig. 1 — Different morphological ascocarp types. A. Ascocarp (weight : 4,55 gr) with big

Pyramidal scales; B. Ascocarp (weight :6,65 gr) with small pyramidal scales; C. Ascocarp

(weight : 8,38 gr) with large flat scales. Scale : 1 cm.

irce : MNHN, Paris.

L'ASCOCARPE DU TUBER MELANOSPORUM VITT. 177

dureté rencontrées dans le sol oà il se développe. Régulier dans les terrains

meubles, il est beaucoup plus bosselé lorsqu'il rencontre des obstacles (pierres,

racines, etc. A l'état adulte, son diamètre varie de quelques millimètres

à plusieurs centimètres et son poids d’un demi gramme à plusieurs centaines de

grammes.

Son point d’attache sur le mycélium générateur est invisible méme sur les

plus jeunes ascocarpes récoltés (MONTANT & KULIFAJ, 1985), mais la loca-

lisation de sa partie inférieure est néanmoins assez aisée du fait que les écailles

y sont nettement plus petites. Il est recouvert par une enveloppe externe noire

ou péridium, constituée par la juxtaposition de nombreuses écailles (appelées

également pointes, grains, diamants, verrues, etc.).

L'illustration la plus précise des «tubercules» (c'est-à-dire des ascocarpes)

et de leurs «verrues» est celle de CHATIN (1892) qui reconnaît et figure sous

la même espèce T. melanosporum, trois variétés dont deux seulement appar-

tiennent à cette espèce : l’une classique et l’autre à grosses verrues; la troisième

(var. moschatum) a été depuis confondue avec une forme de l'espèce T. brumale.

Peu d'observateurs ont noté ces différences dans la taille des écailles; toutefois,

RUFFIANDIS (1967) distingue des «verrues trés apparentes et aussi très petites

au point que le champignon semble presque lisse». MARCHAND (1971) pense

que la différence dans la taille des écailles est en relation avec la nature du terrain

dans lequel se développent les ascocarpes; ainsi, les «verrues (seraient) fines en

sol meuble, plus grossiéres en sol rocailleux». Certains trufficulteurs affirment

que les truffes à petites écailles se récolteraient sous les chénes verts, et celles

qui ont de grosses écailles apparaîtraient sous les chênes pubescents : actuelle-

ment, aucune observation rigoureuse ne permet de vérifier le bien fondé de ces

dires

L'ensemble de nos observations sur les écailles, rapportées en détail dans la

troisième partie de ce travail, nous a amenés à ranger les divers échantillons dans

trois types morphologiques (Fig. 1) suivant que ces écailles sont grosses et pyra-

midales (A), petites et pyramidales (B) ou grandes et planes (C).

Il faut enfin signaler qu'au cours de nos récoltes, nous avons prélevé, sous un

même chêne à Richerenche (près de Valréas, dans le Vaucluse), et ce régulière-

ment depuis le début de la production, des ascocarpes de T. melanosporum qui

demeurent blancs sans que leur parfum soit apparemment altéré. Il est permis

de penser qu'il s'agit peut-étre d'un cas d'albinisme. Une truffiére située à Mé-

rindol (Vaucluse) produirait également cette variété de Tuber melanosporum.

2) Structure.

Pour présenter la structure de la Truffe, divers auteurs (CHATIN, 1892;

FISCHER, 1897; GHEDUZZI, in CERUTI, tab. 34, 1960) ont donné, à côté

d'un dessin de l'ascocarpe in toto, un autre dessin de la méme Truffe coupée en

deux verticalement; récemment, DELMAS (1983) a illustré la couverture d'un

recueil consacré à la Truffe et sa culture par une trés belle photographie en

couleur de la section verticale d'un ascocarpe.

Source : MNHN, Paris

178 A. PARGUEY-LEDUC, C. MONTANT et M, KULIFAJ

Fig. 2 — Coupes longitudinales des ascocarpes de la figure 1. A. Ascocarpe à grosses écailles

pyramidales; B. Ascocarpe à petites écailles pyramidales (l'ascocarpe a été légérement

entaillé en haut à gauche lors de la récolte); C. Ascocarpe à grandes écailles planes.

Échelle :1 cm

Fig. 2 — Longisections of ascocarps illustrated in the fig. 1. A. Ascocarp with big pyramidal

scales; B. Ascocarp with small pyramidal scales (the ascocarp has been lightly notched,

upper left, when collected); C. Ascocarp with large flat scales. Scale: 1 cm.

Fig. 3 — A. Coupe longitudinale d'un ascocarpe pourvu à sa partie inférieure d'une dépres

sion, vers laquelle convergent quelques veines stériles. Échelle : 3 mm. B. Détail de la

partie périphérique de cet ascocarpe (la fléche indique l'émergence d'une veine stérile

au milieu d’une écaille). Echelle :1,2 mm

Fig. 3 — A. Longisection of an ascocarp with sterile veins converging into a basal hollow.

Scale : 3 mm. B. Peripherical portion of the same ascocarp (arrow shows a sterile vein

opening in the middle of a scale). Scale :1,2 mm

Source : MNHN, Paris

L'ASCOCARPE DU TUBER MELANOSPORUM VITT. 179

MNHN, Paris

180 A. PARGUEY-LEDUC, C. MONTANT et M. KULIFA]J

En coupe, l'ascocarpe entièrement charnu, d'aspect cérébriforme, apparait

formé de deux parties non séparables l'une de l'autre (Fig. 2 et 3, A) :

a) à l'intérieur, occupant la quasi-totalité du volume, une glèbe (ou gleba)

noirviolacé, finement granuleuse, hétérogéne, à aspect marbré dit «Grain de

Poudre» (PAGNOL, 1973). La glèbe est essentiellement constituée par une

partie fertile sombre divisée en secteurs par d’étroites veines claires qui rou-

gissent légèrement à l'air. Rappelons que dans un précédent article (PARGUEY-

LEDUC & al., 1984), nous avons nommé respectivement ces dernières, veines

stériles et les plages fertiles qui épousent leurs sinuosités, veines fertiles, Mais

elles ont reçu divers autres noms; ainsi pour les stériles : externes («venae exter-

nae» de VITTADINI, 1831; FISCHER, 1897; GAÜMANN, 1949), blanches

(MALENGON, 1938) ou claires (MOREAU, 1953), aériféres (DANGEARD,

1895-96; MALENCON, 1938; CHADEFAUD, 1960), pseudo-veines (MAR-

CHAND, 1971) et pour les fertiles : internes («venae internae» de VITTADINI,

1831), fructiféres (DANGEARD, 1895-96), sombres ou obscures (MALENCON,

1938; MOREAU, 1953)

A propos de la disposition des veines stériles, MALENÇON (1938) constate

une «disparition compléte de (leur) convergence» et range en conséquence le

Tuber melanosporum dans son dernier type (n9 5, comprenant également les

Tuber aestivum et brumale). En outre, cet auteur signale que les «veines s'ou-

vrent cà et là sans ordre aucun, à la périphérie de la plante».

Nous avons vérifié ces affirmations : les veines stériles, sinueuses, très rami-

figes et non convergentes, forment un véritable labyrinthe, et se développent

généralement sans direction privilégiée (Fig. 2); mais il demeure parfois une dis-

crête convergence vers une dépression basale centrale (Fig. 3, A). Du fait de la

présence d'un feutrage mycélien dans cette dépression, il s’agit probablement

du point d'attache de l'ascocarpe sur le mycélium générateur, plutôt que du

vestige de la cavité centrale reconnue dans le stade apothécioïde (PARGUEY-

LEDUC & al., 1985). Cette légère convergence des veines stériles permet de

penser que le Tuber melanosporum illustrerait un cas intermédiaire entre le type

n° 5 et le type n° 4 de MALENÇON (1938) où la «convergence basilaire est

plus ou moins atténuée». Quant à l'ouverture des veines sur l'extérieur, nous

avons fréquemment observé des cas où elles se développent effectivement

jusqu'au péridium qu'elles percent (fig. 3, B et 11, À, flèches), entrant ainsi

en contact direct avec l'air. Du fait qu'elles emprisonnent ainsi de l'air, elles

apparaissent sous forme de cordons plus souvent blancs, voire nacrés, que jau-

nátres. De place en place, ces cordons s'élargissent en plages blanches irréguliéres

(Fig. 3, À et B); ceci est dû au fait que les veines stériles sont des boyaux irré-

gulièrement bosselés et non des cylindres réguliers.

Lorsque l'ascocarpe a atteint sa pleine maturité, les veines stériles, de plus

en plus fortement comprimées par la masse croissante des asques (jusqu'à

6.000.000/g !), développés dans les veines fertiles, tendent à s'estomper et elles

apparaissent alors sous forme de cordons étroits grisátres; leur cavité s'est en

effet collapsée, chassant ainsi l'air qui y était contenu.

Les veines fertiles, brun-violet à noir, comblent l'espace situé entre les veines

Source : MNHN, Paris

L'ASCOCARPE DU TUBER MELANOSPORUM VITT. 181

stériles et en épousent par conséquent les sinuosités (Fig. 2 et 3). Du fait de la

multiplication des asques à ascospores brunes (des observations récentes nous

permettent toutefois d'affirmer que les ascospores n’atteignent pas toutes le

méme degré de mélanisation), et également de la mélanisation des parois des

éléments non reproducteurs, ces veines fertiles deviennent de plus en plus

sombres et volumineuses au fur et à mesure du vieillissement de l'ascocarpe; à

un stade de parfaite maturation elles constituent la quasi-totalité de la glébe,

devenue trés noire.

Fig. 4 — Détail de la glèbe (vf, veine fertile bourrée d’asques; уз, veines stériles écrasées).

Échelle : 100 Jm. Coloration : hémoxyline ferrique<osine.

Fig. 4 — Portion of the gleba (vf: fertile vein filled with asci; vs: squashed sterile veins).

Scale : 100 Lm. Coloration : iron-hematoxylin.

MNHN, Paris

L'ASCOCARPE DU TUBER MELANOSPORUM VITT. 183

b) à l'extérieur, formant une enveloppe continue, un péridium mince et

sombre, constitué par les écailles protectrices qui, suivant le groupe morpholo-

gique auquel elles appartiennent, sont plus ou moins proéminentes et séparées

par des sillons soit très profonds (Fig. 2, A), soit au contraire peu accusés (Fig.

2, Bet C).

Sous-jacent au péridium est souvent décrit un tissu de soutien ou hypothé-

cium qui, au cours de l'organogénése, subirait des plissements et serait à l'origine

des veines fertiles contournées. Mais en fait, en se reportant au stade apothé-

cioide (PARGUEY-LEDUC & al., 1985), on constate que ce tissu, de nature

para-plectenchymateuse, est tout-à-fait semblable aux écailles et qu’il correspond

en réalité à la base confluente de celles-ci.

11. — STRUCTURE DES VEINES DE LA GLEBE

Comme nous l'avons vu précédemment (Fig. 2 et 3), la glèbe est formée

(Fig. 4) de veines stériles (vs) er de veines fertiles (vf) contenant les asques.

1. Veines stériles : lorsqu'elles ne sont pas encore trop comprimées, les veines

stériles ont une structure parfaitement caractérisée. CHATIN, dès 1869, les

définit ainsi «d'abord blanchâtres, puis rougeâtres et bordées, sur chaque côté,

par une ligne pellucide». Cet auteur avait ainsi reconnu leurs deux constituants

(Fig. 5) : la ligne pellucide qui entoure complètement la veine correspond à

une palissade de files cellulaires (p) tandis que la veine elle-même est occupée

par un réseau de filaments (f).

Par analogie avec la palissade de filaments stériles observée dans l'hyménium

des Discomycètes typiques, nous les avons qualifiés, après TULASNE & TU-

LASNE (1862) et CHADEFAUD (1960) de «paraphyses» (PARGUEY-LEDUC

& al., 1984). Simples ou bifurquées, elles sont constituées d'une file de cellules

généralement uninucléées, parfois binucléées lorsqu'elles sont sur le point de зе

diviser transversalement. Certaines de leurs cellules distales produisent, dans la

cavité de la veine stérile, des filaments pluricellulaires fins, ramifiés et anastomo-

sés, organisés en un réseau arachnoide (f). MALENCON (1938) note que «l'extré-

mité (des paraphyses) s’allonge démesurément... (pour) constituer un tissu

aérifère blanc qui emplit les espaces de la glèbe». En réalité, il semble plutôt que

les filaments du réseau soient émis par une sorte de bourgeonnement de la cellule

distale des paraphyses. Ces filaments ne sont pas sans rappeler les pseudo-para-

physes anastomosées ou un plexus paraphysoide, mais ils ne peuvent être inter-

prétés comme tels puisque nés secondairement à partir des paraphyses elles-

mêmes. Il s’agit en fait d'une formation trés spécifique, propre aux Tubérales,

Fig. 5 — Détail d'une veine stérile non encore écrasée (f, filaments du réseau arachnoide; m,

mucus; p, paraphyses). Échelle :2 Um. (d’après une micrographie électronique).

Fig. 5 — Part of a not yet squashed sterile vein (f, arachnoid net-work; m, mucus; p, para-

physes). Scale :2 Um. (after an electron micrograph).

Source : MNHN, Paris

184 A. PARGUEY-LEDUC, C. MONTANT et M. KULIFAJ

Source : MNHN, Paris

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Fig. 6 — Détail d'une veine stérile (vs) écrasée entre deux veines fertiles. asg: asgue; sp:

éléments sporophytiques; st: filaments stériles. Échelle : 20 Um, Coloration : hémato-

xyline ferrigue-Eosine.

Fig. 6 — Portion of a sterile vein (vs) squashed between two fertile ones (asq: ascus; sp:

sporophytic apparatus; st: sterile threads). Scale : 20 Um. Coloration : iron hematoxylin.

Fig. 7 — Coupe longitudinale d'une grosse écaille pyramidale montrant en son centre l'émer-

gence d'une veine stérile. Échelle : 50 Um. Coloration : hémato xyline ferrique-éosine.

Fig. 7 — Longitudinal section of a big pyramidal scale, showing the opening of a sterile vein

along its axis. Scale : 50 Um. Coloration : iron hematoxylin.

Source : MNHN, Paris

186

A. PARGUEY-LEDUC, C. MONTANT et M. KULIFAJ

Source : MNHN, Paris

L'ASCOCARPE DU TUBER MELANOSPORUM VITT. 187

et que l’on retrouve essentiellement chez certaines autres espèces de Tuber,

mais également dans la cavité unique des Genea ou dans les cavités multiples

des Pachyphloeus.

Les paraphyses, ainsi que les éléments du réseau arachnoïde, peuvent être

réunis par un voile de mucus (m) (Fig. 5 et 8, B), déjà reconnu par DANGEARD

(1895-96) qui note que «les filaments sont plongés dans une masse gélatineuse

continue».

Comme nous l'avons dit, lorsque l'ascocarpe vieillit, ces veines stériles, de plus

en plus fortement comprimées, tendent à étre écrasées et elles se réduisent alors

à de minces cordons (vs) (Fig. 4 et 6) où le réseau, bien que déformé, est encore

reconnaissable, mais où, par contre, la palissade de paraphyses est devenue

indistincte.

L'extrémité des veines stériles s'interrompt généralement brusquement dans

la partie sous-jacente des écailles, mais, parfois elle s'ouvre sur l'extérieur par un

petit orifice percé au milieu d’une écaille (Fig. 3, B et Fig. 11, A, flèches), plutôt

que dans le fond d’un sillon. La figure 7 illustre ce phénomène : la veine encore

parfaitement reconnaissable avec sa palissade bordante et son tissu arachnoïde

interne, se dirige vers la surface en pergant la partie centrale de l'écaille, entrant

ainsi en contact avec le milieu ambiant. Au niveau du tissu para-plectenchy-

mateux de l'écaille, les différents tissus se confondent par un phénoméne de

convergence de structure : la palissade de paraphyses devient indistincte et le

tissu arachnoide, tout en gardant une orientation parallèle à l'axe de la veine,

prend également un aspect voisin du tissu de l'écaille. Vers l'extérieur, au niveau

du cortex sombre de l'écaille, lui-méme lysé, le tissu arachnoide se désagrège

et tend à disparaître complètement.

Cette disposition des veines stériles est très importante du point de vue phy-

siologique, car elle permet aux paraphyses, bien que situées à l'intérieur méme

de l'ascocarpe, d'étre en contact avec l'air ambiant au méme titre que celles des

apothécies des Discomycètes typiques,

Une conséquence de cette ouverture sur l'extérieur est la présence fréquente

de bactéries qui envahissent les mailles du réseau arachnoide (Fig. 8, A), mais

sans toutefois pénétrer à l'intérieur des cellules : elles demeurent en effet

nettement localisées à l'extérieur, très souvent retenues dans des poches creusées

dans le mucus (m) (Fig. 8, B). Ces bactéries ne sont pas connues; au laboratoire,

nous les avons vu proliférer si on ensemence (en vue d'obtenir un mycélium)

un fragment d'ascocarpe jeune sur milieu stérile; inversement, un fragment de

truffe müre ensemencé n'entraine pas forcément la formation de colonie

bactérienne. Malgré nos recherches sur la formation de l'aróme nous ne sommes

Fig. 8 — A. Veine stérile envahie par les Bacteries. Échelle : 2 um. B. Détail d'une poche

creusée dans le mucus (m) et contenant des Bactéries. Échelle : 0,5 Um.

Fig. 8 — A. Bacteria invading a sterile vein, Scale : 2 Hm. B. Bacteria in a mucous pocket

(detail). Scale :0,5 Um.

Source : MNHN., Paris

188 À. PARGUEY-LEDUC, C. MONTANT et M. KULIFAJ

pas encore en mesure de dire si la maturation correspond au début de la putré-

faction et si, d'autre part, les bactéries (et les moisissures) qui se manifestent

au cours de la putréfaction (mais qui ne détruisent pas les ascospores) sont les

mêmes que celles qui sont présentes dans le jeune ascocarpe.

2. Veines fertiles : ces veines fertiles (Fig. 6) sont composées de filaments

stériles entremélés (4), d'éléments sporophytiques (sp) et d’asques (asq); ces

trois types d'éléments apparaissent très clairement sur des coupes semi-fines

pratiquées à l’ultramicrotome et colorées à la pyronine (Fig. 9). Les filaments

stériles fins n'ont aucune orientation privilégiée et sont ainsi coupés longitudi-

nalement, transversalement ou obliquement. Ils forment un réseau lâche dont les

mailles sont occupées par les cellules de l'appareil sporophytique, beaucoup

plus volumineuses, et trés chromophiles.

Primitivement situé dans la partie axiale du réseau, l'appareil sporophytique

se développe ensuite jusque dans la zone sous-jacente aux paraphyses, puis, dans

les ascocarpes totalement mûrs, il envahit en outre la zone située à la base des

AA As LOTO UE

Fig. 9 — Détail d’une veine fertile : outre les filaments de bourrage stériles (st), sont visibles

les éléments de l'appareil sporophytique (sp) et les asques à tous stades de développe-

ment (1 à 5, stades successifs). Échelle : 10 Um. Coloration à la pyronine.

Fig. 9 — Portion of a fertile vein within embedding threads (st) sporophytic apparatus (sp)

and asci at different stages of development (successively 1 to 5) are visible. Scale : 10 Um.

Coloration : pyronine.

Source ; MNHN, Paris

L'ASCOCARPE DU TUBER MELANOSPORUM VITT. 189

écailles. L'apparition des asques progresse suivant la même voie : d'abord situés

au milieu du réseau, ils occupent ensuite la totalité de la zone fertile, puis la

périphérie de la glèbe où on peut même les retrouver jusque dans le cortex

des écailles (a, Fig. 14). L'appareil sporophytique produisant les asques progressi-

vement, on peut observer simultanément, sur une même coupe, tous leurs stades

de développement (Fig. 9). Le plus jeune (1), encore rattaché à son hyphe

ascogène génératrice, contient du glycogène, des vacuoles et des globules lipi-

diques. Au stade suivant (2), les asques présentent une stratification marquée

de leurs constituants comme c'est la régle générale chez les Tuber (JANEX-

FAVRE & PARGUEY-LEDUC, 1976; PARGUEY-LEDUC & JANEX-FAVRE,

1977, 1981; BERTA & FUSCONI, 1983) : alors que le glycogène occupe la

volumineuse zone inférieure, les vacuoles, devenues nombreuses et contenant

toutes une masse globuleuse chromophile, sont groupées dans la partie sommi-

tale de l’asque où elles entourent un ou plusieurs noyaux. Le stade 3 permet de

suivre l'évolution des ascospores (de une à quatre dans chaque asque) que nous

ne rappellerons pas ici, ces observations ayant fait l'objet d'une publication

récente (PARGUEY-LEDUC & al., 1987). Les ascospores sont alors regroupées

au centre de l'asque et entourées par le sac post-sporal, particulièrement bien

mis en évidence, ainsi que les globules qui y sont rattachés, par la pyronine.

Puis apparaît l'ornementation sporale (4) tandis que le sac post-sporal tend à

s'estomper. Au stade adulte (5), ce dernier a complètement disparu et les asco-

spores, devenues très volumineuses, brunes et nettement échinulées, occupent

la quasi totalité de l'asque.

III. — DIFFÉRENTS TYPES D'ÉCAILLES

Les centaines d'écailles noires constituant le péridium adulte ont une base

polygonale et sont toujours pyramidales, au moins dans les 2/3 inférieurs. Elles

ont généralement 5 ou 6 pans convexes séparés par des bourrelets cannelés et

leur sommet, contrairement à ce gu'indigue MALENGON (1938) dans sa clé

dichotomique, est fréquemment déprimé (Fig. 10 et 12, A). Certaines d’entre

elles, en principe les plus grosses, sont traversées par de profondes fentes verti-

cales passant par le centre du sommet; elles indiquent le début d’une scission

longitudinale qui aboutira a leur dédoublement. Cette division active des écailles

permet au péridium de demeurer continu malgré le fort accroissement en volume

de la glébe.

Comme nous l'avons dit précédemment, trois types morphologiques d'écailles

peuvent étre reconnus :

a) grosses écailles pyramidales : c'est le cas de celles qui recouvrent l'asco-

carpe photographié sur la figure 1, A. Elles sont volumineuses, de 2 à 3 mm de

largeur en général (Fig. 10, A), mais pouvant atteindre 4 mm (Fig. 10, B) et sont

séparées par de profonds sillons. La base des écailles est parfois pentagonale,

plus généralement hexagonale. Le sommet de la pyramide est souvent déprimé

et forme un cratère dont le centre est lui-même creusé en une petite cuvette

Source . MNHN. Paris

190 A. PARGUEY-LEDUC, C. MONTANT et M. KULIFAJ

Fig. 10 — A et B. Grosses écailles pyramidales, Echelle :1 mm.

Fig. 10 — A and B. Big pyramidal scales. Scale :1 mm.

ou viennent se terminer les bourrelets délimitant les pans (Fig. 10, B). Sur cer-

taines écailles sont visibles les fentes de division dont les lvres tendent à s'écar-

Source : MNHN. Paris

L'ASCOCARPE DU TUBER MELANOSPORUM VITT. 191

ter, séparant ainsi les deux nouvelles écailles qui se reconstitueront ensuite

indépendamment : deux couples d’écailles ainsi divisées sont figurés en 10 A

(H et +).

En coupe (Fig. 7 et 11), apparaissent nettement les profonds sillons qui sé-

parent ces grosses écailles les unes des autres; la forme de ces dernières est soit

triangulaire (Fig. 11, A), soit plus ou moins hémisphérique (Fig. 11, B).

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® О ® i Oed m un ds 152

Fig. 11 — A et B. Coupes longitudinales de grosses écailles pyramidales (la flèche indique

l'émergence d’une double veine stérile). Échelle : 0,50 Um.

Fig. 11 — A and B. Longisections of big pyramidal scales (the arrow indicates the opening

of a double sterile vein). Scale : 0,50 im.

Source : MNHN, Paris

Fig. 12 — А. Petites écailles pyramidales à sommet déprimé, — B. Petites écailles pyrami-

dales à sommet non déprimé — C. Grandes écailles planes. Echelle :1 mm.

Fig. 12 — A, Small pyramidal scales with hollowe

d tops. — B. Small pyramidal scales with

flat tops. — C. Large flat scales. Scale : 1 mm,

Source : MNHN, Paris

L'ASCOCARPE DU TUBER MELANOSPORUM VITT. 193

b) petites écailles pyramidales : ce sont elles qui constituent le péridium de

l'ascocarpe photographié sur la figure 1, B. Leur forme est tout à fait semblable

à celle des grosses écailles pyramidales, mais leur taille est nettement inférieure,

atteignant rarement plus d’1 mm 1/2 de largeur. Elles ont généralement une

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Fig. 13 — A. Coupe longitudinale de petites écailles pyramidales. — B. Coupe longitudinale

de grandes écailles planes. — C. Coupe longitudinale d'écailles intermédiaires entre les

deux types précédents. Échelle :0,50 Jm.

Fig. 13 — A. Longisection of small pyramidal scales. — B. Longisection of big flat scales. —

C. Longisection of scales intermediate between the two previous types. Scale : 0,50 Him.

Source : MNHN, Paris

Fig. 14 — Coupe longitudinale

d’une écaille plane (а : asque

logé dans le cortex; vs :

extrémité d'une veine sté-

rile), Échelle : 50 4m. Colo-

ration : hématoxyline fer-

rigue-Eosine.

Fig. 14 — Longisection of a

flat scale (a :ascus set in the

cortex; vs : tip of a sterile

vein). Scale : 50 Um, Colo-

ration : iron hematoxylin.

Source : MNHN, Paris

L'ASCOCARPE DU TUBER MELANOSPORUM VITT. 195

forme de pyramide surbaissée à 5 ou 6 pans, délimités par de minces bourrelets :

leur sommet peut étre déprimé en une petite cuvette (Fig. 12, A), ou arrondi

(Fig. 12, B). En coupe (Fig. 13, A), ces écailles, séparées par des sillons assez

profonds, sont plus ou moins triangulaires, mais souvent asymétriques; sur

Pune d'elles est visible la cuvette sommitale.

Ces écailles pyramidales, qu'elles soient petites ou grosses, donnent au péri-

dium, du fait de leur séparation par de profonds sillons, un aspect grossier et

rugueux.

c) grandes écailles planes : elles sont visibles sur l'ascocarpe photographié

sur la figure 1, C. Souvent groupées en larges plaques pouvant atteindre 1/2 cm,

elles sont séparées les unes des autres par des sillons peu accusés. Leur forme,

quoiqu’encore pyramidale à la base, est beaucoup moins régulière que dans les

types précédents : les pans sont de taille très variable et les arêtes les séparant

peu accusées (Fig. 12, C). De plus, leur partie supérieure, au lieu d’être déprimée

ou pointue, est typiquement tabulaire : cette surface sans grand relief donne à

l'ascocarpe un aspect «lisse». Ces caractères se retrouvent très nettement sur les

coupes verticales (Fig. 13, B et 14).

Entre les petites écailles pyramidales et les écailles planes existent des cas in-

termédiaires dont l'un d'eux est représenté en coupe verticale (Fig. 13, C); les

écailles, planes et de taille moyenne, sont séparées par des sillons relativement

profonds.

Toutes ces écailles, quel que soit leur type morphologique, présentent une

structure tout-à-fait semblable (Fig. 7 et 14) : leur partie interne est de nature

prosenchymateuse mais passe progressivement à une nature para-plectenchyma-

teuse, lorsqu'on se rapproche de la périphérie, et devient même franchement

parenchymateuse en surface. Les parois cellulaires s'épaississent et se mélanisent

progressivement du centre vers l'extérieur, ce qui aboutit à la réalisation d'un

cortex compact et très sombre où ne sont plus visibles que de rares lumières

cellulaires.

CONCLUSIONS

Les caractères originaux des asques et de l'ascosporogénése chez les Truffes

(JANEX-FAVRE & PARGUEY-LEDUC, 1976, 1980, 1983; PARGUEY-LEDUC

& JANEX-FAVRE, 1977, 1981; BERTA & FUSCONI, 1983; PARGUEY-

LEDUC & al., 1987), nous avaient déjà permis de justifier la position marginale

des Tubérales dans la systématique des Ascomycétes. Celle-ci est encore confir-

mée par les caractères très particuliers de l’ascocarpe tel que nous venons de le

décrire chez le Tuber melanosporum, dont certains sont tout à fait aberrants

par rapport à ceux de l’apothécie des Discomycètes typiques. Ainsi :

— la position hypogée a entrafné des modifications morphologiques et ana-

tomiques. Les ascocarpes, plus ou moins globuleux, sont, comme l'a indiqué

CHADEFAUD (1960), pratiquement périsporiós, c'est-à-dire dépourvus d'os-

Source : MNHN, Paris

196 A. PARGUEY-LEDUC, C. MONTANT et M. KULIFAJ

tole, les ascospores étant libérées seulement à la suite de sa putréfaction. Mais

les Tubérales ne sont toutefois pas de véritables Périsporiés car les ascocarpes,

ouverts lorsqu'il sont jeunes (PARGUEY-LEDUC & al., 1985), пе sont pas

totalement clos lorsqu'ils sont adultes : en effet, quelques veines stériles aérifères

S'ouvrent encore vers l'extérieur par de petits orifices secondaires.

— l'organisation de l'ascocarpe est trés originale : au lieu de comporter un

hyménium porté par une cupule stérile, il est ici constitué par une enveloppe

écailleuse (ou péridium) et une volumineuse masse interne fertile (ou glébe),

sans polarité nette. Les asques étant toutefois strictement losalisés au sein des

veines fertiles (délimitées par les veines stériles), il ne s'agit pas de Périsporiés

Plectascales chez lesquelles les asques sont toujours disposés sans ordre défini.

— chez les espèces évoluées, telles que les Tuber, il n'y a pas de véritable

«hymõnium», au sens où on l'entend généralement, c'est-à-dire typiquement

constitué par une palissade de paraphyses et d'asques; d'une part, les paraphyses

bordant les veines stériles sont atypiques puisqu'elles produisent à leur extrémité

des hyphes formant un réseau; d'autre part, elles sont dissociées des asques,

ceux-ci se localisant au sein même des veines fertiles,

En ce qui concerne les différentes formations de l'ascocarpe notre étude a

permis de préciser certains points :

— l'enveloppe est um véritable péridium et non pas un pseudo-péridium,

comme l'avaient pensé CHADEFAUD (1960), puis nous-même (PARGUEY-

LEDUC & al., 1984), avant d’avoir observé le stade apothécioide (PARGUEY-

LEDUC & al., 1985) de l'ascocarpe. En effet, celuici nous à montré que les

écailles sont précocement et parfaitement individualisces, formant déjà, à ce

stade, un péridium continu, bien défini. Par la suite, ce dernier, au lieu d'être

caduc, s'accroît au contraire au fur et à mesure de l'augmentation de volume

de la glèbe : 1 пе se différencie donc pas secondairement, en remplacement,

de pseudo-péridium.

— le terme d'hypothécium regroupant, comme nous l'avons vu, à la fois les

bases coalescentes des écailles et le tissu fertile contourné — ce qui ne constitue

pas une formation homogène — n'a pas été conservé.

— la communication des veines stériles avec l'extérieur, bien qu'exception-

nelle, fait de la Truffe un organe ouvert sur le milieu ambiant. Cela a plusieurs

conséquences : d'une part elles ne sont pas véritablement stériles et hébergent

fréquemment des bactéries, comme nous l'avons vu précédemment ; d'autre part,

les ascocarpes peuvent s'affranchir précocement du mycélium générateur (qui

пе serait indispensable qu'au stade des primordiums, et encore), puisque la mise

en contact permanent avec l'extérieur contribue probablement à donner a la

Truffe son autonomie métabolique (elle est en particulier toujours le siége

d'échanges respiratoires intenses (RULIFAJ, 1984). Cela peut sembler en contra.

diction avec l'affaiblissement observé chez certains arbres truffiers (notons

toutefois que les meilleurs d'entre eux présentent au contraire un excellent

développement), et celui des plantes situées sous couvert (phénomène du «brû-

lé»). Des auteurs italiens (FJUSELLO & BONFANTE, 1975; LUPPI MOSCA &

Source : MNHN. Paris

L'ASCOCARPE DU TUBER MELANOSPORUM VITT. 197

FONTANA, 1977; MONTACCHINI 8: CARAMIELLO LOMAGNO, 1977;

MONTACCHINI & al., 1977; PAPA & al., 1978-79) ont émis l'hypothése que

certaines molécules (hormones, coumarines,..) pouvaient expliquer la destruc-

tion des herbes à l'emplacement d'une truffiére, mais il existe des brülés sur les-

quels on n'a jamais trouvé de Truffes et, inversement, on a récolté des Truffes

sur des portions de terrain enherbées, Par ailleurs, si on ajoute un fertilisant

adapté sur une truffière, on voit apparaître une végétation herbacée importante

et... des Truffes. Dans cette autonomie métabolique, on peut supposer que ce

sont les éléments qui sont en contact avec l'atmosphère des veines aérifères

et de ce fait également avec l'atmosphère extérieure, c'est-à-dire les paraphyses

et leur réseau arachnoïde, qui jouent un rôle essentiel : on observe en effet, dans

leurs cellules, de remarquables empilements de réticulum endoplasmique qui

n'ont pas été retrouvés dans les autres cellules de l'ascocarpe et qui attestent

une forte activité métabolique. Il semblerait donc que les paraphyses aient

perdu leur rôle primaire protecteur (tel qu'il existe chez les Discomycètes

typiques) au profit d'un rôle secondaire métabolique. Mais si cette hypothèse

est envisageable, aprés simples observations cytologiques, par contre, elle n'a pu

être confortée par les expérimentations physiologiques; nous sommes, en effet,

incapables d'attribuer un rôle métabolique quelconque et, à fortiori, un rôle

dans le grossissement, à une partie spécifique de l'ascocarpe.

Les caractéres aussi particuliers des Tubérales posent véritablement un pro-

bléme quant à la position systématique de cet ordre. Certes, si l'on ne considère

que l'ascocarpe, la filiation décrite par MALENÇON (1938), puis reprise par

divers auteurs (GAÜMANN, 1949; MOREAU, 1953; CHADEFAUD, 1960;

RUFFIANDIS, 1967; DELMAS, 1979) est très séduisante et l’on passe effecti-

vement facilement, par l'intermédiaire de divers genres, de l'apothécie typique

des Pézizales à l'ascocarpe aberrant des Tuber et du Tuber melanosporum en

particulier. KORF (1973) pense également que Pézizales et Tubérales sont trés

proches et que les premières deviennent des Truffes par perte de l'opercule

fonctionnel. Plus récemment, d'autres auteurs (TRAPPE, 1979; DONADINI,

1983) proposent méme de rattacher l'ensemble des Tubérales aux Pézizales. Si

ce point de vue est envisageable pour les genres qui possédent un hyménium

encore typique (paraphyses étroitement associées à des asques cylindriques

octosporés), il est beaucoup plus difficile à concevoir pour les Tuber (et égale-

ment les Terfezia qui leur sont proches, PARGUEY-LEDUC & al., en voie de

publication) dont les caractères sont beaucoup plus aberrants (hyménium aty-

pique avec dissociation des asques et paraphyses chez les Tuber et même dispa-

rition des paraphyses chez les Terfezia, originalité de l'ascosporogénése, etc... .).

Nous pensons plutôt, comme le résume le schéma, que ces deux ordres, issus

vraisemblablement d'un ancétre commun à apothécie semi-immergée, simple

et trés refermée sur elle-même, représenteraient deux phylums distincts qui

auraient évolué très différemment. Les Pézizales auraient peu évolué : l'apothé-

cie, devenue aérienne, s'ouvre progressivement au cours de la maturation et

lhyménium s'étale à la partie supérieure régulière de la cupule. Chez les plus

primitives des Tubérales (ex. Genea), l'apothécie, souterraine, demeure refermée

Source : MNHN., Paris

A. PARGUEY-LEDUC, C. MONTANT et M. KULIFAJ

198

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Source : MNHN, Paris

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L'ASCOCARPE DU TUBER MELANOSPORUM VITT. 199

sur elle-méme (mais la cavité centrale se trouve néanmoins en communication

avec l'extérieur par un large orifice qui persiste à l'état adulte) et l'hyménium

tapisse les replis internes. Chez les Tubérales évoluées (ex. Tuber melanospo-

rum), l'apothécie, également souterraine, passe par un stade apothécioide

(PARGUEY-LEDUC & al., 1985), trés semblable à l'apothécie du Geriea, mais

ce stade est transitoire; rapidement l'orifice supérieur disparaît et l'hyménium

(dissocié), épousant les veines stériles, vestiges de la cavité centrale, devient

trés contourné.

Il faut noter que dans la filiation que nous venons de rapporter, nous n'avons

pas fait apparaitre, pour le T. melanosporum, le retournement de l'apothécie

figuré par MALENÇON (1938) chez diverses autres espèces de Tuber. En effet,

le jeune stade apothécioïde indique que cette espèce appartient au groupe des

«Superae» plutôt qu’à celui des «Inferae».

Quant à sa position au sein des Tubérales, le Tuber melanosporum semble

représenter un stade déjà très évolué, puisque :

l'orifice primaire a disparu et les orifices secondaires sont petits et peu

nombreux, les veines ne s'ouvrant que rarement à l'extérieur;

— l'hyménium est atypique, paraphyses et asques étant trés nettement disso-

ciés, contrairement à ce qui est observé chez des Tubérales plus primitives,

tels le Genea ou l'Hydnocystis;

— les veines stériles sont encore parfaitement indivisualisées, mais elles sont

étroites et, de plus, trés encombrées par le réseau arachnoide différencié

à partir des paraphyses.

Mais si le stade évolutif du Tuber melanosporum est trés avancé, il n'est

toutefois pas terminal car l'ascocarpe serait alors composé d'une simple enve-

loppe réduite et d'une glébe entiérement fertile, les veines stériles ayant été tota-

lement comblées par le réseau, ou même ne se différenciant plus du tout.

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ÉVALUATION DE L'EFFICACITÉ

DE CERTAINS CHAMPIGNONS ANTAGONISTES

VIS-A-VIS DE VERTICILLIUM DAHLIAE KLEBAHN.

par Jamel Eddine HENNI*

RÉSUMÉ — La germination des microsclérotes de Verticillium dahliae Kleb. est inhibée

par les substances émises par Trichoderma harzianum et Penicillium griseo-fulvum.

SUMMARY — The germination of microsclerotes of Verticillium dahliae Kleb. is inhibited

by substances secreted by Trichoderma harzianum and by Penicillium griseo-fulvum.

MOTS CLÉS : Verticillium dahliae Kleb., microsclérotes, filtrats, Trichederma harzianum,

Penicillium griseo-fulvum ,antagonisme, Aubergine.

L'activité biologique des antogonistes vis-a-vis du Verticillium dahliae Kleb.

peut s’exprimer par une action destructrice ou inhibitrice de la germination des

microsclérotes. La présente étude a pour but de tester les substances émises

par 4 champignons antagonistes sur le V, dahliae inoculé à des plants d'auber-

gines.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Plante-hóte

Le matériel végétal choisi est Aubergine, un des hôtes préférentiels du V.

dahliae, variété «Violette longue de Barbentane» connue pour sa grande sensi-

bilité vis-à-vis de ce parasite (VIGOUROUX & MOLOT, 1975). Cette plante

présente des symptómes trés caractéristiques de la maladie lorsqu'elle est atta-

quée par V. dahliae (ARNOUX & MESSIAEN, 1960).

Les semis des plantes est réalisé par le dépót, dans chaque pot, de 2 à 3

graines à 1 cm de profondeur; aprés la germination des graines, une seule plante

est conservée par pot.

* Institut de Biologie, Université d'Oran, Algérie.

Source : MNHN, Paris

204 J.E. HENNI

Ces plantes sont cultivées en serre à une température moyenne de 26°C le

jour et 19°C la nuit; l'humidité relative moyenne de l'atmosphère est de 60 75;

l'humidité du sol est maintenue par un arrosage des plantes tous les 3 jours

avec de l’eau de ville.

Recherche de la quantité optimale d'inoculum

Cette expérimentation est conduite avec des concentrations d'environ 5.10*,

10? et 5.10? microsclérotes par pot.

— Inoculation : les inoculations sont réalisées par le dépót de 1 ml d'une sus-

pension de microsclérotes au niveau du collet des plantes, préalablement dé-

chaussées. Bien que le parasite ait l'aptitude à pénétrer naturellement dans

l'hôte ce déchaussement provoque des blessures racinaires qui augmentent le

nombre de portes de pénétration (VIGOUROUX & CASTELAIN, 1966).

Les inoculations sont effectuées lorsque les plantes présentent 4 à 5 feuilles

(plantes âgées de 4 semaines environ). Chaque essai est réalisé sur 30 plantes.

— Réisolement du parasite : l'estimation du taux d'attaque est faite 4 se-

maines aprés l'inoculation des plantes en déterminant celles qui hébergent le

parasite. Le champignon est recherché au niveau de l’hypocotyle: pour cela,

cet organe est prélevé et déposé à la surface d'un milieu amidon gélosé addition-

né d'antibiotiques (1g/l d'hydromycine + 1g/l de spécilline), après avoir été

préalablement désinfecté par immersion pendant 30 secondes dans l'alcool à

90° et passage sur une flamme.

La lecture des résultats est effectuée au bout d'une semaine d'incubation à

26^C. Nous notons comme atteintes par le parasite les plantes qui ont donné

naissance à un thalle de V, dahliae.

Tableau I

Quantité de microsclérotes par plante Nombre de plantes attaquées (30)

5.10? 23

1. 103 26

5. 103 28

D'aprés les résultats présentés dans le tableau 1, il apparait que le nombre

de plantes atteintes est fonction de la concentration de l'inoculum. Pour nos

essais, nous retiendrons donc la dose maximale de 5.10? microsclérotes par ml.

Champignons antagonistes utilisés

Il ont été choisis en fonction des travaux effectués par certains auteurs et

appartiennent aux espéces suivantes : Trichoderma hamatum et Trichoderma

harzianum, selon DENNIS & WEBSTER (1971); Penicillium griseo-fulvum,

d'aprés NEWTON (1965) et Gliocladium virens, d’aprés WEBSTER & LOMAS

(1964).

Source : MNHN, Paris

CHAMPIGNONS ANTAGONISTES VIS-A-VIS DE V. DAHLIAE 205

Tests in vitro

Nous nous sommes limités à l'étude d'un seul type d'action des antagonistes :

l'émission de substances inhibitrices de la germination des microsclérotes dans

le milieu de culture. Pour ce faire, nous avons mis en ceuvre deux approches.

— Méthode des filtrats de culture : une bouture mycélienne prélevée dans la

zone de croissance d'une culture de l'antagoniste est déposée dans une fiole

de Roux contenant 150 ml de milieu liquide à 2 % d’extrait de malt. Ces fioles

sont mises à incuber pendant 3 semaines à l'obscurité, à 26°C (CATANI & PE-

TERSON, 1966; WILSON & PORTER, 1957). Après ce délai, le mycélium est

séparé du milieu de culture par centrifugation à 4000 tours/mn pendant 30 mn,

puis le surnageant est filtré sur filtre millipore 0,22 y. Ces filtrats sont ensuite

incorporés à un milieu amidon gélosé, maintenu à 40-45°C après autoclavage,

avant d’être réparti dans les boîtes de Pétri. Ces mélanges se font dans des pro-

portions 1:1.

— Méthode de double couche : cette méthode, inspirée de FREDERICK &

LEVINE (1947), permet de savoir si l'action des substances inhibitrices est

fongicide ou fongistatique sur les microsclérotes. Pour ce faire, le champignon

antagoniste est mis en culture sur milieu gélosé à 2 % d'extrait de malt, à 26°C.

Aprés 7 jours de développement, la culture est tuée par l’adjonction de 1 ml de

chloroforme pur. Au bout d'une semaine, quand le chloroforme s'est compléte-

ment évaporé, on place sur ces cultures des feuilles de cellophane sur lesquelles

des microsclérotes de V. daliliae ont été déposées. Dans le cas où une inhibition

de la germination est constatée, on transfère la cellophane sur milieu amidon

gélosé. La lecture des résultats est faite après 48 h d’incubation a 26°C.

Adjonction de la substance antagoniste

Ce travail n'est entrepris qu'avec les champignons ayant bloqué la germination

des microsclérotes in vitro, Nous avons retenu deux protocoles, inspirés des

travaux de WILSON & PORTER (1957), ISAAC (1954) et DAVET & al. (1981).

Le premier consiste à traiter les plantes-hôtes avec 25 ml du filtrat de culture

obtenu comme nous l'avons exposé plus haut. Le traitement réside en un arrosage

des pots avec le filtrat simultanément à la contamination et une semaine avant

l'inoculation des plantes par les microsclérotes.

Le deuxième consiste à contaminer les plantes-hôtes par une suspension de

conidies de l'antagoniste. La contamination s'effectue par le dépôt de 1 ml de

suspension titrant 4.10% conidies, à 1cm de profondeur au pied de chaque

plante, une semaine avant l'inoculation de la plante par les microsclérotes.

Cette période permettra aux conidies de l'agent antagoniste de se développer

et de secreter les substances inhibitrices, Chaque essai comporte (4) lots, de 30

plantes chacun : — témoin non inoculé non traité,

— témoin inoculé non traité,

— témoin non inoculé traité,

— plantes inoculées et traitées.

Source ` MNHN. Paris

206 J.E. HENNI

RÉSULTATS

Tests in vitro

Les résultats permettent de constater que :

— la germination des microsclérotes de V. dahliae n'est pas affectée par les

filtrats de culture de Gliocladium virens et Trichoderma hamatum. En effet, le

taux de germination des microsclérotes sur ces milieux est respectivement de

91,8 et 94,1 %.

— La germination des microsclérotes est nulle sur un milieu de culture con-

tenant des substances émises par T. harzianum et P. griseo-fulvum.

D'autre part, les expériences de transfert indiquent que P. griseo-fulvum a

une action léthale sur les microsclérotes puisqu'aucun n’a germé après leurs

reports sur le milieu amidon gélosé. En revanche, l'action de T. harzianum est

réversible : 80,4 75 des microsclérotes germent aprés leurs transferts sur le milieu

amidon gélosé.

Tests sur les plantes-hôtes

Ces tests ont été réalisés avec T. harzianum et P. griseo-fulvum, et les résultats

obtenus sont les suivants :

— Effets des filtrats sur les plantes : l'aspect extérieur des plantes témoins

traitées avec les filtrats ou contaminées par les conidies des antagonistes ne

révèle aucune altération particulière par rapport aux plantes témoins non trai-

tées.

— Effets préventifs des filtrats de culture de P. griseo-fulvum et de T. bar-

aianum :

а) Adjonction des filtrats une semaine avant l'inoculation des plantes par des

microsclérotes : l'examen des résultats permet de constater que l'activité pré-

ventive des deux filtrats se manifeste pleinement vis-à-vis des microsclérotes, et

que la stabilité de leurs produits actifs dans le sol présente une bonne persistance

puisque le nombre de plantes infectées est nul aprés action des filtrats issus

d'une culture de P. griseo-fulvum et n'atteint que 4 plantes chez ceux traités

par les filtrats de T. harzianum.

b) Adjonction des filtrats simultanément à la contamination des plantes par

les microsclérotes : les filtrats issus des cultures de D. griseo-fulvum et de T.

harzianum font apparaître une action efficace vis-à-vis des microsclérotes. Le

nombre de plantes attaquées est respectivement de 3 et 0.

— Effets préventifs des conidies de T. barzianum et de P. griseo-fulvum :

L'apport de T. harzianum ne se traduit par aucune action préventive contre

l'infection des plantes par des microsclérotes, puisque le nombre de plantes

infectées par les microsclérotes atteint 23.

Il en est de méme pour P. griseo-fulvum puisque le nombre de plantes atta-

quées (15) ne diffère pas significativement du témoin (28).

Source : MNHN, Paris

CHAMPIGNONS ANTAGONISTES VIS-A-VIS DE V. DAHLIAE 207

Toutefois l'activité des micro-organismes antagonistes dépend des conditions

environnementales (TRONSMO & DENNIS, 1978; TU, 1979) et il est possible

que, dans les conditions utilisées, nous n’ayons pas pu les révéler.

CONCLUSION

La germination des microsclérotes du V. dahliae peut être inhibée pas des

substances émises par P. griseo-fuleum ou de T. harzianum. En effet, ces sub-

stances permettent une protection des plantes contre leur infection par les

microsclérotes du parasites.

Cette étude permet d'envisager une action complémentaire à la lutte chimi-

que étant donné la stabilité de l'antagoniste à long terme par équilibre bio-

logique.

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CONTROLE MORPHOGÉNÉTIQUE DE LA DIFFÉRENCIATION

DES SCLÉROTES DE SCLEROTINIA FRUCTIGENA :

I - ÉTUDES PHYSIOLOGIQUES

par L. NAJIM*

RÉSUMÉ. — Deux milieux de culture, le MCA (malt, casamino-acides) et le milieu synthé-

tique dit de Vogel, qui permettent une croissance végétative presque similaire, ont été uti-

lisés pour induire la morphogenése des sclérotes de Sclerotinia fructigena (Ader. et Ruhl.)

dans des conditions de croissance normale ou a la suite de variations de facteurs physiques

tels que la lumiére et la température. Le milieu MCA est plus favorable pour la différencia-

tion des sclérotes que le milieu synthétique de Vogel.

Par ailleurs, un régime photopériodique de 12 h de lumiére et de 12 h d'obscurité par jour

affecte peu la différenciation des sclérotes : cependant, une lumière continue exerce une

forte action inhibitrice sur leur morphogenèse. Par contre, l'obscurité totale augmente d'une

manière sensible le poids de sclérotes par boite de Pétri. De plus, le transfert des cultures

d'une température à une autre («shift-down») a permis de contrôler l'induction, la diffé-

renciation et la maturation des sclérotes.

SUMMARY. — Two culture media, the MCA (Malt, casamino-acids) and the so called Vogel

synthetic one which allowed a similar vegetative growth, were used to induce sclerotia

in Sclerotinia fructigena (Ader. and Ruhl.) in normal conditions of growth, orafter varia-

tions of physical factors such as light and temperature. The MCA medium, is however more

favorable than the synthetic one for sclerotia production.

A photoperiodical regime of 12h of light and 12h of darkness each day does not affect

much sclerotia differentiation : on the other hand, continuous light has a strong inhibitory

effect on sclerotia morphogenesis. By opposition, darkness leads to a sensible increase

in the sclerotia weight per Petri dish. Furthermore, the transfer of culture from one tempe-

rature to another with a «shift-down» allowed us to control induction, differentiation and

maturation of sclerotia.

MOTS CLÉS : Sclerotinia fructigena, sclérotes, physiologie, différenciation, milieux de

culture, facteurs physiques

INTRODUCTION

Le Sclerotinia fructigena est un champignon pathogène agent de la moniliose

pour un certain nombre de plantes de la famille des Rosacées à pépins et à

* Laboratoire de Cryptogamie, Faculté des Sciences de Rabat, Avenue Ibn Batota, B.P.

1014, Rabat, Maroc.

Source : MNHN. Paris

210 L. NAJIM

noyaux, Ce champignon différencie trois types de fructifications : les macro-

conidies, les microconidies et les sclérotes.

Les sclérotes sont les organes de développernent qui assurent la pérennité de

cette espéce. Dans la nature, les sclérotes se forment sous l'épiderme des fruits

parasités en voie de «momification».

En culture sur milieu gélosé, les sclérotes sont tubéroïdes ou sphériques et

de taille variable; ils se développent soit en surface soit dans le substratum.

Les études concernant l'influence du milieu nutritif et des facteurs physiques

sur la différenciation des sclérotes sont peu nombreuses (TREVETHICK &

COOKE, 1971; WANG & LE TOURNEAU, 1972; OKON & al., 1972; MOORE

& JIRJIS, 1976; ZOBERI, 1980), et particulièrement celles se rapportant au

Sclerotinia fructigena (BYRDE & WILLETTS, 1977). Cependant, ces facteurs

ont été étudiés soit séparément soit de manière combinée afin de déterminer

la physiologie et le potentiel de production des sclérotes de cette espèce.

Cette étude porte sur le contrôle de la morphogenése des sclérotes en utilisant

les facteurs trophiques et physiques les plus importants, tels que la lumière et

la température.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Souche et méthodes culturales

La souche de Sclerotina fructigena (Ader. & Ruhl) (ou Monilinia fructigena

selon Honey) a été isolée d'une pomme momifiée. Cette souche a été maintenue

en culture sur du malt gélosé à 2 %. Deux milieux de culture ont été utilisés

pour l'expérimentation : un milieu «naturel» enrichi (semi-synthétique) et un

milieu synthétique. Le milieu semi-synthétique est composé d'un extrait de malt

à 2% avec de la gélose à 2% et 0,25 % d’un hydrolysat de caséine exempt

de vitamines (MCA) (NAJIM & TURIAN, 1979). Le milieu de culture synthé-

tique est le milieu de VOGEL (1964), qui est à base de sels d'ammonium

(V).

Pour les études relatives à la seule croissance végétative, les cultures ont été

incubées à 23°C et maintenues à l'obscurité totale pendant les 7 jours suivant

l'inoculation, pour assurer un recouvrement mycélien maximum des boîtes de

Pétri de 9 cm de diamètre (condition standard).

Les effets des facteurs physiques les plus importants : lumière et température,

sur la biogenèse et la différenciation des sclérotes, ont été étudiés simultanément

aux facteurs trophiques.

Action de la lumière

Différents régimes d'éclairement ont été expérimentés : lumière artificielle

continue (800 Lux), lumière naturelle, obscurité totale et une exposition à un

rythme périodique de 12 heures de lumière (800 Lux) et 12 heures d'obscurité

par jour (— 12 h, 12 h) pendant un maximum de 35 jours.

Source : MNHN. Paris

SCLEROTINIA FRUCTIGENA 211

Action de la température

Les cultures végétatives après 7 jours de croissance, sont transférées de 23°C

à de plus basses températures : 20, 15, 10, 5 et 3°C («shift-down») pour une

durée allant de 2 à 35 jours, selon le degré de maturation des sclérotes recherché.

Expression des résultats

L'influence de la température a été jugée en prenant comme référence le

poids frais des sclérotes obtenu entre 0 et 25°C sous régime photopériodique

(12 h, 12 h).

Du fait de la taille variable des sclérotes de Sclerotinia fructigena, le critère

de comparaison retenu a été le poids frais par boîte de Pétri et non pas le nom-

bre de sclérotes (voir Figs 2, 3). Ce poids frais des sclérotes isolés de la gélose, a

été apprécié pour les différentes expérimentations afin de mener une étude

comparative sur la différenciation des sclérotes.

RÉSULTATS

Influence du milieu nutritif

Une étude préalable effectuée sur la croissance mycélienne montre que les

cinétiques de la croissance à 23°C, avec 12 heures d'exposition à la lumière et

7 7 8 jus

Fig. 1. — Cinétiques de la croissance végétative sur le milieu semisynthétique (MCA) et sur

le milieu de Vogel (V) sous un régime photopériodique de 12h, 12h/jour dés la mise

en culture.

Fig. 1. — Kinetics of vegetative growth on semi-synthetic medium (MCA) and on Vogel

medium under a photoperiod of 12h, 12h per day.

Source : MNHN, Paris

212 L. NAJIM

12 heures d'obscurité par jour, sont tout à fait comparables pour les deux mi.

lieux de croissance utilisés et que le recouvrement mycélien des boites de Pétri

est atteint au bout de 7 jours de croissance (Fig. 1).

Les cultures maintenues pendant 7 jours à l'obscurité totale et à 23°C présen-

tent le même recouvrement mycélien que celles exposées à la lumière. Les sclé-

rotes ne commencent à se différencier qu'après le recouvrement total des boîtes

de Pétri par le mycélium, ils se présentent sous la forme de masses tubéroïdes de

1 à 4 cm de longueur dans les conditions normales de croissance.

En général, les sclérotes se forment à la surface des boîtes de Pétri et restent

couverts par du mycélium aérien qui forme un feutrage tout autour (Fig. 2).

Certains sclérotes peuvent se différencier dans le substratum et présenter un

cortex réduit. Sur les boites de Pétri exposées auparavant au régime photopé-

к E ‚10° Г

Fig.2 — Culture de Sclerotinia fructigena sur MCA (obscurité totale a 10°C). Sclérotes tu-

béroides (4) reliés entre eux, formant une masse. Sclérotes recouverts par un duvet

mycélien blanchatre.

Fig. 2 — Sclerotinia fructigena culture on MCA (whole darkness at 10°C), Tubercular

sclerotia (4) related together and forming one mass. Sclerotia covered by a downy and

white mycelia.

Fig. 3 —a) Revers de culture de S. fructigena exposée a un régime photopériodique de 12 h,

12 h a 10°C. Sclérotes nombreux, petits et répartis en cercles concentrigues (-- - -).

b) et c) Revers de cultures maintenues à 10°C à l'obscurité totale. Sclérotes tubéroides,

s'étalant sur toute la boite de Pétri (flèches).

Fig. 3 — a) Reverse side of S. fructigena culture exposed under a photoperiod of 12 h, 12 В

per day at 10°C. Numerous and small sclerotia distributed in cencentric circles LR

b) and c) Reverse side of culture maintained at 10°C in whole darkness. Tubercular

sclerotia, covering all the Petri dish (Arrows).

Source : MNHN, Paris

SCLEROTINIA FRUCTIGENA 213

riodique (12 h, 12 h) les sclérotes se forment en zones concentriques qui coin-

cident avec les coussinets conidiféres caractéristiques du genre Monilia (Fig. 3a).

Le poids des sclérotes récoltés sur le milieu MCA est environ le double de

celui obtenu sur le milieu V, bien que le recouvrement en mycélium des boites

de Pétri soit à peu prés identique dans tous les cas étudiés et pendant toute la

durée des différentes expérimentations (Fig. 4).

Influence de la lumiére

Sur les deux milieux de culture, le poids des sclérotes obtenu avec un éclai-

rement naturel est comparable à celui récolté à l'issue d’un régime photopério-

dique (12h, 12h) par jour (Fig. 4).

Le phénomène de zonation des coussinets conidifères provoqués par les

variations cycliques de la lumière (JEREBZOFF, 1965) se retrouve également

pour les sclérotes. Ces derniers ont tendance à se confondre avec les coussinets

conidiféres en cercles concentriques (Fig. За).

Si les cultures sont maintenues à l'obscurité totale, des agrégats de mycélium

apparaissent à partir de 7 jours de culture sous la forme de trois ou quatre

masses mycéliennes qui commencent à se mélaniser dés les premiers stades de

0.5

POIDS DE SCLEROTES EN GRAMME PAR BOITE DE PETRI

(12212400404; Obs. Totale Lim. continue

Fig. 4. — Effet de la lumière sur la biogenèse des sclérotes, exprimé en grammes de poids

frais de sclérotes récoltés sur le milieu MCA et sur le milieu de Vogel (V).

Fig. 4. — Effect of light on sclerotia biogenesis, expressed in fresh weight (g) of sclerotia ob-

tained on MCA and V media.

Source : MNHN, Paris

214 L. NAJIM

formation. Sur ces cultures, les sclérotes se différencient soit en surface soit dans

le substratum. Par contre, ces sclérotes ont tendance à devenir plus volumineux

et moins nombreux et tubéroides à leurs extrémités (Fig. 3a, b, c).

Toutefois, les cultures exposées à la lumière continue pendant 21 jours diffé-

rencient trés peu de sclérotes, que ce soit sur milieu «naturel» ou sur milieu

synthétique.

La figure 4 montre que la lumiére dans son ensemble affecte partiellement

la différenciation des sclérotes. En effet, les différents types d'éclairements

périodiques jouent un rôle limité dans la différenciation des sclérotes. Il n’en va

pas de même pour la lumière continue qui exerce une forte inhibition sur la

morphogenèse des sclérotes.

Influence de la température

La morphogenése des sclérotes de S. fructigena est aussi déterminée par la

température. L'effet de la température a été étudié principalement sur le milieu

MCA. Les cultures qui sont directement incubées après l'inoculation à telle ou

telle température, présentent une différenciation en sclérotes plus ou moins

étalée dans le temps et étroitement dépendante du recouvrement des boîtes de

Pétri en mycélium.

Les sclérotes atteignent leur maturation au bout de 21 jours d'incubation à

23°C, cependant quelques masses sclérotiales peuvent encore se former jusqu'à

35 jours mais elles restent toutefois immatures.

Par contre, avec le système de transfert d’une température à une autre (ou

«shift-down»), la différenciation des sclérotes est amplifiée (Tab. 1). En effet,

les transferts des cultures végétatives, de 23°C à 15 ou 10°C, stimulent et

Tableau 1. — Expérience de «Shift-down» sur milieu MCA : les cultures sont transférées

pour des durées variables sous diverses conditions lumineuses et thermiques. Les résul-

tats sont exprimée en grammes de poids frais de sclérotes par bofte de Pétri (moyenne

sur 60 boîtes de Pétri).

Table 1. — Experience of Shift-down on MCA medium : cultures are transfered under

diverse conditions of light and temperature for different times. Results are expressed in

fresh weight (g) of sclerotia per Petri dish (average on 60 Petri dishes).

Température 23°C 25°C/15°C 23°C/10°C

Eclairement 12h/12h Obscurité 12h/12h Obscurité 12h/12h Obscurité

Délais 21} 1.05 145 0.60 0.80

d'observation (E (£0.03) (£0.05) (40.02) (+0.03)

(après transfert 26) 0.57 0.63 120 1.25 0.73 0.95

des cultures (£0.04) (50.03) (£0.02) (£0.03) (£0.03) (£0.04)

KE Зар 1065 129 1.35 095 110

(50:03) (%0.05) (%0.04) (%0.05) (%0.04) (+0.05)

Source : MNHN. Paris

SCLEROTINIA FRUCTIGENA 215

POIDS DE SCLEROTES EN GRAMME PAR BOITE DE PETRI

5 10 15 20 25 "e

Fig. 5. — Effet de la température sur la biogenèse des sclérotes. Cultures sur le milieu MCA,

aprés 21 jours de «shift-down» 'de température sous un régime photopériodique de 12h,

12h.

Fig. 5. — Effect of temperature on sclerotia biogenesis. Culture on MCA medium, after 21

days of shift down of temperature under a photoperiod rythm of 12 h, 12 h.

e E O N оа

fert à 15°C est très favorable pour la production des sclérotes; en effet on tota-

lise un poids frais moyen de 1,05 g par boîte de Pétri dês 21 jours de culture

avec un régime photopérodique de 12 h de lumière et 12 h d'obscurité. Le

poids est de 1,15 g à l'obscurité totale.

Influence de la lumiére et de la température

Une interaction convenable des facteurs «température» et «lumière» peut

être favorable à une forte production des sclérotes.

Les cultures exposées à la lumière et incubées à de basses températures

forment de nombreux sclérotes (Fig. 3a). Par contre, si ces cultures sont main-

tenues à l'obscurité, la production des sclérotes est différente : ils sont moins

nombreux mais plus volumineux (Fig. 3b, c). Si l'effet de la chute de tempéra-

ture est combiné à celui de l'obscurité, le développement des sclérotes est ampli-

fié comparé aux cultures maintenues à la température initiale mais exposées

à la lumière (Fig. 3).

Les deux facteurs «lumière» et «température» permettent en effet un contrôle

de la différenciation et de la production des sclérotes à partir des hyphes végé-

Source

MNHN. Paris

216 L. NAJIM

tatives, et facilitent par ailleurs toutes les études en microscopie optique et élec-

tronique sur la morphogenése et la différenciation cellulaire des sclérotes.

DISCUSSION ET CONCLUSIONS

On a montré que la biogenèse des sclérotes est contrôlée par les facteurs

trophiques et physiques (Figs. 2, 3). Par ailleurs, l'influence des facteurs phy-

siques a été mise en évidence sur le milieu MCA (NAJIM & TURIAN, 1979).

La composition du milieu nutritif joue un rôle important dans la différencia-

tion des sclérotes où elle peut influer sur le taux de production de ces derniers

(TREVETHICK & COOKE, 1971; WANG & LE TOURNEAU, 1972; OKON &

al., 1972; MOORE & JIRJIS, 1976; ZOBERI, 1980). En effet, les milieux de

culture défavorisant la croissance végétative engendrent trés peu de sclérotes

et les milieux assurant une croissance végétative appréciable ne sont pas tous

favorables à une différenciation des sclérotes. Les deux milieux de culture choi-

sis pour notre expérimentation permettent une croissance végétative rapide

(Fig. 1). Le milieu de culture MCA semble en outre favorable à une différen-

ciation régulière des sclérotes. Dans les conditions normales de croissance, c'est-

à-dire à 23°C sous un régime photopériodique de 12 h de lumiére et de 12 h

d'obscurité par jour, les sclérotes arrivent à maturité au bout de 35 jours environ

et ceci correspond probablement à l'épuisement du milieu en substances nutri

tives. Ainsi, l'appauvrissement progressif du milieu de culture pourrait induire

simultanément le développement des sclérotes, à condition qu'il n'y ait pas

d'inhibiteurs dans le limieu.

La température est un élément capital dans la différenciation fongique, car

elle peut accélérer ou ralentir certains phénomènes biologiques. Chez le S. fruc-

tigena, la méthode de transfert de cultures («shift down») à des températures

plus basses, a permis d'établir les limites de différenciation des sclérotes en fonc-

tion de la température. Les sclérotes se différencient pour toutes les tempéra-

tures testées de 23°C à 5°C, mais avec un maximum à 15°C (Fig. 5). Par ailleurs

aucune relation n’a pu être mise en évidence en ce qui concerne le nombre et

le poids frais des sclérotes; toutefois, plus la température diminue et plus les

sclérotes deviennent volumineux, tubéroides mais moins il sont nombreux.

À une température donnée, on observe une augmentation linéaire du poids

des sclérotes durant route la période de développement, jusqu’à la maturation

(Tab. 1). Dans les conditions standard de croissance, les sclérotes ont tendance

à se former à l'emplacement des coussinets conidiféres, ce qui n'est pas le cas

quand les cultures sont maintenues à l'obscurité, ce qui montre, en effet, une

certaine sensibilité à la lumière. Cependant, une exposition continue à la lu-

mière exerce une action fortement inhibitrice sur la formation des sclérotes

(Fig. 4). Par opposition, l'obscurité totale favorise le développement des sclé-

rotes quelle que soit la température d'incubation et fait disparaître le phéno-

méne de zonation des sclérotes (Figs. 3b, c).

En combinant le facteur température («shift-down») et le facteur lumière,

Source : MNHN. Paris

SCLEROTINIA FRUCTIGENA 217

on observe une progression plus ou moins linéaire du poids frais de sclérotes

durant la croissance et le développement des cultures (Tab. 1). L'effet de la

lumière, cumulé avec une basse température ralentit le développement des sclé-

rotes qui deviennent massifs. Par contre, à l'obscurité la production des sclérotes

est de nature différente : ils sont plus volumineux et forment plusieurs masses

tubéroïdes.

En conclusion, le développement accéléré et contrôlé des sclérotes au labo-

rátoire par la méthode des chutes de température constitue un matériel de

choix pour l'étude de la genèse et de la différenciation des sclérotes. Par ailleurs,

l'influence qualitative et quantitative de la lumière sur la différenciation des

sclérotes pourrait être abordée en complément à l’action de la température.

REFERENCES

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and control. London, Pergamon Press.

JEREBZOFF 5., 1965 — Growth rythms. [n : G.C. AINSWORTH & A.S. SUSSMAN, The

Fungi. N. Y. & London, Academic Press, Vol. 1 : 625-645.

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metabolites in Coprinus cinereus (C. Lagopus sensu Lewis). Trans. Brit. Mycol. Soc.

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NAJIM L. and TURIAN G., 1979 — Ultrastructure de l'hyphe végétative. Sclerotinía fructi-

gena (Ader.et Ruhl.). Canad. J. Bot. 57 :1299-1313.

OKON Y., CHET I. and HENIS Y., 1972 — Lactose induced synchronous formation in

Sclerotium rolfsii and its inhibition by ethanol. J. Gen. Microbiol. 71 :465-470.

TREVETHICK J. and COOKE R.C, 1971 — Effects of some metabolic inhibitors and sul-

phur-containing amino acids on sclerotium formation in Sclerotium rolfsii, S. delphinii

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VOGEL HJJ., 1964 — Distribution of lysine patways among Fungi, evolutionary implica-

tions, Amer. Nat. 98 :124-137.

WANG S.W. and LE TOURNEAU D., 1972 — Amino acids as nitrogen sources for growth

and sclerotium formation in Sclerotinia sclerotiorum. Trans. Brit. Mycol. Soc. 59 :

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ZOBERI M.H., 1980 — Some nutritional factors regulating formation of sclerotia in Sclero-

tium rolfsii. Canad. J. Bot, 58 : 2448-2490.

Source : MNHN. Paris

Cryptogamie, Mycol. 1987, 8 (3) : 219-225 219

NOTES ON TETRACLADIUM APIENSE

SINCLAIR AND EICKER

A. ROLDAN*, E. DESCALS** and M. HONRUBIA*

SUMMARY. — Single conidia isolates and field material of Tetracladium apiense Sinclair.

et Eicker from Spain is compared with holotype. An emendment of the original diagnosis

is provided. The world wide distribution of this fungus is discussed.

RÉSUMÉ. — L'holotype de Tetracladium apiense Sinclair et Eicker est comparé avec plu-

sieurs isolements et échantillons d'Espagne. La description originale est amendée, La distri-

bution mondiale de ce champignon est également discutée.

RESUMEN. — Se compara el holotipo de Tetracladium apiense Sinclair et Eicker con varios

aislamientos y material de campo procedentes de España. Se realiza una enmienda a la des-

cripción original. La distribución mundial de este hongo es comentada.

KEY WORDS : Tetracladium apiense, aquatic hyphomycete, systematic,

SINCLAIR & EICKER (1981) described Tetracladium apiense from pure

cultures derived from conidia on unidentified leaves in Transvaal (S. Africa).

Their holotype (IMI 250776) provides very sparse information on conidioge-

nesis. It does contain numerous conidia, but many are misshapen (see our Fig.

2) (this is a common problem with «aquatic hyphomycetes», where laboratory

sporulation is induced mostly under far from ideal conditions). The authors

only selected for their illustrations what we believe are the most typical conidial

structures (with 6 apices), but other should also represent the species. The three-

dimensional branching is only somewhat evident in the SEM of Fig. 1 A.

Furthermore, the protologue does not seem to always match the characters

evident from examination of the material, or it makes use of some terminology

which we believe needs clarification. For example it states that conidiophores

are micronematous and erect, a contradiction according to ELLIS (1971)

definitions. Conidiogenous cells are said to be monoblastic and conidia thus

solitary, when conidiogenous cell polyblasty is an outstanding generic character.

In describing the structure of detached conidia it is not clear what is meant by

* Dpto. Biología Vegetal (Botánica). Facultad de Biologia. Universidad de Murcia. España.

** Institut Micologic. Cases Noves. Esporles. 07190. Mallorca. España.

Source : MNHN. Paris

220 A. ROLDAN, E. DESCALS and M. HONRUBIA

Fig. 1. — Tetracladium apiense from pure culture (MUB : AR 9700). A to D : Conidio-

phores; E to K : detached conidia; bar —25 Um.

Fig, 1. — Tetracladium apiense en culture pure (MUB : AR 9700). A à D : conidiophores;

E à K : conidies; échelle : 25 im.

Source : MNHN. Paris

TETRACLADIUM APIENSE 221

«central» and «proximal» arms, nor, in the Latin diagnosis, why is conidial

structure limited to only «conidia triradiata vel quadriradiata». Finally, the brief

discussion states that «the central digitate processes are nearly always dichoto-

mously branched». But a dichotomy is by definition a type of apical branching

where both arms of the fork appear at the same time and retain their apical

dominance. This is the case in Dwayaangam, Triposporina, etc... but not Tetra-

cladium, where the arms characteristically arise laterally from below a septum.

We have reisolated T. apiense in the course of surveys of «aquatic hyphomy-

cetes» from mainland Spain and the Balearic Islands. After comparing our

material with the holotype we believe that there is reason for reporting and

illustrating further characters of the fungus, based on our isolates and field

material. We also incorpor some interesting features from the holotype (Fig. 2),

and we draw the readers’ attention to some less easily accessible literature,

such as PRICE (1964) where the fungus was first studied in pure culture.

Tetracladium apiense Sinclair et Eicker 1981, Trans. Brit. Mycol. Soc. 76 (3) :

515-517 (Fig. 1, 3).

Colony (2 % MEA) white to beige, reaching 3.5 cm diam./3 weeks at room

temperature, fluctuating 16-20°. Aerial mycelium absent or scanty, limited to

the centre and white. Submerged hyphae hyaline, 1-3 um wide. Sporulation

sparse on undisturbed colonies on agar, but slices of the culture submerged in

sterile distilled water in Petri dishes (at room temperature) for 7-14 days yielded

numerous conidia. Conidiogenous structures hyaline and thin-walled. Conidio-

phores micronematous or more often semimacronematous and then monone-

matous, septate, simple or very sparsely branched, up to 120 (-150) x 1.5-3 um.

Conidiogenous cells integrated with both the conidiophore and the first coni-

dium, apical, lateral or intercalary, polyblastic sympodial secession, scars denti-

culate, Conidia acropleurogenous, branching sequentially and laterally from two

levels, in more than one plane and immediately below septa. Mature detached

conidia multiseptate, with 2-7 rounded to acute (but never acicular) apices

(typically 6), spanning 25-40 ym, the lower element clavate, (0)- medially sep-

tate, a short caudal extension often present; the upper elements all delimited

by septa, are typically arranged as follows : 4 elements form a verticil, two of

them more or less widely divergent slightly curved outwards, long-fusoid to

subulate, and (0)- medially septate; the other two elements, which tends to be

more central (one of which often is in line with the lower element), are mostly

straight digitiform and medially septate, each bearing at the same level, shorter,

cupulate, digitiform, subulate or phialiform, lateral, inserted immediately below

the median septum. (these two pairs of processes strikingly resemble conidia

of Tricellula aquatica). Sometimes a third lateral may appear on either central

element, at a higher level. Conidia secede schizolytically. The holotype contains

part-conidia, apparently as a result of fragmentation at one or more septa.

Conidia germinate readily in liquefied foam and on isolation media (DESCALS

& al., 1977).

Source : MNHN, Paris

222 A. ROLDAN, E, DESCALS and M. HONRUBIA

| а

pray |

(t 7;

TETRACLADIUM APIENSE 223

Collections examined : monospore isolate from stream foam, Los Chorros

del Rio Mundo, Albacete (UTM WH 4957) Roldán and Descals, 19 Dec. 1985

(MUB : AR 9700); monospore isolate from incubated leaves of Populus nigra

from Rio Vinalopó, Alicante (UTM YH 8806) Roldán and Honrubia, Dec.

1986 (MUB : AR 9701); on boiled grass blades incubated in pond water at room

temperature (ca. 20°C) for two weeks, Esporles, Mallorca (Balearic Islands),

Descals, May 1987 (Descals E 7); conidia in foam, Torrent Sant Pere, from

stream through mixed wood and Platanus plantation, loc. cit., Descals, 5 June

1987; IMI 250776 (holotype).

With regard to distribution and substrate preferences of T. apiense, it is

becoming obvious that the fungus is widespread in warm temperate regions of

the world : COWLING (1963) drew conidia from foam and leaves in Eastern

Australia, although he saw them as abnormal Tetracladium marchalianum and

T. setigerum (his Fig. 7). Interestingly enough, he included in Fig.1] an un-

known propagule from nature which greatly resembles part-conidia seen from

pure culture in the holotype slide, probably as a result of fragmentation after

release. PRICE (1964) described in great detail the conidiogenesis of T, apiense,

isolates obtained from foam and Salix leaves submerged in streams in South

Australia. She unfortunately did not name her fungus although she was aware of

its novelty. SINCLAIR & EICKER (1981) formally described the fungus from S.

Africa, and referred to drawings by INGOLD (1960) of conidia in stream foam

in Rhodesia (now Zimbabwe) which he recognized as an undescribed species.

They also quote FERREIRA & al. (1981), who erroneously recorded conidia as

T. setigerum from the type locality (the River Apies). MATSUSHIMA (1981,

Fig. 119) isolated a conidium from stream scum in Alabama in July 1979, which

he assigned to T. setigerum although several conidia are indistinguishable from

those of T. apiense, Nevertheless, the presence on other conidia of acicular

branches, never present in our pure cultures of T. apiense, seems to be diagnostic

of T. setigerum. It is possible that in some cases one or more branches do not

have the opportunity to develop fully into a pointed end, and remain blunt,

knoblike or digitiform. This phenomenon and its reverse, i. e. : what should

remain as short processes extend into much elongated branches, occur frequent-

ly in Tetracladium spp. If we add to this the capacity for polar germination from

Fig. 2. — A, B, C, F : Tetracladium sp., conidia from stream foam in Enol Lake (Asturias)

Roldán (A-87). D, E : Tetracladium sp., conidia from stream foam in La Molina (Spanish

Pyrénées) Roldán (А 92). С to Z : Tetracladium apiense from holotypus (IMI 250776);

G to I : conidiophores; J to W : detached conidia; X to Z : part conidia. (A to F, scale

4a» —20 [Im; G to Z, scale «b» — 20 Um).

Fig. 2 — A, B, C, F : Tetracladium sp., conidies provenant du Lac Enol (Asturies) Roldan

(A87). D, E : Tetracladium sp., conidies de La Molina (Pyrénées espagnoles) Roldan

(4.92). G'ä Z : Tetracladium apiense de l'holotype (IMI 250776); G à I : conidiophores;

Там : conidies; X à Z : portions de conidies. (A à F, échelle «a» = 20 Hm; G à Z,

échelle «b» —20 Jm).

Source : MNHN, Paris

224 A. ROLDAN, E. DESCALS and M. HONRUBIA

Fig. 3. — Conidiophores of Tetracladium apiense in pure culture (MUB : AR 9700). Arrow

shows sympodial elongations in A. (Water mounts), bar —20 Шт.

Fig. 3. — Conidiophores de Tetracladium apiense en culture pure (MUB : AR 9700). La

flèche montre l'élongation sympodiale en A. Échelle — 20 Um.

any of these conidial apices, the identification of single detached conidia in foam

or water becomes even more unreliable.

In Spain, T. apiense has been recorded by ROLDAN & al. (a, b, in press) from

various localities in the Southern mountain ranges. Conidia have also been seen

developing on Robinia and Salix leaves from acid waters (ROLDAN & al., 1987,

Table II) and in Alicante and Mallorca (Balearic Islands) in alkaline ponds and

streams. The fungus is obviously associated with decomposition of allochtho-

nous leaves in various freshwater habitats, and its distribution is bound to be

much wider than we presently know.

There appear to be undescribed forms close to T. apiense, as seen in DES-

CALS (in press) (mislabeled as T. apiense) and in Fig. 2 A-F, drawn from

conidia in Asturias and Spanish Pyrénées, North Spain.

The species delimitations in Tetracladium will remain unstable until many

more isolates are carefully studied, This is especially true for the continuum

T. apiense - T. setigerum and T. furcatum - T. maxilliforme, but there are now

Source : MNHN. Paris

TETRACLADIUM APIENSE 225

also doubts about the identity of many forms traditionally asigned to T. marcha-

lianum (GÖNCZÖL, in litt., and our observations).

REFERENCES

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CONTRÓLE DE LA FORMATION DES RHIZOMORPHES

D'ARMILLARIELLA MELLEA (VAHL. ex FR.) KARST.

PAR L'ALTERNATIVE NITRATE-AMMONIUM

ET CERTAINS ACIDES AMINÉS

par B. Ch. BEHBOUDI*, H. EBRAHIMZADEH et G. HADADTCHI

RÉSUMÉ. — Étude du pouvoir inducteur du milieu de culture sur la différenciation des

hyphes non agrégées en pseudosclérotes et en rhizomorphes chez Armillariella mellea.

L'emploi d'un milieu nutritif spécifique permet de contróler la genése des rhizomorphes à

partir des hyphes non agrégées. Les nitrates induisent la formation des rhizomorphes, l'am-

monium inhibe leur initiation. La croissance des rhizomorphes est stimulée par la présence

de peptone, de sérine et d'alanine.

ABSTRACT. — The induction's power of the culture medium on differentiation of non

aggregated hyphae to pseudosclerotia and rhizomorphs has been investigated in Armillariella

mellea. The use of a specific nutrition medium has permited to control the initiation of rhi-

zomorphs from non aggregated hyphae. Nitrates induced the rhizomorphs formation,

whereas ammonium salts inhibited their initiation, The growth of rhizomorphs increased in

presence of peptone, serine or alanine.

MOTS CLÉS : Armillariella mellea, rhizomorphes, nutrition azotée minérale, peptone,

alanine, sérine.

Diverses études ont déjà été réalisées sur le comportement in vitro d'isolats

d'Armillariella mellea s.l. originaires de zones géographiques distinctes, ainsi que

sur l'effet de quelques composants du milieu sur l'initiation rhizomorphique

(JACQUES-FÉLIX, 1968; BEHBOUDI, 1974, 1977b). On sait par exemple

que l'éthanol stimule la croissance des hyphes et des rhizomorphes en culture,

mais n'affecte guére ni la consommation, ni l'utilisation du glucose. A l'aide de

glucose marqué au C'*, il a pu étre montré que la radioactivité, en présence

d'éthanol, s'exprime dans le glucose intracellulaire et les polysaccharides parié-

taux, alors que le CO, les lipides et les métabolites du cycle de Krebs restent

peu radioactifs (GARRAWAY & WEINHOLD, 1968). L’acétate exerce un effet

* Dr. B. Ch. BEHBOUDI, Department of Biology, Faculty of Science, University of Tehran,

Tehran, Iran.

Source : MNHN, Paris

228 B.Ch. BEHBOUDI, H. EBRAHIMZADEH et G. HADADTCHI

similaire à celui de l'éthanol sur la croissance des hyphes et l'initiation des rhizo-

morphes et, enfin, en présence de l'un ou l'autre de ces composés, le disulfiram

inhibe la formation des rhizomorp hes et la croissance des hyphes (SORTKJAER

& ALLERMANN, 1972). Ces recherches établissent donc l'importance du róle

de l'éthanol, de l'acétaldéhyde et de l'acétate au niveau de la différenciation

des rhizomorphes.

L'effet de quelques composés aromatiques et de leurs précurseurs sur la for-

mation des rhizomorphes à également fait l'objet d'études. Tl en résulte que

l'acide para-aminobenzoique (APAB) et l'acide ortho-aminobenzoique (AOAB)

stimulent l'initiation et la croissance des rhizomorphes, alors que l'acide méta-

aminobenzoique (AMAB) n'a pas d'effet (GARRAWAY, 1970). L'adjonction

au milieu d'autres composés aromatiques tels que l'aldéhyde protocatéchique,

l'acide quinique, l'acide shikimique, le tryptophane, la tyrosine ou la phényl-

alanine accroit seulement la croissance des hyphes, sans induire l'initiation

rhizomorphique (GARRAWAY, 1970). Chez Neurospora crassa, l'AOAB peut

participer à la synthése de composés indoliques tels que l'acide indolacétique

(AIA) et pourrait fonctionner comme inducteur ou dérépresseur de l'activité

tryptophanesynthéthase dans la biosynthése des composés indoliques (MAT-

CHETT & ROSS, 1963; TURNE & MATCHETT, 1968). Pour ces raisons,

certains auteurs ont suggéré que l'AIA pourrait stimuler la formation et la

croissance des rhizomorphes et que l'AOAB agirait alors sur la croissance des

rhizomorphes en affectant le métabolisme de l'AIA (GARRAWAY, 1969, 1970).

Le présent travail tente de mettre au point un milieu dont la composition

permettrait de contrôler aisément la différenciation rhizomorphique en jouant

sur quelques constituants. Dans un second temps, nous comparerons les effets

de quelques acides aminés sur la formation des rhizomorphes.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Des basidiocarpes qui se sont révélés appartenir à une nouvelle race d'Armil-

lariella mellea (BEHBOUDI, 1977a) ont été récoltés dans la forêt de Kare Sang,

au nord de l'Iran, en novembre 1975. A partir du chapeau d'un basidiocarpe,

des cultures ont été établies sur un milieu standard malt-agar à 45 g/l compre-

nant : 12,75g de maltose, 2,75 g de dextrine, 2,35g de glycérol et 0,75 g de

peptone par litre. La température d’incubation est de 25°C. Des sous-cultures

sont établies à partir d'explantats de 3mm de diamètre prélevés en boîtes

de Pétri.

La différenciation rhizomorphique apparaît dans les cultures issues de frag-

ments de basidiocarpes sur milieu malt-agar, toutes les parties de l'explantat

étant aptes à produire des hyphes aussi bien que des pseudosclérotes ou des

rhizomorphes : les hyphes apparaissent 4 jours, et les rhizomorphes 6 jours,

aprés l'inoculation (Fig. 1). Sur le milieu standard, la séquence d'apparition des

hyphes, des pseudosclérotes et des rhizomorphes est trop intriquée et trop ra-

pide, difficilement appréhendable.

Source : MNHN. Paris |

ARMILLARIELLA MELLEA 229

Pour cette raison, un nouveau milieu a été élaboré pour essayer de dissocier

l'expression des stades successifs de la formation des rhizomorphes et de la diffé-

renciation. Ce milieu contient les macroéléments de la solution de Knop et les

oligoéléments de la solution de Heller. Toutefois, le chlorure de fer a été éliminé,

en lui substituant 5 ml/l d'une solution contenant 7,35 р de Na; EDTA et 5,57 g

de Ее504.7Н;О par litre. De l’oxyde de molybdène (1 ml/l d’une solution

contenant 104 mg/l) est encore ajouté, ainsi que 13g d’agar, 20 g de glucose,

1 mg de vitamine B, et 0,5 mg de vitamines B;, Be, C et PP par litre de milieu.

Ce milieu de culture contenant l'azote sous la forme de nitrates est dénommé

«milieu solide MN».

A partir de ce milieu, l'élimination des nitrates de potassium et de calcium

et leur remplacement par 0,57 g/l de chlorure d'ammonium, 0,62 g/l de chlorure

de calcium et 0,18 g/l de chlorure de potassium procurent un milieu contenant

l'azote sous la forme ammonium, dénommé «milieu solide MA».

RÉSULTATS

Après le repiquage sur le milieu solide MN, on observe une apparition gra-

duelle d'hyphes diffuses, blanches: plus tard, se mettent en place autour de l'ino-

culum des zones hyphales concentriques (Fig. 2) sur lesquelles on peut voir, en

quelques points et après 45 à 60 jours, la formation de pseudosclérotes à partir

desquels vont émerger de fins rhizomorphes. Sur le milieu solide MA, seuls se

forment les cercles concentriques d’hyphes non agrégées, sans aucune formation

de pseudosclérotes ni de rhizomorphes (Fig. 3). L'addition dAIA (107M) n'a

aucun effet sur la formation des rhizomorphes et fait disparaitre la zonation

circulaire du mycélium, ce qui semble infirmer l'hypothèse selon laquelle

l'AIA pourrait stimuler la formation et la croissance des rhizomorphes (GARRA-

WAY, 1969, 1970).

L'intérêt de ces deux milieux est leur aptitude à échelonner dans le temps ou

à dissocier les différentes étapes de la croissance mycélienne et de la différen-

ciation des pseudosclérotes et rhizomorphes. Leurs inconvénients majeurs sont

la difficulté de récolte séparée des hyphes et des rhizomorphes et la lenteur du

développement; il a pu y étre remédié en utilisant simultanément la culture en

milieu liquide et l'adjonction de peptone.

Pour réaliser les cultures en milieu liquide, le champignon est inoculé en tubes

contenant 20 ml des milieux précédents dont on a supprimé l'agar. Certains

des inoculums sombrent au fond de la solution alors que d'autres demeurent

en surface. Les réponses aux milieux liquides sont globalement les mémes que

dans le cas des milieux solides. En milieu liquide MN, on observe aprés 45 à

60 jours la formation de couches blanches de pseudosclérotes et de rhizomor-

phes (Fig. 4, 6a), et ceci aussi bien dans le cas des thalles immergés que dans

celui des thalles surnageants. Par contre, en milieu MA, les hyphes poursuivent

leur croissance sans aucune agrégation (Fig. 6b, Tableau I).

Source : MNHN. Paris

230 B.Ch. BEHBOUDI, H. EBRAHIMZADEH et G. HADADTCHI

Source : MNHN, Paris

ARMILLARIELLA MELLEA 231

Tableau I — Variation de la croissance globale en milieux liquides MN et MA.

Table I — Variation of growth (dry weight) in the MN and MA liquid media.

Age des cultures Poids sec des cultures (mg)

(jours) milieu liquide MN | milieu liquide MA

10 2 4

28 3 12

40 4 19

50 4" 24

63 5° 28

* dans le milieu liquide MN, aprés 50 jours, les hyphes

sont différenciés en rhizomorphes. Dans ce cas, à 50 et

63 jours, le poids sec correspond à l'ensemble hyphes +

rhizomorphes.

L'addition de peptone (5 g/l) augmente le poids sec et induit ou amplifie,

sur les deux milieux liquides mais alors seulement chez les thalles surnageants,

la formation des rhizomorphes qui apparaissent après 3 à 7 jours sur le milieu

MN, après 7 à 10 jours sur le milieu MA. La variante essentielle entre les réac-

tions à ces deux milieux est une stimulation relativement un peu plus importante

de la production hyphale sur le milieu MA, de la production rhizomorphique

sur le milieu MN (Tableau II).

Les mémes résultats s'observant aprés adjonction de peptone aux milieux

MN et MA solides, il apparaît que la peptone est bien un facteur améliorant

la croissance des hyphes et des rhizomorphes. Nous avons alors tenté de sub-

stituer des acides aminés à la peptone.

Figure 1 — Développement des hyphes (H), pseudosclérotes (P) et rhizomorphes sur milieu

malt-agar. Figure 2 — Formation de pseudosclérotes (P) et différenciation des rhizomor-

phes (R) sur milieu solide MN aprés 60 jours. Figure 3 — Formation de cercles concen-

triques d'hyphes non agrégées sur le milieu solide MA aprés 60 jours. Figure 4 — Initia-

tion des rhizomorphes dans le milieu liquide MN aprés 60 jours. Figure 5 — Rhizomor-

phes (R) formés à 20-30 jours, en présence de sérine, danse milieu liquide MN. Figure

6 — a, différenciation des rhizomorphes dans le milieu MN liquide; b, dans le milieu li-

quide MA, la différenciation des rhizomorphes ne se réalise pas.

Figure 1 — Growth of hyphae (H), pseudosclerotia (P) and rhizomorphs (R) in malt-agar

medium. Figure 2 — Formation of pseudosclerotia (P) and rhizomorph differentiation

(R) in MN solid medium after 60 days. Figure 3 — Formation of concentric circles of

non-aggregated hyphae in the MA solid medium after 60 days. Figure 4 — Rhizomorphs

initiation in the MN liquid medium after 60 days. Figure 5 — In the presence of serine,

rhizomorphs (R) formed at 20-30 days in the MN liquid medium. Figure 6 — a, rhizo-

morph differentiation in MN liquid medium; b, in MA liquid medium, the differentiation

of rhizomorphs does not take place.

Source : MNHN, Paris

232 B.Ch. BEHBOUDI, H. EBRAHIMZADEH et G. HADADTCHI

Tableau II — Variation de la croissance des hyphes (au fond du milieu) et des rhizomorphes

(à la surface du milieu) chez les milieux liquides MN et MA contenant de la peptone.

Table II — Variation of growth of hyphae (at bottom of medium) and rhizomorphs (at the

liquid surface) in the MN and MA media plus peptone.

Age des cultures | — Milieu liquide MN « peptone Milieu liquide MA + peptone

(jours) poids sec des | poids sec des | poids sec des | poids sec des

hyphes (mg) |rhizomorphes (mg) | hyphes (mg) |rhizomorphes (mg)

16 20 80 35 60

20 25 125 60 74

34 60 215 75 175

50 70 300 80 240

Tableau III — Effets de divers acides aminés sur la différenciation des rhizomorphes sur

milieux MN et MA liquides.

Table III — Effects of amino-acids on differentiation of rhizomorphs in MN and MA. liquid

media.

Milieu liquide MN Milieu liquide MA

Acides aminés

(та) (mg)

- 2 ae s 29 -À et

Alanine 260 +“ + 220 E +

Cystéine 25 - + 35 - +

Cystine 25 - + 30 - +

Glycine 27 - + 27 - Е

Histidine 20 - + 28 - +

Leucine 28 - + 20 - +

Lysine 30 - + 33 - ++

Methionine 27 + 26 - m

Phényl-alanine 30 - + 34 x E

Proline 30 - „+ 35 - ++

Sérine 270 +++ ++ 230 € +

Tryptophane 30 E + 30 = +

Tyrosine 20 : + 19 = ++

Valine 23 - + 15 5 +

DL-val ine 15 + + 20 - ++

* les signes « indiquent la présence et l'intensité de la croissance des rhizomorphes

et des hyphes; les signes - indiquent l'absence de rhizomorphes.

Source : MNHN. Paris

ARMILLARIELLA MELLEA 233

L'addition d'acides aminés variés (5 g/l) aux milieux MN et MA liquides

conduit à des réactions différentielles sur la production de poids sec et de rhizo-

morphes (Tableau III), certains acides aminés seulement exprimant un effet

similaire a celui de la peptone : alanine et sérine en présence desquelles les rhizo-

morphes apparaissent à 20-30 jours sur milieu MN (Fig. 5), 30-45 jours sur mi-

lieu MA. La DL-valine stimule également la formation de rhizomorphes, mais

seulement sur milieu MN où ils sont alors fins et foncés. Sur milieu MN, la tyro-

sine permet la différenciation des pseudosclérotes, mais non suivie de l'émission

des rhizomorphes et, si le tryptophane n'engendre ni pseudosclérotes ni rhizo-

morphes, il induit une excrétion de pigment foncé dans le milieu.

CONCLUSIONS

L'ensemble de nos expérimentations montre que les rhizomorphes naissent

toujours à partir de pseudosclérotes et que le milieu MN autorise la formation

des rhizomorphes à la fois chez les cultures surnageantes et immergées, alors que

le milieu MA ne permet aucune agrégation. L’adjonction de peptone, de sérine

ou d'alanine induit ou/et stimule la formation des rhizomorphes sur les milieux

MN et MA, mais la différenciation rhizomorphique qui, dans les deux cas,

reste localisée aux seules cultures surnageantes, est plus rapide en présence de

nitrates qu'en présence d'ammonium.

On associe souvent la différenciation, chez les champignons, à des modifi-

cations des processus de respiration et de fermentation : certains de nos résultats

suggèrent qu'il puisse еп ёте de méme à propos de la production rhizomor-

phique. C'est en premier lieu le cas de l'effet stimulant de la peptone, pouvant

impliquer l'intervention de certains de ses acides aminés à l'action similaire, en

particulier la sérine et l'alanine, comestibles en acide pyruvique (BLOOM &

FALL, 1974; DANCER & MANDELSTAM, 1974). C'est également celui de

l'action différentielle des milieux liquides MN et MA où les nitrates autorisent

la thizomorphogenése, tant superficielle qu’immergée alors que l'ammonium,

favorisant la glycolyse au dépens des réactions oxydatives (SOLS, 1968), ne per-

met qu'une production d'hyphes diffuses : les ions nitrate et ammonium pour-

raient contróler la formation des rhizomorphes comme ils semblent contróler

la morphogenése en intensifiant ou en réduisant l'effet Pasteur comme il ressort

des travaux réalisés sur la différenciation conidienne de Neurospora (TURIAN,

1964) et la différenciation ascosporale des levures (MILLER, 1959).

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SEASONAL FLUCTUATIONS OF FUNGI

IN EGYPTIAN SOIL RECEIVING CITY SEWAGE EFFLUENTS

by A.LI. ABDEL-HAFEZ and H.M.M. EL-SHAROUNY*

SUMMARY. — Using the dilution plate methods, 30 genera and 86 species in addition to

4 varieties were recovered from 24 soil samples irrigated by sewage effluents during January

1985 - December 1986 on glucose (26 genera and 74 species + 4 varieties) and cellulose

(23 genera and 48 species + 2 varieties) Czapek's agar at 28°C. The composition of the my-

coflora on the two media were basically similar, but the frequencies of occurrence of some ge-

nera and species were promoted or decreased more on cellulose than on glucose agar plates. The

total counts of glycophilic and cellulose-decomposing fungi were irregularly fluctuated and

the peaks were recorded in March 1985, and May/ October 1986 on the two media, respec-

tively. On glucose agar the most common species were Aspergillus fumagatus, A. niger, A.

sydowi, Penicillium chrysogenum, Mucor hiemalis and Fusarium solani. On cellulose agar

the most prevalent species were A. flavus, A. fumigatus, P. chrysogenum, Mucor racemosus,

Acremonium strictum, Stachybotrys chartarum, F, solani and Chaetomium globosum.

RÉSUMÉ. — A partir de 24 échantillons de sol irrigué par des eaux usées, recueillis entre

Janvier 1985 et Décembre 1986, 30 genres et 86 espèces plus 4 variétés de champignons

ont été récupérés à 28°C sur milieu Czapek-agar contenant du glucose (26 genres et 74

espèces + 4 variétés) et de la cellulose (23 genres et 48 espèces +2 variétés). La composition

de la mycoflore sur ces deux milieux est similaire, mais les fréquences d'apparition de quel-

ques genres et espèces varient. Les nombres totaux de champignons glycophyles et de

champignons cellulolytiques fluctuent irrégulièrement, les maxima ayant été enregistré

respectivement en Mars 1985 et Mai/Octobre 1986. Aspergillus fumigatus, A. niger, A.

sydowi, Penicillium chrysogenum, Mucor hiemalis et Fusarium solani sont les plus communs

sur glucose. Sur cellulose, les espèces dominantes sont A. flavus, A. fumigatus, P. chrysoge-

num, Mucor racemosus, Acremonium strictum, Stachybotrys chartarum, F. solani et Chae-

tomium globosum.

KEY WORDS : Soil fungi, glycophilic fungi, cellulose-decomposing fungi.

INTRODUCTION

As a new science, irrigation with sewage effluents is still in the experimental

stages and many problems need to be solved in the field of hygiene, biology

and microbiology. In the world, numerous investigations were carried out on the

* Botany Department, Faculty of Science, Sohag, Egypt.

Source : MNHN, Paris

236 A.LI. ABDEL-HAFEZ and H.M.M, ELSHAROUNY

mycoflora of soil through the use of sewage as an irrigation supplement (COOKE,

1963, 1971; COOKE & PIPES, 1970; DIENER & al., 1976; EILAND, 1981;

LARRY & WANGER, 1982). In Egypt, there is no information about the

mycoflora of soil irrigated by city sewage effluents and all studies have been

focused on cultivated soil irrigated by freshwater from River Nile (MOUBA-

SHER & MOUSTAFA, 1970; MOUBASHER & EL-DOHLOB, 1970; MOU-

BASHER & MAZEN, 1971; MOUBASHER & al., 1971; MOUBASHER &

ABDEL-HAFEZ, 1978a, b). The present investigation is aimed to study the

density, frequency of occurrence and seasonal incidence of fungal population

in soil regularly irrigated by city sewage effluents.

MATERIALS AND METHODS

Three kilometers out of Assiut city, a plot of sandy soil (about 30 acres in

area) were cultivated by different crops (maize, sorghum and wheat) and irri-

gated monthly by domestic sewage effluent received from the city refuses and

ccording to the system designed for each crop. Monthly soil samples were

collected during January 1985 - December 1986. The soil samples were analysed

chemicaly for the estimation of organic matter contents and total soluble

salts. A Bekman pH-meter was used for the determination of soil pH.

Determination of soil fungi :

The dilution-plate method was used for the estimation of soil fungi as des-

cribed by JOHNSON & al. (1959), but with some modifications as employed

by MOUBASHER & ABDEL-HAFEZ (1978 a, b). Glucose- (10 g/l) and cellu-

lose- (21.9 g/l) Czapek's agar were used as isolation media. To these media

rose bengal (1/15000) was added as a bacteriostatic agent (SMITH & DAWSON,

1944). Ten plates were used for each sample, of which 5 plates were poured

with glucose-agar and the other 5 plates with cellulose-Czapek's agar. Plates

were incubated at 28°C for 7-10 days and the growing fungi were identified,

counted and the numbers were calculated per mg dry soil.

RESULTS AND DISCUSSION

The organic matter contents and total soluble salts of soil tested with sewage

were generally moderate and fluctuated between 3.3 and 4,2 % and between

12 and 2.4 %, respectively. pH values of the soil samples ranged between 6.9-8.4,

and most of the samples were alkaline. MOUBASHER 8: ABDEL-HAFEZ

(1978b) found that the organic matter contents and total soluble salts in Egyp-

tian cultivated soils irrigated by water from River Nile during January-December

1972 and 1973, were low compared with soil receiving sewage and ranged bet-

ween 1.5 and 2.4 %, and between 0.03 and 0.25%, respectively. pH values of

these soils were alkaline with pH from 7.3 to 8.5,

Source . MNHN, Paris

FUNGI IN EGYPTIAN SOIL 237

1 - Fungi recovered on glucose-Czapek's agar :

The total counts of glycophilic fungi in soils receiving sewage were irregularly

fluctuated and widely ranged between 7 and 429 colonies/mg dry soil (compared

with 11.5-26.6 colonies/mg dry soil in cultivated clay soils irrigated by water

from River Nile). The highest counts were estimated in February (315 colonies)

and March (429 colonies) 1985 and the poorest in January, June and September

1985 (22, 7 and 23 colonies, respectively) as shown in Figure 1 and Table 2.

In U.S.A., COOKE & PIPES (1970) reported that the highest fungal counts

in soil receiving sewage were recorded in spring and fewest in summer months.

Also, addition of sewage to soil increase the total count of microorganisms

(CLATHE 8: MAKANI, 1963; EILAND, 1981; LARRY 8 WANGER, 1982).

elony counts(per mg dry soil)

8 5

MJ JASONDJ FMAMJJASOND

1985 1986

Figure 1. — Monthly total counts of glycophilic (—) and cellulose -decomposing fungi (

recovered during January 1985 - December 1986.

Figure 1. — Dénombrements mensuels des champignons glycophiles (——) et cellulolytiques

(= isolés entre Janvier 1985 et Décembre 1986.

Twenty six genera and 74 species in addition to 4 varieties were collected

from 24 monthly soil samples tested during January - December 1985-1986

(Table 1). COOKE (1971) collected 56 fungal species from UK soil samples

in which digested sewage was added triweekly.

Four genera were isolated in high seasonal frequency of occurrence and these

were Aspergillus, Penicillium, Mucor and Fusarium. Aspergillus was the most

common genera, and emerged in 100 % of the samples comprising 36.6 % of

Source : MNHN, Paris

238 A.LI. ABDEL-HAFEZ and H.M.M. EL-SSHAROUNY

Table 1 — Total count (calculated per mg dry soil in every sample), percentage count (calculated

to total fungi) and number of cases of isolation of each of fungal genera and species isolated

from the 24 soil samples, recovered on glucose- and cellulose-Czapek's agar incubated at 28 C.

Tableau 1 — Genres et espèces de champignons isolés à partir de 24 échantillons de sol, sur mi-

lieux Czapek (glucose et cellulose) à 28°C.

Glucose Cellulose

Organisms

TC TC NCI OR TC 4TC NCI OR

Total count 3023.4 2196.2

Aspergillus (total count) 1108.2 366 24 H 9908 451 23 H

A. fumigatus Fres. 450.2 14.8 24 H 586.8 267 21 H

A. niger Van Tiegh. 1838 61 17 H 956 43 9 M

A. sydowi (Bain. & Sart.) 988 32 15 H 82 092 4 1

"Thom & Church

А. terreus Thom 1488 49 14 H - ا‎ с

A. flavus (Link) Fries. 94 33 95 у H

A. falvus var. columnaris Link 182 060 8 M 664 30 7 м

A. nidulans Eidam 16.0 0.52 7 M 808 32 11 M

A. ochraceus Wilhelm 290 096 5 L 6244025 49 E

A. sulphureus (Fres.) Thom 821 027 Ту. = ш لے‎

& Church

A. clavatus Desmaziéres СОМЕ E E X

A. tamarii Kita 7.0% OS U E 4 = =

A. candidus Link ex Fr. 60 019 2 в Б Elm

A. flavipes (Bain. & Sart.) 24 008 2 R = n

Thom & Church

A. fischeri Wehmer 26 (ШӨ: 2 к - NS

A. nidulans var. latus Thom 52 047 2 в 264 12 7 M

& Raper

A. niveus Blochwitz A 018 2 R = =- = =

A. terreus var. africanus 128 042 2 R = 5 а

Fennel & Raper

A. versicolor (Vuill.) Tirab. 60 019 2 в - - -

A. clavato-nanica Bat., Maia 10 003 1 R E = e

Alecrim

A. quadrilineatus Thom & Raper 20 005 0 қ 0:4 002 1 в

A. rugulosus Thom & Raper 20 006 1 R Ээ юле, 252 №

A. wentii Whemer = = os 2 20 009 1 R

Penicillium (total count) 8850 293 20 Н 1600 73 18 H

P. chrysogenum Thom 560.8 185 18 H 764 35 15 H

P. nigricans Bainier 586 19 8 M 128 058 4 L

P. funiculosum Thom 252 420 7 М 348 158 10 M

P. brevicompactum Dierckx 1024 338 6 м (05 022 32 Т

P. oxalicum Currie & Thom 9705 010 А Ж 602 028 2 Е

P. citrinum Thom 148 048 4 т 176 080 8 1

P. corylephilum Dierckx 3621 "149r 3 E - ei аш

P. cyclopium Westling 2147 9Л: 9 Т - - - -

P. janthinellum Biourge ӘР ШІ) 5 5 E - = =

Source : MNHN. Paris

FUNGIIN EGYPTIAN SOIL 239

Glucose Cellulose

Organisms

TC TC. NCU OR TC %TC NCI OR

P. frequentans Westling 150 049 2 R 5б. „022.1. қ

р. rugulosum Thom ӘРЕ Ср Ек - 9

р. purpurogenum Stoll 281-4009: 21, R E 2 ele

steckii Zaleski 18 006 1 R 3 oe oes

>, rubrum Stoll l4 00% 1 oR - 5 2

thomii Maire 10. 8005 М: Қ = 2, =

{ucor (total count) 2678 885 18 H 26.6 16, TH

1. hiemalis Wehmeyer uie "Ag =H - - = =

cinelloides Van Tieghem 800 264 8 М - = = =

1. racemosus Fresenius 756 285 5 1266 57 WLA

usarium (total count) HI 4 6 HF I0, G3 d2

solani (Mart.) Sacc. 798 2463 10 M SUCRE REN

oxysporum Schlech. ex Fr. 364 12 7 M 306 14 CX

moniliforme Sheldon 62 02 AD 2998 15 6 M

poae (Peck) Wollenw. 20 20069 ӨЗ ЧЕ - =) و‎

equiseti (Corda) Sacc. 20 006 1 к - rs

moniliforme var. subglutinans 20° 005 E E - - -

Wollenw. & Reink.

semitectum Berk. & Rav. 20 006 1 R = - -

tricinctum (Corda) Sacc. 7000022 В “к - - - -

remonium (total count) 1202 397 9 М 1308 59 13 їн

rutilum W. Gams 904 299 8 M - = -

strictum W. Gams 244 030 4 L 1908 50 13 TH

implicatum (Gilman & Abb.) 54 ово а в - = =-

Gams

opulariopsis (total count) 434 143 8 M 710 32 10 M

brevicaulis (Sacc.) Bainier 92 19 7м 580. 2.6 6 M

> rumptii Salvanet-Dauval 42 014 № R 130 059 4 L

iryetrichum (total count) 1162 384 7 M 1834 83 10 M

atrogriseum Van Beyma 1008 332 6 M 1834 83 10 M

piluliferum Saccardo & 154 05 в - - -

Marchal

ichederma (total count) 131.6 4.3 7 M 70.6 32 8 M

viride Pers. ex Fr. 940 34 6 M 566 2.6 7 M

album Preuss 3764 214 40 m 140 0590 59 ST,

ecilemyces (total count) 200 066 4 L 128: 058% 51

varioti Bainier 150 049 3 L 88. 040 9 Т

terricola (Miller et al.) 50 016 1 R - - - =-

Onions & Barron

roseolus G. Smith - = = 49. 00% 4 oR

lindrecarpon (total count) 60 19 а È 20 009 1 R

radicicola Wollenweber 40 043 2 R - - -

lichenicola (G. Mass.) Hawksw. 20 006 1 R 20 009 1 R

Drechslera halodes (Drech) 207 alee 138 61 - - -

Subram & Jain

Rhizopus (total count) 90 0299 3 TL 06 003 1 R

Source : MNHN. Paris

240 A.LI. ABDEL-HAFEZ ánd H.M.M. EL-SHAROUNY

Glucose Cellulose

Organisms

TC %TC NCI OR TC %TC NCI OR

R. stolenifer Ehren. ex Fr. Vuill. 70007 2 к 06 003 T R

R. nigricans Ehrenberg 20 006 1 R = "err

Stachybotrys (total count) $6 020 3 L1 1120 Sa 15 H

S. chartarum (Ehr. ex Link.) 66 9250 3 L оло 43 13 H

Hughes

S. microspora (Mat. & Sank.) E mue 18:01 031 4 L

Tong & Devis

Alternaria alternata (Fr.) 40 013 2 R 142 063 2 R

Keissler

Chaetomium (total count) 22. 907 2 қ 2 196 5 M

C. globosum Kunz ex Fr. 0 00 > к Va De 54 г

C. olivaceum Cooke & Ellis 92 өй л к 120 054 2 R

C. spirale Zopf - = = 40 018 1 R

Gliocladium catenulatum 100 033 2 R 40 Oi к

Gilman & Abbott

Sepedonium chrysospermum 10 996 9 ы 240 по: OR

(Bull.) Link

Absidia corymbifera Lichth. 20 006 1 к E اچ د‎

Chrysosporium pannorum 50 0.16 1 R = EE E

Link) Hughes

Cladosporium herbarum (Pers.) 70 022 1 R 10 004 1 R

Link ex Fr.

Circinella muscae (Sorok.) 490. 140 1 R = = је =

Berl. & De Toni

Curvularia (total count) 06 002 R 80 036 2 R

C. tuberculata гіт 0.6 002 R - = c. c

C. lunata (Walker) Boedijn = г.а ЗА: ЖӨР 70482 700%

C. spicifera (Bainier) Boedijn = о е 408 “918% в

Humicola grisea Traaen Wü 0% 1 R- 95:67 9307 5 Т

Geotrichum candidum Link ОБОЗ Та. = 25 42-2

Torula herbarum (Pers.) Ш 907 1 % = Lll cz

Link ex Fries

Trimmatostroma salicis Corda КО ола ЕЕ E = = =

Verticillium (total count) Е = 5 = а оо зг

V. candelabrum Bonorden = X м м 207 218

V. lateritium (Ehr.) Rabenhorst E ә 49 5 uS 0007 22 БЕ

Myrothecium (total count) = E = = 1144 052 4 L

M. verrucaria Ditmar ex Fr. E c бб 00 EE

M. reridum Tode ex Fries = = => 5:4 GR En AR

Pseudobotrytis bisbyi Timonin E Ес

Trichurus spiralis Hasselbring а 2 EE, 2 20 0.098 T R

Mycelia sterilia (white, yellow 600 198 13 H 98 044 5 L

and dark colour)

TC : total count per mg dry soil in every sample. % TC : percentage count (calculated to total

fungi). NCI : number of cases of isolation (out of 24 samples). OR : occurrence remark. H :

high occurrence, more than 11 cases. M :

occurrence, between 3-5 cases. R : rare occurrence, less than 3 cases.

moderate occurrence, between 6-11 cases. L : low

Source : MNHN, Paris

FUNGIIN EGYPTIAN SOIL 241

Mucor (on glucose agar)

———— Mucor (on cellulose agar)

Penicillium (on glucose agar)

ium (on cellulose agar)

soil)

counts

мој

130]

120]

мој

зо

во

70)

во

“|

10]

(on glucose agar) р

(оп cellulose agar) !\

olony

JFMAMJJASOND)

FOMA MS JAS OND

1985

1986.

Figure 2 — Monthly counts (caleulated per mg dry soil) of Aspergillus, Penicillium and

Mucor recovered on glucose- and cellulose-Czapek’s agar during January 1985 - Decem-

ber 1986.

Figure 2 — Dénombrements mensuels des Aspergillus, Penicillium et Mucor isolés sur mi-

lieux Czapek (glucose et cellulose) entre Janvier 1985 et Décembre 1986.

Source : MNHN. Paris

E INE

а Е. > = Ba ge L 5 - + - ко - ғо = fe = |

ET E E E E E |

E cupa rcc

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Source : MNHN. Paris

FUNGI IN EGYPTIAN SOIL 243

total fungi. Its total count was irregularly fluctuated and the maximum were

recorded in March (115 colonies) and October (114 colonies) 1985 and May

(112 colonies) 1986, as shown in Table 2 and Figure 2, It was representated by

19 species and 3 varieties of which A. fumigatus, A. niger, A. sydowi, A. terreus

and A. flavus were the most glycophilic and hydrophilic species of the genus.

Their counts were almost parallel to those of the genus and the best counts

were estimated in October (93 colonies) 1985, March (69 colonies) 1985,

December (25 colonies) 1985, June (43 colonies) 1986 and September (17 co-

lonies) 1986, respectively (Table 3). DIENER & al. (1976) isolated 5 Aspergillus

species from soil in Alabama receiving sewage water and these were A. brunneo-

uniseriatus, A. flavus, A. fumigatus, A. parasiticus and A. versicolor. MOU-

BASHER & ABDEL-HAFEZ (1978b) isolated 24 Aspergillus species in addition

to 2 varieties from Egyptian soil receiving freshwater from River Nile during

January-December 1972 and 1973, of which A. niger, A. fumigatus, A. terreus,

А, nidulans and A. sydowi were isolated in high seasonal frequency of occur-

rence, A. falvus var. columnaris and A, nidulans were recovered from soil recei-

ving sewage water in moderate seasonal frequency of occurrence. The remaining

Aspergillus species (13 species + 2 varieties) were of low or rare seasonal fre-

quency of occurrence.

Penicillium occupied the second place with regard to the number of cases

of isolation. It recovered from 20 months (out of 24) contributing 29.2 % of

total fungi. Its count did not displayed seasonal periodicities and the maxima

were obtained in February (62.8 % of total fungi) and March (48.9 75) 1985.

It was represented by 15 species of which P. chrysogenum was the most preva-

lent, and its count was parallel to those of the genus. P. nigricans, P. funicu-

losum and P. brevicompactum were isolated in moderate seasonal frequency of oc-

currence. DIENER & al. (1976) isolated 9 species of Penicillium from soil receiving

sewage in Alabama, of which P. brevicompactum, P, corylophilum and P, cyclo-

pium are the most common, The remaining Penicillium species (11 species)

were isolated of low or rare seasonal frequency of occurrence (Table 1).

Mucor ranked third according to the number of cases of isolation. It reco-

vered from 18 months contributing 8.8 % of total fungi, Its monthly counts did

not show any regular trend and the maxima were recorded in May (51.6 colo-

nies) and August (52.8 colonies) 1985 (Table 2 and Figure 2). Three species

of Mucor were identified of which M. hiemalis was the most prevalent and its

count was parallel to those of the genus; M. circinelloides and M. racemosus

were less frequent, MOUBASHER & ABDEL-HAFEZ (1978 a, b) isolated the

preceding three species, but with variable densities and frequencies, from Egyp-

tian cultivated soil irrigated by water from River Nile.

Fusarium was also one of the basic components during the experimental

period. It was recorded in 16 months donating 4.5 % of total fungi. Its total

count was irregularly fluctuated and the maximum were obtained in March

(36 colonies) 1985 (Table 2 and Figure 3). COOKE & PIPES (1970) found

that Fusarium was one of the common fungi on soil receiving sewage. It was

represented by 7 species and 1 variety of which F. solani and F. oxysporum

Source . MNHN. Paris

Ты уал c LE A EPG OF = 6: ost = = - 97 bl BL и | 5212щез лооти

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Source : MNHN. Paris

FUNGI IN EGYPTIAN SOIL 245

wete recovered in moderate seasonal frequency of occurrence. These 2 species

were also prevalent in Egyptian cultivated soils receiving water from River Nile

(MOUBASHER & ABDEL-HAFEZ, 1978 a, b). F. moniliforme, F. poae, F. equi-

seti, E. moniliforme var. subglutinans, F. semitectum and F. tricinctum were

less frequent (Table 1).

Acremonium (represented by A. rutilum, A. strictum and A. implecatum),

Scopulariopsis (S. brevicaulis and S. brumptii), Botryotrichum (B. atrogriseum

and B. piluliferum) and Trichoderma (T. viride and T. album) were isolated in

moderate seasonal frequency of occurrence. The remaining genera and species

were isolated in low or rare frequency of occurrence and listed in Table 1.

Comparison between the present results and those obtained from clay soils

irrigated by water from River Nile during January - December 1972 & 1973

(MOUBASHER & ABDEL-HAFEZ, 1978 b) the following observations were

drawn : 1 - Sewage effluents increased the salinity and organic matter contents

of soils. 2- The total count of fungi in soils receiving sewage was very high

and reached to 30234 colonies per mg dry soil in 24 samples (compared with

1317.4 colonies/mg dry soil in 24 samples irrigated by water from River Nile).

3 - There is basic similarities between the mycoflora of the soils irrigated with

sewage with the others and the most prevalent genera are Aspergillus, Penicillium,

Mucor and Fusarium. But Rhizopus and Humicola which are of high seasonal

frequencies in soil receiving water from the River Nile, retreated to a backward

situation (low or rare frequency) in soils irrigated by sewage. 4 - Aspergillus and

Penicillium contributed the broadest spectrum of species in both soils, Also, a

narrowest species was collected from sandy soils on glucose agar at 28°C (74

species + 4 varieties) receiving sewage water (compared with 112 species + 2

varieties in clay soils irrigated by water from River Nile).

II - Fungi recovered on cellulose agar :

The results in Table 1 show clearly that a narrower spectra of genera and

species were collected on cellulose (23 genera and 48 species) than on glucose

agar plates (26 genera and 74 species + 4 varieties) and this is due to glucose

which is a more easily utilizable carbohydrate by fungi. Therefore, the monthly

total counts of cellulose-decomposing fungi were lowest and fluctuated between

12.8 and 158 colonies per mg dry soil. This is in agreement with the results ob-

tained by MOUBASHER & al. (1985) The total counts of cellulose-decomposing

білгі irregularly fluctuated and the maxima were recorded in May (158 colonies)

and October (158 colonies) 1986, and the minima in April (12.8 colonies) and

June (31.8 colonies) 1985 as shown in Table 2 and Figure 1. On the other hand,

the results obtained on cellulose agar were basically similar to those on glucose

and the most frequent genera encountered were Aspergillus (10 species + 1

variety), Penicillium (7 species), Mucor (1 species), Fusarium (3 species), Acre-

monium (1 species) and Stachybotrys (2 species). Their counts were irregularly

fluctuated and the peaks were recorded in May 1986, June 1986, October 1986

and February 1985. From the preceding genera A. fumigatus, A. flavus, A. nidu-

Source : MNHN, Paris

ssf = Aeremonium (on glucose agar) 1

Я Acremonium (on cellulose agar) n

)

(оп glucose agar)

soil

(cn cellulose agar)

dry

(

counts

Colony

Fusarium (on glucose agar)

«sarium (on cellulose agar)

JFMAMJJASONDJFMAM3)J 1

1985 1986

Figure 3 — Monthly counts (calculated per mg dry soil) of Fusarium, Stachybotrys and

Acremonium recovered on glucose- and cellulose- Czapek’s agar during January 1985 -

December 1986.

Figure 3 — Dénombrements mensuels des Fusarium, Stachybotrys et Acremonium isolés

sur milieux Czapek (glucose et cellulose) entre Janvier 1985 et Décembre 1986.

Source : MNHN. Paris

на ор 2 КЕЕ COG 2-2 5-2 үз 900602 097 СБ вал ара ои

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Source : MNHN. Paris

248 A.LI. ABDEL-HAFEZ and H.M.M. EL-SSHAROUNY

lans, P. chrysogenum, M. racemosus, A. strictum and S. chartarum were isolated

in high seasonal frequency of occurrence (Table 1). Their counts were irregular-

ly fluctuated and almost parallel to those of the genera and the best counts

were estimated in November (85 colonies) 1985, July (33 colonies) 1985,

May 1986 (34 colonies), October and November 1986 (13 colonies), July

(20 colonies) 1986, October (58 colonies) 1986 and February (21.4 colonies)

1985, respectively (Table 4). Most of the preceding species were previously

isolated and common on cellulose agar plates from Wadi Bir-El-Ain and salts

marshes soils in Egypt as recorded by ABDEL-HAFEZ & al. (1978) and MOU-

BASHER & al. (1985).

Four genera were isolated in moderate seasonal frequency of occurrence and

these were Scopulariopsis (2 species), Botryotrichum (1 species), Trichoderma

(2 species) and Chaetomium (2 species). From the preceding genera S. brevi-

caulis, B. atrogriseum, T. viride and C. globosum were the most prevalent.

The remaining genera and species were of low or rare seasonal frequency of oc-

currence (Table 1). Most of the fungal species recovered on cellulose agar plates

are well known as cellulose decomposer, but with variable degrees, as recorded

by several researchers (FLANNIGAN, 1970; MALIK & EGGINS, 1970; ABDEL-

HAFEZ & al., 1978; MOUBASHER & al., 1985; RAPER & FENNEL, 1965;

STEWART & WALSH, 1972; TRIBE, 1961, 1966).

It is worthmentioning that eleven species have been recorded on cellulose

which are not collected on glucose. Most are typical cellulolytic fungi. Also the

seasonal frequency of occurrence of numerous fungi was however increased on

cellulose than on glucose agar; example A. nidulans var. latus (from 2 to 7

samples), M. racemosus (5 to 16), Acremonium strictum (4 to 13), Chaetomium

spp- (2 to 6) and Stachybotrys chartarum (3 to 13). On the contrary, the fre-

quency of others was decreased; example A. niger (17 to 9), A. terreus (14 to 0),

A. sydowi (15 to 4), Penicillium nigricans (8 to 4), P. brevicompactum (6 to

3), P. oxalicum (5 to 2), M. hiemalis (13 to 0), M. circinelloides (8 to 0) and

А. rutilum (8 to 0) as shown in Table 1.

ACKNOWLEDGEMENT

The authors are very indebted to Prof. Dr. S.I.I. Abdel-Hafez, Professor of Microbiology,

Botany Department, Faculty of Science, Assiut University, Egypt, for reading the manu-

script.

REFERENCES

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Source . MNHN, Paris

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